A MITOKONDRIÁLIS DNS ÉS AZ OXIDATÍV FEHÉRJE FOLDING APPARÁTUS KAPCSOLATA

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA

A MITOKONDRIÁLIS DNS ÉS AZ OXIDATÍV FEHÉRJE FOLDING APPARÁTUS KAPCSOLATA

DOKTORI ÉRTEKEZÉS

BALOGH TIBOR

Témavezető: DR. SZARKA ANDRÁS

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM ALKALMAZOTT BIOTECHNOLÓGIA ÉS ÉLELMISZERTUDOMÁNYI TANSZÉK

2016

2

Tartalomjegyzék Rövidítésjegyzék ....................................................................................................................6 1

Bevezetés ........................................................................................................................9

2

Irodalmi áttekintés ......................................................................................................... 11 2.1

A mitokondriális oxidatív fehérje folding és az ALR fehérje .................................. 11

2.1.1

A fehérje folding jelentősége ...........................................................................11

2.1.1.1 Folding-probléma a biotechnológiában ........................................................ 13 2.1.1.2 Folding-probléma humán betegségekben ..................................................... 14 2.1.2

Az oxidatív fehérje folding általános sémája .................................................... 16

2.1.3

A mitokondriumok jelentősége ........................................................................ 19

2.1.3.1 A mitokondriumok eredete és morfológiája.................................................. 19 2.1.3.2 Az oxidatív foszforiláció folyamata a mitokondriumban .............................. 20 2.1.3.3 A mitokondriális DNS szerepe a sejtben ...................................................... 21 2.1.3.3.1 mtDNS-mentes ρ0-sejtvonalak jelentősége, létrehozása .......................... 21 2.1.3.3.2 A ρ0-sejtvonalak funkcionális és morfológiai eltérései ............................ 22 2.1.4

Fehérjék mitokondriális importja ..................................................................... 24

2.1.5

Oxidatív folding a mitokondriumban ............................................................... 26

2.1.5.1 A mitokondriális oxidatív folding szubsztrátfehérjéi .................................... 26 2.1.5.2 A MIA40 fehérje szerepe a mitokondriális oxidatív folding folyamatában ... 27 2.1.5.3 Az ALR fehérje szerepe a mitokondriális oxidatív folding folyamatában ..... 28 2.1.5.3.1 Az ALR fehérje egyéb funkciói .............................................................. 29 2.1.5.3.1.1 Az ALR felfedezése, különböző formái ............................................ 29 2.1.5.3.1.2 Az ALR szerepe a májregenerációban .............................................. 30 2.1.5.3.1.3 Az ALR enzimes funkciói ................................................................ 31 2.2 A dehidroaszkorbinsav, mint a mitokondriális oxidatív folding potenciális elektron akceptora .......................................................................................................................... 33 2.2.1

Az aszkorbinsav fiziológiás jelentősége ........................................................... 33

2.2.2

C-vitamin és fehérje folding ............................................................................ 34

2.2.2.1 Aszkorbinsav-függő hidroxilációs folyamatok ............................................. 35 2.2.2.2 Oxidatív folding az endoplazmás retikulumban ............................................ 36 2.2.2.2.1 Redox útvonalak az endoplazmás retikulumban ......................................38 2.2.2.2.2 A dehidroaszkorbinsav szerepe az ER oxidatív foldingban ..................... 39 2.2.3

A dehidroaszkorbinsav mitokondriális importja ............................................... 41 3

2.2.3.1 A C-vitamin transzportja .............................................................................. 41 2.2.3.2 Mitokondriális dehidroaszkorbinsav transzport ............................................ 43 2.2.3.3 A dehidroaszkorbinsav sorsa a mitokondriumban......................................... 45 3

Célkitűzések .................................................................................................................. 47

4

Anyagok és módszerek .................................................................................................. 49 4.1

Anyagok ................................................................................................................. 49

4.2

Módszerek .............................................................................................................. 49

4.2.1

Sejtfenntartás................................................................................................... 49

4.2.2

ρ0-sejtvonalak létrehozása és fenntartása ......................................................... 50

4.2.3

A mitokondriális respirációs komplexek inhibeálása ........................................ 50

4.2.4 A mitokondriális oxidatív folding enzimek expressziójának meghatározása Western blot technikával ............................................................................................... 51 4.2.5

Az ALR mRNS szintjének meghatározása RTqPCR analízissel ....................... 51

4.2.6

C-vitamin transzporterek mitokondriális lokalizációjának in silico vizsgálata .. 52

4.2.7 mtDNS-deficiens HepG2 sejtek dehidroaszkorbinsav-felhasználásának meghatározása ............................................................................................................... 52 4.2.8

C-vitamin meghatározási módszerekhez szükséges oldatok készítése .............. 53

4.2.9 Növényi minták preparálása C-vitamin meghatározási módszerek teszteléséhez .................................................................................................................. 54 4.2.10

α,α’-dipiridiles módszer C-vitamin meghatározására ....................................... 54

4.2.11 Aszkorbinsav-oxidáz enzimes módszer C-vitamin meghatározására (OPDA, OPDA-fluori) ................................................................................................................ 55 4.2.12 5

HPLC (referencia) módszer C-vitamin meghatározására .................................. 55

Eredmények .................................................................................................................. 56 5.1

ρ0-sejtvonalak létrehozása....................................................................................... 56

5.2 A mitokondriális DNS depléciójának hatása az ALR fehérje expressziójára humán eredetű sejtvonalakban ......................................................................................................57 5.3

Különböző respirációs inhibitorok hatása az ALR fehérje expressziójára ................ 58

5.4

C-vitamin transzporterek mitokondriális lokalizációja in silico vizsgálatok alapján 59

5.5

mtDNS-deficiens HepG2 sejtek dehidroaszkorbinsav-felvétele............................... 67

5.6 C-vitamin meghatározási módszerek analitikai teljesítményjelzőinek összehasonlítása ................................................................................................................ 68 5.6.1

Linearitás ........................................................................................................ 68

5.6.2

Pontosság ........................................................................................................ 69

5.6.3

Precizitás ......................................................................................................... 70 4

6

5.6.4

Kimutatási határ (LoD) és meghatározási határ (LoQ) ..................................... 71

5.6.5

Különböző gyümölcs és zöldség minták C-vitamintartalmának meghatározása 71

5.6.6

A vizsgált módszerek áteresztőképessége ........................................................ 73

Diszkusszió ................................................................................................................... 74 6.1

A mitokondriális DNS depléció hatása az ALR fehérje expressziójára .................... 74

6.2

C-vitamin transzporterek mitokondriális lokalizációja, in silico vizsgálatok alapján76

6.3

A mtDNS-depléció hatása a sejtek dehidroaszkorbinsav-felvételére........................ 81

6.4

C-vitamin meghatározási módszerek alkalmazhatóságának jellemzése ................... 82

7

Összefoglalás ................................................................................................................ 85

8

Tézisek .......................................................................................................................... 88

9

Publikációs lista ............................................................................................................ 89

Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................. 90 Irodalomjegyzék ................................................................................................................... 91

5

Rövidítésjegyzék AA A/A Aβ ACTB AD ADP ALR AMS ALS AP1 αSyn ATP CcO CCS CJD CYP450 CoA COX II CPT2 DHA DIC DMEM DNP DNS DsbA DsbB DTT E. coli EDTA EGF EGFP EGFR EMEM ER ERK1/2 Ero1 Erv1 Erv2 ETF EtOH

aminosav antibiotikum/antimikotikum oldat amiloid-Beta Beta-aktin Alzheimer betegség adenozin-difoszfát augmenter of liver regeneration (a mitokondriális intermembrán tér diszulfidgeneráló enzime) 4′-acetamido-4′-maleimidilsztilbén-2,2′-diszulfonsav amiotrófiás laterálszklerózis aktivátor fehérje 1 α-szinuklein adenozin-trifoszfát citokróm c-oxidáz copper chaperone for SOD1 (a szuperoxid dizmutáz 1 dajkafehérjéje) Creutzfeldt-Jakob betegség citokróm P450 koenzim-A citokróm c-oxidáz II. alegység carnitine o-palmitoyltransferase 2 (mitokondriális karnitin opalmitoiltranszferáz 2) dehidroaszkorbinsav dicarboxylate carrier (mitokondriális dikarbonsav hordozó fehérje) Dulbecco's modified eagle medium (tápoldat) 2,4-dinitrofenol dezoxiribonukleinsav disulfide bond A (bakteriális periplazma diszulfidhordozó fehérjéje) disulfide bond B (bakteriális periplazma diszulfidgeneráló enzime) ditiotreitol Escherichia coli (mikroorganizmus) etilén-diamin-tetraacetát epidermal growth factor (epidermális növekedési faktor) gerjesztett zölden fluoreszkáló fehérje epidermal growth factor receptor (epidermális növekedési faktor receptor) Eagle's minimum essential medium (tápoldat) endoplazmás retikulum extracellular signal-regulated kinase 1/2 (extracelluláris jel-vezérelt kináz) endoplasmic reticulum oxidoreductin 1 (az endoplazmás retikulum diszulfidgeneráló enzime) essential for respiration and vegetative growth 1 (a mitokondriális intermembrán tér diszulfidgeneráló enzime) essential for respiration and vegetative growth 2 (az endoplazmás retikulum diszulfidgeneráló enzime) elektron-transzfer flavoprotein etil-alkohol 6

FAD FADH2 FBS FMN GFER GFP GLO GLUT (1-14) GSH GSSG HD HGF HIF-α/β/1α HPLC HRP HSS HTT IL-1/6 IM IMP IMS JAB1 k-NN LPS M mAb MAPK MIA MIA40 MPC2 MPCP MPP mRNS mtDNS NAD+ NADP+ NADH NADPH nDNS NEAA NF-κB NK NRF-1

flavin-adenin-dinukleotid redukált flavin-adenin-dinukleotid fötális szarvasmarha szérum flavin-mononukleotid growth factor Erv1-like (Erv1/ALR homológ) zölden fluoreszkáló fehérje gulono-1,4-lakton-oxidáz glükóz transzporter 1-14 redukált glutation glutation-diszulfid Huntington betegség hepatocyte growth factor (májsejt növekedési faktor) hipoxia-indukált transzkripciós faktor-α/β/1α nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia torma-peroxidáz enzim hepatocyte stimulator substance (májregenerációt stimulálni képes fehérje frakció) huntingtin fehérje interleukin-1/6 (mitokondriális) belső membrán inner membrane peptidase (a mitokondriális belső membrán peptidázai) (mitokondriális) intermembrán tér Jun-activating domain-binding protein 1 (Jun-aktivált domén-kötő fehérje) k-nearest-neighbors (k-legközelebbi szomszéd predikciós algoritmus) lipopoliszacharid (mitokondriális) mátrix monoklonális antitest mitogen-activated protein kinase (mitogén-aktivált fehérje kináz) mitochondrial intermembrane space assembly machinery (a mitokondriális intermembrán tér diszulfidközvetítő rendszere) mitochondrial import and assembly 40 (a mitokondriális intermembrán tér diszulfidhordozó fehérjéje) mitochondrial pyruvate carrier 2 (mitokondriális piroszőlősav hordozó fehérje) mitochondrial phosphate carrier protein (mitokondriális foszfát hordozó fehérje) matrix mitochondrial peptidase (mitokondriális mátrixban lokalizálódó endopeptidáz) hírvivő ribonukleinsav mitokondriális dezoxiribonukleinsav oxidált nikotinsav-adenin-dinukleotid oxidált nikotinsav-adenin-dinukleotid foszfát redukált nikotinsav-adenin-dinukleotid redukált nikotinsav-adenin-dinukleotid foszfát nukleáris (sejtmagi) dezoxiribonukleinsav nem-esszenciális aminosavak nuclear factor-κB (transzkripciós faktor) természetes ölősejtek nuclear respiratory factor (transzkripciós faktor) 7

ODDD OM OPDA OXPHOS PCR PD PDI PrP PrPc PrPsc rhALR RNS ROS RTqPCR SAM SOD1 SVCT (1/2) SVM TBS TFAM TGF-α TIM (22/23) Tim (8/9/10/12/13) TOM tRNS TTFA

oxigén-dependens degradációs domén (mitokondriális) külső membrán orto-fenilén-diamin oxidatív foszforiláció polimeráz láncreakció Parkinson betegség protein diszulfid izomeráz prion fehérje celluláris prion fehérje prion fehérje „scrapie” (a prion fehérje surlókórban megjelenő változata) humán rekombináns augmenter of liver regeneration fehérje ribonukleinsav reaktív oxigén vegyületek reverz transzkripcióval kombinált kvantitatív polimeráz láncreakció sorting and assembly machinery (a fehérjék mitokondriális külső membránba történő inzercióját szabályozó komplex) szuperoxid-dizmutáz 1 nátrium-dependens C-vitamin transzporter 1/2 support vector machine (tartóvektor-gép predikciós algoritmus) trisz-puffer (NaCl tartalmú) mitochondrial transcription factor A (mitokondriális transzkripciós faktor) transforming growth factor-alpha (transzformálódó növekedési faktor) translocase of the inner membrane (a mitokondriális belső membrán transzlokázai) a mitokondriális intermembrán tér szolubilis chaperonjai translocase of the outer membrane (a mitokondriális külső membrán transzlokáza) transzfer ribonukleinsav teonil-trifluoro-aceton

8

1 Bevezetés A fehérjék biológiai aktivitását háromdimenziós (3D) szerkezetük határozza meg, amelyet alapvetően az aminosav sorrendjük definiál. A natív szerkezetet tovább stabilizálhatják a fehérjék cisztein egységei között oxidáció hatására kialakuló diszulfidhidak. Sokáig úgy tűnt, hogy a stabil diszulfidkötések enzim-mediált kialakítása csak a prokarióták periplazmás terében és az eukarióták endoplazmás retikulumának lumenében lehetséges. A közelmúltban azonban világossá vált, hogy a mitokondriumok intermembrán terében is lejátszódnak fehérjeoxidáló folyamatok. Fehérjealapú készítmények biotechnológiai gyártásánál a megfelelő, magas hozam elérése érdekében gyakran rekombináns technikát alkalmaznak. Ha viszont egy sejtes rendszerben (legyen az prokarióta, vagy eukarióta) túltermeltetik az adott rekombináns gént, a sejtek folding kapacitása túlterheltté válhat, ami biológiailag inaktív, helytelenül feltekeredett fehérjék keletkezésében, illetve aggregálódásában nyilvánul meg. Diszulfidkötésekben gazdag fehérjék esetében még nagyobb a hibás hajtogatás valószínűsége, hiszen a termelésben elterjedten alkalmazott prokarióta organizmusok redukáló jellegű citoplazmája nem kedvez a diszulfidhidak kialakulásának. A fehérjék hibás hajtogatódása a humán szervezetben is súlyos következményekkel jár. Az Alzheimer, Parkinson, Huntington és Creutzfeld Jacob betegség, a kettes típusú diabétesz, az amiotrófiás laterálszklerózis és egy sor szisztémás amiloidózis esetében kivétel nélkül, helytelenül feltekeredett fehérjékből képződött aggregátumok szaporodnak fel az érintett szövetekben. A hibás fehérje folding speciális esetekben mitokondriális rendellenességekre vezethető vissza. Már viszonylag régóta ismert, hogy a mitokondriális DNS mutációk leginkább

az

idegrendszert

érintő

nagyon

súlyos,

akár

fatális

tünetekkel

is

manifesztálódhatnak. Tekintve, hogy a mitokondriális elektrontranszport lánc az oxidatív fehérjefolding végső elektron akceptora is, felmerült annak lehetősége, hogy a mitokondriális DNS károsodása során a fehérjék foldingja is sérül, ez pedig hibás struktúrák felhalmozódásával tovább súlyosbíthatja a helyzetet. Látható, hogy a hibás fehérjestruktúrák kialakulása mind a biotechnológiát, mind az orvostudományt komoly kihívások elé állítja. A fehérjefolding összetett folyamatának minél részletesebb megismerése emiatt kiemelkedő jelentőséggel bír. Kísérleteink során elsődlegesen a mitokondriális DNS károsodásának oxidatív foldingra gyakorolt hatását vizsgáltuk. Ehhez modellként mesterségesen mitokondriális DNS 9

fosztott, úgynevezett ρ0-sejtvonalakat használtunk. Emellett azt is vizsgáltuk, hogy az endoplazmás retikulum esetében sikerrel alkalmazott dehidroaszkorbinsav képes lehet-e elektron akceptorként bekapcsolódni a mitokondriális oxidatív folding folyamatába. Dolgozatom irodalmi áttekintésében igyekszem részletes képet adni a fehérje foldinggal kapcsolatban ez idáig feltárt ismereteinkről, különös tekintettel a mitokondriális oxidatív foldingra. Emellett a dehidroaszkorbinsav említett folyamatban feltételezett részvételének irodalmi hátterét is részletezem, mely magában foglalja a C-vitamin transzportmechanizmusainak bemutatását is.

10

2 Irodalmi áttekintés 2.1 A mitokondriális oxidatív fehérje folding és az ALR fehérje 2.1.1 A fehérje folding jelentősége A fehérje molekulák a szerkezet és funkció közötti szoros kapcsolat molekuláris szintű megtestesítői, melyek számos biokémiai folyamatban játszanak szerepet. A fehérjék biológiai aktivitását háromdimenziós (3D) szerkezetük határozza meg, amelyet alapvetően aminosav sorrendjük definiál. A fehérjelánc különböző egységei közötti másodlagos kölcsönhatások (hidrogén kötések, van der

Waals-erők, elektrosztatikus kölcsönhatások, hidrofób

kölcsönhatások), valamint a molekula gerinc szögpreferenciái mind a natív 3D struktúra kialakulásának kedveznek

[1]. A fehérjék feltekeredése metastabil köztes állapotokon

keresztül valósul meg; először az egyes részek egymástól függetlenül feltekerednek majd azok tovább rendeződnek, hogy végül elérjék a molekulára jellemző energia minimumot. Speciális dajkafehérjék (chaperonok) segítik a fehérjéket a rájuk jellemző térszerkezet felvételében és a hibásan kialakult, vagy meghibásodott szerkezetek kijavításában. A javítás során a dajkafehérjék kilazítják a hibás fehérje struktúrát, és új lehetőséget biztosítanak a fehérje helyes feltekeredésére [2]. Kezdetben azt feltételezték, hogy a fehérjék specifikus folding-útvonalakon keresztül érik el natív struktúrájukat, azonban világossá vált, hogy több különböző hajtogatatlan formából is képesek a korrekt konformációba rendeződni. Ennek fényében a foldingmechanizmust legjobban egy tölcsérszerű energia-térképpel tudjuk jellemezni (1. ábra), melynek

felülete

a

molekula

szabadenergiáját

szemlélteti.

A

termodinamikailag

legkedvezőbb, natív struktúra a tölcsér alján helyezkedik el, míg a különböző átmeneti állapotok magasabb szabadenergiát képviselnek. A folding-tölcsér több lokális minimumot is tartalmaz, melyek közül néhány viszonylag stabil, natív jellegű struktúrát (molten globule) reprezentál, míg mások csapdaként viselkednek, és gátolják a fehérjét a natív állapot elérésében [3].

11

1. ábra: A fehérje folding teoretikus energiatérképe [3]

A transzláció során szintetizált fehérjeláncok jelentős része további reakciók tárgya lesz, hogy elnyerje biológiailag aktív formáját. Ezeket a reakciókat összefoglaló néven poszttranszlációs módosulásoknak (PTM) nevezzük. Az alapvetően enzimmediált folyamatok között szerepelnek amino- és karboxi-terminálist érintő módosulások (pl. láncvégek hasítása), a szignálszekvenciák lehasítása, egyéni aminosavat érintő módosulások (pl. foszforiláció, karboxiláció, metiláció), szénhidrát oldalláncok csatolása (pl. glikoziláció), izoprenilcsoportok addíciója (pl. G-fehérjénél), prosztetikus csoportok addíciója (pl. hem csoport a hemoglobinban), proteolitikus hasítás (pl. proinzulin  inzulin) és a diszulfidkötések kialakulása (intra- és intermolekuláris) [4]. A fehérje készletet érintő poszttranszlációs módosulások így a genomnál legalább két nagyságrenddel változatosabb proteomot eredményeznek [5]. Tekintve, hogy a folding alapjaiban képes befolyásolni a fehérje molekula háromdimenziós struktúráját és azon keresztül biológiai aktivitását is, a folyamat vizsgálata kiemelkedő jelentőséggel bír. Azon túl, hogy hozzájárul a fehérjék érésének alaposabb megismeréséhez, a folding tanulmányozásának számos gyakorlati hozadéka is van. Egyes fehérjealapú készítmények biotechnológiai úton történő előállításánál rengeteg probléma adódhat a hibásan kialakult molekulaszerkezetből, hiszen az akár a hatóanyag teljes funkcióvesztését is okozhatja. Éppen ezért olyan módszereket kell kidolgozni, melyek a gyártási folyamat során a helyes struktúra kialakulásának kedveznek. A

fehérjék

hibás

feltekeredése

központi

szerepet

játszik

egyes

(főként

neurodegeneratív) betegségek patogenezisében. Ezek közé sorolhatjuk az Alzheimer, Parkinson, Huntington és Creutzfeld Jacob betegséget, a kettes típusú diabéteszt, az

12

amiotrófiás laterálszklerózist és egy sor szisztémás amiloidózist. Ezek közös jellemzője, hogy egy normálisan oldható és funkcióképes fehérje egy oldhatatlan, patogén struktúrává alakul át, mely

aztán

a

különböző

szervekben,

szövetekben

felhalmozódva

zárványszerű

aggregátumokat képez [6]. A felsorolt betegségek nagy részének kialakulási valószínűsége az életkor előrehaladtával egyre növekszik, így komoly egészségügyi és ezzel együtt gazdasági terheket rónak a fejlettebb országok jellemzően elöregedő társadalmára. 2.1.1.1 Folding-probléma a biotechnológiában Az elmúlt évtizedekben az antitestek a terápia, a diagnosztika és a kutatások fontos eszközeivé váltak, napjainkban már főszerepet játszanak a biológiai analitok detektálásában. Ennek fényében nem meglepő, hogy a manipulált antitestek a klinikai tesztelés alá vont biológiai hatóanyagok mintegy 30 %-át teszik ki [7]. A monoklonális antitestek (mAb) gyógyászati

alkalmazása

forradalmasította

a

betegségek

kezelését.

A

daganatos

megbetegedésektől az autoimmun betegségek kezeléséig az elmúlt két évtizedben antitestterápiával érték el a legkiemelkedőbb klinikai eredményeket. A siker hátterében a mAb-ok eredendően alacsony toxicitása és egyedi hatásmechanizmusa áll. Ez a két tulajdonság lehetővé teszi, hogy a hagyományos radio- és kemoterápiákkal kombinálva rövid időn belül bevezessék alkalmazásukat a klinikai gyakorlatba, ugyanakkor elkerüljék a klasszikus kismolekulás hatóanyagoknál tipikusan előforduló gyógyszer-rezisztenciát [8]. A mAb-ok és más fehérjealapú készítmények előállítása azonban új kihívásokat hozott a gyógyszeripar számára. A biotechnológiai alapú gyógyszergyártás egyik fő célja, hogy a lehető legnagyobb hozammal állítsák elő a helyesen hajtogatott, aktív fehérjéket. A legtöbb fehérje esetében lehetetlen megfelelő

mennyiségeket

izolálni az eredeti termelő

organizmusból (gondoljunk csak a humán inzulinra). Sok esetben csak rekombináns termeléssel érhető el a megfelelő hozam. Ebben az esetben a fehérjét kódoló genetikai információt olyan gazda-organizmusba viszik át, melyet kifejezetten nagyléptékű termelésre fejlesztettek ki. Ezek lehetnek növényi vagy emlős eredetű sejtvonalak, illetve rovar, élesztő vagy baktérium sejtek is [9]. Eukarióta rendszereket akkor alkalmaznak, ha a rekombináns fehérje valamilyen poszttranszlációs módosítása (pl. glikoziláció) szükséges. Egyéb esetekben előszeretettel használnak bakteriális rendszereket (pl. E. coli-t), melyek nagy előnye, hogy genetikai módosításuk viszonylag egyszerű, a fehérjét nagy mennyiségben és gyorsan termelik, a fermentáció pedig általában költséghatékony [9, 10]. 13

Az élő sejtek meghatározott szabályozható chaperon készlettel rendelkeznek annak érdekében, hogy elkerüljék a nem produktív folding reakciókat, és növeljék a helyesen hajtogatott natív fehérjék hozamát. Viszont abban az esetben, ha egy mesterségesen létrehozott sejtes rendszerben túltermeltetik az adott rekombináns gént, nagy valószínűséggel fordul elő hibás folding, mely sok esetben fehérje-aggregációhoz vezet. Ilyenkor a sejtek folding kapacitása túlterhelt lesz, ami biológiailag inaktív, helytelenül feltekeredett fehérjék keletkezésében nyilvánul meg. A hajtogatatlan, vagy hibásan hajtogatott fehérjék sorsa kétféle lehet: degradálódnak a sejt proteolitikus gépezetének közreműködésével, vagy biológiailag inaktív, nagyméretű aggregátumok, úgynevezett zárványtestek (inclusion bodies) keletkeznek belőlük [9, 11]. A fehérjék túltermeléséből származó folding-problémák kezelésére különböző stratégiák terjedtek el. Megoldást jelenthet egyes chaperonok célfehérjével együtt történő szimultán túltermelése, vagy molekuláris chaperon keverékek adagolása a tisztítási procedúra során, vagy az után (pl. a zárványtestek in vitro reszolubilizációja céljából) [9]. A diszulfidban gazdag fehérjék prokarióta rendszerben történő termeltetésénél problémát jelent, hogy a redukáló jellegű bakteriális citoszólban a diszulfidkötések képzése gátolt, így ezek a fehérjék nagyobb valószínűséggel aggregálódnak a sejtekben [12]. Ennek kivédésére létrehoztak már olyan mutáns E. coli törzseket, melyek csökkent tioredoxinreduktáz aktivitással rendelkeznek, így mérsékelve a citoszól reduktivitását [13]. Alternatív megoldást jelenthet még a fehérjék termelésének áthelyezése az oxidatív környezetet biztosító periplazmás térbe [14]. Mivel a feldolgozás során a fehérjeláncok szabad tiol-csoportjai spontán módon, véletlenszerűen képesek egymással diszulfidkötéseket kialakítani, speciális redox-pufferekkel gondoskodnak arról, hogy a fehérjék lehetőleg a natív szerkezetükbe rendeződjenek. A puffer általában egy tiol-reagens oxidált és redukált formájának keverékét tartalmazza, a fő reakcióiránynak megfelelő oxidáló túlsúllyal. A legszélesebb körben alkalmazott

tiol

reagensek

a

redukált

és

oxidált

glutation

(GSH/GSSG),

a

ditiotreitol/glutation-diszulfid (DTT/GSSG), a cisztein/cisztin és a ciszteamin/cisztamin páros [12]. Az ezekkel a rendszerekkel megvalósított dinamikus kötésfelbomlás-újrakötés folyamat az energiaminimumot képviselő molekulaszerkezet kialakulását segíti elő. 2.1.1.2 Folding-probléma humán betegségekben A fehérje foldingot érintő kutatások már jóval a folding-betegségek felfedezése előtt elkezdődtek. 1972 előtt még azt feltételezték, hogy a fertőző betegségek csak DNS és RNS 14

útján, vírusok és baktériumok közvetítésével képesek terjedni egyik egyedről a másikra. Később a Creutzfeldt-Jakob betegség (CJD) tanulmányozása vezetett el egy addig ismeretlen betegség-mechanizmus felismeréséhez, mely végső soron a fehérjék hibás hajtogatódására (misfolding) vezethető vissza [1, 15]. A CJD-t a juhoknál előforduló súrlókórhoz, vagy a szarvasmarhákat érintő kergemarhakórhoz hasonlóan fehérjetermészetű, nukleinsav-mentes fertőző ágensek, úgynevezett prionok okozzák. A prionok képesek a gazdaszervezet fehérjéit magukhoz hasonlóan hibás térszerkezetűvé tenni, ezáltal újabb prionokat hoznak létre. A prion

betegségek

eredhetnek

genetikailag

öröklődő,

fertőzéses

vagy

szórványos

rendellenességekből, de minden esetben a prion fehérje konformációs változásával járnak együtt. Az egyelőre ismeretlen funkciót betöltő celluláris PrP c fehérje átalakul a patológiás PrPsc formába azáltal, hogy a natív szerkezet α-hélixei β-szálakká rendeződnek át [15]. Az így létrejött struktúrák proteáz-rezisztens aggregátumokat képeznek, melyek feldúsulása szivacsos agyvelőgyulladáshoz vezet [16]. A felfedezés, hogy rendellenes fehérjekonformációk képesek önmaguk propagálására, rávilágított a fehérje folding jelentőségére egyes betegségek patomechanizmusában [11]. A prion betegségekhez hasonló folding rendellenességek megfigyelhetők az Alzheimer (AD), Parkinson (PD) és Huntington betegségben (HD), valamint az amiotrófiás laterálszklerózisban (ALS) is [6]. A vizsgálatok kezdeti fázisában azt figyelték meg, hogy az érintett szövetek jóddal jól festhetők. Ebből azt a téves következtetést vonták le, hogy a vizsgált mintákban megfigyelt aggregátumok keményítőben gazdagok, ezért azóta általánosan amiloid (keményítő-szerű) képleteknek nevezzük őket [17]. Az amiloid képletek valójában fehérje molekulákból épülnek fel, melyek rendezett β-redő struktúrákban gazdag, fibrózus aggregátumokat képeznek. Ahogy a CJD-ben a PrP fehérje, úgy a többi folding betegségben is egy vagy több specifikus, hibásan feltekeredett fehérje feldúsulása figyelhető meg, ezek pedig a következők: amiloid-β (Aβ) és a tau fehérje az AD-ben, a huntingtin mutáns formái (mHTT) a HD-ben, az α-szinuklein (αSyn) a PD-ben, és a szuperoxid-dizmutáz (SOD1) az ALS-ben [16, 18]. Az amiloid képzés képessége nem korlátozódik a fehérjék vagy peptidek kisebb csoportjaira, potenciálisan bármely fehérje felveheti ezt a szerkezeti állapotot. A különböző fehérjék amiloid átrendeződésre való hajlama azonban jelentősen eltérhet egymástól, azt alapvetően a natív szerkezetük termodinamikai stabilitása és a részlegesen hajtogatott intermediereik kinetikai hozzáférhetősége határozza meg [6, 19]. Az amiloid struktúrák kialakulása minden esetben hasonló kulcslépéseket követ. Legelőször egy önmagával kapcsolódni hajlamos struktúra keletkezik. Ez létrejöhet például hidrofób reakciópartnerek 15

jelenlétében, melyek képesek részlegesen széthajtogatni a globuláris fehérjék foldingintermediereit [20]. A következő lépésben az aggregációra hajlamos egységek oligomer struktúrákba rendeződnek, melyekből aztán létrejönnek a magasan szervezett, érett fibrillumok. A rostszálak kialakulása bonyolult, többlépéses folyamat, mely magába foglalja az elsődleges gócképződést, a konformációs átrendeződést, az aggregátum növekedést, fragmentációt, és a másodlagos gócképződést is [19]. A folding betegségek általában neurodegeneratív tünetekkel manifesztálódnak, így komoly hatást gyakorolnak a páciensek életminőségére. Hatással lehetnek az elvont gondolkodásra, a mozgásra, az érzelmekre, a memóriára, a kognitív és egyéb képességekre [21]. 2.1.2 Az oxidatív fehérje folding általános sémája A fehérjék oxidatív módosítások által bekövetkező poszttranszlációs hajtogatódását oxidatív foldingnak nevezzük. Bár többféle oxidatív módosítás lehet hatással a foldingra, az oxidatív folding kifejezés használata hagyományosan a diszulfid hidak kialakítására korlátozódik [22]. A cisztein egységek közötti diszulfidkötések ugyanis jelentős mértékben hozzájárulnak a fehérjék termodinamikailag stabil szerkezetének kialakításához [23]. A kötések csökkentik a hajtogatatlan állapot entrópiáját, és a natív állapotot stabilizáló kölcsönhatásokat eredményeznek [24]. Ez a hatás az exportra kerülő, vagy szekretált fehérjék esetében kimagasló jelentőséggel bír, hiszen segít fenntartani azok natív struktúráját az intracelluláristól lényegesen eltérő, általában oxidáló jellegű extracelluláris környezetben is [4]. Sokáig úgy tűnt, hogy a stabil diszulfid hidak enzim-mediált kialakítása csak a prokarióták periplazmás terében és az eukarióták endoplazmás retikulumának (ER) lumenében lehetséges. A közelmúltban azonban kiderült, hogy a mitokondriumok intermembrán terében (IMS) is lejátszódnak fehérjeoxidáló folyamatok (2. ábra) [22]. A diszulfid hidak kialakításának sémája nagy hasonlóságot mutat a különböző kompartmentekben. A fehérjék szintézise mindig olyan kompartmentben történik, ahol a redukáló miliő redukált formában tartja a ciszteinek tiol-csoportjait. Ezután a transzlálódott fehérjék egy membránon áthaladva jutnak az oxidatív folding helyszínére (oxidáló körülmények) (2. ábra) [25].

16

A diszulfidkötések létrejöttének legfontosabb kémiai reakciója a tiol-diszulfid cserereakció [25]: 𝑅1 𝑆 − + 𝑅2 𝑆𝑆𝑅3 → 𝑅2 𝑆 − + 𝑅1 𝑆𝑆𝑅3 A reakció lényege, hogy az 𝑅1 𝑆 − tiolát anion kiszorít egy kénatomot az 𝑅2 𝑆𝑆𝑅3 molekula diszulfidkötéséből [26]. Ennek feltétele, hogy a tiolát anion olyan szoros kapcsolatba

kerüljön

delokalizálódhasson.

a A

diszulfidkötéssel, fehérje

diszulfidok

hogy

töltése

kialakulásához

a két

három

kénatomon

ilyen tiol-diszulfid

cserereakcióra van szükség egy megfelelő redox partnerrel. Az első reakcióban egy kevert diszulfid jön létre a fehérje és a redox reagens között, majd ezzel reagál a fehérje újabb tiol csoportja.

Ennek

következtében

felbomlik

az

intermolekuláris

keresztkötés,

és

intramolekuláris diszulfidkötés keletkezik [24]. Az oxidatív folding folyamatában a szubsztrátfehérjét rendszerint valamilyen oxidoreduktáz aktivitású enzim oxidálja, mely tulajdonképpen annyit tesz, hogy az elsődlegesen szulfhidril-oxidáz enzimek által létrehozott diszulfidokat átadja a célfehérjének. Mindehhez az oxidáló erőt általában az oxigén biztosítja [25]. Más megközelítésben a folyamatot úgy is értelmezhetjük, hogy az oxidoreduktáz diszulfidot ad át a szubsztrátfehérjének, és a redukált oxidoreduktázról az elektronokat oxidáz enzimek szállítják a végső elektron akceptornak, mely a legtöbb esetben a molekuláris oxigén (2. ábra) [22]. A különböző kompartmentek oxidatív folding rendszereit a 3. ábra foglalja össze. A baktériumok esetében a periplazmában esnek át a fehérjék az oxidatív foldingon érésük során, melyet a DsbA (Disulfide bond A) enzim katalizál. A redukált DsbA-t a DsbB (Disulfide bond B) oxidálja vissza, mely az elektronokat aerob esetben az ubiquinon és citokróm-oxidázok közvetítésével a légzési oxigén felé továbbítja, anaerob esetben pedig a menaquinon és különböző reduktáz enzimek közvetítésével anaerob elektron akceptoroknak (pl. fumársav, nitrátok) adja át. Az endoplazmás retikulumban különböző szekréciós és membránfehérjék oxidatív hajtogatódása megy végbe. Ebben az esetben a PDI (Protein Diszulfid Izomeráz) oxidálja a szubsztrátfehérjéket, a folyamatból származó elektronokat pedig az Ero1 (Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1) vagy az Erv2 (Essential for respiration and vegetative growth 2) enzim továbbítja a légzési oxigén vagy egyéb alternatív elektron akceptor felé. Az ER oxidatív folding folyamatának bővebb ismertetése a 2.2.2.2 fejezetben található. A mitokondriális intermembrán térbe importált fehérjék szerkezetében a MIA40 (Mitochondrial import and Assembly 40) alakítja ki a diszulfid hidakat. A MIA40 reoxidációjáért az ALR (Augmenter of Liver Regeneration), vagy élesztő homológja, az Erv1 (Essential for respiration and vegetative growth 1) felel, mely fehérjék az elektronokat a 17

citokróm c közvetítésével képesek a légzési elektrontranszport láncra továbbítani [27]. A mitokondriális oxidatív folding folyamat a 2.1.5 fejezetben részletes ismertetésre kerül.

2. ábra: Oxidatív fehérje folding [25]. A, Az in vivo fehérje szintézis és folding folyamatok környezete. B, Az oxidatív fehérje folding helyszínei baktériumokban és eukarióta sejtekben. C, Az in vivo oxidatív fehérje folding általános sémája

3. ábra: Szubcelluláris kompartmentek folding apparátusa [27]

18

2.1.3 A mitokondriumok jelentősége A mitokondrium minden magvas sejtben megtalálható organellum, mely magában foglalja a légzési elektrontranszport lánc tagjait (KOMPLEX I-IV) és az ATP-szintáz enzimkomplexet (komplex V), ezáltal az oxidatív foszforilációval (OXPHOS) keletkező ATP (adenozin-trifoszfát) fő előállítója [28]. Ezen kívül a redox állapot szabályozásával, hőtermeléssel, és szekunder hírvivő molekulák előállításával is hozzájárul az eukarióta sejtek homeosztázisának fenntartásához [29]. 2.1.3.1 A mitokondriumok eredete és morfológiája A mitokondriumok olyan autonóm, primitív baktérium-szerű organizmusoktól eredeztethetők, melyek képesek voltak sikeres endoszimbiotikus kapcsolat kialakítására eukarióta sejtekkel. Mivel a mitokondriumok OXPHOS rendszerük által nagy kapacitással képesek ATP szintézisre, az intracelluláris energia fő forrásává váltak. Az eukarióta sejtek normális működéséhez nélkülözhetetlen a mitokondriumok tevékenysége. Ez a kapcsolat azonban kölcsönös: a mitokondrium különféle fehérjéket importál a citoszólból, melyek feltétlenül szükségesek specifikus funkcióinak betöltéséhez [30]. Az ősi endoszimbionta fehérjetartalma jelentősen megváltozott az évmilliók alatt, míg a ma ismert, modern mitokondriummá alakult át. Egyes bakteriális útvonalak teljesen elvesztek, miközben a mitokondrium számos eukarióta eredetű komplexszel gazdagodott, mint például az ATP/ADP transzlokáz, és a citoplazma felől történő fehérje importban résztvevő fehérjék többsége [31]. A mitokondriumok morfológiája egyszerre komplex, és plasztikus. Méretük és formájuk dinamikus, gyakran változik, miközben nagy távolságokat tesznek meg a citoszkeletális traktus mentén. Alakjuk általában megnyúlt tubulusra hasonlít. A mitokondriumok eloszlását, és morfológiáját kifinomult mechanizmusok irányítják, így segítik a sejt alkalmazkodását a változó intracelluláris igényekhez, és külső körülményekhez [32]. A mitokondriális mátrixot két lipid membrán választja el a citoszóltól. A belső membrán tartalmazza a légzési elektrontranszport lánc komplexeit. Ez a membrán az ionos diffúzió hatékony gátja, tehát rendkívül fontos faktor az ATP szintéziséhez szükséges proton gradiens kialakításában. A belső membrán által határolt mitokondriális mátrix tartalmazza többek között a citromsavciklus és a β-oxidáció folyamataiban részt vevő enzimeket, melyek nélkülözhetetlenek a szénhidrátok és zsírok hasznosításához. A belső membránnal ellentétben a külső membrán pórusain (ún. porinok) keresztül lehetővé teszi a kis molekulatömegű anyagok passzív diffúzióját a citoszól és az intermembrán tér között [30]. 19

2.1.3.2 Az oxidatív foszforiláció folyamata a mitokondriumban A mitokondrium egyik legfontosabb feladata az oxidatív foszforilációval történő ATP szintézis, melyben öt fehérjekomplex (összesen több mint 80 polipeptid) játszik szerepet. Ezek együtt alkotják a légzési elektrontranszport láncot (4. ábra). Négy komplex a mitokondriális belső membrán két oldala közötti proton gradiens kialakításáért felel [33]. A KOMPLEX I (NADH – Ubiquinon oxidoreduktáz) képes fogadni az egyes szubsztrátok mint glutamát, piruvát és β-hidroxi-butarát - lebontásából származó elektronokat, míg a szukcinát oxidációjával keletkező elektronok a KOMPLEX II-re adódnak át FADH2 koenzim közvetítésével. A zsírsav oxidációból származó elektronokat a heterodimer szerkezetű elektron-transzfer flavoprotein (ETF) a belső membrán mátrix felőli oldalán lokalizálódó ETF-dehidrogenáz enzim közvetítésével az ubiquinonnak adja át.

Ezután az ubiquinon

átszállítja az elektronokat a KOMPLEX III-ra (ubiquinol-citokróm c-reduktáz), ahol a citokróm c redukciója lehetővé teszi az elektronok transzportját a KOMPLEX IV-re (citokróm c-oxidáz), mely végül a légzési oxigén vízzé redukálására használja fel őket. Az elektronok végigáramlása a láncon energiát biztosít a KOMPLEX I, III és IV-en működő proton pumpák számára, melyek a mátrixból az intermembrán térbe transzportálják a hidrogén-ionokat (H+). A KOMPLEX V (F0F1 ATP-áz) a gradienst kihasználva képes ATP-t szintetizálni ADP (adenozin-difoszfát) és szervetlen foszfát felhasználásával, miközben a protonok rajta keresztül visszaáramolnak a mátrixba [30, 33].

4. ábra: A mitokondriális légzési elektrontranszport lánc felépítése [30]. A piros nyilak az elektronok áramlási irányát, a kék és zöld nyilak a sejtmagi ill. mitokondriális gének OXPHOS rendszer kódolásában betöltött szerepét jelölik. (Q = ubiquinon, C = citokróm c)

20

2.1.3.3 A mitokondriális DNS szerepe a sejtben A sejten belül - a növényi sejtek kloroplasztiszait leszámítva - egyedül a mitokondriumok tartalmaznak extra-kromoszómális DNS szálakat. A mitokondriális genom több kópiában jelenlévő cirkuláris dupla szálú (ds) DNS molekula (emberben 16,6 kilóbázis), mely kódolja az oxidatív foszforilációs (OXPHOS) rendszer 13 alapvető polipeptidjét, és az organellumban történő transzlációjukhoz szükséges RNS „gépezetet” (2 rRNS és 22 tRNS) (5. ábra). A mitokondriális DNS-nek (mtDNS) az OXPHOS rendszer kódolásában betöltött szerepét megfigyelhetjük a 4. ábrán. A légzési transzportlánc többi fehérje alegysége, valamint a mtDNS karbantartásáért felelős fehérjék a nukleáris DNS-en kódoltak, a citoplazma riboszómáin szintetizálódnak, és a 2.1.4. fejezetben részletezett, speciális mechanizmusokkal rendeződnek a rendeltetési helyükre az organellumon belül [28]. Történetileg a mitokondriumok diszkrét, nonkommunikatív egységeknek tekinthetők, gyakran bekövetkező fúziójuk és hasadásuk azonban lehetővé teszi a genetikai információcserét közöttük [28].

5. ábra: A mitokondriális genom [28]

2.1.3.3.1 mtDNS-mentes ρ0-sejtvonalak jelentősége, létrehozása A mtDNS-t érintő mutációk a sejtek biokémiai zavarainak széles spektrumát okozhatják, mely élő szervezetben akár szervek vagy egész szervrendszerek működésére is kihathat. Az efféle betegségek diagnózisa és kezelése nagy kihívást jelent az orvostudomány számára, mivel a tünetek progresszívan jelentkeznek, és súlyos károsodásokat, akár halált is okozhatnak. 21

A mtDNS defektusok okozta biokémiai zavarok tanulmányozására létrehozhatunk olyan sejtvonalakat, melyekből a teljes endogén mtDNS állomány hiányzik. Ezeket a sejtvonalakat ρ0-sejtvonalaknak nevezzük [34]. A ρ0-sejtvonalak létrehozásának „klasszikus” módja a sejtek hosszú távú, alacsony koncentrációjú etídium-bromidos kezelése. Az etídium-bromid egy fenantridin festék (3,8diamino-5-etil-6-fenilfenantridin bromid), mely preferáltan interkalálódik a kettős szálú DNS molekulák szálai közé [35]. A vegyület a mtDNS replikációjának hatékony inhibitora, a sejtmagi DNS sokszorozódását ugyanakkor nem gátolja [36–40]. Részlegesen tisztított enzimeken végzett kísérletekkel is igazolták, hogy az etídium-bromid a mitokondriális DNS polimeráz működését sokkal nagyobb mértékben gátolja, mint a sejtmagi DNS polimerázt [41]. Később Wiseman és Attardi kimutatták, hogy humán sejtvonalak esetében nagyon alacsony etídium-bromid koncentráció (20 ng/ml) is szinte teljes mértékben blokkolja a mtDNS szintézisét, és „n” osztódási ciklus elteltével a sejtek mtDNS állománya 1/2 nszeresére csökken [42]. Ugyanakkor emlős sejtekben a kezelés során az eredeti mtDNS készlet jól megtartott, sőt nagymértékben intakt marad [37]. Mindebből arra következtethetünk, hogy a megfelelően alacsony koncentrációban alkalmazott etídium-bromid a mtDNS replikáció hatékony inhibitora, jelenléte ugyanakkor nem okoz DNS károsodást. Kutatások

folynak

olyan

metódusok

kifejlesztésére,

melyek

segítségével

biztonságosan, az erősen karcinogén hatású etídium-bromid alkalmazása nélkül hozhatunk létre ρ0-sejtvonalakat. Egy ilyen alternatív megoldás lehet a mtDNS restrikciós endonukleázokkal történő eliminációja a sejtekből. Ehhez a sejteket olyan vektorral fertőzik, mely a génállományba viszi a mitokondriális cél-szekvenciával (nDNS-en kódolt, mitokondriumban lokalizálódó fehérjét kódoló génszakasz) fúzionált restrikciós enzim génjeit. Ezekről a génekről a beépített konstitutív promóter miatt a fúzionált fehérje folyamatosan átíródik, és a mitokondriumba szállítódik, ahol hasítja a DNS szálakat [43]. 2.1.3.3.2 A ρ0-sejtvonalak funkcionális és morfológiai eltérései A ρ0-sejtek a mtDNS teljes állományának hiánya miatt nem rendelkeznek működőképes légzési elektrontranszport lánccal, a mtDNS által kódolt fehérjék teljes hiánya figyelhető meg bennük [44]. Ebből kifolyólag a ρ0-ás sejtek az oxidatív foszforiláció révén nem képesek ATP-t előállítani, ehelyett azt a glikolízis fokozásával próbálják pótolni. Ennek eredményeképpen egyrészt megemelkedik glükóz fogyasztásuk, másrészt a redukált NADH 22

citoszólban történő felhalmozódása is megfigyelhető. A piruváttal kiegészített tápközegben tartott ρ0-sejtek azonban képesek regenerálni a felhalmozódott NADH mennyiséget, miközben laktát-dehidrogenáz enzim katalizálta folyamatban a piruvátot tejsavvá alakítják [45]. Az emelkedett glükóz igény, valamint a nagy mennyiségben termelődő tejsav jelenléte miatt a ρ0-ás sejtek tenyésztésénél a tápközeg gyakori frissítése szükséges. Felfedezték, hogy a respirációs (légzési) deficienciával rendelkező sejtek életben maradásához és proliferációjához a piruvát mellett külső pirimidin (uridin) forrás is szükséges. Ezzel bebizonyosodott, hogy a de novo pirimidin szintézis (6. ábra) feltétele a működő légzési elektrontranszport lánc [34]. Ennek hátterében az áll, hogy a dihidro-orotát dehidrogenáz flavoprotein, mely a mitokondriális belső membránba ágyazva a dihidroorotátot orotáttá konvertálja, a felszabaduló elektronokat közvetlenül a légzési láncba táplálja. Funkcióképes respirációs elektrontranszport lánc nélkül viszont a reakció nem tud végbemenni.

6. ábra: A de novo pirimidin szintézis menete [45]

A mtDNS hiánya nem befolyásolja a nDNS-en kódolt mitokondriális fehérjék expresszióját, importját és aktivitását a mitokonriumban. A működésképtelen légzési elektrontranszport

lánccal

rendelkező

mitokondriumok 23

továbbra

is

képesek

membránpotenciált generálni a glikolitikus ATP felhasználásával. A folyamat lényege, hogy az extramitokondriális ATP-4 intramitokondriális ADP-3-ra cserélődik az nDNS-en kódolt adenin nukleotid transzporter és az F1ATP-áz enzimek aktivitásának köszönhetően [44]. A mtDNS hiánya hatással van a sejtek morfológiájára is. A mitokondriumok ultrastruktúrájának karakteres megváltozását okozza a kriszták felbomlása. Ennek hatására alakul ki a mitokondriális vázak jellegzetes kiterjedt, „szellem-szerű” morfológiája. Ezen kívül az elégtelen β-oxidáció miatt a lipidek felhalmozódása figyelhető meg, mely kisebbnagyobb zsírcseppek megjelenését okozza a citoplazmában. A ρ0-sejtek citoplazmájában a mitokondriális vázak száma nem mutat változást az egészséges sejtekhez képest. Ez közvetlenül bizonyítja a mitokondriális biogenezis mtDNS-től való függetlenségét az osztódó sejtekben [44]. 2.1.4 Fehérjék mitokondriális importja A mitokondriumok eredetével kapcsolatban széles körben elfogadott endoszimbionta elméletnek megfelelően a mitokondriális gének nagy része a „gazdasejt” genomjába helyeződött át [46]. Ebből következik, hogy a 13 mtDNS-en kódolt elektrontranszport lánc fehérje kivételével a mitokondriális fehérjék többsége bonyolult import folyamatok segítségével éri el rendeltetési helyét a megfelelő szubmitokondriális kompartmentek valamelyikében. A mitokondriális fehérje-targeting szempontjából négy régiót lehet elkülíteni: a külső-membránt (OM), az intermembrán teret (IMS), a belső membránt (IM), valamint a mátrixot (M) [47]. A mitokondriumba érkező fehérjék - későbbi rendeltetési helyüktől függetlenül - először a külső membránban lokalizálódó TOM (Translocase of the Outer Membrane) komplexek csatornáin keresztülhaladva érkeznek meg a IMS-be. További útvonalaik viszont szerteágaznak a targeting-nek megfelelően (7. ábra) [27].

24

7. ábra: A fehérjék mitokondriális importja és elosztása a szubmitokondriális kompartmentek között [27]

A mátrixba célzott prekurzor fehérjék egy α-hélix szerkezetű, amfipatikus jellegű preszekvenciát

tartalmaznak

N-terminálisukon,

melyet

a

mátrixban

lokalizálódó

endopeptidázok (MPP, Matrix Mitochondrial Peptidase) képesek lehasítani. A fehérjék ezen csoportja a TIM23 (Translocase of the Inner Membrane) csatornákon keresztül jut át a belső membránon a mátrixba [48]. A fehérjék mátrixba történő transzlokációját a preszekvencia pozitív töltése is segíti a mitokondriális membránpotenciál révén [27]. A mitokondriális belső membránba beágyazódó fehérjék igen változatosak, és az Nterminális preszekvencia mellett egy láncon belüli, hidrofób targeting szekvenciát is hordoznak, melynek célja, hogy az érett fehérjét a belső membránhoz horgonyozza. Ezeket a fehérjéket chaperonként funkcionáló, kisméretű Tim fehérjék komplexe vezeti át az IMS-en, egészen a TIM22 transzlokázokig, melyek a mátrix-targeting preszekvencia lehasítása után beágyazzák a célfehérjéket a membránba [49, 50]. A külső

membrán fehérjéit

szintén Tim chaperonok stabilizálják,

miután

keresztüljutnak a TOM komplexen. A β-hordó típusú fehérjék úgynevezett β-szignált hordoznak a C-terminálisukon, mely semmiféle hasonlóságot nem mutat az α-hélix szerkezetű preszekvenciákkal. Ezt a szignált képes felismerni a SAM (Sorting and Assembly Machinery) komplex, mely elvégzi a fehérjék inzercióját a külső membránba [51]. A külső membrán fehérjéinek egy jelentős része viszont α-helikális szerkezetű, melyeknek mindkét terminálisán, sőt, köztes régióikban is megfigyeltek már különböző szignál szekvenciákat, melyek jellemzően α-hélix transzmembrán szegmensekből állnak [52–55]. Az IMS-ben lokalizálódó fehérjéket két csoportba oszthatjuk aszerint, hogy natív formájuk elnyeréséhez átesnek-e oxidatív foldingon a szubkompartmentbe történő importjuk során. A fehérjék azon csoportja, mely oxidatív hajtogatódás nélkül tölti be funkcióját, kétoldalú preszekvenciát hordoz, melyet egy hidrofób domén követ. A preszekvencia a 25

fehérjét a TIM23 csatornákhoz vezeti, ahol a transzlokázba történő illeszkedés után az MPP-k lehasítják azt („stop-transzfer”), csakúgy, mint a mátrix-célzott fehérjék esetében. Ezt a hasítást azonban egy második proteolitikus esemény követi a belső membrán IMS felőli oldalán az IMP-k (Inner Membrane Peptidase) által, aminek következtében a fehérje kikerül az IMS-be [47, 56]. Az IMS fehérjék másik csoportjának tagjai oxidatív foldingon esnek át érésük során. A diszulfidkötések létrejötte a MIA (Mitochondrial Intermembrane space Assembly machinery) oxidatív útvonal segítségével történik. A fehérjék importja a „folding-csapda” modellt követi, melynek lényege, hogy a célfehérjék a tiol-diszulfid cserereakció által elnyerik natív konformációjukat, és az IMS-ben ragadnak [47]. Tekintve, hogy a mitokondriális oxidatív folding témája a dolgozat egyik központi részét képezi, a fehérjék mitokondriális importhoz kapcsolt redox módosításai a következőkben részletesen ismertetésre kerülnek. 2.1.5 Oxidatív folding a mitokondriumban A mitokondriális intermembrán térben zajló oxidatív folding felfedezése egészen váratlan fejlemény volt a mitokondrium redukáló jellegű citoszóllal való direkt kapcsolata miatt. A többi oxidáló kompartmenttől eltérően a mitokondrium kevéssé szeparált a citoszóltól. Azonban azt is figyelembe kell venni, hogy a diszulfidhíddal rendelkező fehérjék az IMS-ben lokalizálódnak, de legalább is annak irányába orientálódnak [57]. Redox mérések alapján bebizonyosodott, hogy az IMS (-255 mV) sokkal oxidálóbb jellegű redoxstátusszal rendelkezik, mint a citoszól (-286 mV) vagy a mitokondriális mátrix (-296 mV) [58]. Ez a redox környezet kedvezően hat a citoszólból importált fehérjék oxidatív foldingjára. 2.1.5.1 A mitokondriális oxidatív folding szubsztrátfehérjéi A mitokondriális diszulfidközvetítő rendszer szubsztrátjainak többsége kis méretű (7 – 15 kDa), és jellegzetes hélix-turn-hélix szerkezetet hordoz, melyben a két hélixet két párhuzamos diszulfidhíd köti össze. Attól függően, hogy a konzervált szekvenciákon belül a két

ciszteint

három,

megkülönböztethetünk

vagy kettős

kilenc CX3C,

egyéb vagy

aminosav

kettős

CX9C

választja

el

egymástól,

motívummal

rendelkező

szubsztrátfehérjéket [25]. Kettős CX3C motívummal rendelkező fehérjék alkotják a kisméretű TIM fehérjék csoportját (Tim8, Tim9, Tim10, Tim12 és Tim13), melyek szolubilis chaperonként segítik a belső membránban lokalizálódó, hidrofób szakaszokat tartalmazó 26

fehérjék IMS-en történő áthaladását [47, 59]. Ezzel szemben a kettős CX9C motívumot tartalmazó fehérjék a COX fehérjék családjába tartoznak, melyek a citokróm c-oxidáz (CcO) enzim komplex kialakításában vesznek részt. A CcO komplex összeállásához több mint 30 fehérje részvétele szükséges. Ezek a fehérjék szerepet játszanak a hem-kötésben, transzportban és fémionok kötésében. Ezek közül a Cox12, a Cox17, a Cox19, és a Cox23 rendelkezik kettős CX9C motívummal [47]. Mindemellett a mitokondriális oxidatív folding apparátus részt vesz kevésbé karakterisztikus cisztein-mintázattal rendelkező fehérjék IMS-be történő importjában is. Ezek között megemlíthetjük a sejt különféle kompartmentjeiben nagy mennyiségben megtalálható SOD1 réz-cink szuperoxid-dizmutázt. Más kisméretű IMS fehérjékhez hasonlóan az IMS-be történő importja, és retenciója a foldingjától és érésétől függ, beleértve az intra- és intermolekuláris diszulfidkötések kialakítását [60]. A réz beépülését és az oxigén-dependens diszulfidhíd kialakítását a SOD1 réz chaperonja, a CCS (Copper Chaperone for SOD1) segíti, mely maga is rendelkezik két diszulfidkötéssel, így ugyancsak a mitokondriális diszulfidközvetítő rendszer potenciális szubsztrátjának tekinthető [61]. Végül meg kell említeni a fehérjecsoport tagjaiként a MIA40 és ALR fehérjéket is, melyek a mitokondriális oxidatív folding folyamatának nélkülözhetetlen szereplői, így a következő fejezetekben részletes bemutatásra kerülnek. 2.1.5.2 A MIA40 fehérje szerepe a mitokondriális oxidatív folding folyamatában A mitokondriális diszulfidközvetítő folyamat főszereplője a MIA40 (Mitochondrial Import and Assembly) fehérje, mely gombákban membránkötött, növényekben és állatokban pedig szolubilis állapotban van jelen az IMS-ben [25]. A MIA40 egy olyan fehérje családba tartozik, melynek tagjai hat cisztein egységet tartalmaznak a következő, teljesen konzervált elrendezésben: CPC-CX9CCX9C. A MIA40 elsődleges szekvenciájának hosszúsága azonban változatos. A humán homológ (142 aminosav, 40 kDa, prekurzor fehérjéje 44 kDa) nagyfokú (több mint 50 %) szekvencia azonosságot mutat a többi eukarióta homológ (47 - 105 aminosav) központi szakaszával, mely a konzervált CPC-CX9CCX9C motívumot is magában foglalja [62]. A MIA40 említett konzervált szekvenciájában jelenlévő CPC (cisztein-prolin-cisztein) szakaszon kialakuló redox-aktív diszulfidkötés képes az IMS-be belépő polipeptid láncok cisztein egységeinek oxidálására (8. ábra) [25]. Az aktív hely közvetlen szomszédságában karakterisztikus hidrofób üreg található a fehérje felületén, mely szubsztrát felismerő és 27

kötőhelyként funkcionál, illetve stabilizálja a nem kovalens kölcsönhatásokat, melyek megfelelő helyzetben pozícionálják a részlegesen hajtogatott szubsztrátokat [62]. 2.1.5.3 Az ALR fehérje szerepe a mitokondriális oxidatív folding folyamatában A célfehérjék oxidálása során a MIA40 redukálódik, így annak újbóli oxidációja szükséges, hogy visszanyerje funkcióképességét. A reoxidációért az ALR (Augmenter of Liver Regeneration) nevű fehérje felel (8. ábra) [63], melynek élesztő homológja, az ERV1 (Essential for Respiration and Vegetative growth) nélkülözhetetlen a sejt életben maradásához és a funkcióképes mitokondriumok biogeneziséhez [64, 65]. Mindkét fehérje a szulfhidriloxidáz aktivitású flavoproteinek közé tartozik. E fehérjék közös jellemzője, hogy tartalmaznak egy C-terminálison lokalizálódó konzervált CXXC motívumot és egy nem kovalensen kötött FAD (flavin-adenin-dinukleotid) domént, melyek feltétlenül szükségesek a katalitikus aktivitásukhoz [66]. Az ALR és ERV1 fehérjék a C-terminálison kívül egy további, N-terminális domént is tartalmaznak egy újabb, redox-aktív CXXC motívummal. Ez az úgynevezett N-domén, amely flexibilis „transzfer-kar”-ként közvetíti az elektronokat a MIA40-től az ALR C-terminális doménjéig [67]. Az ALR C-terminális doménjén található konzervált CXXC motívum a FAD kofaktor közvetlen közelében helyezkedik el. Ez a közelség elektronok közvetlen transzferét teszi lehetővé a redukált CXXC motívumról a kofaktorra, így hozzájárul a belső diszulfid kötés megújulásához [68]. Mint minden redox-aktív enzimnek, az ALR-nek is szüksége van valamilyen elektron akceptor molekulára. A szulfhidril-oxidázok általában molekuláris oxigént használnak fel elektron akceptornak, és a folyamat közben hidrogén-peroxid keletkezik [69]. Az ALR és az ERV1 azonban citokróm c-reduktáz aktivitása révén [70, 71] képes az oxidatív folding során felvett elektronokat a citokróm c közvetítésével a citokróm c-oxidáz aktivitással rendelkező KOMPLEX IV-re átadni. A KOMPLEX IV pedig ezeket, a terminális oxidációból származó többi elektronnal együtt, a légzési oxigén vízzé redukálására használja fel (8. ábra). Az ALR tehát a mitokondriális oxidatív folding folyamatát a légzési elektrontranszport lánchoz kapcsolja, ezzel megnöveli az oxidáció hatékonyságát és elkerüli a reaktív hidrogén-peroxid keletkezését [22, 72–74].

28

8. ábra: A mitokondriális diszulfidközvetítő rendszer [57]

2.1.5.3.1 Az ALR fehérje egyéb funkciói A mitokondriális oxidatív foldinggal kapcsolatos méréseink jelentős részét tette ki az ALR

fehérje

expressziós

változásainak

vizsgálata

különböző,

a

mitokondriális

elektrontranszport lánc működését befolyásoló kezelések alkalmazása mellett. Ennek fényében, a következő alfejezetekben igyekszem részletesebb képet adni a fehérjéről. 2.1.5.3.1.1 Az ALR felfedezése, különböző formái Az ALR története egészen 1975-ig nyúlik vissza, amikor LaBrecque és Pesch regenerálódó patkány májból izolált egy fehérje frakciót, mellyel képesek voltak stimulálni részleges hepatektómián átesett patkányok májregenerációját [75]. A fehérje izolátumot HSSnek (Hepatocyte Stimulator Substance) nevezték el, és úgy találták, hogy specifikusan stimulálja a hepatociták proliferációját, illetve segíti a máj regenerációját szerv-specifikus, de nem faj-specifikus módon [75, 76]. A következő években különböző kutatócsoportok több 29

másik állatfaj (kutya, sertés, nyúl) regenerálódó májából mutattak kis hasonló hepatocita stimuláló aktivitást [77–79]. Francavilla és munkatársai a nyers HSS extraktum további tisztításával egy hozzávetőlegesen 30 kDa tömegű növekedési faktort izoláltak, melyet ALRnek (Augmenter of Liver Regeneration) neveztek el [80, 81]. A fehérjét szekvenálták, génjét klónozták patkány, egér és humán sejtek esetében is [82, 83]. Bár a kezdeti kutatások az ERV1 és az ALR molekula tömegét rendre 14, illetve 15 kDa-ra tették [64, 82], később megfejtették, hogy mind az ALR, mind az ERV1 tartalmazhat egy járulékos N-terminális szekvenciát, amely a mitokondriális import szignál szekvenciáját foglalja magába; ezzel együtt mindkét fehérje molekulatömege 22 kDa-ra tehető [83]. Az ALR „rövid” (15 kDa; 125 AA) és „hosszú” (22 kDa; 198 vagy 205 AA) formája alternatív splicing termékként keletkezik, és nemcsak méretében, de funkciójában is eltér egymástól. A „rövid” ALR az emlősökben extracelluláris növekedési faktorként funkcionál [84], amely különböző specifikus sejtfelszíni receptorokkal képes kapcsolódni [85]. A „hosszú” forma viszont - az élesztő homológ ERV1-hez hasonlóan - a mitokondriális intermembrán térben lokalizálódik, és az oxidatív fehérje folding folyamatában nélkülözhetetlen diszulfid cserereakciókban vesz részt [22, 86]. 2.1.5.3.1.2 Az ALR szerepe a májregenerációban Az

ALR

már

említett,

szekretált

formája

központi

szerepet

játszik

a

májregenerációban. Wang és munkatársai a „rövid” formájú (15 kDa) humán rekombináns rhALR magas affinitású receptorait fedezték fel mind patkány, mind humán hepatocitákon [87]. Az ALR receptorához történő kötése az EGFR foszforilációját váltja ki, mely ezután a MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) jelátviteli kaszkád aktiválódását okozza, amely fontos szerepet tölt be a sejtnövekedés szabályozásában [88]. Ezen kívül az ALR az EGFR-től független módon, az ERK1/2 (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) kinázok indukálásával is képes bekapcsolódni a MAPK útvonalba [89]. Meglepő módon az rhALR nagyobb hatásfokkal képes stimulálni a hepatociták DNS szintézisét, mint az erős hepatocita mitogénként számon tartott EGF, vagy TGF-α [87]. Sőt, az rhALR által indukált DNS szintézis mértéke összemérhető a leghatásosabb hepatocita mitogénként számon tartott HGF hatásával is [90]. Az ALR stimulálja mind az NF-κB [91], mind a c-Myc [90] transzkripciós faktorokat, másrészt fokozza a poliaminok szintézisét is [90], mely vegyületek fontos szerepet játszanak a növekedési faktor indukálta DNS szintézisben [92] és a májregenerációban [93]. Mindemellett az ALR sok más növekedési faktorhoz (HGF, EGF) és citokinhez (TNF-α, IL-6, 30

IL-1) hasonlóan képes gátolni a máj, méregtelenítő funkciójában fontos szerepet játszó citokróm P450 enzimeket [91]. Ez a párhuzam is az ALR növekedési faktor mivoltát látszik erősíteni. Az ALR egy MAPK-tól független jelátviteli úton keresztül is támogatja a májregenerációt. A citoszólikus ALR képes kölcsönhatásba lépni a JAB1 (Jun-Activating domain-Binding protein 1) fehérjével, amely ezáltal elősegíti a c-Jun fehérje foszforilációját. A JAB1-mediált foszforiláció pedig lehetővé teszi a c-Jun/AP1 (Activator Protein 1) fehérje komplex létrejöttét, amely transzkripciós faktorként funkcionál a sejtekben [94]. Az ALR és a JAB1 közötti kölcsönhatás kialakulásához az ALR C-terminális doménjén lokalizálódó konzervált CXXC motívum megléte feltétlenül szükséges [84], ez a felfedezés viszont azt sugallja, hogy a folyamat esetleg az ALR enzimes redox funkciójához köthető. Az eddigieken kívül az ALR közvetett módon, az immunrendszer egyes elemeinek szabályozásával is támogatja a hepatociták védelmét és regenerációját. Az ALR több más növekedési faktorhoz hasonlóan képes az NK (natural killer) sejtek gátlására [95], ami azért fontos, mert az egészséges májsejtekkel ellentétben a regenerálódó májsejtek rendkívül érzékenyek az NK sejtek sejtkárosító hatásával szemben [96]. Patkány modellben leírták, hogy az extracelluláris ALR hatással van a máj Kupffer-sejtjeire is, ugyanis azokon G-fehérje kapcsolt ALR-receptorokat fedeztek fel [85]. A receptorok stimulálásával TNF-α, IL-6 és nitrogén-monoxid (NO) felszabadulást figyeltek meg [85], amely mediátorok akut gyulladásban és májregenerációban egyaránt fontos szerepet játszanak [97]. A megfigyelések szerint az ALR kiváltotta TNF-α, IL-6 és NO indukció felülmúlta az endotoxinnal (lipopolysaccharide (LPS)) kiváltható stimuláció mértékét is [85]. 2.1.5.3.1.3 Az ALR enzimes funkciói Ahogy már a korábbi fejezetekben részletesen szó esett róla, az ALR egyik legfontosabb enzimatikus funkciója, hogy szulfhidril-oxidázként részt vesz kisméretű fehérjék MIA40-függő mitokondriális importjának és oxidatív foldingjának kapcsolt folyamatában, az intermembrán térben [22]. Mivel a fehérjék C-terminálisa hordozza az aktivitáshoz szükséges szekvenciát, így az ALR-nek mind a „rövid” mind a „hosszú” formája képes betölteni ezt az enzimes funkciót [98]. A folyamatban igen hasznosnak bizonyul az ALR citokróm c-reduktáz aktivitása is, hiszen ezáltal képes az oxidatív foldingból származó elektronokat a citokróm c közvetítésével a légzési elektrontranszport lánc negyedik komplexének átadni, ezzel elkerüli az igen reaktív hidrogén-peroxid keletkezését [22, 74]. 31

Az ALR egy másik, oxidatív foldingtól független enzimes funkciója, hogy több más mitokondriális fehérjével együtt részt vesz egyes fehérjék Fe/S-klasztereinek érési folyamataiban. A funkció betöltéséhez az egész ERV1/ALR szekvencia – beleértve a kevésbé konzervált N-terminálist is – szükséges [99]. Érdekesség, hogy az ERV1 és az ALR kizárólag citoszólikus Fe/S fehérjék érését indukálja, mitokondriális fehérjékét nem [99].

32

2.2 A dehidroaszkorbinsav, mint a mitokondriális oxidatív folding potenciális elektron akceptora 2.2.1 Az aszkorbinsav fiziológiás jelentősége Az aszkorbinsav (köznapi nevén C-vitamin) szerkezetét tekintve egy hatszénatomos cukorszármazék, a 2-dezoxi-2-keto-L-gulonsav γ-laktonja. A molekula savas karakterét a 2-es és 3-as szénatomok között található dienol csoportnak köszönheti, amelynek delokalizált π elektronrendszere lehetővé teszi fiziológiás pH-n a 3-as szénatomhoz tartozó hidroxil csoport hidrogénjének disszociációját és ezzel az aszkorbát anion kialakulását. Az aszkorbinsavnak szinte minden funkciója könnyű oxidálhatóságán alapszik. Az aszkorbát két, konszekutív reakcióban, egy-egy elektron leadásával előbb aszkorbil-gyökké, majd dehidroaszkorbinsavvá (DHA) képes oxidálódni. Kitűnő elektrondonor lévén, az aszkorbinsav az egyik legfontosabb vízoldékony antioxidánsunk [100]. Az oxidáltsági állapot és a pH függvényében a C-vitamin változatos formáival találkozhatunk (9. ábra). Fiziológiás körülmények között azonban a Cvitamin 99,95 %-a aszkorbát monoanion formában van jelen a szervezetünkben.

9. ábra: Az aszkorbinsav-dehidroaszkorbinsav rendszer egyensúlyi és redox formái [101]. AscH2 = aszkorbinsav, AscH- = aszkorbát monoanion, Asc2- = aszkorbát dianion, AscH. = aszkorbil gyök, Asc.- = aszkorbát gyök, DHA = dehidroaszkorbinsav

33

Az aszkorbinsavat Szent-Györgyi Albert izolálta először 1928-ban [102], és azóta bebizonyosodott, hogy a molekula kiemelkedő jelentőséggel bír a szervezet egészségének fenntartásában. A C-vitamin számos fiziológia reakcióban játszik központi szerepet, úgy, mint az antioxidáns védelemben, az immunitásban, a vas metabolizmusában és a fehérjék foldingjában [103–105]. A vitamin jelentőségét tekintve igazán meglepő, hogy az evolúció során számos faj, köztük a főemlősök és az ember is elvesztették aszkorbinsav szintetizáló képességüket, a C-vitamin bioszintézis utolsó lépését katalizáló gulono-1,4-lakton-oxidáz (GLO) enzim génjében történt mutációk miatt [104, 106, 107]. Mivel az aszkorbinsavdeficiencia számos egyéb élőlénytörzs képviselőjében, pl. a csontos halakban, a verébalakú madarakban, a tengerimalacban és a denevérekben egyaránt kifejlődött, feltételezhető, hogy a GLO gén mutációja egymás után többször is bekövetkezhetett a törzsfejlődés során [108– 110]. Tekintve, hogy a mutáció nem csak kisebb szubpopulációkat érintő polimorfizmusként jelenik meg, de a természetes szelekció is segíti annak fennmaradását, elképzelhető, hogy az aszkorbinsav szintézis hiánya előnyt jelent a fent említett fajok képviselőinek. Pozitív szelekciós nyomást okozhat, hogy a szintézis kiesésével elkerülhető a gulono-1,4-lakton oxidációjával felszabaduló reaktív hidrogén-peroxid keletkezése, melynek semlegesítése jelentős mennyiségű redukált glutationt (GSH) emésztene fel. A szintézisre képtelen fajok Cvitamin igénye pedig táplálkozás útján (pl. növényi forrásból) teljes mértékben fedezhető [104]. A C-vitamint alapvetően redukáló ágensnek tartjuk, tekintve, hogy antioxidánsként vesz részt a szabadgyökök által mediált oxidációs folyamatokban. Azonban azt is figyelembe kell venni, hogy a molekula képes olyan redox-aktív fémek redukálására is, mint a réz és a vas, így hozzájárul ezek prooxidáns aktivitásának fenntartásához [111]. Tehát az aszkorbinsav viselkedhet

prooxidánsként

és

antioxidánsként

is

a

szervezetünkben;

alacsony

koncentrációban inkább a prooxidáns, míg magas koncentrációban inkább az antioxidáns karaktere dominál [104, 111]. 2.2.2 C-vitamin és fehérje folding A C-vitamin komplex módon, több szinten is szerepet játszik a fehérjék foldingjában. Az első nyilvánvaló kapcsolatra akkor derült fény, amikor feltárták az aszkorbinsav hiánybetegsége, a skorbut tüneteinek patobiokémiai hátterét. Világossá vált, hogy az aszkorbinsav kofaktorként segíti egyes kollagén-hidroxilációban szerepet játszó enzimek működését [105, 112]. 34

Az aszkorbinsav és a fehérje folding következő kapcsolata egy nagyon fontos biokémiai megfigyeléshez köthető. Az endoplazmás retikulum oxidatív fehérje folding rendszerének oxidoreduktáza, a protein diszulfid izomeráz (PDI) enzim izolálásával egy hőstabil faktort is leírtak, mely részt vesz a diszulfid kötések kialakításában [113, 114]. Ez a hőstabil faktor pedig helyettesíthető a C-vitamin oxidált formájával, a dehidroaszkorbinsavval (DHA) [115]. Ezen megfigyelés alapján a DHA az oxidatív fehérje folding potenciális elektron akceptorának tekinthető [105]. 2.2.2.1 Aszkorbinsav-függő hidroxilációs folyamatok A fehérje hidroxiláció egy nagyon fontos poszttranszlációs módosulás, melynek során hidroxil csoportok épülnek a fehérjék megfelelő régióira, melyek később glikozilációs helyként szolgálhatnak [105]. A hidroxilációt számos esetben az α-ketoglutarát-dependens dioxigenázok katalizálják, melyek a vas(II)-dependens nem-hem oxigenázok csoportjába tartoznak, és megtalálható közöttük a prolil-4-hidroxiláz és a lizil-5-hidroxiláz enzim is [116, 117]. A dioxigenázok az oxigén és az α-ketoglutarát mellett Fe2+-t és aszkorbinsavat igényelnek működésükhöz. A vasat az aszkorbinsav képes a katalízishez szükséges aktív vas(II) formában tartani [118, 119]. Az aszkorbinsav nélkülözhetetlen szerepét a folyamatban mi sem mutatja jobban, mint hogy a vitamin hiányában a kollagén hidroxiláció csorbát szenved, ez pedig a skorbut jellegzetes, kötőszöveteket érintő tüneteihez vezet. A bőr elveszti rugalmasságát, a hajszálerek fragilissé válnak, a bőr véraláfutásos lesz, az íny sorvadni kezd, mely aztán fogvesztést von maga után. A celluláris fehérjetömeg kb. 30 %-át kollagén teszi ki. Napjainkra legalább 27 kollagén típust írtak már le 42 különböző polipeptid lánccal, ezen kívül több mint 20 fehérjét találtak kollagénszerű doménekkel [104, 117]. A kollagén megfelelő, hő-stabil formájának kialakilásához prolin és lizin egységek hidroxilációjára van szükség, mely 4-hidroxiprolin és 5-hidroxilizin kialakulását eredményezi a fehérje struktúrájában [120, 121]. A prolin hidroxilációja a XPG (x-prolin-glicin) aminosav tripleteken történik, és a reakciót a kollagén prolil-4-hidroxiláz enzim katalizálja. Az enzim α2β2 heterotetramer szerkezetű, az ER-ben lokalizálódik, működéséhez pedig α-ketoglutarát, oxigén, vas(II) és aszkorbinsav szükséges. Az α alegység közvetlenül részt vesz a hidroxilációban, míg a β alegységet az ER oxidatív folding apparátus PDI enzimeként azonosították, mely valószínűleg azt a célt szolgálja, hogy az enzimkomplexet a kompartmentben visszatartsa [122–124]. A lizin hidroxiláció a kollagén XKG (x-lizin-glicin) egységein történik. A folyamatot a lizil-535

hidroxiláz katalizálja, mely a prolil-4-hidroxilázhoz hasonlóan α-ketoglutarátot, oxigént, vas(II)-t igényel kofaktorként [125]. A hipoxia-indukált transzkripciós faktor-1α (HIF-1α) szintén az említett dioxigenáz enzimcsalád szubsztrátja; aktivitása hidroxiláció által szabályozható, mely ugyancsak aszkorbinsav-függő

folyamat.

Hipoxia

esetén a

HIF-ek

minden

magvas

sejtben

expresszálódnak, ezzel egy igen összetett hálózat szabályzásában vesznek részt [126]. Normális oxigénellátottság esetén a HIF-1α oxigén-dependens degradációs doménját (ODDD) egy prolil-4-hidroxiláz aktivitású enzim hidroxilálja egy vagy két helyen, ennek hatására a fehérje a proteoszómában lebontásra kerül. Hipoxia esetén azonban nem tud lejátszódni az oxigén-igényes hidroxiláció, ekkor a HIF-α hozzáköt a HIF-β-hoz, az így létrejött aktív transzkripciós faktor pedig több mint 100 hipoxia-releváns gént képes aktiválni a nukleuszban [127]. A fent említett reakciókban a fehérjék hidroxilálása önmagában nem igényel aszkorbinsavat. A hidroxilázok tulajdonképpen két katalitikus reakcióban vesznek részt: Az első reakcióban az aminosavak hidroxilálódnak, míg az α-ketoglutarát dekarboxileződik, és a molekuláris oxigénből származó atomok a hidroxil-csoportokba, illetve az újonnan keletkezett szukcinát karboxil-csoportjába épülnek be. Ez a folyamat nem igényel aszkorbinsavat. Azonban egy másik reakcióban a hidroxiláz enzim hidroxiláció nélkül dekarboxilezi az αketoglutarátot, de az előző esethez hasonlóan molekuláris oxigént használ fel. A reakcióban a vas(II) oxidálódik, az enzim pedig mindaddig inaktív állapotban marad, míg az aszkorbinsav visszaredukálja. Annak ellenére, hogy a második reakció aránya csupán 1-4 %-ot ér el, telített szubsztrát koncentráció mellett is lejátszódik, az aszkorbinsav pedig feltétlenül szükséges, hogy újra aktiválja az oxidált enzimet [118, 122, 123]. 2.2.2.2 Oxidatív folding az endoplazmás retikulumban Az endoplazmás retiukulum optimális környezetet biztosít az oxidatív fehérje folding számára. A fehérje folding itt egy olyan enzimrendszer segítségével valósul meg, melynek legfontosabb tagjai a FAD-dependens Ero1, és a protein diszulfid izomeráz (PDI). Az Ero1-et a molekuláris oxigén oxidálja (hidrogén-peroxid termelődése mellett) a PDI pedig specifikus oxidálószereként funkcionál, mely közvetlenül képes oxidálni a szubsztrátfehérjéket, diszulfidkötéseket kialakítva azok struktúrájában (10. ábra) [128].

36

10. ábra: Oxidatív fehérje folding az endoplazmás retikulumban [128]

Viszonylag korán felismerték, hogy az oxidatív folding elektron akceptor dependens, in vivo katalizált folyamat, azonban a mechanizmust befolyásoló fiziológiai összefüggések sokáig ismeretlenek maradtak. A szulfhidril-oxidáz aktivitású Ero1 (Endoplasmic reticulum oxidoreductin) enzim élesztő törzsben történt felfedezésével látszólag teljessé vált az endoplazmás retikulumban játszódó oxidatív fehérje folding folyamatának képe. Azt találták, hogy az ER membránkötött Ero1 hiányában akkumulálódik a redukált PDI, és megszűnik az oxidatív fehérje folding. Bár ez a fenotípus nagyon hasonlít a DsbB enzim hiányos baktériumok funkcióvesztésére, az Ero1 nem mutat homológiát a DsbB-vel, vagy bármely más redox-aktív enzimmel [129]. Az Ero1 úgy vesz részt a fehérje oxidációban, hogy kapcsolatot teremt a molekuláris oxigén oxidáló kapacitása és a flavin kofaktor között, hogy diszulfidkötéseket generáljon [130]. A PDI diszulfidkötések kialakításában betöltött szerepe már régóta ismert. Az enzim épp olyan jól katalizálja a diszulfidkötések kialakulását és izomerizációját, mint a szubsztrátfehérjék széles spektrumának in vitro redukcióját [128]. A PDI tulajdonképpen diszulfid-karrierként képzelhető el, mely a membránkötött Ero1-től közvetlenül a célfehérjéknek szállítja az azon kialakult diszulfidokat [130]. A PDI rendelkezik két jellegzetes, tioredoxin-szerű CGHC (cisztein-glicin-hisztidin-cisztein) aktív hellyel, melyek mutációja esetén az enzim elveszti oxidáló képességét, és csak izomeráz aktivitása marad [128]. A PDI fehérjecsaládnak már több mint egy tucat tagját azonosították, a legismertebb 37

tagjai a PDI, az ERp57, ERp72, ERp28, PDIp, PDIR és a P5 fehérjék. A PDI a leggyakrabban előforduló családtag, az élesztő és az emlős sejtek teljes celluláris fehérje mennyiségének kb. 0,8 %-át teszi ki [131]. Az ERV/ALR szulfhidril-oxidáz család egyik tagja, az Erv2 is részt vehet az ER-ben játszódó oxidatív foldingban, ahol az Ero1 enzimmel parallel funkciót képes betölteni [128]. 2.2.2.2.1 Redox útvonalak az endoplazmás retikulumban Az ER lumen és a citoszól redoxrendszerei egymástól jól szeparáltan működnek. A két kompartment egymástól független bázist biztosít az elektron-karrierek számára. Az ER lumen legjelentősebb redox rendszereit (a citoszólhoz hasonlóan) a tiol-diszulfid párok és a redukált és oxidált piridin nukleotidok alkotják [132]. Az ER-ben lokalizálódó fehérjék lényegesen több diszulfidhíddal, és kevesebb szabad ciszteinil tiol csoporttal rendelkeznek, mint a citoszólikus fehérjék. Ezt a különbséget a glutation (GSH) és a glutation diszulfid (GSSG) aránya is tükrözi (az ER lumenben a [GSH]/[GSSG] arány kb. 20-szor alacsonyabb, mint a citoszólban) [133–135]. Mivel a GSH és a GSSG a PDI enzim potenciális szubsztrát molekulái, azt feltételezték, hogy az importált GSSG biztosítja a PDI számára az oxidáló erőt a diszulfidkötések kialakításához. Ennek a feltételezésnek viszont ellent mond az a tény, hogy a GSSG nem képes átjutni az ER membránon [136]. Sokkal valószínűbb, hogy a GSH a PDI diszulfidjainak redukálása révén a fehérjék diszulfid-izomerizációjában játszik szerepet, a folyamatban termelődő GSSG pedig az ER lumen oxidatív státuszának fenntartásához járul hozzá [133]. A fentebb már említett Ero1 flavoprotein képes a PDI tiol csoportjainak oxidálására, miközben oxigénből hidrogén-peroxidot termel. Mivel a FAD eredményesen transzportálódik az ER membránon keresztül, valószínűsíthető, hogy mobilis elektron karrierként járul hozzá az ER lumen tiol-oxidáló miliőjének kialakításához [137]. A metabolikus folyamatok legfontosabb vízoldékony elektron karriere a NAD(H) és foszforilált változata a NADP(H). Míg a NAD+ molekulát a szénhidrát- és lipid-katabolizmus enzimrendszerei töltik fel elektronokkal, addig néhány speciális citoszólikus dehidrogenáz enzim a NADP+-t használja elektron akceptornak. A NADH az elektronokat főként közvetlenül a respirációs elektrontranszport láncnak adja át, a NADPH pedig a különböző bioszintetikus, biotranszformációs folyamatok és az antioxidáns védelem számára biztosít elektronokat [138]. Az ER membrán legtöbb bioszintetikus és biotranszformációs enzime (pl. CYP450 redutáz, 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reduktáz, szkvalén-szintáz, enoil-CoA 38

reduktáz, 3-ketoacil-CoA reduktáz, biliverdin reduktáz) a lipid kettősréteg külső felszínén lokalizálódik, így működése során a citoszólikus NADPH készletet használja. Emellett természetesen az ER lumen is tartalmaz NADPH-fogyasztó reduktáz enzimeket. Mivel azonban az ER membrán piridin nukleotidokra nézve nem permeábilis, ezek az enzimek szeparált NADPH készletet használnak, melynek szintjét a luminális NADPH-termelő folyamatok tartják fenn [139]. A glutation és a piridin nukleotidok mellett az ER egyéb elektrontranszport molekulákban is gazdag. Ilyenek az aszkorbinsav, a tokoferol, a FAD, az FMN, a K-vitamin és az ubiquinon [132]. Ezek az ER-ben változatos reakciókban vesznek részt redoxpartnerként,

azonban

koncentrációjukról,

membrántranszportjukról,

és

redox

kapcsolataikról még keveset tudunk. 2.2.2.2.2 A dehidroaszkorbinsav szerepe az ER oxidatív foldingban Az endoplazmás retikulum megfelelő oxidatív környezetet biztosít az újonnan szintetizált fehérjék diszulfid-kötéseinek kialakításához. A folyamat azonban az ER-eredetű mikroszómális vezikulákban nem játszódik le. Ebből viszont arra lehet következtetni, hogy a folding mechanizmus valószínűleg egy citoszólikus, vagy membrán-permeábilis faktort használ, mely elvész a mikroszómák izolálása során [140]. Kézenfekvőnek tűnt a feltételezés, hogy a GSSG tölti be ezt a nélkülözhetetlen funkciót, azonban az elmélet megbukott, mikor kimutatták, hogy a diszulfidképzés GSHdeficiens élesztő sejtekben is intakt marad, másrészt az ER membránon keresztül történő GSSG transzport elhanyagolható mértékű [141, 142]. A következő potenciális jelölt az aszkorbinsav volt, mely az ER-ben legnagyobb mennyiségben megtalálható vízoldékony antioxidáns. Ahhoz, hogy prooxidánsként bekapcsolódjon a folding-folyamatba, az aszkorbinsavnak a legoxidáltabb, dehidroaszkorbinsav formájában kell jelen lennie. Eleinte azt feltételezték, hogy az aszkorbinsav oxidációja állati sejtekben egy enzimmentes folyamat, melyet a fémionok és szabad gyökök katalizálnak, később azonban aszkorbinsav-oxidáz enzim aktivitást mutattak ki az ER-ben. A kísérletben patkány májból izolált mikroszómák jelenlétében az aszkorbinsav folyamatos oxidációját figyelték meg aszkorbil-szabadgyökké, majd dehidroaszkorbinsavvá. Az aszkorbinsav-oxidáció mértéke azonban a minta előzetes hővel, vagy proteázzal történő kezelésével szignifikánsan lecsökkent [143]. Ezzel bebizonyosodott a folyamat fehérje-mediált mivolta. A későbbi kísérletekben különböző inhibitorok hatását vizsgálták, és azt találták, hogy a kelátorok, azok közül is a neokuproin 39

nevű réz-specifikus kelátor képes leginkább lecsökkenteni az újonnan felfedezett aszkorbinsav-oxidáz aktivitását. Ez a felfedezés azért volt jelentős, mert az évtizedekkel korábban növényekben felfedezett aszkorbinsav-oxidáz enzim is rezet tartalmaz [144]. A máj mikroszóma mintákhoz adagolt aszkorbinsav fogyásával párhuzamosan a fehérje tiolok oxidációját is megfigyelték, mely az aszkorbinsav hozzáadása nélkül elhanyagolható volt. Neokuproin adagolásával pedig mind az aszkorbát, mind a fehérje tiolcsoportok oxidációja mérséklődött [143]. Bár azt tapasztalták, hogy DHA adagolás is fokozza a fehérje tiolok oxidációját, hatása elmarad az aszkorbinsavétól. Ez a megfigyelés különösen fontos, ha szem előtt tartjuk, hogy a két forma közül az ER membránon keresztül a DHA transzportja valósul meg, míg az aszkorbinsav transzportja elhanyagolható [145]. Ennek megfelelően az aszkorbinsav-oxidáz enzim gátlása az aszkorbinsav ER lumenbe történő transzportját is akadályozza. A dehidroaszkorbinsav, mint a PDI enzim egyik szubsztrátja, kis molekulatömegű elektron akceptorként képes bekapcsolódni az oxidatív folding mechanizmusába (11. ábra). A DHA oxidálja a PDI enzim tiol-csoportjait, így az újra képes lesz reagálni a frissen transzlálódott, redukált tiol-csoportokat tartalmazó fehérjékkel, diszulfidkötéseket kialakítva azok szerkezetében. A folyamat következtében redukált aszkorbinsav termelődik az ER lumenben [105, 146]. Ezen kívül a DHA rapid reakcióban, PDI-független módon is képes oxidálni a hajtogatatlan, vagy részben hajtogatott fehérjék tiol-csoportjait [147]. Tekintve, hogy az aszkorbinsav képes a reaktív oxigén vegyületek (ROS) eliminálása közben

keletkező

tokoferoxil-gyökök

visszaredukálására

tokoferollá

[148],

joggal

valószínűsíthető az E-vitamin részvétele a mikroszómális elektrontranszfer láncolatban [105, 140]. A feltételezés szerint az E-vitamin, mint lipidoldékony molekula az ER membránban foglal helyet, és két ponton kapcsolódik a fent leírt, összetett folyamatba. Az ER külső felületén a tokoferol semlegesíti az aszkorbinsav-oxidáz működése közben keletkező reaktív oxigénvegyületeket, miközben ő maga oxidálódik. Az így keletkező tokoferoxil-gyökök pedig képesek oxidálni a membrán túloldalán a luminális aszkorbinsavat dehidroaszkorbinsavvá, és közben visszaredukálódnak tokoferollá (11. ábra) [105, 140].

40

11. ábra: A dehidroaszkorbinsav szerepe az endoplazmás retikulumban történő oxidatív fehérje folding folyamatában [140]. (AscH2 = aszkorbinsav, DHA = dehidroaszkorbinsav, Ascox = aszkorbát-oxidáz enzim, T = tokoferol)

2.2.3 A dehidroaszkorbinsav mitokondriális importja Az előző fejezetekben láthattuk, hogy a dehidroaszkorbinsav többféleképpen bekapcsolódhat az endoplazmás retikulumban történő fehérje-oxidációs folyamatokba. Mivel azt feltételezzük, hogy a DHA a mitokondrium oxidatív folding apparátusának működését is hasonlóan, alternatív elektron akceptorként képes támogatni, érdemes megvizsgálni, milyen útvonalakon keresztül juthat az említett molekula a felhasználási helyére. 2.2.3.1 A C-vitamin transzportja A feltételezések szerint a C-vitamin sejtekbe irányuló csökkent mértékű transzportja látens, vagy intracelluláris skorbuthoz vezethet. Ez a hipotézis már magában foglalja a transzporterek jelentőségét a betegség kialakulásában. A későbbi megfigyelések még ennél is tovább mennek: feltételezik a szubcelluláris skorbut lehetőségét is, mely esetben csak adott kompartmentbe irányuló aszkorbinsav transzport sérül, így alakul ki a skorbutra jellemző fenotípus, akár aszkorbinsav szintézisre képes fajok képviselőiben is [149]. Az emlős sejtek minden szubcelluláris kompartmentjében lejátszódnak aszkorbinsav felhasználó reakciók, így

41

az intracelluláris membránokon keresztül megvalósuló C-vitamin transzport kiemelkedő fontossággal bír. Tekintve, hogy az aszkorbát és oxidált származékai töltéssel rendelkező vízoldékony molekulák, transzporterek összehangolt működése szükséges ahhoz, hogy a C-vitamin koncentráció mindig optimális szintet tartson a sejtorganellumokban. Az aszkorbinsav és dehidroaszkorbinsav transzportereket legelőször a plazmamembránban karakterizálták (12. ábra).

12. ábra: A C-vitamin membrántranszportjának lehetséges mechanizmusai [149]. A, Az aszkorbát anion (AscH-) másodlagos aktív transzportja, mely egy kation pumpa által létrehozott koncentráció gradienst használ fel. B, A dehidroaszkorbinsav (DHA) facilitált diffúziója, mely GLUT típusú transzportereken keresztül valósul meg. C, A rendkívül alacsony DHA koncentrációt figyelembe véve elképzelhető, hogy a DHA transzportját cisz-oldali aszkorbát-oxidáz és transz-oldali DHA-reduktáz enzimek segítik.

Az aszkorbinsav felvétel másodlagos aktív transzporttal történik nátrium-dependens C-vitamin transzportereken keresztül (SVCT1 és SVCT2). Míg az SVCT1 az epithel sejtek jellegzetes

aszkorbinsav transzportere,

és a

C-vitamin

szintjének

szervezet-szintű

szabályozásában játszik szerepet, addig az SVCT2 széles körben elterjedt a különböző szövettípusokban [150]. A két fehérje szekvenciája 65 % homológiát mutat egymással, mindkettő 12 transzmembrán doménnal valamint citoplazmában lokalizálódó C- és Nterminális doménnal rendelkezik [151]. Több kutatócsoport mérési eredményei alapján arra következtethetünk, hogy míg az SVCT2 egy magas affinitású, alacsony kapacitású transzporter, addig az SVCT1 alacsonyabb affinitással, de magasabb kapacitással rendelkezik [151, 152]. A dehidroaszkorbinsav ezzel szemben facilitált diffúzió útján, a GLUT hexóztranszporter család tagjainak közbenjárásával kerül felvételre [153]. A felvételt követően a DHA rapid reakcióban redukálódik aszkorbinsavvá, ezzel fenntartva egy DHA-felvételt segítő 42

gradienst, másrészt a redukált aszkorbinsav már nem szubsztrátja a GLUT transzportereknek, így a visszaáramlás is gátolt [154]. Mindazonáltal vita tárgyát képezi, hogy mennyire lehet jelentős a GLUT-ok szerepe a C-vitamin felvételben normál, fiziológiás állapotban, hiszen a DHA-nak a glükózzal kell versengnie a szabad transzporterekért [155]. A glükóz-kompetíció hatása viszont a különböző sejttípusok között jelentős eltéréseket mutat, ami további DHA transzport mechanizmusok létezésére utalhat [156]. Humán vörösvértesteken végzett kísérletek alapján arra következtethetünk, hogy a DHA felvétel szabályozása a GLUT transzporter egyéb membránfehérjékkel történő kapcsolódásával valósul meg. Kimutatták, hogy az eritropoézis (vörösvérsejt-képződés) folyamata során a GLUT1 transzporter transzkripciója felerősödik, ugyanakkor a glükóz-transzport csökkenése figyelhető meg a DHA-transzport intenzitásának szignifikáns emelkedése mellett [157, 158]. További vizsgálatok alapján azt valószínűsítik, hogy a folyamat hátterében a stomatin nevű membránfehérje áll. A fehérje expressziója jelentősen megnövekszik az eritropoézis során, a GLUT1-hez kapcsolódva pedig emelkedett DHA-transzportot vált ki, mely érzéketlen az extracelluláris glükóz kompetitív hatására. Ez az effektus egyfajta kompenzációs folyamatként értelmezhető a C-vitamin szintézisre képtelen organizmusokban, és segít magyarázni a különböző sejttípusok DHA-transzportjának változó mértékű glükózérzékenységét [157, 158]. Igaz, hogy a GLUT-mediált C-vitamin transzport csak a DHA-t képes kezelni, a redukált formát nem, ez azonban egyáltalán nem csökkenti a folyamat fiziológiai jelentőségét. Azon kívül, hogy a humán étrend normál esetben is tartalmaz DHA-t az aszkorbinsav mellett, DHA képződés figyelhető meg a béltraktusban is, miközben az aszkorbinsav különböző oxidáló ágensekkel reagál [159]. Ezen kívül az extracelluláris DHA koncentráció markáns emelkedése figyelhető meg különböző patológiás állapotokban, például gyulladás esetén is [159]. Bár a C-vitamin transzporterek jelenléte és funkciója a plazmamembránban jól dokumentált, azok különböző szubcelluláris membránokon való eloszlásáról ma még nagyon keveset tudunk. 2.2.3.2 Mitokondriális dehidroaszkorbinsav transzport A C-vitamin mitokondriális transzportját több mint 30 éve írták le először [160], azonban a rendszer számos részlete csak a közelmúltban vált ismertté (13. ábra).

43

13. ábra: A C-vitamin mitokondriális transzportja [149]. Mind SCVT-, mind GLUT-dependens mitokondriális trnaszport folyamatokról beszámoltak már. A dehidroaszkorbinsav (DHA) változatos elektrondonorokkal (glutation, liponsav) reagálva aszkorbinsavvá (AscH2) redukálódhat a mitokondriális mátrixban. Az aszkorbinsav túlnyomórészt antioxidánsként kerül felhasználásra az organellumban.

Előbb növényi, majd egy évvel később állati sejteken is igazolták, hogy a C-vitamin DHA formájában jut be a mitokondriumba [161, 162]. Emlőssejtből izolált mitokondriumban olyan sztereospecifikus D-glükóz felvételt mutattak ki, mely a dehidroaszkornisav transzportjával kompetitív viszonyban áll. Számítógépes analízissel, a humán GLUT (glükóz transzporter család) izoformáinak N-terminális szekvenciáit vizsgálva, a GLUT1 jelenlétét valószínűsítették a mitokondriális membránban. Ezt az előrejelzést aztán fúzionált GLUT1EGFP

expressziójának

vizsgálatával,

valamint

immunoblot

és

immunolokalizációs

technikákkal is igazolták [162]. Néhány éve a GLUT10 transzporter mitokondriális jelenlétét is leírták egér aorta eredetű sima izomban és inzulinnal stimulált zsírsejtekben [163]. A GLUT10 serkentette a radioaktívan jelölt DHA beáramlását a mitokondriumba, és ezzel együtt csökkentette a ROS szintet a H2O2-kezelt simaizom sejtekben. Ez a protektív hatás azonban glükóz-előkezeléssel, vagy a GLUT10-expresszió RNS-interferenciával történő gátlásával megszüntethetőnek bizonyult [163]. Bár egészen a közelmúltig a DHA-t tekintették a C-vitamin mitokondriális belső membránján keresztül transzportálható formájának [162, 164], egy újabb vizsgálatban a korábban már említett, nátrium-dependens SVCT2 aszkorbinsav transzporterek jelenlétét mutatták ki U937 sejtek mitokondriumaiban [165]. Az újonnan felfedezett mitokondriális transzport-folyamat jelentőségét később további kísérletekkel igazolták. HEK-293 sejtvonalon végzett kolokalizációs vizsgálatok alapján megállapították, hogy az SVCT2 valóban főként a mitokondriumokban prezentálódik, ezen kívül kisebb mennyiségben megtalálható az endoplazmás retiukulumban, de még a plazmamembránban is kimutatható a jelenléte. A

44

felfedezést még jobban alátámasztja, hogy ugyanezt a lokalizációs mintázatot 16 különböző eredetű humán sejtvonalon kimutatták, melyek között normál, neoplasztikus és primer kultúrák is szerepeltek [166]. Az SVCT2-expresszió siRNS-sel történő csendesítésével a fehérje szintjének 75 %-os csökkenése mellett a mitokondriális aszkorbinsav transzport hasonló mértékű mérséklődését érték el [166]. Érdekes módon a HEK-293 sejteken végzett kísérletek nem erősítették meg a GLUT1 mitokondriális lokalizációját, így annak mitokondriális C-vitamin transzportban betöltött kiemelkedő fontossága is megkérdőjelezhetővé vált [166]. Ugyanez a kutatócsoport a GLUT10-expresszió hiányát is megfigyelte az említett sejtvonalon. A leírt megfigyelések fényében meglehetősen zavaros képet kapunk a GLUT-ok mitokondriális DHA transzportban betöltött szerepéről. Az egymásnak ellentmondó kísérleti eredményekből szinte lehetetlen felelős következtetéseket levonni a folyamatról. 2.2.3.3 A dehidroaszkorbinsav sorsa a mitokondriumban Fiziológiás körülmények között, in vitro a dehidroaszkorbinsav rapid reakcióban hidrolizál [167]. A C-vitamin veszteség elkerülése érdekében a mitokondriumban léteznie kell egy aszkorbinsav regeneráló rendszernek, mely képes hasznosítani a sejtplazmából érkező importált, vagy éppen a mátrixban keletkező dehidroaszkorbinsavat. Mind az intakt, mind a külső membránjától megfosztott mitokondrium (ún. mitoplaszt) pillanatszerűen képes felvenni, majd aszkorbinsavvá redukálni a DHA-t. Az aszkorbinsav koncentráció ekkor a folyamatos kiáramlás ellenére is millimólos szintre emelkedhet a kompartmentben [164]. Több különböző redox folyamatot feltételeztek már a gyors aszkorbinsav regeneráció hátterében. Megfigyelték, hogy a mitokondrium redukálni képes a DHA-t többek között egy α-liponsav függő útvonalon [168]. Egy másik kutatócsoport a glutation kiemelkedő jelentőségéről számolt be a mitokondriális DHA redukcióban [164]. Azt találták ugyanis, hogy a DHA adagolás szignifikánsan lecsökkenti a mitokondriális GSH szintet; a másik irányból megközelítve pedig a csökkent mitokondriális GSH szint a DHA redukció elégtelenségéhez vezet [164]. A mitokondriális tioredoxin-reduktáz enzim ugyancsak képes redukálni a DHA-t. Mivel az enzim szeléniumot igényel normális működéséhez [169], a kutatók szeléniummentes diétának alávetett patkányokon vizsgálták a tioredoxin-reduktáz funkcióvesztésének hatását. A kísérlet tanúsága szerint azonban a tioredoxin-reduktáz működése csak egészen kis mértékben befolyásolja a mitokondriális DHA redukció folyamatát [164]. 45

Az eddigieken kívül azt is megfigyelték, hogy különböző respirációs szubsztrátok hiányában a patkánymájból izolált mitokondriumok képtelenek az aszkorbinsav szintjének növelésére, sőt, fenntartására is [164, 170, 171]. Ez a megfigyelés arra enged következtetni, hogy a mitokondriális légzési lánc is szerepet játszik a DHA redukciójában. Kimutatták, hogy néhány respirációs szubsztrát (szukcinát, malát, glicerin-3-foszfát) valóban képes fokozni a DHA-ból történő aszkorbát képzés folyamatát. A mitokondriális elektrontranszport lánc komplexeinek specifikus inhibitorokkal történő blokkolásával kiderítették, hogy az aszkorbinsav regeneráció a légzési lánc III. komplexéhez köthető [170]. Dehidroaszkorbinsav adagolásával a reaktív oxigénvegyületek által indukált károsodások is enyhíthetők. Az emelkedett ROS szint a mitokondriális membránpotenciál felborulását okozhatja, mely aztán sejthalálhoz vezethet. HL-60 sejtvonalon végzett kísérletekben megfigyelték, hogy DHA előzetes adagolásával a H2O2-kezelés hatására sérülő mitokondriális membránpotenciál részben megőrizhető, sőt, a mitokondriális citokróm c denaturálódása és kiáramlása is elkerülhető [172]. A DHA hasonló, apoptózis-gátló hatását azóta leírták már FAS-liganddal kezelt monociták [173], valamint hipoxia-reoxigenáció hatásának kitett humán endothel sejtek esetében is [174]. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy

az

aszkorbinsav

a

mitokondriális

membránpotenciál

fenntartásának

egyik

kulcskomponense, mely „ROS-fogó” képességének köszönhetően anti-apoptotikus hatással is bír [164, 172–174].

46

3 Célkitűzések Dolgozatom elkészítése során a mitokondriális oxidatív fehérje folding apparátusának és mechanizmusának részletesebb megismerését tűztem ki célul. A

fehérjék

oxidatív

hajtogatódása

kulcsfontosságú

ahhoz,

hogy elnyerjék

karakterisztikus, biológiailag aktív háromdimenziós struktúrájukat. Tekintve, hogy a mitokondriális elektrontranszport lánc a kompartmentben zajló oxidatív fehérjefolding végső elektron akceptora is, felmerült annak lehetősége, hogy a mtDNS károsodása során a fehérjék foldingja is sérül. Ezt a feltételezést alapul véve, munkám során elsődlegesen a mtDNS, és azon keresztül a respirációs elektrontranszport lánc sérülésének mitokondriális oxidatív folding apparátusra kifejtett hatását vizsgáltam. A C-vitamin oxidált formája, a dehidroaszkorbinsav az endoplazmás retikulumban képes oxidálni a protein diszulfid izomeráz (PDI) enzimet, mely a kompartmentben működő oxidatív folding apparátus egyik központi tagjának tekinthető [105, 146]. A megfigyelés alapján elképzelhető, hogy a DHA mitokondriális folyamatban is hasonló szerephez juthat. Így kísérleteink másik része a dehidroaszkorbinsav mitokondriális oxidatív foldingban potenciálisan betöltött alternatív elektron akceptor funkciójának tisztázására irányult. Ahhoz, hogy a DHA bekapcsolódhasson a mitokondriális oxidatív folding folyamatába, elsődlegesen arra van szükség, hogy megfelelő mennyiségben rendelkezésre álljon a kompartmentben. Az egymásnak ellentmondó kísérleti eredmények alapján azonban meglehetősen zavaros kép állt rendelkezésünkre a C-vitamin mitokondriális importjáról. Ennek tisztázása céljából in silico vizsgálatokkal igyekeztünk jellemezni a különböző számításba jöhető GLUT és SVCT transzporterek mitokondriális lokalizációjának valószínűségét. Kísérleteink során nagyszámú minta DHA-tartalmának meghatározására volt szükség, ezért igyekeztünk megfelelő analitikai jellemzőkkel rendelkező C-vitamin mérési módszert találni a meglehetősen időigényes HPLC módszer kiváltására. Különböző spektrofotometriás és fluorimetriás módszerek analitikai teljesítményjellemzőit vizsgáltuk meg annak érdekében, hogy objektív képet kapjunk azok alkalmazhatóságáról. A fent részletezett kérdéskörök alapján a kísérleti munkám fő célkitűzései a következők voltak: -

Különböző humán eredetű sejtvonalakból mtDNS-deficiens, ún. ρ0-sejtek előállítása a respirációs lánc elégtelen működésének modellezésére 47

-

A mitokondriális oxidatív folding folyamatában szerepet játszó fontosabb fehérjék expressziós

változásainak

vizsgálata

ρ0-sejtvonalakon

és

-

a

modell

finomításaként - különböző légzési komplex inhibitorokkal kezelt sejteken -

Potenciális dehidroaszkorbinsav-transzporterek mitokondriális jelenlétének in silico eszközökkel történő vizsgálata

-

Normál és ρ0-sejtek dehidroaszkorbinsav felhasználásának összehasonlítása

-

Gyors, költséghatékony C-vitamin meghatározási módszerek tesztelése és összehasonlítása a kutatásban általánosan alkalmazott HPLC módszerrel

48

4 Anyagok és módszerek 4.1 Anyagok A felhasznált L(+)-aszkorbinsav, a nátrium-dihidrogén-foszfát, a dinátrium-hidrogénfoszfát, a jégecet, az abszolút etanol és a vas-klorid a Reanal cégtől származott. Az ortofenilén-diamint (OPDA), a α,α’-dipiridilt, az aszkorbinsav-oxidáz (EC 1.10.3.3) enzimet, az emlős sejtek fenntartásához szükséges összes tápközeget, a fötális szarvasmarha szérumot (FBS), a nem-esszenciális aminosavakat (NEAA) tartalmazó oldatot, az etídium-bromidot, a nátrium-piruvátot, az uridint, a rotenont, az antimicin A-t, a nátrium-azidot és a 2,4dinitrofenolt a Sigma cégtől szereztük be. A felhasznált 100-szoros töménységű antibiotikum/antimikotikum (A/A) oldat, a glutamin és a 0,25 %-os tripszin-EDTA oldat a Life Technologies cég termékei voltak. A fehérjék specifikus jelölésére használt anti-GFER (ALR), anti-MIA40, anti-ACTB nyúl eredetű, poliklonális elsődleges antitesteket, és a peroxidáz enzimmel konjugált, kecske eredetű anti-nyúl poliklonális másodlagos antitesteket a Proteintech csoporttól vásároltuk. A COX II, a β-globin és az ALR mRNS-ére, valamint a 18S rRNS-re tervezett specifikus primereket a Sigma szállította. A felsorolásban nem szereplő összes egyéb felhasznált vegyszer ugyancsak analitikai tisztaságú volt.

4.2 Módszerek 4.2.1 Sejtfenntartás A HepG2 humán máj karcinóma, az MCF7 humán mell adenokarcinóma, és az SHSY5Y humán neuroblasztóma eredetű sejtvonalakat a Sigma cégtől szereztük be, és 37 °C-on, 5 % CO2-t tartalmazó atmoszférában szaporítottuk őket. A HepG2 sejteket EMEM tápközegben tartottuk fenn, amit 10 % FBS-sel, 2 mM glutaminnal, 1 % NEAA-val és A/A oldattal egészítettünk ki. Az MCF7 sejtvonalat 10 % FBS-sel, 2 mM glutaminnal és A/A oldattal kiegészített DMEM oldatban neveltük. Az SH-SY5Y sejteket pedig Ham’s F12 és EMEM tápoldat 1:1 arányú elegyében tartottuk fenn, amit 15 % FBS-sel, 2 mM glutaminnal, 1 % NEAA-val és A/A oldattal egészítettünk ki. A fent leírt összetételű tápközeg keverékek a továbbiakban „komplett médium” néven szerepelnek.

49

4.2.2 ρ0-sejtvonalak létrehozása és fenntartása A ρ0-sejtek létrehozásánál a King és Attardi által leírt protokollt követtük [175]. A mtDNS sejtekből történő eliminációjához a kiválasztott sejtvonalakat (HepG2, MCF7, SHSY5Y) hosszú távú etídium-bromidos kezelésnek vetettük alá, miközben a komplett médiumokat piruváttal és uridinnel is kiegészítettük. A HepG2 és MCF7 sejteket 50 ng/ml etídium-bromiddal, 100 μg/ml piruváttal és 50 μg/ml uridinnal kiegészített komlett médiumban tartottuk legalább két hétig. Az SH-SY5Y sejteket pedig Trimmer és munkatársai leírása [176] alapján 5 μg/ml etídium-bromiddal kezeltük kb. 16 héten keresztül, és a médiumot ebben az esetben is 100 μg/ml piruváttal és 50 μg/ml uridinnal egészítettük ki. A mtDNS elminiációját real-time PCR technikával igazoltuk. A mitokondriális és sejtmagi DNS mennyiség arányának alakulását PikoReal (Thermo Scientific) real-time PCR készülékkel követtük az etídium-bromidos kezelés során. A mtDNS-en kódolt szekvenciaként a COX II gén egy specifikus szakaszát vizsgáltuk; amplifikációjához a következő primer párt használtuk: FW 5’-CATCCTAGTCCTCATCGCCCTCC-3’ és REV 5’-GGGCATGAAACT GTGGTTTGCTCC-3’. Nukleáris DNS-en kódolt referencia szekvenciaként pedig a β-globin gén egy szakaszát alkalmaztuk, a következő primer párral: FW 5’-TTTCCCACCCTTAGGCT GCTG-3’ és REV 5’-GGGAAAGAAAACATCAAGCGTCCCA-3’. A PCR reakcióhoz szükséges DNS-t Wizard SV (Promega) genomi DNS tisztító kit segítségével izoláltuk mind a normál, mind a ρ0-sejtekből. Minden mintával három párhuzamos mérést futtattunk. A PCR reakció a következő protokoll szerint történt: kezdő denaturáló lépés 95 °C-on 3 percig, majd denaturáció 95 °C-on 10 másodpercig, majd kombinált betapadási és lánchosszabbítási lépés következik 60 °C-on 30 másodpercig; a ciklus 40-szer ismétlődik. 4.2.3 A mitokondriális respirációs komplexek inhibeálása A különböző mitokondriális respirációs komplexek blokkolása céljából a HepG2 sejteket 24 óráig inkubáltuk komplett mediumban, amit 100 μg/ml nátrium-piruváttal, 50 μg/ml uridinnal és az adott légzési komplex megfelelő inhibitorával egészítettünk ki. A következő inhibitor koncentrációkat alkalmaztuk: 0,025 μM rotenont a KOMPLEX I, 200 μM teonil-trifluoro-acetont (TTFA) a KOMPLEX II, 0,0025 μM antimicin A-t a KOMPLEX III, és 250 μM nátrium-azidot a KOMPLEX IV blokkolására. Ezen kívül egy jól ismert szétkapcsoló szert, a 2,4-dinitrofenolt (DNP) használtuk 100 μM-os végkoncentrációban a mitokondriális ATP-szintáz (KOMPLEX V) ATP produkciójának gátlására. A kezelt sejtek 50

életképességét tripánkék festékkel ellenőriztük a kezelések során; az elpusztult sejtek aránya minden esetben 5 % alatt maradt. Az inhibitor-kezelések eredményességét a sejtek légzési oxigén felvételének Clark-típusú elektróddal (ún. oxigráf, Hansatech Instruments) történő mérése alapján igazoltuk. 4.2.4 A mitokondriális oxidatív folding enzimek expressziójának meghatározása Western blot technikával A sejteket a plate-ekről szuszpendáltuk, ülepítettük, majd lízis puffer (150 mM NaCl; 1 % NP40; 0.1 % SDS; 50 mM Tris-HCl, pH 8) segítségével feltártuk. A homogenizált mintákat előbb 30 percig 4 °C-on inkubáltuk, majd 14000 g-n centrifugáltuk 15 percig 4 °Con, hogy a sejttörmeléket (pellet) elválasszuk a fehérje frakciótól (felülúszó). A fehérje koncentrációkat Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) segítségével határoztuk meg a gyártói protokollnak megfelelően. A fehérje mintákból 50 μg-os mennyiségeket vittünk fel 15 %-os poliakrilamid gélre, redukáló körülményeket alkalmazva. A méret szerint elválasztott fehérjéket ezután a gélről 0,45 μm pórusátmérőjű nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A műveletekhez Cleaver típusú elektroforézis és Western blot készüléket használtunk (Cleaver Scientific). Miután Ponceau-festéssel ellenőriztük a fehérjeminták mennyiségi uniformitását, a membrán szabadon maradt kötőhelyeit 2 órán keresztül folyamatos himbáztatva blokkoltuk telítő oldat (5 % zsírszegény tejpor TBS-Tween-ben (0,05 M Tris; 0,15 M NaCl; 0,05 % Tween-20) feloldva) segítségével. A blokkolás után a membránokat 4 °C-on overnight inkubáltuk a megfelelő elsődleges antitesttel, melyet telítő oldatban vettünk fel. Ezután a membránokat 1 órán át HRP-konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd ECL reagensbe áztattuk őket, hogy fényérzékeny filmen (AGFA Healthcare) detektálható jelet kapjunk. 4.2.5 Az ALR mRNS szintjének meghatározása RTqPCR analízissel A sejtek teljes RNS-tartalmát innuPREP RNA Mini Kit (Analytikjena) segítségével izoláltuk és tisztítottuk. 2 μg-nyi mennyiségeket írtunk át DNS-re Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) alkalmazásával. Az ALR és a belső kontrolként alkalmazott 18S rRNS transzkriptumainak mennyiségi elemzését PikoReal (Thermo Scientific) real-time PCR készülék és Sensifast SYBR No-ROX Kit (Bioline London) felhasználásával végeztük. Az ALR cDNS meghatározásához a FW 5’-CACAATGAAGTGA 51

ACCGCAAG-3’ és REV 5’-CACCCAACTGAGACACAACAG-3’ primer párt, a 18S rRNSről átírt cDNS-hez pedig a FW 5’-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’ és REV 5’-CCATCC AATCGGTAGTAGCG-3’ primer párt alkalmaztuk [177]. 4.2.6 C-vitamin transzporterek mitokondriális lokalizációjának in silico vizsgálata A GLUT és SVCT transzport fehérjék, valamint négy különböző, egyértelműen mitokondriálisan lokalizálódó szállító fehérje (Mitochondrial pyruvate carrier 2, MPC2; Mitochondrial phosphate carrier protein, MPCP; Dicarboxylate carrier, DIC; Carnitine Opalmitoyltransferase 2, CPT2) aminosav szekvenciáját az Uniprot adatbázisból töltöttük le (http://www.uniprot.org). Mivel az ismert mitokondriális targeting szekvenciák általában 6-60 aminosav hosszúságúak, és a GLUT1-5 és 7 transzportereket érintő korábbi kutatásokban is ilyen hosszúságú szekvenciákat vizsgáltak [162], a transzporterek predikciós analíziséhez a fehérjék első 60 aminosav egységét használtuk fel. A fehérjék (GLUT1-14; SVCT1,2) szubcelluláris lokalizációját összesen nyolc különböző predikciós szoftverrel elemeztük: -

Target P: http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ [178]

-

Mitoprot II: http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html [179]

-

Predotar: https://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html [180]

-

Psort II: http://psort.hgc.jp/form2.html [181]

-

MultiLoc/TargetLoc: http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc/ [182]

-

ngLOC: http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html [183]

-

YLoc: http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/webloc.cgi [184]

-

CELLO v2.5: http://cello.life.nctu.edu.tw/ [185]

Az elemzéseket 2014 áprilisában és augusztusában végeztük, 2014 augusztusában az összes eredményt újra ellenőriztük és megerősítettük. 4.2.7 mtDNS-deficiens HepG2 sejtek dehidroaszkorbinsav-felhasználásának meghatározása Figyelembe véve a vegyület bomlékonyságát, a kísérletek előtt minden alkalommal friss dehidroszakorbinsav oldatot készítettünk. Ehhez 100 mM koncentrációjú L-aszkorbinsav oldatot brómmal oxidáltunk, mindaddig, míg az oldat meg nem tartotta a bróm jellegzetes, 52

sárgás-vöröses színét, mely arra utalt, hogy az aszkorbinsav teljes mennyisége deidroaszkorbinsavvá oxidálódott. A bróm felesleget az oldat nitrogén gázzal történő átbuborékoltatásával távolítottuk el. Megfelelő kontroll csoportok létrehozása érdekében az aszkorbinsav oldattal megegyező térfogatú desztillált vizet is ugyanolyan mennyiségű brómmal kezeltünk (vak oldat). Mind a ρ0, mind a normál tenyésztési körülmények között fenntartott kontroll HepG2 sejteket négy órán keresztül dehidroaszkorbinsavas kezelésnek vetettük alá. Ezt úgy kiviteleztük, hogy a sejttípusnak megfelelő (etídium-bromiddal, piruváttal és uridinnal kiegészített; ill. kontroll) komplett médiumot 1 mM dehidroaszkorbinsavval egészítettük ki. Az így elkészített tápoldatot a sejteken félóránként frissre cseréltük, hiszen a sejtek számára optimális 37 ˚C-os hőmérsékleten számolnunk kell a dehidroaszkorbinsav jelentős mértékű bomlásával is. Hogy kizárjuk a kezelésre használt DHA mintákban esetlegesen jelenlévő bróm maradványok sejtkárosító hatását, külön kontroll és ρ 0-ás sejtkultúrákon a tápoldatot dehidroaszkorbinsav helyett a fentebb említett vak oldattal (brómozott desztillált víz) egészítettük ki, majd a sejtek életképességét tripánkék-festéssel ellenőriztük. A pusztult sejtek aránya egyik esetben sem haladta meg az 5 %-ot. A HepG2 sejtek dehidroaszkorbinsav fogyasztásának meghatározása céljából a kezelés során óránként mintát vettünk a betáplált, illetve a sejtekről eltávolított, elhasznált tápoldatokból. Minden egyes mintából kétszer 100 µl-es egységeket vettünk, melyből az egyikhez 30 µl 25 %-os metafoszforsavat, a másikhoz pedig 30 µl 25 %-os metafoszforsavban oldott 6 mmol/l ditiotreitol (DTT) oldatot adtunk. A ditiotreitol erős redukálószer,

mely

a

mintában

jelenlévő

dehidroaszkorbinsav teljes

mennyiségét

aszkorbinsavvá redukálja vissza. A metafoszforsav pedig az aszkorbinsav stabilitásához szükséges savas jellegű kémhatás fenntartását szolgálja. A párhuzamosan vett mintákban mért aszkorbinsav koncentrációk különbsége tehát megadja az oldatban eredetileg jelenlévő dehidroaszkorbinsav koncentrációját. A betáplált és elvett tápközegből óránként mintát vettünk, a két minta DHA-koncentrációja közötti különbséget a sejtek adott (félórás) időintervallumra vonatkoztatott DHA-felhasználásának tekintettük. A mintákra számolt DHA fogyást az élő sejtszámra normáltuk. 4.2.8 C-vitamin meghatározási módszerekhez szükséges oldatok készítése Az aszkorbinsav növényi mintákból történő extrakciójához 5 %-os ecetsav oldatot használtunk, melyet jégecetből hígítottunk ki. 53

Aszkorbinsavból 100 mM-os törzsoldatot készítettünk 5 %-os ecetsavban. A törzsoldat -80 °C-on tárolva egy hétig stabil maradt. A kalibrátorokat a törzsoldatból hígítva készítettük el a következő koncentrációkban: 1, 5, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, 2500, és 5000 μM. A 4,6 mM-os koncentrációjú orto-fenilén-diamin oldatot mindig közvetlenül a felhasználás előtt készítettük el 0,1 M-os foszfát pufferben (pH 6,5) oldva, majd sötétben tároltuk a mérés megkezdéséig. A liofilizált aszkorbinsav-oxidáz enzimből 0,1 M-os foszfát pufferrel 200 U/ml-es törzsoldatot készítettünk, melyet 12,5 µl-es alikvotokra osztottunk, és -80 °C-on tároltunk. Ezeket csak közvetlenül a felhasználás előtt olvasztottuk fel, majd 250 µl foszfát puffer hozzáadásával 10 U/ml aktivitású munka-oldatot készítettünk belőlük. Az 1 %-os α,α’-dipiridilt és az 1 %-os FeCl3 oldatokat is közvetlenül a mérés előtt készítettük. Míg a FeCl3 jól oldódik vízben, addig az α,α’-dipiridil oldat készítéséhez abszolút etanol oldószert kellett használnunk. 4.2.9 Növényi minták preparálása C-vitamin meghatározási módszerek teszteléséhez Összesen négyféle, élelmezésben fontos zöldség és gyümölcs C-vitamintartalmát elemeztük, hogy különböző aszkorbinsav meghatározási módszerek alkalmazhatóságát ellenőrizzük. A vizsgált minták a következők voltak: citrom (Citrus medica), narancs (Citrus sinensis), paprika (Capsicum annuun), paradicsom (Solanum lycopersicum). A minta extraktumok elkészítéséhez a mintákat apró darabokra vágtuk, folyékony nitrogénnel fagyasztottuk, majd porcelán mozsárban porítottuk. Ezután ismert tömegű mintát 5 %-os ecetsavban homogenizáltunk. A mintatérfogatokat feljegyeztük, majd a mintákat 16500 g-n 5 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A felülúszókat ezután alikvotoztuk, és felhasználásukig -80 °C-on tároltuk. 4.2.10 α,α’-dipiridiles módszer C-vitamin meghatározására 75 µl 85 %-os ortofoszforsavat, 750 µl 1 %-os α,α’-dipiridilt (absz. etanolban oldva) és 300 µl 1 %-os FeCl3 oldatot adtunk 300 µl aszkorbinsavat tartalmazó mintához mikrocentrifuga-csőben. Az így elkészített mintákat 60 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 5 percig 16500 g-n centrifugáltuk őket. Ezután a felülúszókból 350 µl-es mennyiségeket mikrotiter lemez well-jeibe pipettáztunk. Minden mintából 3-3 párhuzamos

54

bemérést végeztünk. A minták abszorbanciáját ezután 525 nm hullámhosszúságon Thermo Multiskan Go spektrofotometriás plate reader-rel határoztuk meg. A mért vak oldatok az aszkorbinsav tartalmú minta helyett ugyanolyan térfogatú 5 %os ecetsavat tartalmaztak. Minden minta mellé kontrollt is készítettünk, hogy a mért értékeket korrigálhassuk a mintához tartozó háttér értékével. A kontroll oldatok készítésénél az α,α’dipiridil helyett csak az oldószereként használt abszolút etanolt adtuk a mintákhoz. 4.2.11 Aszkorbinsav-oxidáz enzimes módszer C-vitamin meghatározására (OPDA, OPDA-fluori) 300 μl 4,6 mM-os OPDA oldatot (0,1 M foszfát pufferben) és 15 μl 10 U/ml aszkorbinsav oxidáz enzimet (0,1 M foszfát pufferben) adtunk 37,5 μl C-vitamin tartalmú mintához mikrotiter lemezen. Félperces rázás, és 10 perc szobahőmérsékleten történő inkubáció után 340 nm hullámhosszon mértük a minták abszorbanciáját. Alternatív módon, fluoriméterrel a minták fluoreszcenciája is

mérhető. Ehhez egy Jasco FP-8200

spektrofluorimétert használtunk 340 nm excitációs és 420 nm emissziós hullámhossz beállítással. A vak oldatok elkészítésénél a C-vitamin tartlamú mintát 5 %-os ecetsavra cseréltük. A mintákkal párhuzamosan kontrollokat is mértünk, melyekhez az aszkorbinsav-oxidáz enzim oldat helyett foszfát puffert adagoltunk. Minden standardból, mintából és kontrollból három párhuzamos mérést végeztünk mindkét detektálási módszerrel kivitelezve. 4.2.12 HPLC (referencia) módszer C-vitamin meghatározására Az elválasztást Waters 2690 folyadékkromatográfiás készülékkel, Teknokroma TR011349 Nucleosil 100 C18 fordított fázisú kolonnán végeztük, Szarka és munkatársai által publikált módszer alkalmazásával [143]. Az izokratikus mozgófázis összetétele 0,1 M NaH2PO4, 0,2 mM Na2EDTA, pH 3,1 (ortofoszforsavval beállítva) volt, és 1 ml/perc áramlási sebességet alkalmaztunk. Az aszkorbinsavat SPD-10A UV-VIS detektorral 254 nm-en detektáltuk. A mérések előtt a kromatográfiás oszlopot 30 percig vízzel, majd 30 percig az eluenssel mostuk. Az eluenst felhasználás előtt mindig gondosan légmentesítettük.

55

5 Eredmények 5.1 ρ0-sejtvonalak létrehozása A HepG2 humán máj karcinóma, az MCF7 humán mell adenokarcinóma, és az SHSY5Y humán neuroblasztóma eredetű sejtvonalakat hosszú távú etídium-bromidos kezelésnek vetettük alá, hogy mtDNS-mentes, működőképes légzési lánccal nem rendelkező sejteket hozzunk létre. A mitokondriális és nukleáris DNS mennyiségi arányának (amely lényegében a mtDNS kópiák sejtenkénti száma) változását real-time PCR technikával követtük a kezelések során. Ez az arány mindhárom sejtvonal esetében meredeken zuhant, az utolsó mintavételi pontnál mtDNS gyakorlatilag már nem detektálható (14. ábra).

14. ábra: A HepG2, MCF7 és SH-SY5Y sejtvonalak mtDNS-tartalmának változása hosszú távú etídiumbromidos kezelés hatására. A kezelést sejttípusonként, párhuzamosan fenntartott sejtkultúrákon egy időben kezdtük el. A párhuzamosan kezelt sejttenyészeteket a kezelés különböző szakaszaiban tártuk fel, majd teljes DNS-tartalmukat izoláltuk. A mintákban található mtDNS mennyiségét real-time PCR technikával határoztuk meg.

A ρ0-sejt-generálás sikerességét a légzési aktivitás vizsgálatával is visszaigazoltuk. A várakozásainknak megfelelően az oxigén-fogyasztás szignifikánsan leesett a sejtenkénti mtDNS mennyiség csökkenésének hatására. Ezúton megbizonyosodtunk a funkcióképes légzési lánc hiányáról a sejtekben. Az ilyen módon megfigyelhető légzési aktivitásváltozást jól szemlélteti a 15. ábra, melyen egy egyedi ρ0-ás HepG2 sejttenyészet kontrollhoz viszonyított légzési aktivitása látható.

56

15. ábra: Egyedi ρ0-ás HepG2 sejtkultúra légzési aktivitása a kontrollhoz viszonyítva. A sejteket tripszineztük, majd komplett médiumban szuszpendáltuk. A légzési aktivitást oxigráffal határoztuk meg, az eredményeket pedig az élő sejtszámra normáltuk.

5.2 A mitokondriális DNS depléciójának hatása az ALR fehérje expressziójára humán eredetű sejtvonalakban Az ALR kiemelkedő szerepet játszik a funkcióképes mitokondriumok biogenezisében, és a mitokondriális genom fenntartásában [64, 74, 186–188]. Az mtDNS és a mitokondriális elektrontranszport lánc ALR-expresszió szabályozásában betöltött esetleges szerepéről azonban még semmilyen információ nem állt rendelkezésünkre. Emiatt kezdtük el vizsgálni a mtDNS

depléciójának,

és

azzal

együtt

a

mitokondriális

elektrontranszport

lánc

funkcióvesztésének hatását májeredetű, és nem májeredetű sejtvonalakon egyaránt. Miután három különböző sejtvonalból (HepG2, MCF7, SHSY5Y) sikeresen hoztunk létre ρ0-sejteket, az ALR expresszióját (mRNS szinten) real-time PCR technikával vizsgáltuk. A mtDNSdepléció egyik vizsgált sejttípusban sem okozott szignifikáns változást az ALR mRNS szintjében (1. táblázat).

Sejtvonal HepG2 kontroll HepG2 ρ0 SH-SY5Y kontroll SH-SY5Y ρ0 MCF7 kontroll MCF7 ρ0

relatív ALR-expresszió 1,00 ± 1,11 0,48 ± 1,28 1,00 ± 1,42 0,94 ± 1,25 1,00 ± 1,44 1,86 ± 1,82

1. táblázat: A mtDNS-depléció hatása az ALR (mRNS szintű) expressziójára

57

A mtDNS elimináció ALR-expresszióra kifejtett hatását mRNS mellett fehérje szinten is vizsgáltuk. Az ALR fehérje szintje szignifikánsan emelkedett a mtDNS-depléció hatására. A fehérje expressziójának növekedését a nem máj eredetű (MCF7 humán mell adenokarcinóma, és az SH-SY5Y humán neuroblasztóma) sejtvonalakban is kimutattuk, ami azért fontos, mert az ALR-ről először, mint májnövekedési faktorról írtak (16. ábra) [189]. Mérési eredményünkkel tehát kizártuk annak lehetőségét, hogy az ALR-expresszió növekedése a fehérje májsejt-specifikus védőhatásával függne össze. A mitokondriális oxidatív folding apparátus másik tagját, a MIA40 fehérjét is vizsgáltuk. A fehérje szintje azonban nem változott a mtDNS-depléció hatására (16. ábra).

16. ábra: Az mtDNS-depléció hatása az ALR és MIA40 fehérje expressziójára. Az mtDNS hiányos (ρ 0) sejtek ALR és MIA40 fehérje szintjeit összehasonlítottuk a megfelelő kontroll (K) sejtekével. A máj (HepG2) és nem máj eredetű (MCF7 és SH-SY5Y) sejtek mtDNS-tartalmát hosszú távú etídium-bromidos kezelés alkalmazásával elimináltuk. Ezután a sejteket feltártuk, majd a teljes fehérjetartalmukat izoláltuk. A fehérje extraktumokból 50 μg-nyi mennyiségeket SDS-PAGE technikával választottunk el redukáló körülmények között. Blottolás után a membránokat anti-ALR, majd anti-MIA40 antitesttel jelöltük. A felvitt mintamennyiségek uniformitásának ellenőrzése céljából, belső kontrollként a β-aktin fehérjét vizsgáltuk. Az ábra öt független kísérlet eredményét reprezentálja.

5.3 Különböző respirációs inhibitorok hatása az ALR fehérje expressziójára HepG2 sejteket kezeltünk a mitokondriális elektrontranszport lánc különböző komplexeinek inhibitoraival, hogy további információt nyerjünk az ALR-expresszió szabályozásáról. Ezzel a módszerrel a ρ0-sejt-generáláshoz hasonlóan csökkenthető a sejtek ATP-termelése. A KOMPLEX I rotenonnal történő inhibeálása blokkolja az ubiquinol elektron-ellátását, így az ATP-szintézis mellett a ROS-képződést is visszaszorítja. Ezzel szemben az antimicin A a KOMPLEX III szelektív inhibeálásával az ATP-szint csökkentése 58

mellett az oxidáló ágensek keletkezését segíti elő. Ezáltal mind az ATP, mind a reaktív oxigénvegyületek lehetséges szabályozó hatása vizsgálható. A teljesség kedvéért a KOMPLEX II inhibitor TTFA-val, a KOMPLEX IV inhibitor nátrium-aziddal és a szétkapcsoló szer 2,4-dinitrofenollal is végeztünk kísérleteket. Utóbbi vegyület az ATPmellett a ROS-termelést is csökkenti. Az inhibitor- és a szétkapcsoló szer kezelések sejtlégzésre kifejtett hatását a sejtek oxigén-fogyasztásának mérésével igazoltuk. A vegyületek respirációra kifejtett hatása a várakozásainknak megfelelő volt. Azonban érdekes módon az alkalmazott vegyületek egyike sem okozott a ρ 0-sejtekben megfigyelthez hasonló ALR-expresszió növekedést (17. ábra (összevetve 16.ábrával)).

17. ábra: Különböző mitokondriális légzési lánc inhibitorok hatása az ALR és a MIA40 expressziójára. HepG2 sejtkultúrákat egymástól függetlenül KOMPLEX I inhibitor rotenonnal (0,025 μM), KOMPLEX II inhibitor TTFA-val (200 μM), KOMPLEX III inhibitor antimicin A-val (0,0025 μM) és KOMPLEX IV inhibitor nátriumaziddal (250 μM) kezeltünk. A 2,4-dinitrofenolt (DNP, 100 μM), mint szétkapcsoló szert alkalmaztuk. A vízben oldhatatlan reagenseket etanolban oldottuk fel, ezért etanolos (EtOH) kontrollt is készítettünk, mely 0,45 v/v % EtOH-t tartalmazott, mely az inhibitor-kezelt sejtek médiumaiban előforduló legmagasabb EtOHkoncentrációnak felel meg. 24 órás kezelések után a sejtek teljes fehérje tartalmát izoláltuk. A fehérje extraktumokból 50 μg-nyi mennyiségeket SDS-PAGE technikával választottunk el redukáló körülmények között. Blottolás után a membránokat anti-ALR, majd anti-MIA40 antitesttel jelöltük. Belső kontrollként a βaktin fehérjét vizsgáltuk. Az ábra három független kísérlet eredményét reprezentálja.

5.4 C-vitamin transzporterek mitokondriális lokalizációja in silico vizsgálatok alapján Ahogyan arról már az irodalmi áttekintésben (2.1.4 fejezet) szó esett, a mitokondriális fehérjék többsége a sejtmagi genomon kódolt, szintézisük pedig a citoszólban történik. Ezek a nukleárisan kódolt fehérjék speciális import útvonalakon keresztül jutnak a mitokondriumba,

59

melyhez speciális N-terminális targeting szekvenciákat használnak [27]. Ezeket a targeting szekvenciákat használtuk fel a GLUT (SLC2) és SVCT (SLC23) transzporterek lokalizációjának nyolc különböző predikciós szoftverrel történt elemzésénél. A két fehérjecsalád összes tagjának (beleértve az ismert izoformákat is) szekvenciáit az Uniprot adatbázisból töltöttük le. Ezen felül négy különböző mitokondriális szállító fehérje, név szerint az MPC2 (Mitochondrial pyruvate carrier 2), az MPCP (Mitochondrial phosphate carrier protein), a DIC (Dicarboxylate carrier), valamint a CPT2 (Carnitine Opalmitoyltransferase 2) szekvenciáját is letöltöttük, melyeket mitokondriális transzporter standardként használtunk fel, tekintve, hogy mitokondriális membránban való lokalizációjuk kísérletesen is igazolt, többszörösen megerősített. A predikciók sorát e négy mitokondriális standard fehérje elemzésével kezdtük (2. táblázat). Bár a dolgozatnak nem célja a különböző predikciós eszközök összehasonlítása, nyilvánvaló, hogy azok különböző hatékonysággal dolgoznak, és a hatékonyság változik az elemezni kívánt fehérjék változatosságával is [190]. A használt szoftverek különbségeit jól szemlélteti a négy mitokondriális standard fehérjére kapott eredmények változatossága (2. táblázat). Ez is alátámasztja Sprenger és munkatársai álláspontját, akik öt különböző predikciós szoftvert hasonlítottak össze, és arra jutottak, hogy egyénileg egyetlen módszer érzékenysége sem elégséges [190]. A vizsgálatainkhoz éppen ezért nyolc különböző, eltérő jel-predikciós algoritmussal dolgozó szoftvert használtunk. Vizsgálatunkban az első potenciális mitokondriális DHA transzporter a GLUT1 volt. Ahogy arra korábbi in silico, in vitro és in vivo megfigyelések alapján számítani lehetett [162], szinte mindegyik predikciós eszköz (az ngLOC kivételével) nagy valószínűséget rendelt mitokondriális lokalizációjához (3. táblázat, 1. sor). A GLUT1 mitokondriális lokalizációjának magas valószínűsége még szembetűnőbb, ha értékeit összevetjük a következő sorokban látható GLUT2-től GLUT8-ig listázott transzporterek, valamint a mitokondriális standard fehérjék között található DIC valószínűségi pontszámaival (2. és 3. táblázat). A következő potenciálisan mitokondriumban lokalizálódó GLUT a GLUT9. A nyolcból öt predikciós eszköz adott magas pontszámot mitokondriális lokalizációjára. A GLUT9 két izoformával rendelkezik (a és b izoforma). Figyelembe véve, hogy a két izoforma N-terminális (targeting) szekvenciájában is különbözik egymástól, nem meglepő, hogy mitokondriális lokalizációjuk valószínűsége is eltérő, és a b izoforma alacsonyabb pontszámot kapott.

60

A vizsgálatok során érdekes módon a GLUT10-re kaptuk a legalacsonyabb valószínűségi pontszámot (3. táblázat). A GLUT11 négy izoformája háromféle, eltérő N-terminális szekvenciát hordoz. Ezek közül a 4. izoforma mitokondriális lokalizációjának van a legkisebb valószínűsége. Ezzel szemben a GLUT11 2. és 3. izoformája nagy valószínűséggel lokalizálódik a mitokondriumban (3. táblázat). Ezt a magas valószínűséget egy eddigiektől független, PredSL nevű szoftverrel is sikerült megerősítenünk [191] (ennek eredményét a táblázatban nem tüntettük fel). A GLUT12 viszonylag alacsony pontszámot kapott. A GLUT13 izoformák egy speciális csoportot képeznek a GLUT családon belül, ritkán nevezik őket GLUT13-nak SLC13 helyett. Az SLC13 H+ - mio-inozitol kotranszporterként funkcionál [192]. Ebből kifolyólag a mitokondriális lokalizációjukra kapott magas pontszámok sem meglepőek (3. táblázat). A GLUT14, valamint 2. és 3. izoformája átlagos pontszámokkal jellemezhető, így mitokondriális lokalizációjuk valószínűsége mérsékelt. A GLUT család összes tagjához hasonlóan az SVCT transzporter család ismert izoformáit is megvizsgáltuk ugyanazokkal a predikciós eszközökkel. Itt is ugyanazt a négy ismert mitokondriális hordozó fehérjét használtuk fel mitokondriális standard gyanánt (2. táblázat). Bár az SVCT1 három különböző izoformával rendelkezik, azok N-terminális szekvenciája nem különbözik, így mitokondriális lokalizációjuk ugyanazzal a mérsékelt valószínűségi

pontszámmal

jellemezhető

(4.

táblázat).

A

közelmúlt

kísérletes

megfigyeléseinek megfelelően [165, 166, 193] a predikciós szoftverek fele meglehetősen magas pontszámot ad az SVCT2 mitokondriális lokalizációjára (4. táblázat).

61

Fehérje

N-terminalális szekvencia a FASTA-cimkével

Target P

Mitoprot

Predotar

PSORT II

MultiLoc / TargetLoc

ngLOC

yLoc

Cello

MPC2

>sp|O95563|MPC2_HUMAN Mitochondrial pyruvate carrier 2 OS=Homo sapiens GN=MPC2 PE=1 SV=1 MSAAGARGLRATYHRLLDKVELMLPEKLRPLYNHPAGPRTVFFW APIMKWGLVCAGLADM

0,607

0,8369

0,05

30,4%

0,87

14,73

99,8% (0,82)

2,781

MPCP

>sp|Q00325|MPCP_HUMAN Phosphate carrier protein, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SLC25A3 PE=1 SV=2 MFSSVAHLARANPFNTPHLQLVHDGLGDLRSSSPGPTGQPRRPR NLAAAAVEEQYSCDYG

0,668

0,6828

0,03

30,4%

0

48,1

99,9 (0,95)

1,217

DIC

>sp|Q9UBX3|DIC_HUMAN Mitochondrial dicarboxylate carrier OS=Homo sapiens GN=SLC25A10 PE=1 SV=2 MAAEARVSRWYFGGLASCGAACCTHPLDLLKVHLQTQQEVKLR MTGMALRVVRTDGILAL

0,384

0,4777

0,00

8,7%

0,87

69,59

14,8 (0,00)

1,606

CPT2

>sp|P23786|CPT2_HUMAN Carnitine Opalmitoyltransferase 2, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=CPT2 PE=1 SV=2 MVPRLLLRAWPRGPAVGPGAPSRPLSAGSGPGQYLQRSIVPTM HYQDSLPRLPIPKLEDT

0,930

0,9970

0,90

78,3%

0,15

53,03

99,96 (0,93)

1,337

2. táblázat: Különböző mitokondriális szállító fehérjék mitokondriális lokalizációjának in silico predikciója. MPC2: Mitochondrial pyruvate carrier 2; MPCP: Mitochondrial phosphate carrier protein; DIC: Dicarboxylate carrier; CPT2: Carnitine O-palmitoyltransferase 2.

62

Fehérje

N-terminális szekvencia a FASTA-cimkével

Target P

Mitoprot

Predotar

PSORT II

MultiLoc / TargetLoc

ngLOC

yLoc

Cello

Glut 1 - Slc2A1

>sp|P11166|GTR1_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 OS=Homo sapiens GN=SLC2A1 PE=1 SV=2 MEPSSKKLTGRLMLAVGGAVLGSLQFGYNTGVINAPQKVIEEFY NQTWVHRYGESILPTT

0,167

0,4341

0,03

13,0 %

0,41

-

0,5% (0,65)

1,333

Glut 2 - Slc2A2

>sp|P11168|GTR2_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 2 OS=Homo sapiens GN=SLC2A2 PE=1 SV=1 MTEDKVTGTLVFTVITAVLGSFQFGYDIGVINAPQQVIISHYRHVL GVPLDDRKAINNYV

0,026

0,1606

0

11,1%

-

5,635

0,0% (0,96)

0,514

Glut 3 - Slc2A3

>sp|P11169|GTR3_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3 OS=Homo sapiens GN=SLC2A3 PE=1 SV=1 MGTQKVTPALIFAITVATIGSFQFGYNTGVINAPEKIIKEFINKTLTD KGNAPPSEVLLT

0,028

0,1775

0

11,1%

-

-

0,0% (0,97)

0,949

Glut 4 - Slc2A4

>sp|P14672|GTR4_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 4 OS=Homo sapiens GN=SLC2A4 PE=1 SV=1 MPSGFQQIGSEDGEPPQQRVTGTLVLAVFSAVLGSLQFGYNIGVI NAPQKVIEQSYNETW

0,034

0,0191

0

21,7%

-

-

0,0% (0,40)

0,695

Glut 5 - Slc2A5

>sp|P22732|GTR5_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 5 OS=Homo sapiens GN=SLC2A5 PE=1 SV=1 MEQQDQSMKEGRLTLVLALATLIAAFGSSFQYGYNVAAVNSPAL LMQQFYNETYYGRTGE

0,017

0,0253

0

11,1%

-

-

0,0% (0,64)

0,486

Glut 5 - Slc2A5 2. izoforma

>sp|P22732-2|GTR5_HUMAN Isoform 2 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 5 OS=Homo sapiens GN=SLC2A5 MEQQDQSMKEGRLTLVLALATLIAAFGSSFQYGYNVAAVNSPAL LMQQFYNETYYGRTGE

0,017

0,0253

0

11,1%

-

-

0,0% (0,64)

0,486

Glut 6 - Slc2A6

>sp|Q9UGQ3|GTR6_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 6 OS=Homo sapiens GN=SLC2A6 PE=1 SV=2 MQEPLLGAEGPDYDTFPEKPPPSPGDRARVGTLQNKRVFLATFA AVLGNFSFGYALVYTS

0,091

0,0284

0

8,7%

-

-

0,2% (0,14)

0,935

Glut 6 2. izoforma

>sp|Q9UGQ3-2|GTR6_HUMAN Isoform 2 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 6 OS=Homo sapiens GN=SLC2A6 MQEPLLGAEGPDYDTFPEKPPPSPGDRARVGTLQNKRVFLATFA AVLGNFSFGYALVYTS

0,091

0,0284

0

8,7%

-

-

0,2% (0,14)

0,935

63

Glut 7 - Slc2A7

>sp|Q6PXP3|GTR7_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 7 OS=Homo sapiens GN=SLC2A7 PE=2 SV=2 MENKEAGTPPPIPSREGRLQPTLLLATLSAAFGSAFQYGYNLSVV NTPHKVFKSFYNETY

0,030

0,1891

0

21,7%

-

-

0,1% (0,11)

0,988

Glut 8 - Slc2A8

>sp|Q9NY64|GTR8_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 8 OS=Homo sapiens GN=SLC2A8 PE=1 SV=3 MTPEDPEETQPLLGPPGGSAPRGRRVFLAAFAAALGPLSFGFALG YSSPAIPSLQRAAPP

0,130

0,0143

0

13,0%

-

-

0,8% (0,08)

0,591

Glut 9 -Slc2A9a

>sp|Q9NRM0|GTR9_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9 OS=Homo sapiens GN=SLC2A9 PE=1 SV=2 MARKQNRNSKELGLVPLTDDTSHAGPPGPGRALLECDHLRSGVP GGRRRKDWSCSLLVAS

0,253

0,9044

0

34,8%

-

-

0,5% (0,05)

0,712

Glut 9 -Slc2A9b 2. izoforma

>sp|Q9NRM0-2|GTR9_HUMAN Isoform 2 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9 OS=Homo sapiens GN=SLC2A9 MKLSKKDRGEDEESDSAKKKLDWSCSLLVASLAGAFGSSFLYGYN LSVVNAPTPYIKAFY

0,035

0,0487

0

22,2%

-

-

0,1% (0,05)

0,774

Glut 10 - Slc2A10

>sp|O95528|GTR10_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 10 OS=Homo sapiens GN=SLC2A10 PE=1 SV=2 MGHSPPVLPLCASVSLLGGLTFGYELAVISGALLPLQLDFGLSCLE QEFLVGSLLLGALL

0,020

0,0175

0

4,3%

-

-

0,0% (0,97)

0,502

Glut 11

>sp|Q9BYW1|GTR11_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 11 OS=Homo sapiens GN=SLC2A11 PE=2 SV=1 MRALRRLIQGRILLLTICAAGIGGTFQFGYNLSIINAPTLHIQEFTNE TWQARTGEPLPD

0,485

0,9739

0,22

-

-

-

5,7% (0,91)

1,403

Glut 11 -Slc2A11 2. izoforma

>sp|Q9BYW1-2|GTR11_HUMAN Isoform 2 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 11 OS=Homo sapiens GN=SLC2A11 MLHALLRSRMIQGRILLLTICAAGIGGTFQFGYNLSIINAPTLHIQE FTNETWQARTGEP

0,474

0,1447

0,58

30,4%

-

-

8,0% (0,79)

1,453

Glut 11 3. izoforma

>sp|Q9BYW1-3|GTR11_HUMAN Isoform 3 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 11 OS=Homo sapiens GN=SLC2A11 MLHALLRSRMIQGRILLLTICAAGIGGTFQFGYNLSIINAPTLHIQE FTNETWQARTGEP

0,474

0,1447

0,58

30,4%

-

-

8,0% (0,79)

1,453

Glut 11 4. izoforma

>sp|Q9BYW1-4|GTR11_HUMAN Isoform 4 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 11 OS=Homo sapiens GN=SLC2A11 MEDELEPSLRPRTQIQGRILLLTICAAGIGGTFQFGYNLSIINAPTL HIQEFTNETWQAR

0,032

0,2340

0

17,4%

-

-

0,0% (0,52)

0,890

64

Glut 12 -Slc2A12

>sp|Q8TD20|GTR12_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 12 OS=Homo sapiens GN=SLC2A12 PE=2 SV=1 MVPVENTEGPSLLNQKGTAVETEGSGSRHPPWARGCGMFTFLS SVTAAVSGLLVGYELGI

0,216

0,0370

0

11,1%

-

16,67

0,1% (0,30)

0,690

Glut 13 - Slc2A13

>tr|Q86X07|Q86X07_HUMAN SLC2A13 protein OS=Homo sapiens GN=SLC2A13 PE=2 SV=1 MGERRRKQPEPDAASAAGECSLLAAAESSTSLQSAGAGGGGVG DLERAARRQFQQDETPA

0,132

0,0516

0

30,4%/

-

-

0,0% (0,34)

0,545

Glut 13 - Slc2A13

>sp|Q96QE2|MYCT_HUMAN Proton myo-inositol cotransporter OS=Homo sapiens GN=SLC2A13 PE=1 SV=3 MSRKASENVEYTLRSLSSLMGERRRKQPEPDAASAAGECSLLAAA ESSTSLQSAGAGGGG

0,508

0,9743

0,11

43,5%

-

-

0,6% (0,04)

0,651

Glut 13 - Slc2A13

>tr|E9PE47|E9PE47_HUMAN Proton myo-inositol cotransporter OS=Homo sapiens GN=SLC2A13 PE=2 SV=1 MSRKASENVEYTLRSLSSLMGERRRKQPEPDAASAAGECSLLAAA ESSTSLQSAGAGGGG

0,508

0,9743

0,11

43,5%

-

-

0,6% (0,04)

0,651

Glut 14 - Slc2A14

>sp|Q8TDB8|GTR14_HUMAN Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 14 OS=Homo sapiens GN=SLC2A14 PE=2 SV=1 MEFHNGGHVSGIGGFLVSLTSRMKPHTLAVTPALIFAITVATIGSF QFGYNTGVINAPET

0,413

0,0417

0

11,1%

-

-

0,3% (0,76)

0,880

Glut 14 - Slc2A14 2. izoforma

>sp|Q8TDB8-2|GTR14_HUMAN Isoform 2 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 14 OS=Homo sapiens GN=SLC2A14 MDNRQNVTPALIFAITVATIGSFQFGYNTGVINAPETIIKEFINKTL TDKANAPPSEVLL

0,031

0,0483

0

34,8%

-

-

0,0% (0,88)

0,820

Glut 14 - Slc2A14 3. izoforma

>sp|Q8TDB8-3|GTR14_HUMAN Isoform 3 of Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 14 OS=Homo sapiens GN=SLC2A14 MIGLGGMAFCSTLMTVSLLLKNHYNGMSFVCIGAILVFVACFEIG PGPIPWFIVAELFSQ

0,071

0,2139

0,15

22,2%

-

-

0,0% (1,00)

0,563

3. táblázat: A humán GLUT (SLC2) transzporter család mitokondriális lokalizációjának in silico predikciója

65

Fehérje

N-terminális szekvencia a FASTA-cimkével

Target P

Mitoprot

Predotar

PSORT II

MultiLoc / TargetLoc

ngLOC

yLoc

Cello

SVCT 1 - Slc23A1

>sp|Q9UHI7|S23A1_HUMAN Solute carrier family 23 member 1 OS=Homo sapiens GN=SLC23A1 PE=1 SV=3 MRAQEDLEGRTQHETTRDPSTPLPTEPKFDMLYKIED VPPWYLCILLGFQHYLTCFSGTI

0,132

0,2153

0,0

13,0%

-

-

0,0% (0,25)

0,934

SVCT 1 - Slc23A1 2. izoforma

>sp|Q9UHI7-2|S23A1_HUMAN Isoform 2 of Solute carrier family 23 member 1 OS=Homo sapiens GN=SLC23A1 MRAQEDLEGRTQHETTRDPSTPLPTEPKFDMLYKIED VPPWYLCILLGFQHYLTCFSGTI

0,132

0,2153

0,0

13,0%

-

-

0,0% (0,25)

0,934

SVCT 1 - Slc23A1 3. izoforma

>sp|Q9UHI7-3|S23A1_HUMAN Isoform 3 of Solute carrier family 23 member 1 OS=Homo sapiens GN=SLC23A1 MRAQEDLEGRTQHETTRDPSTPLPTEPKFDMLYKIED VPPWYLCILLGFQHYLTCFSGTI

0,132

0,2153

0,0

13,0%

-

-

0,0% (0,25)

0,934

SVCT 2 - Slc23A2

>sp|Q9UGH3|S23A2_HUMAN Solute carrier family 23 member 2 OS=Homo sapiens GN=SLC23A2 PE=1 SV=1 MMGIGKNTTSKSMEAGSSTEGKYEDEAKHPAFFTLP VVINGGATSSGEQDNEDTELMAIY

0,236

0,5133

0,02

26,1%

-

-

0,0% (0,04)

0,515

4. táblázat: A humán SVCT (SLC23) transzporter család mitokondriális lokalizációjának in silico predikciója

66

5.5 mtDNS-deficiens HepG2 sejtek dehidroaszkorbinsav-felvétele A dehidroaszkorbinsav (DHA) mint a PDI (protein diszulfid izomeráz) enzim egyik szubsztrátja, kis molekulatömegű elektron akceptorként képes bekapcsolódni az endoplazmás retikulumban (ER) zajló oxidatív folding mechanizmusába [105]. A DHA oxidálja a PDI enzim tiol-csoportjait, így az újra képes lesz reagálni a frissen transzlálódott fehérjékkel, diszulfidkötéseket kialakítva azok szerkezetében. A fent leírtak alapján felmerült annak lehetősége, hogy a DHA a mitokondrium oxidatív folding apparátusában is betölthet hasonló, alternatív elektron akceptor funkciót. Alap esetben a folyamatból származó elektronok a respirációs lánc közvetítésével a légzési oxigénre adódnak át. mtDNS-deficiens, tehát funkcióképes respirációs lánccal nem rendelkező sejtekben ez a lehetőség nem áll fenn, így az elektronok jó eséllyel a kompartmentben jelenlévő egyéb, elsősorban oxidáns jellegű vegyületeket redukálják. Mindezt figyelembe véve azt feltételeztük, hogy a ρ 0-ás sejtek nagyobb mennyiségű DHA-t használnak fel, mint a normális működésű kontroll sejtek. Kísérletünk célja az volt, hogy megvizsgáljuk, hogyan változik a sejtek DHA-felhasználása a mtDNS eliminálásának hatására. A ρ0-ás sejtek DHA-felvétele a kezelés előrehaladtával előbb hirtelen megugrott, majd egy köztes szintre állt be. Érdekes módon azt tapasztaltuk, hogy a kontroll sejtekről származó mintákban a DHA fogyás az első órában még jócskán meghaladta a ρ 0-ás sejteknél tapasztaltat, a négyórás kezelés végére azonban a ρ0- és kontroll sejtek DHA-fogyasztása egészen hasonló értéket mutatott (18. ábra).

67

18. ábra: A kontroll és ρ0-ás sejtek DHA-felvételének alakulása az idő függvényében. A sejtkultúrákat négy órán keresztül a médiumba kevert 1 mM végkoncentrációjú DHA-val kezeltük. A médiumot a DHA hőbomlásából eredő hibák elkerülése érdekében félóránként cseréltük. A betáplált és elvett tápközegből óránként mintát vettünk, a két minta DHA-koncentrációja közötti különbséget a sejtek adott (félórás) időintervallumra vonatkoztatott DHA-felvételének tekintettük. A DHA koncentrációt DTT-vel redukált, és nem redukált minták aszkorbinsav-koncentrációjának különbségéből számítottuk ki. Az aszkorbinsavat az 4.2.12 fejezetben részletezett HPLC módszerrel határoztuk meg. A mintákra számolt DHA fogyást az élő sejtszámra normáltuk. Az ábrázolt értékek három párhuzamos kísérlet eredményeinek átlagából származnak.

5.6 C-vitamin meghatározási módszerek analitikai teljesítményjelzőinek összehasonlítása Különböző analitikai módszerek objektív módon történő összehasonlításának legjobb módja, ha meghatározzuk analitikai teljesítményjelzőiket, úgy, mint a linearitásukat, pontosságukat, precizitásukat, valamint kimutatási és meghatározási határukat. Ezt szem előtt tartva a felsorolt paramétereket mind α,α’-dipiridiles, mind az OPDA és OPDA-fluori módszerekre vonatkozóan meghatároztuk. A spektrofotometriás és fluorimetriás módszereket összehasonlítottuk egymással, és egy etalonnak tekinthető HPLC módszerrel is. 5.6.1 Linearitás A linearitás vizsgálatokhoz a következő koncentrációjú, 5 %-os ecetsavban felvett standard aszkorbinsav oldatokat használtuk: 0, 1, 5, 25, 100, 250, 500, 1000, 2000, 2500, 5000 és 10000 μM. A lineáris regresszió számításához a legkisebb négyzetek módszerét alkalmaztuk. A lineáris tartományokat, a regressziós egyenesek meredekségét és a 68

determinációs együtthatókat (R2) az 5. táblázat tartalmazza. A kalibrációt lineárisnak tekintettük, ha az R2 értéke meghaladta a 0,98-at. A három tesztelt módszer közül az OPDA-fluori meghatározásnál tapasztaltuk a legnagyobb érzékenységet (lásd: kalibrációs egyenes meredeksége). Azonban azt is észre kell venni, hogy ez az érték még mindig messze (három nagyságrenddel) elmarad a kromatográfiás technika érzékenységétől (5. táblázat). Emellett ez a módszer rendelkezik a legszűkebb lineáris tartománnyal (0 - 250 µM); a viszonylag alacsony felső méréshatár azonban nem okoz különösebb problémát, hiszen a koncentráltabb minták egyszerűen kihígíthatók a megfelelő tartományba. A módszert szélesebb koncentrációtartományban, de még a HPLC meghatározás lineáris tartományán belül is leteszteltük (5. táblázat). A mérési intervallum kiterjesztésével az érzékenység és az R2 értékének markáns csökkenése is arra utal, hogy a módszer szűk lineáris tartománnyal rendelkezik. Ehhez képest az α,α’-dipiridiles és OPDA módszerek sokkal szélesebb tartományban használhatók, az α,α’-dipiridiles módszer lineáris tartományát csak a mérésekhez használt spektrofotométer teljesítménye limitálta.

Módszer Referencia (HPLC) α,α’-dipiridil OPDA OPDA-fluori OPDA-fluori

Lineáris tartomány (μM) 0,5 - 1000# 5 - 1000 22 - 5000 0,5 - 250 0,5-1000*

Regressziós egyenes meredeksége 20551,3974 0,0029 0,0006 10,6563 6,1623

R2 0,9995 0,9995 0,9975 0,9980 0,9198

5. táblázat: Különböző C-vitamin meghatározási módszerek linearitásának összehasonlítása. #: A HPLC módszer linearitását nem vizsgáltuk szélesebb tartományban. *: Az OPDA-fluori módszer lineáris tartományán kívül, de a referencia (HPLC) módszer lineáris tartományán belül.

5.6.2 Pontosság A pontosság a mért és névleges értékek százalékos eltérését jelenti. Az α,α’-dipiridiles és OPDA módszer a magasabb koncentrációk tartományában hasonló pontosságot mutat, azonban ez mindkét (kifejezetten az α,α’-dipiridiles) módszer esetében szignifikánsan lecsökken az alacsonyabb koncentrációk meghatározása esetén (6. táblázat). Ez nem is meglepő, hiszen mindkét módszer meglehetősen magas LoD és LoQ értékekkel jellemezhető (lásd 5.6.4 fejezet) [194]. Az OPDA-fluori módszer a lineáris tartományán belül közepesen pontosnak bizonyult, ahogy arra magasabb érzékenysége alapján számítani is lehetett. 69

Meglepő módon magasabb aszkorbinsav koncentrációk esetében mindhárom módszer megközelítette, sőt, felülmúlta a HPLC meghatározás pontosságát (6. táblázat).

Koncentráció (μM) 5,00 50,00 500,00 1000,00 Átlag

HPLC 13,46 3,60 7,67 1,93 8,25

Pontosság (%) α,α’-dipiridil OPDA 30,73 23,73 0,53 1,80 1,06 0,48 0,31 0,11 8,16 6,53

OPDA-fluori 2,57 0,03 1,30

6. táblázat: Különböző C-vitamin meghatározási módszerek pontossága. A mért koncentrációkat a különböző módszerek lineáris tartományaiból választottuk. Minden eredmény három független méréssorozat átlagából származik.

5.6.3 Precizitás Egy módszer precizitása az adott módszerrel vizsgált homogén minta független mérési eredményei közötti eltérést fejezi ki. A precizitás jellemzésére a tapasztalati szórás (standard deviation; SD) használható. A módszerek ismételhetőségének vizsgálatánál a méréseket az adott mérőműszerrel rövid időintervallumon belül ismételtük. Az OPDA-fluori módszer ismételhetősége a saját lineáris tartományán belül messze felülmúlta a többi vizsgált módszert (7. táblázat). A HPLC módszerrel összehasonlítva mindkét OPDA módszer megfelelő precizitást mutatott. Az α,α’-dipiridiles módszernél azonban az SD értékek emelkedése tapasztalható, főleg magas koncentrációk esetén (7. táblázat).

Koncentráció (μM) 5,00 50,00 500,00 1000,00 Átlag

HPLC 0,33 2,40 5,07 15,83 5,91

Precizitás (SD) α,α’-dipiridil OPDA 4,07 0,79 1,39 3,59 21,88 4,55 11,35 2,05 9,67 2,74

OPDA-fluori 0,02 0,00 0,01

7. táblázat: A különböző aszkorbinsav meghatározási módszerek ismételhetősége. A mért koncentrációkat a különböző módszerek lineáris tartományaiból választottuk. Minden eredmény három független méréssorozat átlagából származik.

70

5.6.4 Kimutatási határ (LoD) és meghatározási határ (LoQ) A kimutatási határ (Limit of Detection; LoD) és megahatározási határ (Limit of Quantification; LoQ) az analit azon legkisebb koncentrációját fejezik ki, mely az adott analitikai módszerrel még megbízhatóan detektálható, illetve kvantitálható. Mindkét analitikai jellemző értéke a háttér (vak) méréséből származó tapasztalati szórás, és a kalibrációs görbe meredekségének felhasználásával számítható, egyezményesen elfogadott módszerrel: 𝐿𝑜𝐷 =

3×𝑆𝐷𝑏

𝐿𝑜𝑄 =

𝑆

, és

10×𝑆𝐷𝑏 𝑆

,

ahol SDb = a vak méréséből származó tapasztalati szórás, S = a kalibrációs görbe meredeksége. Az OPDA-fluori és a HPLC módszer LoD és LoQ értékei szinte megegyeznek (8. táblázat). Ahogy arra a korábbi megfigyelések alapján számítani lehetett [194], az α,α’dipiridiles módszer LoD és LoQ értékei nem közelítették meg a HPLC módszerét. Egyértelműen az OPDA módszernél tapasztalhatók a legnagyobb LoD és LoQ értékek, így annak alkalmazása 7 μM-nál alacsonyabb analit-koncentráció esetén nem ajánlott.

Módszer Referencia (HPLC) α,α’-dipiridil OPDA OPDA-fluori

LoD (μM) 0,11 1,34 6,53 0,13

LoQ (μM) 0,38 4,46 21,75 0,42

8. táblázat: A különböző aszkorbinsav meghatározási módszerek LoD és LoQ értékei

5.6.5 Különböző gyümölcs és zöldség minták C-vitamintartalmának meghatározása Az általunk vizsgált C-vitamin meghatározási módszerek megbízhatóságát különböző, széles körben fogyasztott gyümölcs és zöldség minták mérésével is összehasonlítottuk. Négy népszerű természetes C-vitamin forrást választottunk ki a tesztekhez: citromot, narancsot, paprikát és paradicsomot. Mindegyik minta aszkorbinsav-tartalmát megmértük mind a négy módszerrel (9. táblázat). Minden minta esetében hasonló tendencia figyelhető meg. Az α,α’dipiridillel mért eredmények állnak legközelebb a referencia HPLC módszerrel mértekhez. Az α,α’-dipiridillel mért értékek a narancs, citrom és a paprika esetében meghaladják a HPLC-vel meghatározott C-vitamintartalmat. A paradicsom minta esetében azonban fordított a helyzet, 71

az α,α’-dipiridiles mérés eredménye a HPLC-vel mértnél alacsonyabb C-vitamintartalomra utal. Az eltérések legalább kétféleképpen magyarázhatók. Egyrészről az α,α’-dipiridiles mérés kevésbé specifikus, hiszen a karnitin, hidroxiaceton, α-tokoferol, glutation, cisztein, vagy egyéb redukáló ágensek interferenciát okozhatnak a meghatározás során [195]. Ezt az interferenciát ortofoszforsav alkalmazásával próbáltuk csökkenteni, de a mintákban előforduló egyéb redukáló ágensek jelenléte nem zárható ki. Másrészt azt is számításba kell venni, hogy az α,α’-dipiridiles módszerrel a dehidroaszkorbinsav nem határozható meg közvetlenül [196]. Ennek természetesen nincsen komoly jelentősége, hiszen a növényi szövetekben a C-vitaminnak több, mint 95 %-a redukált (aszkorbinsav) formában van jelen [197]. Legfeljebb a C-vitamintartalom enyhe alulbecslését okozhatja.

Minta Citrom Narancs Paprika Paradicsom

Aszkorbinsav-tartalom (mg aszkorbinsav/100 g minta) Referencia (HPLC) α,α’-dipiridil OPDA OPDA-fluori 39,8 40,7 34,7 28,9 28,9 31,0 26,4 24,5 146,1 148,1 133,5 126,9 17,9 16,4 11,9 13,9

9. táblázat: A tesztelt módszerekkel végzett aszkorbinsav meghatározások eredményei. Az eredményeket kontroll mérésekkel korrigáltuk. A tapasztalati szórás egyik esetben sem haladta meg az 1 %-ot.

A specificitási probléma elkerülhető az aszkorbinsav-oxidáz enzim (EC 1.10.3.3.) alkalmazásával, mely igen specifikusan képes az aszkorbinsavat dehidroaszkorbinsavvá oxidálni [198, 199]. Ezt figyelembe véve az OPDA módszer specificitását nagyjából a HPLC módszerekéhez hasonlónak becsültük. Azonban az OPDA és OPDA-fluori módszerekkel minden minta esetében nagyjából 10 %-kal kevesebb aszkorbinsav-tartalmat mértünk, mint a HPLC-vel. Ez a különbség magyarázható az aszkorbinsav származékképzésével. Amikor egy mintában aszkorbinsav és dehidroaszkorbinsav egyszerre van jelen, akkor az OPDA a hozzáférhető dehidroaszkorbinsavval komplexet képez. Ezzel felborul az aszkorbinsav és dehidroaszkorbinsav közötti egyensúly, és még több dehidroaszkorbinsav képződik, mely aztán ugyancsak elreagálhat az OPDA-val, quinoxalin származékokat képezve. Lehetséges, hogy a folyamat végeredményeképpen, tévesen egy emelkedett dehidroaszkorbinsav szintet, és egy csökkent aszkorbinsav koncentrációt határozunk meg [195].

72

5.6.6 A vizsgált módszerek áteresztőképessége Olykor egy mérési módszer legfontosabb tulajdonsága az áteresztőképessége. Úgy gondoljuk, hogy az általunk kielemzett aszkorbinsav meghatározási technikákat leginkább kicsi, vagy közepes méretű (élelmiszeranalitikai) laboratóriumok alkalmazhatják sikerrel, ahol a megmérendő minták száma maximum napi néhány százra tehető. Mind az α,α’-dipiridiles, mind az OPDA módszerek áteresztőképessége jelentősen növelhető az abszorbancia vagy fluoreszcencia plate reader-rel történő detektálásával. Ebben az esetben (96 lyukú plate felhasználásával) 32 különböző minta aszkorbinsav-tartalma mérhető meg egyszerre 3 párhuzamos sorozatban, mindössze 5 perc műszeridő felhasználással. Az α,α’-dipiridiles módszernél 60 perces inkubációs időt alkalmazunk, mely jelentősen megnöveli az aszkorbinsav meghatározás időtartamát. Ezzel szemben az OPDA módszerek menete csak 10 perces inkubációt követel meg, ráadásul az OPDA-fluori mérésnél ugyancsak detektálhatunk speciális plate reader-rel, mely fluoreszcencia mérésére alkalmas. Bár az elemzéseknél a HPLC technikát tekintettük referencia módszernek, annak alkalmazásánál minimum 10 - 15 perc mérési idővel számolhatunk mintánként. Ebből kifolyólag nem igazán alkalmas nagy áteresztőképességű C-vitamintartalom meghatározásra.

73

6 Diszkusszió 6.1 A mitokondriális DNS depléció hatása az ALR fehérje expressziójára Az ALR fehérje szerepe több szempontból is a mitokondriumhoz köthető. Részt vesz a mitokondriumok

biogenezisében,

fenntartásában,

valamint

fiziológiás

működésük

szabályozásában is nélkülözhetetlen [64, 74, 186–188]. A mitokondriális diszulfidközvetítő rendszerből (melyet a MIA40 és az ALR alkot) származó elektronokat normális esetben a mitokondriális elektrontranszport lánc fogadja [72, 73]. Az ALR depléciójának mitokondriális funkciókra vonatkozó hatását már széles körben tanulmányozták. Ezzel szemben a fordított irányt, vagyis a mtDNS és az elektrontranszport lánc hiányának ALR-expresszióra kifejtett hatását ez idáig nem vizsgálták. Éppen ezért, kutatásunk során célul tűztük ki a mitokondriális respirációs lánc és a mtDNS ALR-expresszió szabályozásában betöltött szerepének felderítését. A mitokondriális légzési lánc deplécióját elérhetjük a mtDNS szelektív eliminálásával. Hosszú távú etídium-bromidos kezeléssel létrehozhatunk olyan sejteket, melyeknek teljes mtDNS állománya hiányzik, ebből kifolyólag funkcióképes légzési elektrontranszport lánccal sem rendelkeznek [175]. Kísérleteink kezdeti fázisában humán máj karcinóma eredetű HepG2 sejtvonalból hoztunk létre mtDNS-mentes ρ0-ás sejteket. Az mtDNS hiányát és a respirációs lánc funkcióképtelenségét real-time PCR módszerrel (14. ábra), és a sejtek oxigénfelvételének mérésével (15. ábra) is igazoltuk. Tekintve, hogy az ALR a májregeneráció folyamatában is fontos szerepet játszik [98, 189], két másik, nem májeredetű (MCF7 humán mell adenokarcinóma, és az SH-SY5Y humán neuroblasztóma eredetű) sejtvonalból is létrehoztunk ρ0-sejteket. A mtDNS hiányát real-time PCR technika segítségével ezekben a sejtekben is egyértelműen sikerült igazolnunk (14. ábra). A kísérletek második fázisában a mtDNS és a funkcióképes légzési lánc hiányának hatására az ALR mRNS szintjében esetlegesen bekövetkező változást vizsgáltuk reverz transzkripciót követő real-time PCR segítségével. Érdekes módon a vizsgált sejtvonalakban az mtDNS hiánya nem okozott detektálható különbséget az ALR mRNS expressziójában (1. táblázat). Ezzel szemben fehérje szinten markáns különbséget mutatott az ALR-expressziója a mtDN-depléció hatására (16. ábra). Ez az effektus biztosan nem lehet máj specifikus, hiszen a jelenséget a másik két, nem májeredetű (MCF7 és SH-SY5Y) sejtvonalon is kimutattuk. Azt 74

is megállapítottuk, hogy a mitokondriális diszulfidközvetítő rendszer másik tagja, a MIA40 fehérje szintje nem emelkedett együtt az ALR-rel (16. ábra). Az ezt követő kísérletekben arra próbáltunk választ találni, hogy milyen szabályozó faktor állhat az ALR-expresszió szignifikáns növekedésének hátterében. Az egyik lehetséges válasz az ATP szint lehet. Az már jól ismert tény, hogy az ALR hiánya az ATP szint csökkenéséhez vezet [187, 188]. Ebből kiindulva lehet arra esély, hogy a ρ0-sejtekben, működőképes respirációs lánc hiányában lecsökkent ATP szint az ALR fehérje szintjének emelkedését idézi elő. Ahhoz, hogy ezt leellenőrizzük, a normál sejteket az ATP szint csökkentése céljából különböző légzési inhibitorokkal és szétkapcsoló szerrel kezeltük. A kezelések hatására azonban nem tapasztaltunk semmilyen változást az ALR fehérje szintjében (17. ábra), így az ATP szint jó eséllyel nem játszik szerepet az ALR-expresszió szabályozásában. Az ALR szintjét befolyásoló faktor szerepére a második jelöltünk a reaktív oxigénvegyületek

voltak,

hiszen

a

ρ0-sejtekben

az

elektrontranszport

lánc

funkcióképtelensége a ROS termelés jelentős növekedésével jár együtt [200]. Köztudott, hogy a ROS termelés növelésének egyik leghatásosabb módja az elektrontranszport lánc (KOMPLEX III) antimicin A-val történő blokkolása [201]. Azonban a KOMPLEX III blokkolásából eredő ROS szint emelkedés sem váltotta ki az ALR-expresszió növekedését (17. ábra). Ugyanakkor a 2,4-dinitrofenol kezelés hatására kialakuló csökkent ROS szintnek sem volt hatása az ALR fehérje szintjére (17. ábra). Az ALR gén csendesítésének vagy kiütésének hatására megfigyelt kaszpáz-3 aktiváció [202] egy harmadik lehetőséget vet fel, miszerint az ALR anti-apoptotikus hatással bír a ρ0sejtekben. Ezt az eshetőséget a ρ0-sejtek apoptózissal szemben megfigyelt emelkedett ellenálló képessége is támogatja [203]. Az a megfigyelés, hogy a mitokondriális diszulfidközvetítő rendszer másik tagjának, a MIA40-nek nem változott együtt a szintje az ALR-rel (16. ábra), felveti annak lehetőségét, hogy az ALR szint emelkedése esetleg független lehet a mitokondriális oxidatív folding folyamatától. De az sincs kizárva, hogy az ALR szint növekedés megoldja a problémát azzal, hogy több elektront képes átvenni a MIA40-től, így annak expressziós növekedése szükségtelen. Úgy tűnik, hogy a mtDNS és/vagy egyes géntermékei szerepet játszanak az ALR fehérje szabályozásában. Korábban már megfigyelték két nukleárisan kódolt mitokondriális biogenezist szabályozó gén, az NRF-1 és a TFAM pozitív szabályozását ρ0-sejtekben [200]. A mtDNS depléciója a mitokondriális struktúra zavaraival, valamint a külső és belső membrán 75

rendezetlenségével jár együtt, ami ún. „szellem-szerű” mitokondriumok megjelenését okozza [44].

A

mitokondriális

biogenezisre

(a

mitokondriális

vázak

számára)

és

a

membránpotenciálra azonban nincs hatással a mtDNS elvesztése [44, 200, 204]. Tekintve, hogy az ALR részt vesz a mitokondriumok biogenezisében és fenntartásában [64, 74, 186– 188], az ALR májtól független pozitív irányú szabályozása a ρ0-sejtek adaptív válasza lehet, melynek segítségével a mtDNS-en kódolt fehérje komponensek kiesése ellenére is meg tudják őrizni a mitokondriális belső membrán integritását és a membrán két oldala közötti elektrokémiai gradienst is. Ezáltal az ALR a mtDNS hiánya, vagy a mitokondriális betegségekben és az öregedés során előforduló mtDNS mutációk esetében is hozzájárulhat a mitokondriális funkciók fenntartásához. A mitokondriumok biogeneziséről és fenntartásáról jelenleg még csak részleges információk állnak rendelkezésünkre. Az ALR ennek a gépezetnek egy fontos eleme lehet, és a mtDNS fontos szabályozó funkciót tölthet be az ALR fehérjeexpresszió szabályozásában. Az általunk megfigyelt effektusnak hatása lehet a humán patológiára is. Az ALR bizonyítottan rendelkezik májvédő hatással különböző proapoptotikus szerekkel - többek között alkohollal - kezelt humán hepatociták esetében [205]. Az ALR májspecifikus deléciója egerekben zsírmáj és májkarcinóma kialakulásához vezetett [188]. Ezek a megfigyelések mind azt sugallják, hogy az ALR egy potenciális májvédő faktor, mely érdemes lehet arra, hogy további klinikai vizsgálatoknak vessék alá.

6.2 C-vitamin transzporterek mitokondriális lokalizációja, in silico vizsgálatok alapján Hosszú éveken át tartotta magát az a feltételezés, hogy a C-vitamin főleg oxidált formájában, dehidroaszkorbinsavként, GLUT típusú transzportereken keresztül jut a mitokondriumba [161, 162]. A közelmúltban publikált újabb kísérleti eredmények azonban több szempontból is szembe mennek az eddigi megfigyelésekkel [166]. Az új vizsgálatok egyrészt megcáfolják egyes GLUT transzporterek addig szinte biztosra vett részvételét a folyamatban, másrészt SVCT típusú aszkorbinsav transzporterek mitokondriális lokalizációját is valószínűsítik. Ezen a ponton úgy gondoltuk érdemes lehet segítségül hívni az in silico predikciós módszerek eszköztárát, hogy kicsit tisztább képet kapjunk a C-vitamin mitokondriális transzportjáról az egymásnak ellentmondó in vitro és in vivo vizsgálati eredmények sokaságában. Mind az in vitro, mind az in vivo vizsgálati módszerek számos technikai 76

korlátba ütközhetnek, főleg a fehérjék fúziójának és jelölésének interferenciájából, valamint a keresztszennyezésből adódóan [178]. Emellett a szubcelluláris lokalizáció kísérletes meghatározása rendkívül időigényes és költséges. A számításos predikció ezzel szemben csak a fehérje szekvenciáját veszi alapul, meglehetősen gyors és viszonylag megbízható eredményeket ad. A predikciós eszközök által számított valószínűségi pontszámok általában jól összecsengnek a fehérjék lokalizációjának kísérletes vizsgálataiból nyert eredményekkel. Elfogadjuk Sprenger és munkatársai álláspontját, miszerint egyénileg egyetlen predikciós módszer érzékenységes sem elégséges [190], a vizsgálatainkhoz nyolc különböző, eltérő algoritmussal dolgozó predikciós szoftvert használtunk. Ezek a következők voltak: -

Target P [178]: neurális hálózatok kombinációját használja a valószínűségi pontszámok számításához, valamint egy súly mátrixot a peptidek hasítási helyeinek meghatározásához.

-

Mitoprot II [179]: tulajdonság-alapú módszer, mely a szekvencia számos jellemzőjét felhasználja, úgy mint az aminosav abundanciát, a maximális hidrofóbicitást és a maximális hidrofóbicitási momentumot (α-hélix amfifilicitást).

-

Predotar [180]: neurális hálózat alapú megközelítést képvisel.

-

Psort II [181]: a k-legközelebbi szomszéd (k-Nearest-Neighbors; k-NN) algoritmust használja.

-

MultiLoc/TargetLoc [182]: olyan tartóvektor-gép (Support Vector Machine; SVM) alapú megközelítést használ a szubcelluláris lokalizáció becsléséhez, mely N-terminális targeting szekvenciákat, aminosav összetételt és fehérje szekvencia motívumokat is figyelembe vesz.

-

ngLOC [183]: n-gram alapú Bayes-osztályozóként működik.

-

YLoc [184]: egy interpretálható web-szerver a szubcelluláris lokalizáció becslésére, mely gén ontológiai tulajdonságokat is használ.

-

CELLO [185]: egy többosztályos SVM alapú osztályozó rendszer, mely négy különböző szekvencia kódoló sémát használ.

Bár a különböző számítási algoritmusok a szubcelluláris lokalizáció becslésében változatos teljesítményt mutatnak, a mitokondrium az egyik legmegbízhatóbban prediktálható lokalizációs helyszín a kompartmentek között [190]. A vizsgálatok során négy, biztosan a mitokondriumban lokalizálódó szállító fehérjét választottunk ki, melyeket mitokondriális standardként használtunk. Ez a négy fehérje mind a nyolc predikciós szoftvertől magasabb pontszámot kapott a mitokondriális lokalizáció valószínűségére, mint a GLUT és az SVCT család bármelyik tagja (2., 3. és 4. táblázat). 77

Érdekesség, hogy az eredményekben kétféle változatosság figyelhető meg. Egyrészt egyértelműen megmutatkoznak a predikciós eszközök közötti különbségek (2. táblázat). Vannak közöttük szigorúbbak, melyek csak a legnagyobb valószínűség esetén jósolnak mitokondriális lokalizációt, és vannak olyanok is, melyek eltérő skálát használnak. Másrészt a mitokondriális standardok lokalizációs pontszámai között is különbségek figyelhetők meg. Ez alapján az etalonként használt négy fehérje három csoportba osztható. A nyolc predikciós eszközből hat nagyon magas pontszámot, kettő pedig közepes pontszámot ad a CPT2 mitokondriális lokalizációjára (2. táblázat). Ez arra utal, hogy a fehérje N-terminálisát a szoftverek magas valószínűséggel ismerték fel mitokondriális szignál szekvenciaként. A DIC viszont jelentősen alacsonyabb pontszámokat kapott a predikciós eszközök legtöbbjétől (ez alól kivételt képez a MultiLoc/TargetLoc és az ngLOC), tehát N-terminálisa szignál szekvenciáját sokkal kisebb valószínűséggel ismerték fel mitokondriálisként (2. táblázat). Az MPC2 és MPCP pedig közepes mitokondriális lokalizációs pontszámaikkal átmenetet képeznek a két véglet között (2. táblázat). A predikciós szoftverek (az ngLOC kivételével) a mitokondriális etalonként vizsgált fehérjékhez hasonlóan a GLUT1 mitokondriális lokalizációjára is nagy esélyt jósoltak (3. táblázat). A GLUT1 mitokondriális loklaizációjának nagy valószínűsége még egyértelműbb, ha pontszámait összehasonlítjuk a következő, GLUT2-től GLUT8-ig listázott GLUT transzporterekre, vagy a DIC mitokondriális etalonra kapott pontszámokkal (3. táblázat összevetve 2. táblázattal). A GLUT1-re kapott eredményeink jól összecsengnek KC és munkatársai korábbi, GFP-fúziós és immunoblot módszerekkel tett megfigyeléseivel [162]. A GLUT2, 3, 4 és 8, mind DHA transzporterként számon tartott fehérjék [154, 206–208], azonban mitokondriális lokalizációjuk nem valószínű, hiszen azt sem a predikciós szoftverektől kapott pontszámok, sem korábbi kísérleti eredmények nem támasztják alá. A nyolc predikciós szoftver közül öt magas pontszámot adott a GLUT9 mitokondriális lokalizációjára. Tekintve, hogy izoformáinak N-terminális (targeting) szekvenciái eltérőek, nem meglepő, hogy közülük az egyik, a b izoforma alacsonyabb pontszámokat kapott. Bár a GLUT9 (más néven SLC2A9) a GLUT családba tartozik, újabban elsődlegesen nagy kapacitású húgysav (urát) transzporter szerepkörét emelik ki, melynek segítségével glükózt és fruktózt képes húgysavra cserélni a membrán két oldala között [209, 210]. A húgysavat feszültségfüggő módon képes transzportálni, a negatív felől a pozitív irányba [211]. Sajnos egyelőre még csak az ER-ben, a Golgi-apparátusban és a lizoszómákban vizsgálták a fehérje lokalizációját. Az eddigi kísérleti eredmények alapján nehéz lenne bármit is mondani az SLC2A9 izoformák potenciális lokalizációjáról. Azonban az köztudott, hogy az urát csökkenti 78

a mitokondriális tömeget, valamint az enoil-CoA-hidratáz-1 expresszióját és az akonitáz-2 aktivitását is csökkentette humán aorta endothel sejtekből izolált mitokondriumokban [212]. Mindezek alapján a következő modellt feltételezzük: az SLC2A9a a mitokondriális membránban lokalizálódik, és húgysavat transzportál feszültség-dependens módon a mátrixból a citoszól felé (negatív felől a pozitív felé mutató irányban), ezzel pedig glükóz, vagy a glükózzal rokon vegyület, DHA felvételét váltja ki. Tehát feltételezésünk szerint az SLC2A9a amellett, hogy csökkenti a mitokondriumot terhelő magas urát-szintet, és az általa okozott ROS termelést és diszfunkciót, növeli az antioxidáns C-vitamin felvételét is. A GLUT10 mitokondriális lokalizációjára kapott pontszámok nagy meglepetést okoztak, hiszen ezek voltak a legalacsonyabbak (3. táblázat). Korábban NIH3T3 egér fibroblaszt és differenciált 3T3-L1 adipocita sejtek vizsgálatánál úgy találták, hogy a GLUT10-EGFP a Golgi-apparátusban lokalizálódik [163]. Emellett inzulinnal kezelt 3T3-L1 sejtekben a GLUT10-EGFP készlet egy részének mitokondriumban történő lokalizációját is megfigyelték.

Ehhez hasonlóan, A10 patkány aorta eredetű simaizom sejtekben is azt

találták, hogy a GLUT10-EGFP készletnek nagyjából fele a mitokondriumokban lokalizálódik mind normál, mind inzulinstimulált körülmények között. Ráadásul ezt az intracelluláris megoszlási mintázatot immunoblot technikával is igazolták [163]. Egy újabb, HEK-293 sejteken végzett tanulmányban a GLUT10-expresszió hiányát írták le, ezzel megkérdőjelezték a GLUT10 részvételét a mitokondriális DHA transzportban (legalábbis az adott sejttípust tekintve) [166]. Ezzel együtt az in silico vizsgálatunkból nyert nagyon alacsony predikciós pontszámok (3. táblázat) is kérdésessé teszik a GLUT10 mitokondriális (C-vitamin) transzporter szerepét. A MultiLoc és ngLoc kivételével minden predikciós szoftver magas pontszámot adott a GLUT11 mitokondriális lokalizációjára. Tekintve, hogy az 1., a 2. és 3. SLC2A11 izoforma a 4. izoformától különböző N-terminális (targeting) szekvenciával rendelkezik, nem meglepő, hogy mitokondriális lokalizációjuk valószínűségére is eltérő pontszámokat kaptak (3. táblázat), a legalacsonyabb predikciós pontszámot pedig a 4. izoforma kapta. A GLUT11 legközelebbi rokona a GLUT5 fruktóz transzporter, mellyel 42 % aminosav egyezést mutat [213]. Mindegyik izoforma képes transzportálni a glükózt és a fruktózt is, a galaktózt viszont nem. Lézeres pásztázó mikroszkópia alapján három vizsgált izoforma szubcelluláris lokalizációja megegyezik. Immunfehérjés vizsgálatok alapján a GLUT11 a sejtek felszínén, valamint egy intracelluláris kompartmentben lokalizálódik [214]. Sajnos ennél pontosabb kísérleti adatot ez idáig nem publikáltak. Minden esetre nem lehet kizárni, hogy a megfigyelt intracelluláris kompartment akár a mitokondrium is lehet. 79

A GLUT 12, mely Xenopus oocita expressziós rendszerben kifejezve alacsony glükóz transzport aktivitást mutatott, nem kapott magas pontszámot mitokondriális lokalizációjára (3. táblázat). Eredményeinkkel összhangban, úgy tűnik, hogy inkább a Golgi-apparátusban és a plazmamembránban lokalizálódik [215]. Kimutatták, hogy humán vázizomban inzulinnal akut módon stimulálható a GLUT12 transzlokációja az intracelluláris membránokról a plazmamembránra [216], valamint a fehérje túltermelése fokozza az inzulinérzékenységet egerekben [217]. Emellett

érdemes megjegyezni,

hogy a GLUT12 proton-függő

szimporterként képes működni, mely MDCK sejtvonalban glükózt transzportál koncentráció gradienssel szemben [218]. A GLUT13 (HMIT) összes izoformája nagy eséllyel lokalizálódik a mitokondriumban, mivel erre a legtöbb predikciós szoftver magas pontszámokat adott (3. táblázat). A GLUT13 vagy más néven HMIT egy H+ - mio-inozitol kotranszporter, melyet az SLC2A13 gén kódol [219]. A HMIT eredendően intracitoszólikus membránokban expresszálódik [220]. Így neuronok esetében például a Golgi-apparátusban lokalizálódik [221]. Bár a mitokondriumok esetében adott lenne a hajtóerő (H+-gradiens), a HMIT mitokondriális C-vitamin transzportban történő részvétele nem valószínű, tekintve, hogy cukor transzport aktivitása nem detektálható [221]. Valószínűsítik, hogy a GLUT14 a GLUT3-t kódoló gén duplikációjával keletkezett [220]. Így nem meglepő, hogy mitokondriális lokalizációja, a GLUT3-hoz hasonlóan, nem valószínű (3. táblázat). Ahogy már fentebb szó esett róla, egy újabb vizsgálatban a nátrium-dependens aszkorbinsav

transzporter

SVCT2

mitokondriális

expresszióját

mutatták

ki,

így

valószínűsíthető, hogy aszkorbinsav transzport is zajlik a mitokondriális belső membrán két oldala között [165, 166, 193]. A teljesség kedvéért az SVCT1 mitokondriális lokalizációját is megvizsgálták. Az SVCT1-et expresszáló, transzfektált HEK-293 sejtekben az SVCT1 a plazmamembránban lokalizálódott, így nem vett részt a mitokondriális aszkorbinsav transzportban [166]. A kísérletes eredményekkel összhangban, in silico vizsgálatunk sem valószínűsíti az SVCT1 izoformáinak mitokondriális lokalizációját (4. táblázat). Az SVCT1-gyel ellentétben az SVCT2 jó pontszámokat kapott mitokondriális lokalizációjának valószínűségére (4. táblázat). Ez az eredmény is összhangban van a korábban említett tanulmány konfokális lokalizációs, immunoblot és SVCT2 csendesítéses technikákkal meghatározott eredményeivel [166]. Az SVCT2 működéséhez a membrán két oldala között Na+-gradiens megléte szükséges. Energizált mitokondriumok esetén, melyek protonokat pumpálnak, azt feltételezik, 80

hogy a pH-gradiens alakítja a Na+-gradienst. Az in situ mitokondriális pH-gradiensre alapozva nagyjából kétszer akkora, vagy kicsit alacsonyabb Na+-gradienst becsülnek. A Na+ koncentráció a citoplazmában 8 mM, míg a mitokondriumban tipikusan 6 mM-os értékre tehető [222]. Ez a környezet lehetővé teszi, hogy az SVCT2 (alacsony affinitású) aszkorbinsav transzporterként működjön a mitokondriális membránban.

6.3 A mtDNS-depléció hatása a sejtek dehidroaszkorbinsav-felvételére Ahogy korábban láttuk az ER-ben a dehidroaszkorbinsav a PDI enzim szubsztrátjaként képes bekapcsolódni az oxidatív folding mechanizmusába. A DHA oxidálja a PDI enzim tiolcsoportjait, így az újra képes lesz diszulfidkötéseket kialakítani szubsztrátfehérjéinek szerkezetében [105, 146]. Ez alapján feltételeztük, hogy a DHA a mitokondriális oxidatív folding apparátus működését is támogathatja. Feltételezésünket az analógián kívül molekulaszerkezeti és elektrokémiai jellegzetességek is támogatják. Egyrészt a mitokondriális oxidatív foldingban szerepet játszó ALR fehérje aktív helyén, a PDI-hez hasonlóan, redox aktív CXXC motívumot tartalmaz [67]. Ehhez az ALR felxibilis N-doménjén lokalizált másik konzervált CXXC egység továbbítja a fehérjék oxidációja során felszabadult, MIA40 által közvetített elektronokat [67]. A molekulaszerkezetből adódóan a „transzfer-kar”-ként funkcionáló Ndomén csak egy másik N-domén, vagy kis molekulasúlyú redox partnerek (mint a DHA) által közelíthető meg [223]. Másrészt az elektronok ALR-ről DHA-ra történő átadásának elektrokémiai akadálya sincsen, hiszen az ALR -150 mV-os középponti redoxpotenciáljához viszonyítva [224] a DHA pozitívabb, +58 mV-os redoxpotenciállal rendelkezik [225]. Ez kellően nagy potenciálkülönbségnek nevezhető, bár a citokróm c a maga +250 mV-os redoxpotenciáljával [47] preferáltabb elektron akceptornak számít. Viszont megváltozik a helyzet, amennyiben sérül - a KOMPLEX IV citokróm c-oxidáz aktivitása révén - a folyamatból

érkező

elektronokat

fogadni

képes

mitokondriális

respirációs

lánc.

Feltételezésünk szerint ilyen körülmények között előtérbe kerülhet olyan kis molekulasúlyú, alternatív elektron akceptorok szerepvállalása, mint a DHA. Kísérletünkben elektrontranszport

lánc

a

sejteket

négyórás

funkcióvesztését

a

DHA-kezelésnek korábbi

vetettük

kísérleteinknél

is

alá.

Az

alkalmazott,

mesterségesen mtDNS-fosztott ρ0-sejtekkel modelleztük. Eredményeink szerint a négyórás kezelés alatt a ρ0-sejtek DHA-felvétele a második órában jelentősen megnőtt, majd egy közepes szintre állt be (18. ábra). Az általunk vizsgált 81

kontroll sejtek a ρ0-sejteknél hamarabb elérték ezt a maximumot, valószínűleg ennek köszönhető, hogy a kontroll sejtekről származó mintákban a DHA fogyás az első órában még jócskán meghaladta a ρ0-ás sejteknél tapasztaltat, a négyórás kezelés végére azonban a ρ 0- és kontroll sejtek DHA-fogyasztása egészen hasonló értéket mutatott. Biztatónak látszik, hogy a kontroll és ρ0-sejtek DHA-felvétele között egyértelmű különbség rajzolódik ki (18. ábra). Természetesen arra vonatkozóan, hogy a DHA a mitokondriális oxidatív folding alternatív elektron akceptora lehet, jelenlegi eredményeinkből egyértelmű következtetést nem vonhatunk le. Éppen ezért a jövőben tervezzük kontroll és ρ 0sejtek esetében az IMS-ben lokalizálódó szubsztrátfehérjék tiol csoportjainak AMS jelöléssel történő redox vizsgálatát. A módszer alapján egyértelműen elkülöníthetjük az oxidált (diszulfidhíddal rendelkező) és redukált (tiol állapotban lévő) fehérjéket, illetve nyomon követhetjük a DHA esetleges hatását is.

6.4 C-vitamin meghatározási módszerek alkalmazhatóságának jellemzése Napjainkban már számos analitikai módszer áll rendelkezésre az aszkorbinsav biológiai mintákból történő meghatározására [195]. Ezek közül az egyik legegyszerűbb az α,α’-dipiridiles meghatározás. Ez a módszer azon alapszik, hogy az aszkorbinsav a mintához adott vas(III)-ionokat vas(II)-vé redukálja, melynek α,α’-dipiridillel alkotott narancs-vörös színű komplexe spektrofotometriásan jól detektálható. Ortofoszforsav jelenlétében pH 1-2 értéken az egyéb redukáló és interferáló vegyületek, mint a reduktonok (karbonil csoporttal rendelkező éndiolok), a glukozon (2-ketoglükóz), a redukálósav (2,3-dihidroxiciklopent-2-én1-on), az α-tokoferol (E-vitamin), a glutation, a cisztein, az acetol (hiroxiaceton), a metilglioxál és a kreatinin hatása eliminálható, de legalábbis csökkenthető [196, 226]. A C-vitamin meghatározás specificitása enzim alkalmazásával is emelhető. Ez kivitelezhető

az

aszkorbinsav

dehidroaszkorbinsavvá,

melynek

aszkorbinsav-oxidáz orto-feniléndiaminnal

enzimmel (OPDA)

történő képzett

oxidálásával quinoxalin-

származéka fotometriásan detektálható. A keletkezett komplex a reakció végpontjában mind abszorbancia [198, 199], mind flureszcencia [227, 228] detektálás útján meghatározható. Az utóbbi években a HPLC vált az aszkorbinsav meghatározás preferált módszerévé, annak ellenére, hogy meglehetősen munkaigényes és költséges [198]. Kísérleteink során nagyszámú minta C-vitamintartalmának meghatározására volt szükség, így merült fel az igény, hogy a meglehetősen időigényes és költséges HPLC módszert egy gyorsan és egyszerűen kivitelezhető, nagy áteresztőképességű mérési 82

módszerrel váltsuk ki. Összesen három módszer analitikai teljesítményjelzőit vizsgáltuk meg, és vetettük össze az általunk alkalmazott HPLC módszerrel, hogy elfogulatlan képet alakíthassunk ki azok felhasználási lehetőségeiről. Mivel az analitikai módszerek alkalmazhatósága nagymértékben függ attól, hogy a mérési eredményeket mennyire befolyásolják a valós mintákban az analiton kívül jelenlévő, változatos mátrix-komponensek, a tesztelt módszerekkel négyféle, táplálkozásban fontos zöldség és gyümölcs Cvitamintartalmát határoztuk meg. Ezzel ugyanakkor élelmiszerminősítéssel foglalkozó laboratóriumok számára is értékes információkat gyűjtöttünk. Vizsgálatunkban a HPLC módszer mellett a fentebb részletezett α,α’-dipiridiles, valamint aszkorbinsav-oxidáz enzimet és OPDA-t alkalmazó módszereket teszteltük, utóbbit abszorbancia és fluoreszcencia detektálással (jelölése: OPDA, ill. OPDA-fluori) egyaránt. Méréseink és számításaink alapján a tesztelt módszerekkel kapcsolatban az alábbi következtetéseket vontuk le: Az OPDA-fluori módszert alacsony C-vitamintartalmú minták meghatározására tudjuk ajánlani, mivel kellően alacsony LoD és LoQ értékekkel rendelkezik (8. táblázat). Jóllehet, ez a módszer jellemezhető a legszűkebb lineáris tartománnyal is (5. táblázat). Fontos viszont megemlíteni, hogy a különböző gyümölcs és zöldség minták C-vitamintartalmát ez a módszer kissé alulbecsülte (9. táblázat), valószínűleg az aszkorbinsav származékképzése miatt. Sajnos a spektrofotometriás detektálással kombinált OPDA módszer analitikai tulajdonságai messze elmaradtak a többi módszerétől (5., 6., 7. és 8. táblázat). Emiatt alkalmazását nem tudjuk ajánlani. Az α,α’-dipiridiles módszer viszont minden tesztben kiegyensúlyozott teljesítményt nyújtott (5., 6., 7. és 8. táblázat). Ráadásul a zöldség és gyümölcs minták esetében ezzel a módszerrel mért értékek közelítették meg leginkább a HPLC-vel mért C-vitamintartalmakat (9. táblázat). Az is bebizonyosodott, hogy a módszer specificitási problémái ortofoszforsav alkalmazásával jól kezelhetők. Az

OPDA-fluori

módszerhez

hasonlóan

az

α,α’-dipiridiles

módszer

áteresztőképessége jelentősen megnövelhető, ha az abszorbanciát vagy fluoreszcenciát plate reader-rel határozzuk meg. A fenti tapasztalatokat összegezve a tesztelt módszerek közül az α,α’-dipiridiles módszer tűnik a legmegfelelőbbnek kis- és középméretű élelmiszerminősítő laboratóriumok számára, ahol a napi mintamennyiség nem haladja meg a néhány százat. Bár néhány paraméter esetében egészen elfogadható értékeket produkáltak a tesztelt C-vitamin meghatározási módszerek, érzékenység tekintetében nagyságrendekkel elmaradnak 83

a HPLC módszertől. Alapkutatást végző laboratóriumokban a legtöbb esetben nagyon változatos koncentrációjú és összetételű minták meghatározására van szükség. Ilyen körülmények között a vizsgált módszerek közül kizárólag a HPLC képes megfelelő szelektivitást, érzékenységet és megbízhatóságot nyújtani.

84

7 Összefoglalás A humán mitokondriális DNS (mtDNS) 16569 bázispárból álló, kettősszálú cirkuláris molekula, amely összesen 37 gént kódol: 13 polipeptidet a mitokondriális elektrontranszfer lánc részére, 2 rRNS-t és 22 tRNS-t a mitokondriális fehérjeszintézishez [28]. Magi védőhisztonok, valamint megfelelő DNS hibajavító rendszer hiányában a mtDNS jóval érzékenyebb a mutagén hatásokra (nagyobb mutációs rátával jellemezhető), mint a magi DNS. A mitokondriális DNS károsodások igen változatos klinikai képeket okozhatnak az enyhébb izomgyengeségtől a fatális gyermekkori megbetegedésekig [30]. Mivel a mitokondriális elektrontranszport lánc az oxidatív fehérje folding végső elektron akceptoraként is funkcionál [22, 72–74], megalapozottnak tűnik a feltételezés, hogy a mtDNS károsodás a fehérjék folding-rendszerének károsításával is hozzájárul a különböző patológiás elváltozások kialakulásához. A fenti feltételezést alapul véve, munkám során elsődlegesen a mtDNS, és azon keresztül a respirációs elektrontranszport lánc sérülésének mitokondriális oxidatív folding apparátusra kifejtett hatását vizsgáltam. Modell rendszerünkben a mtDNS károsodásának hatásait mesterségesen mtDNS-fosztott, ún. ρ0-sejteken tanulmányoztuk. Azt találtuk, hogy a mtDNS eliminálásának hatására a máj karcinóma eredetű HepG2 sejtvonalból létrehozott ρ0sejtekben mRNS szinten nem, fehérje szinten viszont jelentősen megemelkedett a mitokondriális oxidatív folding apparátusban szulfhidril-oxidázként funkcionáló ALR fehérje expressziója. Tekintve, hogy az ALR a májregeneráció folyamatában is fontos szerepet játszik [98, 189], felmerült annak lehetősége, hogy a HepG2 sejteken csak egy májspecifikus válaszreakciót mértünk ki. Ezt az eshetőséget azonban sikerült kizárnunk, hiszen két másik, nem májeredetű (MCF7 humán mell adenokarcinóma, és az SH-SY5Y humán neuroblasztóma eredetű) ρ0-sejtvonalon is az ALR fehérje szintjének markáns növekedését mutattuk ki. Modellünk finomításával igyekeztünk feltárni, milyen szabályozó faktor állhat az ALR szintjének növekedése hátterében. Ehhez a normál HepG2 sejteket specifikus respirációs komplex inhibitorokkal, valamint szétkapcsolószerrel kezeltük. Azt tapasztaltuk, hogy sem a légzési lánc inhibitorok, sem a szétkapcsolószer nem okozott változást az ALR expressziójában. Ebből több következtetést is levonhatunk. Egyrészt kizárhatjuk, hogy a kezelések hatására lecsökkent ATP szint állna az ALR szint szabályozása mögött. Másrészt a reaktív oxigénvegyületek (ROS) respirációs komplex blokkolókkal kiváltható emelkedésének, illetve szétkapcsolószer okozta csökkenésének szabályozó szerepe is kizárható. 85

A mitokondriális diszulfidközvetítő rendszer másik tagjának, a MIA40-nek is megvizsgáltuk az expresszióját ρ0-sejtvonalakon. Ennek szintjében azonban nem detektáltunk változást a kontroll sejtekhez képest. Ez a megfigyelés felveti annak lehetőségét, hogy az ALR szint emelkedése független lehet a mitokondriális oxidatív folding folyamatától, de az sincs kizárva, hogy az ALR szint növekedés megoldja a problémát azzal, hogy több elektront képes átvenni a MIA40-től, így annak expressziós növekedése szükségtelen. Tekintve, hogy az ALR részt vesz a mitokondriumok biogenezisében és fenntartásában [64, 74, 186–188], az ALR májtól független pozitív irányú szabályozása a ρ0-sejtek adaptív válasza lehet, melynek segítségével a mtDNS-en kódolt fehérje komponensek kiesése ellenére is meg tudják őrizni a mitokondriális belső membrán integritását és a membrán két oldala közötti elektrokémiai gradienst is. A C-vitamin oxidált formája, a dehidroaszkorbinsav az endoplazmás retikulumban képes oxidálni a protein diszulfid izomeráz (PDI) enzimet, mely a kompartmentben működő oxidatív folding apparátus központi tagjának tekinthető [105, 146]. Feltételezéseink szerint a DHA a folyamat mitokondriális alternatívájában is hasonló szerephez juthat. Így kísérleteink másik része a dehidroaszkorbinsav mitokondriális oxidatív foldingban potenciálisan betöltött alternatív elektron akceptor funkciójának tisztázására irányult. Korábbi kísérletek alapján azt feltételezték, hogy a C-vitamin főleg DHA formában, GLUT típusú transzportereken keresztül jut a mitokondriumba [161, 162], egy újabb vizsgálatban azonban az SVCT2 aszkorbinsav transzporter mitokondriális lokalizációját is kimutatták, valamint megcáfolták egyes GLUT transzporterek jelenlétét a kompartmentben [166]. Az egymásnak ellentmondó kísérleti eredmények tisztázása céljából in silico vizsgálatokkal igyekeztünk jellemezni a különböző GLUT és SVCT izoformák mitokondriális lokalizációjának

valószínűségét.

Vizsgálatunk

eredményei

alapján

a

korábban

mitokondriumban feltételezett két GLUT transzporter közül a GLUT1 kompartmentben való lokalizációját megerősítettük, viszont a GLUT10 mitokondriális jelenlétére a predikciós szoftverek csekély valószínűséget jósoltak. A predikciós pontszámok alapján a transzporter család két további tagja, a GLUT9 és GLUT11 mitokondriális DHA transzportban való részvételét is joggal valószínűsíthetjük. Az SVCT típusú aszkorbinsav transzporterek közül elemzésünk az SVCT1-gyel ellentétben az SVCT2 mitokondriális lokalizációjára nagy valószínűséget jósolt. Ez az eredmény is jól összecseng a korábbi, kolokalizációs, immunoblot és géncsendesítéses technikákkal nyert kísérletes eredményekkel [166]. Kísérleteink során nagyszámú minta C-vitamintartalmának meghatározására volt szükség, így merült fel az igény, hogy a meglehetősen időigényes és költséges HPLC 86

módszert egy gyorsan és egyszerűen kivitelezhető, nagy áteresztőképességű mérési módszerrel váltsuk ki. A HPLC módszer mellett egy α,α’-dipiridilt, valamint egy aszkorbinsav-oxidáz enzimet és OPDA-t alkalmazó módszer analitikai teljesítményjelzőit teszteltük, utóbbit abszorbancia és fluoreszcencia detektálással egyaránt. Tapasztalataink alapján az α,α’-dipiridiles, spektrofotometriás módszer tűnik a legmegfelelőbbnek kis- és középméretű laboratóriumok számára. Alapkutatást végző laboratóriumokban azonban a minták változatos koncentrációja és összetétele miatt a vizsgált módszerek közül kizárólag a HPLC képes megfelelő szelektivitást, érzékenységet és megbízhatóságot nyújtani.

87

8 Tézisek 1) Kimutattuk, hogy különböző humán sejtvonalak sejtjeiben a mitokondriális DNS depléciójának hatására az ALR (Augmenter of Liver Regeneration) expressziója fehérje szinten jelentősen megemelkedik, míg mRNS szinten változatlan marad. Az effektus nem szövet specifikus, mivel a vizsgált sejttípusok szöveti eredete különböző volt (HepG2 májkarcinóma, MCF7 mell adenokarcinóma, és SHSY5Y neuroblasztóma eredetű) [229]. 2) Kizártuk a sérült mitokondriális elektrontranszport lánc hatására megváltozó ATP vagy ROS szintek ALR-expressziót befolyásoló szerepét, mivel az ALR mennyisége nem mutat változást a sejtek specifikus respirációs komplex blokkoló, és mitokondriális szétkapcsoló szerekkel történő kezelésének hatására sem [229]. 3) Dehidroaszkorbinsav transzporterek mitokondriális lokalizációjának in silico vizsgálatával megerősítettük a GLUT1 transzporter kompartmentben való lokalizációját, ugyanakkor a GLUT10 mitokondriális jelenlétét megkérdőjelezzük [230]. 4) In silico vizsgálataink eredményei alapján valószínűsíthető két újabb, eddig nem ellenőrzött GLUT típusú transzporter, a GLUT9 és GLUT11 mitokondriális dehidroaszkorbinsav transzportban való részvétele [230]. 5) Predikciós szoftverek alkalmazásával megerősítettük az SVCT2 aszkorbinsav transzporter korábbi kísérletes eredmények alapján is feltételezett mitokondriális lokalizációját [230]. 6) Megállapítottuk, hogy az aszkorbinsav-oxidáz enzimet, orto-feniléndiamin komplexképzőt és fluoreszcens detektálást alkalmazó C-vitamin meghatározási módszer pontosság és precizitás tekintetében felülmúlja az elterjedten alkalmazott reverz fázisú HPLC módszert. Alkalmazását viszont szűk lineáris tartománya, és az

aszkorbinsav-dehidroaszkorbinsav

egyensúly

megbontásából

fakadó

torzítottsága korlátozza [231]. 7) Vizsgálatainkkal megállapítottuk, hogy az aszkorbinsav redukáló hatását kihasználó, vas(III)-klorid és α,α’-dipiridil reagenst alkalmazó spektrofotometriás C-vitamin meghatározási módszer kiegyensúlyozott analitikai teljesítménye mellett megbízható mérési eredményeket szolgáltat. A módszer ideálisan alkalmazható kis és közepes méretű élelmiszeranalitikai laboratóriumokban [231].

88

9 Publikációs lista A dolgozat alapját képző publikációk: Balogh Tibor, Lőrincz Tamás, Stiller Ibolya, Mandl József, Bánhegyi Gábor, Szarka András The Level of ALR is Regulated by the Quantity of Mitochondrial DNA Pathology Oncology Research, DOI: 10.1007/s12253-015-0020-y (2015), IF: 1,855 Szarka András, Balogh Tibor In silico aided thoughts on mitochondrial vitamin C transport Journal of Theoretical Biology 365, 181-189, DOI: 10.1016/j.jtbi.2014.10.015 (2015), IF: 2,116 Balogh Tibor, Szarka András A comparative study: Methods for the determination of ascorbic acid in small and middle sized food analytic laboratories Acta Alimentaria, DOI: 10.1556/AAlim.2015.0017 (2015), IF: 0,427 Balogh Tibor, Szarka András Egy multifunkcionális fehérje: az ALR Orvosi Hetilap 156 (13), 503-509, DOI: 10.1556/OH.2015.30119 (2015), IF: 2015-re vonatkozóan hirdetnek először Egyéb publikáció: Balogh Tibor, Szarka András Napfény és C-vitamin Élelmiszer - Tudomány Technológia 67 (3), 27-28 (2013)

89

Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, dr. Szarka Andrásnak, aki lehetővé tette, hogy kutatócsoportja tagjaként elkészítsem doktori dolgozatomat. Széleskörű elméleti tudásával és gyakorlati tapasztalataival is nélkülözhetetlen segítséget nyújtott kísérleteim elvégzéséhez. Köszönöm, hogy doktoráns éveim alatt állandó bizalmát és szűntelen támogatását élvezhettem. Köszönettel tartozom dr. Salgó Andrásnak és dr. Vértessy G. Beátának, hogy lehetőséget adtak arra, hogy a Budapesti Műszaki Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszéken végezhessem kutatásaimat. Szeretnék köszönetet mondani dr. Mandl József egyetemi tanárnak és dr. Bánhegyi Gábornak, a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai es Patobiokémiai Intézet igazgatójának, hogy a kísérleteimhez szükséges feltételek biztosításával hozzájárultak dolgozatom elkészítéséhez. Köszönettel tartozom dr. Stiller Ibolyának, aki segített elsajátítani a kísérletes munkavégzéshez szükséges alapvető technikákat. Szeretnék köszönetet mondani dr. Wunderlich Liviusnak és dr. Deák Veronikának munkám során nyújtott értékes szakmai tanácsaiért és önzetlen segítségéért. Külön köszönettel tartozom dr. Tomasskovics Bálintnak és Lőrincz Tamásnak, akik a gyakorlati munkában nyújtott értékes segítségük mellett szüntelen baráti támogatásukról is biztosítottak. Köszönettel tartozom a kutatócsoportom további munkatársainak: Buday Katalinnak, Csécsy Katalinnak, Czobor Ádámnak és Hajdinák Péternek munkám során nyújtott segítségükért és támogatásukért. Külön köszönetet szeretnék mondani a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány tisztelt kuratóriumi tagjainak, akik témám fontosságát felismerve, támogatást nyújtottak a kísérleteim befejezéséhez. Mindezek mellett szeretném megköszönni a Budapesti Műszaki Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék, valamint a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai es Patobiokémiai Intézet minden kedves és segítőkész munkatársának, akik hozzájárultak dolgozatom elkészüléséhez. Hálával tartozom a családomnak és barátaimnak belém vetett rendíthetetlen bizalmukért, és mindenkori támogatásukért.

90

Irodalomjegyzék 1.

Dill KA, MacCallum JL (2012) The protein-folding problem, 50 years on. Science 338:1042–6. doi: 10.1126/science.1219021

2.

Tőzsér J, Emri T, Csősz É (2011) Fehérjebiotechnológia. Debreceni Egyetem

3.

Schultz CP (2000) Illuminating folding intermediates. Nat Struct Biol 7:7–10. doi: 10.1038/71197

4.

Nelson DL, Cox MM (2008) Lehninger Principles of Biochamistry, 5th ed. W. H. Freeman and Company

5.

Cook KM, Hogg PJ (2013) Post-translational control of protein function by disulfide bond cleavage. Antioxid Redox Signal 18:1987–2015. doi: 10.1089/ars.2012.4807

6.

De Genst E, Messer A, Dobson CM (2014) Antibodies and protein misfolding: From structural research tools to therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta 1844:1907–1919. doi: 10.1016/j.bbapap.2014.08.016

7.

Hudson PJ, Souriau C (2003) Engineered antibodies. Nat Med 9:129–134. doi: 10.1038/nm0103-129

8.

Vaughan AT, Cragg MS, Beers SA (2015) Antibody modulation: Limiting the efficacy of therapeutic antibodies. Pharmacol Res 99:269–75. doi: 10.1016/j.phrs.2015.07.003

9.

Mogk A, Mayer MP, Deuerling E (2002) Mechanisms of protein folding: molecular chaperones and their application in biotechnology. Chembiochem 3:807–14. doi: 10.1002/14397633(20020902)3:9<807::AID-CBIC807>3.0.CO;2-A

10.

Baneyx F, Mujacic M (2004) Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol 22:1399–408. doi: 10.1038/nbt1029

11.

Yon JM (2001) Protein folding: a perspective for biology, medicine and biotechnology. Braz J Med Biol Res 34:419–35.

12.

Singh SM, Panda AK (2005) Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng 99:303–10. doi: 10.1263/jbb.99.303

13.

Derman AI, Prinz WA, Belin D, Beckwith J (1993) Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science 262:1744–7.

14.

Skerra A, Plückthun A (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 240:1038–41.

15.

Prusiner SB (1998) Prions. Proc Natl Acad Sci U S A 95:13363–83.

16.

Soto C (2003) Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci 4:49–60. doi: 10.1038/nrn1007

17.

Kyle RA (2001) Amyloidosis: a convoluted story. Br J Haematol 114:529–38.

18.

Chiti F, Dobson CM (2006) Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu Rev Biochem 75:333–66. doi: 10.1146/annurev.biochem.75.101304.123901

19.

Knowles TPJ, Vendruscolo M, Dobson CM (2014) The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol 15:384–96. doi: 10.1038/nrm3810

20.

Ecroyd H, Carver JA (2008) Unraveling the mysteries of protein folding and misfolding. IUBMB Life 60:769–74. doi: 10.1002/iub.117

21.

Martin JB (1999) Molecular basis of the neurodegenerative disorders. N Engl J Med 340:1970–80. doi: 10.1056/NEJM199906243402507

22.

Szarka A, Bánhegyi G (2011) Oxidative folding: recent developments. Biomol Concepts 2:1–12. doi: 10.1515/BMC.2011.038

23.

Betz SF (1993) Disulfide bonds and the stability of globular proteins. Protein Sci 2:1551–8. doi: 10.1002/pro.5560021002

91

24.

Narayan M, Welker E, Wedemeyer WJ, Scheraga H a (2000) Oxidative folding of proteins. Acc Chem Res 33:805–12.

25.

Riemer J, Bulleid N, Herrmann JM (2009) Disulfide formation in the ER and mitochondria: two solutions to a common process. Science 324:1284–7. doi: 10.1126/science.1170653

26.

Wedemeyer WJ, Welker E, Narayan M, Scheraga HA (2000) Disulfide bonds and protein folding. Biochemistry 39:4207–16.

27.

Chacinska A, Koehler CM, Milenkovic D, et al. (2009) Importing Mitochondrial Proteins: Machineries and Mechanisms. Cell 138:628–644. doi: 10.1016/j.cell.2009.08.005

28.

Taylor RW, Turnbull DM (2005) Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet 6:389–402. doi: 10.1038/nrg1606

29.

Yu M, Shi Y, Wei X, et al. (2007) Depletion of mitochondrial DNA by ethidium bromide treatment inhibits the proliferation and tumorigenesis of T47D human breast cancer cells. Toxicol Lett 170:83–93. doi: 10.1016/j.toxlet.2007.02.013

30.

McFarland R, Turnbull DM (2009) Batteries not included: diagnosis and management of mitochondrial disease. J Intern Med 265:210–28. doi: 10.1111/j.1365-2796.2008.02066.x

31.

Gabaldón T, Huynen MA (2004) Shaping the mitochondrial proteome. Biochim Biophys Acta 1659:212–20. doi: 10.1016/j.bbabio.2004.07.011

32.

Okamoto K, Shaw JM (2005) Mitochondrial morphology and dynamics in yeast and multicellular eukaryotes. Annu Rev Genet 39:503–36. doi: 10.1146/annurev.genet.38.072902.093019

33.

Piechota J, Szczesny R, Wolanin K, et al. (2006) Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochim Pol 53:485–95.

34.

Armand R, Channon JY, Kintner J, et al. (2004) The effects of ethidium bromide induced loss of mitochondrial DNA on mitochondrial phenotype and ultrastructure in a human leukemia T-cell line (MOLT-4 cells). Toxicol Appl Pharmacol 196:68–79. doi: 10.1016/j.taap.2003.12.001

35.

Desjardins P, Frost E, Morais R (1985) Ethidium bromide-induced loss of mitochondrial DNA from primary chicken embryo fibroblasts. Mol Cell Biol 5:1163–9.

36.

Nass MM (1970) Abnormal DNA patterns in animal mitochondria: ethidium bromide-induced breakdown of closed circular DNA and conditions leading to oligomer accumulation. Proc Natl Acad Sci U S A 67:1926–33.

37.

Nass MM (1972) Differential effects of ethidium bromide on mitochondrial and nuclear DNA synthesis in vivo in cultured mammalian cells. Exp Cell Res 72:211–22.

38.

Leibowitz RD (1971) The effect of ethidium bromide on mitochondrial DNA synthesis and mitochondrial DNA structure in HeLa cells. J Cell Biol 51:116–22.

39.

Smith CA, Jordan JM, Vinograd J (1971) In vivo effects of intercalating drugs on the superhelix density of mitochondrial DNA isolated from human and mouse cells in culture. J Mol Biol 59:255–72.

40.

Horwitz HB, Holt CE (1971) Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J Cell Biol 49:546–53.

41.

Meyer RR, Simpson M V. (1969) DNA biosynthesis in mitochondria: Differential inhibition of mitochondrial and nuclear DNA polymerases by the mutagenic dyes ethidium bromide and acriflavin. Biochem Biophys Res Commun 34:238–244. doi: 10.1016/0006-291X(69)90637-8

42.

Wiseman A, Attardi G (1978) Reversible tenfod reduction in mitochondria DNA content of human cells treated with ethidium bromide. Mol Gen Genet 167:51–63.

43.

Kukat A, Kukat C, Brocher J, et al. (2008) Generation of rho0 cells utilizing a mitochondrially targeted restriction endonuclease and comparative analyses. Nucleic Acids Res 36:e44. doi: 10.1093/nar/gkn124

44.

Holmuhamedov E, Jahangir A, Bienengraeber M, et al. (2003) Deletion of mtDNA disrupts mitochondrial function and structure, but not biogenesis. Mitochondrion 3:13–9. doi: 10.1016/S15677249(03)00053-9

45.

Doremus HD, Jagendorf AT (1985) Subcellular localization of the pathway of de novo pyrimidine

92

nucleotide biosynthesis in pea leaves. Plant Physiol 79:856–61. 46.

Gray MW, Burger G, Lang BF (1999) Mitochondrial evolution. Science 283:1476–81.

47.

Sideris DP, Tokatlidis K (2010) Oxidative protein folding in the mitochondrial intermembrane space. Antioxid Redox Signal 13:1189–204. doi: 10.1089/ars.2010.3157

48.

Neupert W, Herrmann JM (2007) Translocation of proteins into mitochondria. Annu Rev Biochem 76:723–49. doi: 10.1146/annurev.biochem.76.052705.163409

49.

Milenkovic D, Müller J, Stojanovski D, et al. (2007) Diverse mechanisms and machineries for import of mitochondrial proteins. Biol Chem 388:891–7. doi: 10.1515/BC.2007.097

50.

Rehling P, Model K, Brandner K, et al. (2003) Protein insertion into the mitochondrial inner membrane by a twin-pore translocase. Science 299:1747–51. doi: 10.1126/science.1080945

51.

Kutik S, Stojanovski D, Becker L, et al. (2008) Dissecting membrane insertion of mitochondrial betabarrel proteins. Cell 132:1011–24. doi: 10.1016/j.cell.2008.01.028

52.

Beilharz T, Egan B, Silver PA, et al. (2003) Bipartite signals mediate subcellular targeting of tailanchored membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 278:8219–23. doi: 10.1074/jbc.M212725200

53.

Otera H, Taira Y, Horie C, et al. (2007) A novel insertion pathway of mitochondrial outer membrane proteins with multiple transmembrane segments. J Cell Biol 179:1355–63. doi: 10.1083/jcb.200702143

54.

Stojanovski D, Guiard B, Kozjak-Pavlovic V, et al. (2007) Alternative function for the mitochondrial SAM complex in biogenesis of alpha-helical TOM proteins. J Cell Biol 179:881–93. doi: 10.1083/jcb.200706043

55.

Kemper C, Habib SJ, Engl G, et al. (2008) Integration of tail-anchored proteins into the mitochondrial outer membrane does not require any known import components. J Cell Sci 121:1990–8. doi: 10.1242/jcs.024034

56.

Herrmann JM, Hell K (2005) Chopped, trapped or tacked--protein translocation into the IMS of mitochondria. Trends Biochem Sci 30:205–11. doi: 10.1016/j.tibs.2005.02.005

57.

Deponte M, Hell K (2009) Disulphide bond formation in the intermembrane space of mitochondria. J Biochem 146:599–608. doi: 10.1093/jb/mvp133

58.

Hu J, Dong L, Outten CE (2008) The redox environment in the mitochondrial intermembrane space is maintained separately from the cytosol and matrix. J Biol Chem 283:29126–34. doi: 10.1074/jbc.M803028200

59.

Koehler CM (2004) The small Tim proteins and the twin Cx3C motif. Trends Biochem Sci 29:1–4. doi: 10.1016/j.tibs.2003.11.003

60.

Kawamata H, Manfredi G (2008) Different regulation of wild-type and mutant Cu,Zn superoxide dismutase localization in mammalian mitochondria. Hum Mol Genet 17:3303–17. doi: 10.1093/hmg/ddn226

61.

Kawamata H, Manfredi G (2010) Import, maturation, and function of SOD1 and its copper chaperone CCS in the mitochondrial intermembrane space. Antioxid Redox Signal 13:1375–84. doi: 10.1089/ars.2010.3212

62.

Banci L, Bertini I, Cefaro C, et al. (2009) MIA40 is an oxidoreductase that catalyzes oxidative protein folding in mitochondria. Nat Struct Mol Biol 16:198–206. doi: 10.1038/nsmb.1553

63.

Fischer M, Horn S, Belkacemi A, et al. (2013) Protein import and oxidative folding in the mitochondrial intermembrane space of intact mammalian cells. Mol Biol Cell 24:2160–70. doi: 10.1091/mbc.E12-120862

64.

Lisowsky T (1992) Dual function of a new nuclear gene for oxidative phosphorylation and vegetative growth in yeast. Mol Gen Genet 232:58–64.

65.

Becher D, Kricke J, Stein G, Lisowsky T (1999) A mutant for the yeast scERV1 gene displays a new defect in mitochondrial morphology and distribution. Yeast 15:1171–1181. doi: 10.1002/(SICI)10970061(19990915)15:12<1171::AID-YEA443>3.0.CO;2-T

93

66.

Gatzidou E, Kouraklis G, Theocharis S (2006) Insights on augmenter of liver regeneration cloning and function. 12:4951–4958.

67.

Banci L, Bertini I, Calderone V, et al. (2011) Molecular recognition and substrate mimicry drive the electron-transfer process between MIA40 and ALR. Proc Natl Acad Sci U S A 108:4811–4816. doi: 10.1073/pnas.1014542108

68.

Wu C-K, Dailey TA, Dailey HA, et al. (2003) The crystal structure of augmenter of liver regeneration: A mammalian FAD-dependent sulfhydryl oxidase. Protein Sci 12:1109–18. doi: 10.1110/ps.0238103

69.

Coppock DL, Thorpe C Multidomain flavin-dependent sulfhydryl oxidases. Antioxid Redox Signal 8:300–11. doi: 10.1089/ars.2006.8.300

70.

Allen S, Balabanidou V, Sideris DP, et al. (2005) Erv1 mediates the Mia40-dependent protein import pathway and provides a functional link to the respiratory chain by shuttling electrons to cytochrome c. J Mol Biol 353:937–44. doi: 10.1016/j.jmb.2005.08.049

71.

Farrell and Thorpe, C. SR (2005) Augmenter of liver regeneration: a flavin dependent sulfhydryl oxidase with cytochrome C reductase activity. Biochemistry 44:1532–1541.

72.

Dabir D V, Leverich EP, Kim S-K, et al. (2007) A role for cytochrome c and cytochrome c peroxidase in electron shuttling from Erv1. EMBO J 26:4801–4811. doi: 10.1038/sj.emboj.7601909

73.

Bihlmaier K, Mesecke N, Terziyska N, et al. (2007) The disulfide relay system of mitochondria is connected to the respiratory chain. J Cell Biol 179:389–395. doi: 10.1083/jcb.200707123

74.

Di Fonzo A, Ronchi D, Lodi T, et al. (2009) The mitochondrial disulfide relay system protein GFER is mutated in autosomal-recessive myopathy with cataract and combined respiratory-chain deficiency. Am J Hum Genet 84:594–604. doi: 10.1016/j.ajhg.2009.04.004

75.

LaBrecque DR, Pesch LA (1975) Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance (SS) from rat liver. J Physiol 248:273–84.

76.

LaBrecque DR (1991) Hepatic stimulator substance. Discovery, characteristics and mechanism of action. Dig Dis Sci 36:669–73.

77.

Starzl TE, Jones AF, Terblanche J, et al. (1979) Growth-stimulating factor in regenerating canine liver. Lancet (London, England) 1:127–30.

78.

van Hoorn-Hickman R, Kahn D, Green J, et al. Is there a regeneration stimulator substance in the effluent from perfused partially hepatectomized livers? Hepatology 1:287–93.

79.

Fleig WE, Lehmann H, Wagner H, et al. (1986) Hepatic regenerative stimulator substance in the rabbit. Relation to liver regeneration after partial hepatectomy. J Hepatol 3:19–26.

80.

Francavilla A, Ove P, Polimeno L, et al. (1987) Extraction and partial purification of a hepatic stimulatory substance in rats, mice, and dogs. Cancer Res 47:5600–5.

81.

Francavilla A, Barone M, Van Thiel DH, et al. (1991) Further steps of hepatic stimulatory substance purification. Dig Dis Sci 36:674–680. doi: 10.1007/BF01297037

82.

Hagiya M, Francavilla a, Polimeno L, et al. (1994) Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc Natl Acad Sci U S A 91:8142–8146. doi: 10.1073/pnas.92.7.3076a

83.

Giorda R, Hagiya M, Seki T, et al. (1996) Analysis of the structure and expression of the augmenter of liver regeneration (ALR) gene. Mol Med 2:97–108.

84.

Chen X, Li Y, Wei K, et al. (2003) The potentiation role of hepatopoietin on activator protein-1 is dependent on its sulfhydryl oxidase activity. J Biol Chem 278:49022–30. doi: 10.1074/jbc.M304057200

85.

Gandhi CR, Murase N, Starzl TE (2010) Cholera toxin-sensitive GTP-binding protein-coupled activation of augmenter of liver regeneration (ALR) receptor and its function in rat kupffer cells. J Cell Physiol 222:365–73. doi: 10.1002/jcp.21957

86.

Mesecke N, Terziyska N, Kozany C, et al. (2005) A disulfide relay system in the intermembrane space of mitochondria that mediates protein import. Cell 121:1059–69. doi: 10.1016/j.cell.2005.04.011

87.

Wang G, Yang X, Zhang Y, et al. (1999) Identification and characterization of receptor for mammalian

94

hepatopoietin that is homologous to yeast ERV1. J Biol Chem 274:11469–72. 88.

Li Y, Li M, Xing G, et al. (2000) Stimulation of the mitogen-activated protein kinase cascade and tyrosine phosphorylation of the epidermal growth factor receptor by hepatopoietin. J Biol Chem 275:37443–7. doi: 10.1074/jbc.M004373200

89.

Ilowski M, Putz C, Weiss TS, et al. (2010) Augmenter of liver regeneration causes different kinetics of ERK1/2 and Akt/PKB phosphorylation than EGF and induces hepatocyte proliferation in an EGF receptor independent and liver specific manner. Biochem Biophys Res Commun 394:915–20. doi: 10.1016/j.bbrc.2010.03.074

90.

Dayoub R, Thasler WE, Bosserhoff AK, et al. (2006) Regulation of polyamine synthesis in human hepatocytes by hepatotrophic factor augmenter of liver regeneration. Biochem Biophys Res Commun 345:181–7. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.04.040

91.

Thasler WE, Dayoub R, Mühlbauer M, et al. (2006) Repression of cytochrome P450 activity in human hepatocytes in vitro by a novel hepatotrophic factor, augmenter of liver regeneration. J Pharmacol Exp Ther 316:822–9. doi: 10.1124/jpet.105.094201

92.

Higaki I, Matsui-Yuasa I, Hirohashi K, et al. The role of polyamines in growth factor induced DNA synthesis in cultured rat hepatocytes. Hepatogastroenterology 46:1874–9.

93.

Luk GD (1986) Essential role of polyamine metabolism in hepatic regeneration. Inhibition of deoxyribonucleic acid and protein synthesis and tissue regeneration by difluoromethylornithine in the rat. Gastroenterology 90:1261–7.

94.

Lu J, Xu W-X, Zhan Y-Q, et al. (2002) Identification and characterization of a novel isoform of hepatopoietin. World J Gastroenterol 8:353–6.

95.

Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. (2000) Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol 35:112–9.

96.

Vujanovic NL, Polimeno L, Azzarone A, et al. (1995) Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J Immunol 154:6324–38.

97.

Michalopoulos GK (2007) Liver regeneration. J Cell Physiol 213:286–300. doi: 10.1002/jcp.21172

98.

Gandhi CR (2012) Augmenter of liver regeneration. Fibrogenesis Tissue Repair 5:10. doi: 10.1186/1755-1536-5-10

99.

Lange H, Lisowsky T, Gerber J, et al. (2001) An essential function of the mitochondrial sulfhydryl oxidase Erv1p / ALR in the maturation of cytosolic Fe / S proteins. EMBO Rep 2:715–720.

100.

Du J, Cullen JJ, Buettner GR (2012) Ascorbic acid: chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim Biophys Acta 1826:443–57. doi: 10.1016/j.bbcan.2012.06.003

101.

Packer L (1997) Vitamin C in Health and Disease. CRC Press

102.

Szent-Györgyi A (1928) Observations on the function of peroxidase systems and the chemistry of the adrenal cortex: Description of a new carbohydrate derivative. Biochem J 22:1387–1409.

103.

Padh H (1990) Cellular functions of ascorbic acid. Biochem Cell Biol 68:1166–73.

104.

Mandl J, Szarka A, Bánhegyi G (2009) Vitamin C: update on physiology and pharmacology. Br J Pharmacol 157:1097–110. doi: 10.1111/j.1476-5381.2009.00282.x

105.

Szarka A, Lőrincz T (2014) The role of ascorbate in protein folding. Protoplasma 251:489–97. doi: 10.1007/s00709-013-0560-5

106.

Nishikimi M, Yagi K (1991) Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am J Clin Nutr 54:1203S–1208S.

107.

BURNS JJ (1957) Missing step in man, monkey and guinea pig required for the biosynthesis of Lascorbic acid. Nature 180:553.

108.

Chaudhuri CR, Chatterjee IB (1969) L-ascorbic acid synthesis in birds: phylogenetic trend. Science 164:435–6.

95

109.

Birney EC, Jenness R, Ayaz KM (1976) Inability of bats to synthesise L-ascorbic acid. Nature 260:626– 8.

110.

Dabrowski K (1990) Gulonolactone oxidase is missing in teleost fish. The direct spectrophotometric assay. Biol Chem Hoppe Seyler 371:207–14.

111.

Buettner GR, Jurkiewicz BA (1996) Catalytic metals, ascorbate and free radicals: combinations to avoid. Radiat Res 145:532–41.

112.

Englard S, Seifter S (1986) The biochemical functions of ascorbic acid. Annu Rev Nutr 6:365–406. doi: 10.1146/annurev.nu.06.070186.002053

113.

GOLDBERGER RF, EPSTEIN CJ, ANFINSEN CB (1963) Acceleration of reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by a microsomal system from rat liver. J Biol Chem 238:628–35.

114.

VENETIANER P, STRAUB FB (1963) The enzymic reactivation of reduced ribonuclease. Biochim Biophys Acta 67:166–8.

115.

VENETIANER P, STRAUB FB (1964) THE MECHANISM OF ACTION OF THE RIBONUCLEASEREACTIVATING ENZYME. Biochim Biophys Acta 89:189–90.

116.

Hewitson KS, McNeill LA, Elkins JM, Schofield CJ (2003) The role of iron and 2-oxoglutarate oxygenases in signalling. Biochem Soc Trans 31:510–515. doi: 10.1042/BST0310510

117.

Myllyharju J (2004) Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends Genet 20:33–43. doi: 10.1016/j.tig.2003.11.004

118.

Myllylä R, Majamaa K, Günzler V, et al. (1984) Ascorbate is consumed stoichiometrically in the uncoupled reactions catalyzed by prolyl 4-hydroxylase and lysyl hydroxylase. J Biol Chem 259:5403–5.

119.

Tschank G, Sanders J, Baringhaus KH, et al. (1994) Structural requirements for the utilization of ascorbate analogues in the prolyl 4-hydroxylase reaction. Biochem J 300 ( Pt 1:75–9.

120.

Kivirikko KI, Shudo K, Sakakibara S, Prockop DJ (1972) Studies on protocollagen lysine hydroxylase. Hydroxylation of synthetic peptides and the stoichiometric decarboxylation of -ketoglutarate. Biochemistry 11:122–9.

121.

Kivirikko KI, Myllylä R, Pihlajaniemi T (1989) Protein hydroxylation: prolyl 4-hydroxylase, an enzyme with four cosubstrates and a multifunctional subunit. FASEB J 3:1609–17.

122.

Pihlajaniemi T, Myllylä R, Kivirikko KI (1991) Prolyl 4-hydroxylase and its role in collagen synthesis. J Hepatol 13 Suppl 3:S2–7.

123.

Myllyharju J (2003) Prolyl 4-hydroxylases, the key enzymes of collagen biosynthesis. Matrix Biol 22:15–24.

124.

Braakman I, Bulleid NJ (2011) Protein folding and modification in the mammalian endoplasmic reticulum. Annu Rev Biochem 80:71–99. doi: 10.1146/annurev-biochem-062209-093836

125.

Turpeenniemi-Hujanen TM, Puistola U, Kivirikko KI (1980) Isolation of lysyl hydroxylase, an enzyme of collagen synthesis, from chick embryos as a homogeneous protein. Biochem J 189:247–53.

126.

Semenza GL (2003) Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 3:721–32. doi: 10.1038/nrc1187

127.

Myllyharju J (2008) Prolyl 4-hydroxylases, key enzymes in the synthesis of collagens and regulation of the response to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med 40:402–17. doi: 10.1080/07853890801986594

128.

Tu BP, Weissman JS (2004) Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences. J Cell Biol 164:341–6. doi: 10.1083/jcb.200311055

129.

Tu BP (2000) Biochemical Basis of Oxidative Protein Folding in the Endoplasmic Reticulum. Science (80- ) 290:1571–1574. doi: 10.1126/science.290.5496.1571

130.

Sevier CS, Kaiser C a (2008) Ero1 and redox homeostasis in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta 1783:549–56. doi: 10.1016/j.bbamcr.2007.12.011

131.

Gruber CW, Cemazar M, Heras B, et al. (2006) Protein disulfide isomerase: the structure of oxidative

96

folding. Trends Biochem Sci 31:455–64. doi: 10.1016/j.tibs.2006.06.001 132.

Csala M, Margittai E, Bánhegyi G (2010) Redox control of endoplasmic reticulum function. Antioxid Redox Signal 13:77–108. doi: 10.1089/ars.2009.2529

133.

Bass R, Ruddock LW, Klappa P, Freedman RB (2004) A major fraction of endoplasmic reticulumlocated glutathione is present as mixed disulfides with protein. J Biol Chem 279:5257–62. doi: 10.1074/jbc.M304951200

134.

Hwang C, Sinskey AJ, Lodish HF (1992) Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. Science 257:1496–502.

135.

Dixon BM, Heath S-HD, Kim R, et al. (2008) Assessment of endoplasmic reticulum glutathione redox status is confounded by extensive ex vivo oxidation. Antioxid Redox Signal 10:963–72. doi: 10.1089/ars.2007.1869

136.

Bánhegyi G, Lusini L, Puskás F, et al. (1999) Preferential transport of glutathione versus glutathione disulfide in rat liver microsomal vesicles. J Biol Chem 274:12213–6.

137.

Tu BP, Weissman JS (2002) The FAD- and O(2)-dependent reaction cycle of Ero1-mediated oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Cell 10:983–94.

138.

Pollak N, Dölle C, Ziegler M (2007) The power to reduce: pyridine nucleotides--small molecules with a multitude of functions. Biochem J 402:205–18. doi: 10.1042/BJ20061638

139.

Bublitz C, Lawler CA (1987) The levels of nicotinamide nucleotides in liver microsomes and their possible significance to the function of hexose phosphate dehydrogenase. Biochem J 245:263–7.

140.

Margittai É, Csala M, Mandl J, Bánhegyi G (2009) Participation of low molecular weight electron carriers in oxidative protein folding. Int J Mol Sci 10:1346–1359. doi: 10.3390/ijms10031346

141.

Cuozzo JW, Kaiser CA (1999) Competition between glutathione and protein thiols for disulphide-bond formation. Nat Cell Biol 1:130–5. doi: 10.1038/11047

142.

Csala M, Fulceri R, Mandl J, et al. (2003) Glutathione transport in the endo/sarcoplasmic reticulum. Biofactors 17:27–35.

143.

Szarka A, Stadler K, Jenei V, et al. (2002) Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation in rat liver endoplasmic reticulum. J Bioenerg Biomembr 34:317–23.

144.

Dawson CR, Strothkamp KG, Krul KG (1975) Ascorbate oxidase and related copper proteins. Ann N Y Acad Sci 258:209–20.

145.

Csala M, Mile V, Benedetti A, et al. (2000) Ascorbate oxidation is a prerequisite for its transport into rat liver microsomal vesicles. Biochem J 349:413–5.

146.

Wells WW, Xu DP, Yang YF, Rocque PA (1990) Mammalian thioltransferase (glutaredoxin) and protein disulfide isomerase have dehydroascorbate reductase activity. J Biol Chem 265:15361–4.

147.

Saaranen MJ, Karala A-R, Lappi A-K, Ruddock LW (2010) The role of dehydroascorbate in disulfide bond formation. Antioxid Redox Signal 12:15–25. doi: 10.1089/ars.2009.2674

148.

Niki E (1987) Interaction of ascorbate and alpha-tocopherol. Ann N Y Acad Sci 498:186–99.

149.

Bánhegyi G, Benedetti A, Margittai É, et al. (2014) Subcellular compartmentation of ascorbate and its variation in disease states. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res 1843:1909–1916. doi: 10.1016/j.bbamcr.2014.05.016

150.

Corti A, Casini AF, Pompella A (2010) Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch Biochem Biophys 500:107–115. doi: 10.1016/j.abb.2010.05.014

151.

Liang WJ, Johnson D, Jarvis SM (2001) Vitamin C transport systems of mammalian cells. Mol Membr Biol 18:87–95.

152.

Daruwala R, Song J, Koh WS, et al. (1999) Cloning and functional characterization of the human sodium-dependent vitamin C transporters hSVCT1 and hSVCT2. FEBS Lett 460:480–4.

153.

Vera JC, Rivas CI, Fischbarg J, Golde DW (1993) Mammalian facilitative hexose transporters mediate the transport of dehydroascorbic acid. Nature 364:79–82. doi: 10.1038/364079a0

97

154.

Rumsey SC, Kwon O, Xu GW, et al. (1997) Glucose transporter isoforms GLUT1 and GLUT3 transport dehydroascorbic acid. J Biol Chem 272:18982–9.

155.

Tsukaguchi H, Tokui T, Mackenzie B, et al. (1999) A family of mammalian Na+-dependent L-ascorbic acid transporters. Nature 399:70–5. doi: 10.1038/19986

156.

Wilson JX (2005) Regulation of vitamin C transport. Annu Rev Nutr 25:105–25. doi: 10.1146/annurev.nutr.25.050304.092647

157.

Montel-Hagen A, Kinet S, Manel N, et al. (2008) Erythrocyte Glut1 triggers dehydroascorbic acid uptake in mammals unable to synthesize vitamin C. Cell 132:1039–48. doi: 10.1016/j.cell.2008.01.042

158.

Montel-Hagen A, Sitbon M, Taylor N (2009) Erythroid glucose transporters. Curr Opin Hematol 16:165–72. doi: 10.1097/MOH.0b013e328329905c

159.

Wilson JX (2002) The physiological role of dehydroascorbic acid. FEBS Lett 527:5–9.

160.

Ingebretsen OC, Normann PT (1982) Transport of ascorbate into guinea pig liver mitochondria. Biochim Biophys Acta - Biomembr 684:21–26. doi: 10.1016/0005-2736(82)90044-X

161.

Szarka A, Horemans N, Bánhegyi G, Asard H (2004) Facilitated glucose and dehydroascorbate transport in plant mitochondria. Arch Biochem Biophys 428:73–80. doi: 10.1016/j.abb.2004.05.011

162.

KC S, Cárcamo JM, Golde DW (2005) Vitamin C enters mitochondria via facilitative glucose transporter 1 (Glut1) and confers mitochondrial protection against oxidative injury. FASEB J 19:1657–67. doi: 10.1096/fj.05-4107com

163.

Lee Y-C, Huang H-Y, Chang C-J, et al. (2010) Mitochondrial GLUT10 facilitates dehydroascorbic acid import and protects cells against oxidative stress: mechanistic insight into arterial tortuosity syndrome. Hum Mol Genet 19:3721–33. doi: 10.1093/hmg/ddq286

164.

Li X, Cobb CE, Hill KE, et al. (2001) Mitochondrial uptake and recycling of ascorbic acid. Arch Biochem Biophys 387:143–53. doi: 10.1006/abbi.2000.2245

165.

Azzolini C, Fiorani M, Cerioni L, et al. (2013) Sodium-dependent transport of ascorbic acid in U937 cell mitochondria. IUBMB Life 65:149–53. doi: 10.1002/iub.1124

166.

Muñoz-Montesino C, Roa FJ, Peña E, et al. (2014) Mitochondrial ascorbic acid transport is mediated by a low-affinity form of the sodium-coupled ascorbic acid transporter-2. Free Radic Biol Med 70:241–54. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2014.02.021

167.

Winkler BS (1987) In vitro oxidation of ascorbic acid and its prevention by GSH. Biochim Biophys Acta - Gen Subj 925:258–264. doi: 10.1016/0304-4165(87)90190-5

168.

Xu DP, Wells WW (1996) alpha-Lipoic acid dependent regeneration of ascorbic acid from dehydroascorbic acid in rat liver mitochondria. J Bioenerg Biomembr 28:77–85.

169.

Lee SR, Kim JR, Kwon KS, et al. (1999) Molecular cloning and characterization of a mitochondrial selenocysteine-containing thioredoxin reductase from rat liver. J Biol Chem 274:4722–34.

170.

Li X, Cobb CE, May JM (2002) Mitochondrial recycling of ascorbic acid from dehydroascorbic acid: dependence on the electron transport chain. Arch Biochem Biophys 403:103–10. doi: 10.1016/S00039861(02)00205-9

171.

May JM, Li L, Qu Z-C, Cobb CE (2007) Mitochondrial recycling of ascorbic acid as a mechanism for regenerating cellular ascorbate. Biofactors 30:35–48.

172.

Gruss-Fischer T, Fabian I (2002) Protection by ascorbic acid from denaturation and release of cytochrome c, alteration of mitochondrial membrane potential and activation of multiple caspases induced by H2O2, in human leukemia cells. Biochem Pharmacol 63:1325–1335. doi: 10.1016/S00062952(02)00863-8

173.

Perez-Cruz I, Carcamo JM, Golde DW (2003) Vitamin C inhibits FAS-induced apoptosis in monocytes and U937 cells. Blood 102:336–43. doi: 10.1182/blood-2002-11-3559

174.

Dhar-Mascareño M, Cárcamo JM, Golde DW (2005) Hypoxia-reoxygenation-induced mitochondrial damage and apoptosis in human endothelial cells are inhibited by vitamin C. Free Radic Biol Med 38:1311–22. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2005.01.017

98

175.

King MP, Attardi G (1996) Isolation of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods Enzymol 264:304–13.

176.

Trimmer PA, Keeney PM, Borland MK, et al. (2004) Mitochondrial abnormalities in cybrid cell models of sporadic Alzheimer’s disease worsen with passage in culture. Neurobiol Dis 15:29–39.

177.

Dayoub R, Wagner H, Bataille F, et al. (2011) Liver regeneration associated protein (ALR) exhibits antimetastatic potential in hepatocellular carcinoma. Mol Med 17:221–228. doi: 10.2119/molmed.2010.00117

178.

Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, von Heijne G (2000) Predicting Subcellular Localization of Proteins Based on their N-terminal Amino Acid Sequence. J Mol Biol 300:1005–1016. doi: 10.1006/jmbi.2000.3903

179.

Claros MG, Vincens P (1996) Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur J Biochem 241:779–786.

180.

Small I, Peeters N, Legeai F, Lurin C (2004) Predotar: A tool for rapidly screening proteomes for Nterminal targeting sequences. Proteomics 4:1581–90. doi: 10.1002/pmic.200300776

181.

Nakai K, Horton P (1999) PSORT: a program for detecting sorting signals in proteins and predicting their subcellular localization. Trends Biochem Sci 24:34–6.

182.

Hoglund A, Donnes P, Blum T, et al. (2006) MultiLoc: prediction of protein subcellular localization using N-terminal targeting sequences, sequence motifs and amino acid composition. Bioinformatics 22:1158–1165. doi: 10.1093/bioinformatics/btl002

183.

King BR, Vural S, Pandey S, et al. (2012) ngLOC: software and web server for predicting protein subcellular localization in prokaryotes and eukaryotes. BMC Res Notes 5:351. doi: 10.1186/1756-05005-351

184.

Briesemeister S, Rahnenfuhrer J, Kohlbacher O (2010) YLoc--an interpretable web server for predicting subcellular localization. Nucleic Acids Res 38:W497–W502. doi: 10.1093/nar/gkq477

185.

Yu C-S, Chen Y-C, Lu C-H, Hwang J-K (2006) Prediction of protein subcellular localization. Proteins 64:643–51. doi: 10.1002/prot.21018

186.

Lisowsky T (1994) ERV1 is involved in the cell-division cycle and the maintenance of mitochondrial genomes in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet 26:15–20.

187.

Thirunavukkarasu C, Wang LF, Harvey S a K, et al. (2008) Augmenter of liver regeneration: an important intracellular survival factor for hepatocytes. J Hepatol 48:578–88. doi: 10.1016/j.jhep.2007.12.010

188.

Gandhi CR, Chaillet JR, Nalesnik M a., et al. (2015) Liver-Specific Deletion of Augmenter of Liver Regeneration Accelerates Development of Steatohepatitis and Hepatocellular Carcinoma in Mice. Gastroenterology 148:379–391.e4. doi: 10.1053/j.gastro.2014.10.008

189.

Francavilla A, Hagiya M, Porter KA, et al. (1994) Augmenter of liver regeneration: its place in the universe of hepatic growth factors. Hepatology 20:747–57.

190.

Sprenger J, Fink JL, Teasdale RD (2006) Evaluation and comparison of mammalian subcellular localization prediction methods. BMC Bioinformatics 7 Suppl 5:S3. doi: 10.1186/1471-2105-7-S5-S3

191.

Petsalaki EI, Bagos PG, Litou ZI, Hamodrakas SJ (2006) PredSL: a tool for the N-terminal sequencebased prediction of protein subcellular localization. Genomics Proteomics Bioinformatics 4:48–55. doi: 10.1016/S1672-0229(06)60016-8

192.

Mueckler M, Thorens B (2013) The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med 34:121–38. doi: 10.1016/j.mam.2012.07.001

193.

Guidarelli A, Cerioni L, Fiorani M, et al. (2014) Mitochondrial ascorbic acid is responsible for enhanced susceptibility of U937 cells to the toxic effects of peroxynitrite. Biofactors 40:236–46. doi: 10.1002/biof.1139

194.

McGown EL, Rusnak MG, Lewis CM, Tillotson JA (1982) Tissue ascorbic acid analysis using ferrozine compared with the dinitrophenylhydrazine method. Anal Biochem 119:55–61.

99

195.

Washko PW, Welch RW, Dhariwal KR, et al. (1992) Ascorbic acid and dehydroascorbic acid analyses in biological samples. Anal Biochem 204:1–14.

196.

Omaye ST, Turnbull JD, Sauberlich HE (1979) Selected methods for the determination of ascorbic acid in animal cells, tissues, and fluids. Methods Enzymol 62:3–11.

197.

Zsigmond L, Tomasskovics B, Deák V, et al. (2011) Enhanced activity of galactono-1,4-lactone dehydrogenase and ascorbate-glutathione cycle in mitochondria from complex III deficient Arabidopsis. Plant Physiol Biochem 49:809–15. doi: 10.1016/j.plaphy.2011.04.013

198.

Lee W, Roberts SM, Labbe RF (1997) Ascorbic acid determination with an automated enzymatic procedure. Clin Chem 43:154–7.

199.

Vermeir S, Hertog ML a TM, Schenk a, et al. (2008) Evaluation and optimization of high-throughput enzymatic assays for fast l-ascorbic acid quantification in fruit and vegetables. Anal Chim Acta 618:94– 101. doi: 10.1016/j.aca.2008.04.035

200.

Miranda S, Foncea R, Guerrero J, Leighton F (1999) Oxidative stress and upregulation of mitochondrial biogenesis genes in mitochondrial DNA-depleted HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 258:44– 49. doi: 10.1006/bbrc.1999.0580

201.

Boveris a, Chance B (1973) The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J 134:707–716.

202.

Polimeno L, Pesetti B, De Santis F, et al. (2012) Decreased expression of the Augmenter of Liver Regeneration results in increased apoptosis and oxidative damage in human-derived glioma cells. Cell Death Dis 3:e289. doi: 10.1038/cddis.2012.25

203.

Lee MS, Kim JY, Park SY (2004) Resistance of ρ0 cells against apoptosis. Ann N Y Acad Sci 1011:146–153. doi: 10.1196/annals.1293.015

204.

Li K, Neufer PD, Williams RS (1995) Nuclear responses to depletion of mitochondrial DNA in human cells. Am J Physiol 269:C1265–C1270.

205.

Ilowski M, Kleespies A, de Toni EN, et al. (2011) Augmenter of liver regeneration (ALR) protects human hepatocytes against apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 404:148–52. doi: 10.1016/j.bbrc.2010.11.083

206.

Rumsey SC, Daruwala R, Al-Hasani H, et al. (2000) Dehydroascorbic acid transport by GLUT4 in Xenopus oocytes and isolated rat adipocytes. J Biol Chem 275:28246–53. doi: 10.1074/jbc.M000988200

207.

Mardones L, Ormazabal V, Romo X, et al. (2011) The glucose transporter-2 (GLUT2) is a low affinity dehydroascorbic acid transporter. Biochem Biophys Res Commun 410:7–12. doi: 10.1016/j.bbrc.2011.05.070

208.

Corpe CP, Eck P, Wang J, et al. (2013) Intestinal dehydroascorbic acid (DHA) transport mediated by the facilitative sugar transporters, GLUT2 and GLUT8. J Biol Chem 288:9092–101. doi: 10.1074/jbc.M112.436790

209.

Caulfield MJ, Munroe PB, O’Neill D, et al. (2008) SLC2A9 is a high-capacity urate transporter in humans. PLoS Med 5:e197. doi: 10.1371/journal.pmed.0050197

210.

Vitart V, Rudan I, Hayward C, et al. (2008) SLC2A9 is a newly identified urate transporter influencing serum urate concentration, urate excretion and gout. Nat Genet 40:437–42. doi: 10.1038/ng.106

211.

Anzai N, Ichida K, Jutabha P, et al. (2008) Plasma urate level is directly regulated by a voltage-driven urate efflux transporter URATv1 (SLC2A9) in humans. J Biol Chem 283:26834–8. doi: 10.1074/jbc.C800156200

212.

Sánchez-Lozada LG, Lanaspa MA, Cristóbal-García M, et al. (2012) Uric acid-induced endothelial dysfunction is associated with mitochondrial alterations and decreased intracellular ATP concentrations. Nephron Exp Nephrol 121:e71–8. doi: 10.1159/000345509

213.

Doege H, Bocianski A, Scheepers A, et al. (2001) Characterization of human glucose transporter (GLUT) 11 (encoded by SLC2A11), a novel sugar-transport facilitator specifically expressed in heart and skeletal muscle. Biochem J 359:443–9.

214.

Scheepers A, Schmidt S, Manolescu A, et al. (2005) Characterization of the human SLC2A11 (GLUT11)

100

gene: alternative promoter usage, function, expression, and subcellular distribution of three isoforms, and lack of mouse orthologue. Mol Membr Biol 22:339–51. doi: 10.1080/09687860500166143 215.

Flessner LB, Moley KH (2009) Similar [DE]XXXL[LI] motifs differentially target GLUT8 and GLUT12 in Chinese hamster ovary cells. Traffic 10:324–33. doi: 10.1111/j.1600-0854.2008.00866.x

216.

Stuart CA, Howell MEA, Zhang Y, Yin D (2009) Insulin-stimulated translocation of glucose transporter (GLUT) 12 parallels that of GLUT4 in normal muscle. J Clin Endocrinol Metab 94:3535–42. doi: 10.1210/jc.2009-0162

217.

Purcell SH, Aerni-Flessner LB, Willcockson AR, et al. (2011) Improved insulin sensitivity by GLUT12 overexpression in mice. Diabetes 60:1478–82. doi: 10.2337/db11-0033

218.

Pujol-Giménez J, Barrenetxe J, González-Muniesa P, Lostao MP (2013) The facilitative glucose transporter GLUT12: what do we know and what would we like to know? J Physiol Biochem 69:325–33. doi: 10.1007/s13105-012-0213-8

219.

Uldry M, Ibberson M, Horisberger JD, et al. (2001) Identification of a mammalian H(+)-myo-inositol symporter expressed predominantly in the brain. EMBO J 20:4467–77. doi: 10.1093/emboj/20.16.4467

220.

Augustin R (2010) The protein family of glucose transport facilitators: It’s not only about glucose after all. IUBMB Life 62:315–33. doi: 10.1002/iub.315

221.

Di Daniel E, Mok MH, Mead E, et al. (2009) Evaluation of expression and function of the H+/myoinositol transporter HMIT. BMC Cell Biol 10:54. doi: 10.1186/1471-2121-10-54

222.

Murphy E, Eisner DA (2009) Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease. Circ Res 104:292–303. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.108.189050

223.

Riemer J, Fischer M, Herrmann JM (2011) Oxidation-driven protein import into mitochondria: Insights and blind spots. Biochim Biophys Acta - Biomembr 1808:981–989. doi: 10.1016/j.bbamem.2010.06.003

224.

Tienson HL, Dabir D V, Neal SE, et al. (2009) Reconstitution of the mia40-erv1 oxidative folding pathway for the small tim proteins. Mol Biol Cell 20:3481–90. doi: 10.1091/mbc.E08-10-1062

225.

Meurant G (1985) Vitamins and Hormones: Advances in Research and ApplicationsVolume 42. Academic Press

226.

Koenig R, Schiefelbusch T, Johnson C (1943) Chromogenic Reagent for Vitamin C Determinations. Ind Eng Chem Anal Ed 15:181–182. doi: 10.1021/i560115a010

227.

Wu X, Diao Y, Sun C, et al. (2003) Fluorimetric determination of ascorbic acid with ophenylenediamine. Talanta 59:95–9.

228.

Vislisel JM, Schafer FQ, Buettner GR (2007) A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal Biochem 365:31–9. doi: 10.1016/j.ab.2007.03.002

229.

Balogh T, Lőrincz T, Stiller I, et al. (2015) The Level of ALR is Regulated by the Quantity of Mitochondrial DNA. Pathol Oncol Res. doi: 10.1007/s12253-015-0020-y

230.

Szarka A, Balogh T (2015) In silico aided thoughts on mitochondrial vitamin C transport. J Theor Biol 365:181–189. doi: 10.1016/j.jtbi.2014.10.015

231.

Balogh T, Szarka A (2015) A comparative study: Methods for the determination of ascorbic acid in small and middle sized food analytic laboratories. Acta Aliment 1–9. doi: 10.1556/AAlim.2015.0017

101