1
A. JUDUL PENELITIAN Skrining Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol 70% Sepuluh Daun Tanaman Terhadap Bakteri Klebsiella Pneumoniae
B. LATAR BELAKANG Klebsiella pneumoniae adalah bakteri Gram-negatif, non-motil, tidak berkapsul, memfermentasi laktosa, bersifat anaerob fakultatif yang merupakan kelompok Enterobakteriaceae (Elmer et al., 2006). K. pneumoniae mempunyai dua habitat yaitu di lingkungan dan permukaan mukosa mamalia. K. pneumoniae dapat ditemukan pada habitat lingkungan seperti permukaan air, tanah, dan tanaman. Pada permukaan mukosa mamalia dapat ditemukan pada manusia, kuda, dan babi (Podschun and Ullman, 1998). K. pneumoniae merupakan bakteri patogen penyebab gangguan pernapasan. Pneumonia yang disebabkan oleh K. pneumoniae dapat berupa pneumonia komuniti (community acquired pneumonia). Jenis bakteri ini banyak menginfeksi manusia (Elfidasariet al., 2013), seperti infeksi nosokomial. K. Pneumoniae merupakan penyebab Penyakit Paru Obstruksi Kronik (PPOK), terutama pada pasien yang menggunakan ventilator (Sonita and Masri, 2014). Menurut Podschun and Ullman (1998) K. pnumoniae selain menyebabkan PPOK juga dapat menyebabkan penyakit lain seperti infeksi saluran kemih (ISK) dan septikemia. Laboratorium Mikrobiologi RSUP Dr. M. Djamil Padang menyatakan bahwa K. pneumoniae merupakan penyebab PPOK tertinggi dengan persentase 42,44% (Sonita and Masri, 2014). Tingginya persentase PPOK yang disebabkan oleh K. pneumoniae maka diperlukan terapi dengan antibiotik. World Health Organization (WHO) menyatakan bahwa antibiotika yang telah ditetapkan sebagai terapi empiris PPOK eksaserbasi akut yaitu amoksisilin, eritromisin, dan kloramfenikol (WHO cit. Sonita and Masri, 2014). Sonita dan Masri (2014) menyatakan bahwa K. pneumoniae memiliki tingkat resistensi terhadap antibiotik ampisilin (76%), sulfametoksazol dan trimetroprim (71%) dan eritromisin (69%). Pada penelitian tersebut juga
2
menyatakan bahwa K. pneumoniae memiliki tingkat sensitivitas paling tinggi pada antibiotik seperti netilmisin (53%). Selain netilmisin, K. pneumoniae memiliki
sensitivitas
pada
antibiotik
meropenem
dan
seftazidin.
K. pneumoniae sensitif pada obat tersebut, akan tetapi penggunaan obat-obat tersebut baru dipasarkan sehingga penggunaan antibiotik ini tidak terlalu sering, jumlahnya terbatas dan pertimbangan efek samping obat seperti nefrotoksik, ruam, diare, mual, dan muntah (Sonita dan Masri, 2014). Berdasarkan hal tersebut perlu adanya alternatif lain atau terobosan baru dalam mengembangkan pengobatan bahan alam karena efektif lebih aman tanpa efek samping. Bahan alam dari tumbuhan diharapkan menjadi solusi bagi masyarakat untuk dijadikan salah satu pengobatan alternatif untuk mengatasi penyakit yang ditimbulkan oleh K. pneumoniae. Tumbuhan yang ada di alam banyak ditemukan disekitar lingkungan masyarakat sehingga mudah untuk diperoleh serta terjangkau dalam hal biaya. Penelitian ini menggunakan sepuluh sampel daun tanaman yaitu daun kersen, daun salam, daun belimbing wuluh, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong, daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu. Penelitian ini akan menggunakan sepuluh daun tanaman yangtelah teruji memiliki aktivitas antibakteri. Sepuluh daun tanaman yang telah diteliti sebelumnya menggunakan pelarut yaitu etanol dan metanol. Ekstrak etanol daun kersen (Muntingia calabura L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Eschericia coli dengan diameter zona hambat sebesar 12,3 mm (Buhian et al., 2016), ekstrak etanol daun bambu mampu menghambat K. pneumoniae dengan Ø zona hambat sebesar 15,00 mm (Wasnik and Tumane, 2014), ekstrak etanol daun rambutan (Nephelium lappaceum) mampu menghambat pertumbuhan E. coli dengan Ø zona hambat sebesar 9,00 mm (Nethaji et al., 2015) dan ekstrak etanol daun kelengkeng (Dimocarpus longan) dapat menghambat aktivitas Staphyllococcus aureus dengan diameter daerah hambat sebesar 6,8 mm (Wisitsak et al., 2012). Penelitian yang menggunakan pelarut metanol yaitu ekstrak metanol daun sukun (Artocarpus altilis) dengan konsentrasi 30 mg/mL sebanyak
3
20 µL dapat menghambat aktivitas Pseudomonas aeruginosa dengan diameter daerah hambat sebesar 10 mm (Pradhan et al., 2013), ekstrak metanol daun salam (Eugenia polyantha) dengan volume 25µL dapat menghambat pertumbuhan P. aeruginosa dengan diameter daerah hambat 7 mm (Gowri and Vasantha, 2014), ekstrak metanol daun binahong (Anredera cordifolia) memiliki aktivitas terhadap bakteri P. aeruginosa dengan Konsentrasi Hambat Minimum sebesar 256 µg/mL (Nuryanti et al., 2014), ekstrak metanol daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi Linn) dengan konsentrasi 400 µg/disk dapat menghambat aktivitas P. aeruginosa dengan diameter hambat sebesar 6,5 ± 0,44 mm (Das et al., 2011), ekstrak metanol daun alpukat (Persea americana) dengan konsentrasi 50 mg/mL dapat menghambat pertumbuhan bakteri K. pneumoniae dengan diameter zona hambat sebesar 2,0 mm (Ogundare and Oladejo, 2014), dan ekstrak metanol daun kayu putih (Melaleuca leucadendra) memiliki aktivitas terhadap Staphylococcus aureus dengan diameter zona hambat sebesar 12,33 ± 0,57 mm (Al-Abd et al., 2015). Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri sepuluh ekstrak daun tanaman terhadap K. pneumoniae dan mengetahui golongan senyawa ekstrak daun yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi.
C. RUMUSAN MASALAH Berdasarkan latar belakang di atas, maka pada penelitian ini dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: 1. Apakah ekstrak etanol 70% daun kersen, daun salam, daun belimbing wuluh, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong, daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Klebsiella pneumoniae? 2. Apakah golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak daun tanaman yang memiliki diameter hambat terbesar? 3. Apakah golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam ekstrak daun tanaman yang memiliki diameter hambat terbesar?
4
D. TUJUAN PENELITIAN Berdasarkan latar belakang dan rumusan masalah maka tujuan penelitian ini adalah: 1. Mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol 70% daun kersen, daun salam, daun belimbing wuluh, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong, daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu terhadap Klebsiella pneumoniae 2. Mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak daun tanaman yang memiliki diameter hambat terbesar. 3. Mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam ekstrak daun tanaman yang memiliki diameter hambat terbesar.
E. TINJAUAN PUSTAKA 1. Klebsiella pneumoniae Klasifikasi K. pneumoniae : Kingdom
: Bacteria
Phylum
: Proteobacteria
Class
: Gamma Proteobacteria
Order
: Enterobacteriales
Family
: Enterobacteriaceae
Genus
: Klebsiella
Species
: K.pneumoniae
Binomial name
: Klebsiella pneumoniae (Shaiket al., 2014)
a. Morfologi Klebsiella pneumoniae (Gambar 1) termasuk Gram negatif dan bersifat anaerob fakultatif. Bakteri Klebsiella berbentuk basil atau batang, tidak berspora, tidak bergerak, dan memiliki kapsul (Shaiket al., 2014). Anggota genus Klebsiella memiliki 2 tipe antigen pada permukaan sel yaitu antigen O dan antigen K. Antigen O merupakan bagian terluar dari lipopolisakarida dinding sel dan terdiri atas unit polisakarida yang berulang. Antigen K beradadi luar antigen O dan
5
merupakan suatu capsular polysacharida. Antigen K dapat mengganggu aglutinasi melalui antiserum O dan berhubungan dengan virulensi (Sirkawar and Batra, 2011).
(A)
(B)
Gambar 1. (A) Koloni Klebsiella pneumoniae (Elfidasari et al., 2014) dan (B) Bentuk sel Klebsiellapneumoniae (Shaiket al., 2014).
b. Sifat Biokimiawi Klebsiella pneumoniae merupakan proteobacteria, dapat memfermentasi laktosa dan bakteri ini tidak mampu tumbuh pada suhu 10⁰C (Shaiket al., 2014). Spesies Klebsiella biasanya diidentifikasi dan dibedakan dengan cara menguji reaksi biokimia. K. pneumoniae menghasilkan lisin dekarboksilase tetapi tidak menghasilkan ornitin dekarboksilase dan pada umumnya K. pneumoniae dengan uji Voges-Proskauer (VP) hasilnya positif (Podschun and Ullman, 1998).
c. Patogenesis K. pneumonia merupakan salah satu bakteri yang menyebabkan penyakit pneumonia komuniti seperti PPOK. Penyakit tersebut disebabkan karena adanya penggunaan ventilator. Angka kejadian infeksi K. pneumoniae terhadap pasien yang menderita PPOK dari tahun 2011-2012 sebanyak 42,44%. Pada penderita PPOK, K. pneumonia memiliki sensitifitas terhadap antibiotik netilmisin (Sonita and Masri, 2014).
6
2. Kersen Senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak etanol daun kersen adalah sterol, flavonoid, alkaloid, saponin, glikosida dan tanin. Ekstrak etanol daun kersen memiliki aktivitas antibakteri terhadap Eschericia coli dengan diameter zona hambat sebesar 12,3 mm (Buhian et al., 2016)
3. Rambutan Senyawa yang terkandung dalam daun rambutan yaitu steroid, alkaloid, flavonoid, tanin, dan triterpenoid dan ekstrak etanol daun rambutan memiliki potensi dalam menghambat aktivitas E. coli dengan diameter daerah hambat sebesar 9 mm (Nethaji et al., 2015).
4. Kelengkeng Daun kelengkeng memiliki golongan senyawa sterol, glikosida, flavonoid dan tanin (Khaled and Gerda, 2013). Ekstrak etanol daun kelengkeng miliki efek antibakteri terhadap E.coli dengan daerah hambat sebesar 6,8 mm (Wisitsak et al., 2012)
5. Bambu Ekstrak etanol daun bambu memliki golongan senyawa yaitu alkaloid, flavonoid, tanin, steroid, diterpen, dan saponin. Senyawa aktif yang diduga memiliki aktivitas antibakteri yaitu alkaloid, flavonoid, dan tanin. Ekstrak etanol daun bambu memiliki aktivitas antibakteri terhadap K. pneumoniae dengan zona hambat 15,00 mm sedangkan ekstrak metanol daun bambu hanya mampu menghambat aktivitas K. pneumoniae dengan zona hambat sebesar 12,00 mm (Wasnik and Tumane, 2014).
6. Kayu Putih Senyawa yang terkandung dalam daun kayu putih adalah terpenoid, fenol, flavonoid, aromatik, dan seskuiterpen. Ekstrak metanol daun kayu putih memiliki
7
aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dengan zona hambat dan deviasi standar sebesar 12,33 ± 0,57 (Al-Abd et al., 2015)
7. Sukun Senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak metanol daun sukun adalah flavonoid dan fitosterol. Ekstrak metanol daun sukun dengan konsentrasi 30 mg/mL dengan volume 20 µL dapat menghambat aktivitas P. aeruginosa dengan diameter daerah hambat sebesar 10 mm (Pradhan et al., 2013).
8. Salam Senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol daun salam adalah minyak esensial, tannin, dan flavonoid (Lau et al., 2014). Ekstrak metanol daun salam dengan volume 25 µL dapat menghambat pertumbuhan P. aeruginosa dengan diameter zona hambat 7,00 mm (Gowri and Vasantha, 2014).
9. Belimbing Wuluh Senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol daun belimbing wuluh yaitu alkaloid, saponin, dan flavonoid (Siddique et al, 2013). Ekstrak metanol daun belimbing wuluh dengan konsentrasi 400 µg/disk dapat menghambat aktivitas P. aeruginosa dengan diameter hambat sebesar 6,5 ± 0,44 mm (Das et al., 2011)
10. Binahong Senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol daun binahong adalah flavonoid, saponin, dan triterpenoid. Ekstrak metanol daun binahong memiliki aktivitas terhadap bakteri P. aeruginosa dengan konsentrasi hambat minimum sebesar 256 µg/mL (Nuryanti et al., 2014)
11. Alpukat Penelitian yang dilakukan oleh Ogundare and Oladejo (2014) menunjukkan bahwa senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak metanol daun alpukat yaitu
8
saponin, tanin, flavonoid, dan terpenoid. Ekstrak metanol daun alpukat dengan konsentrasi 50 mg/mL dapat menghambat pertumbuhan bakteri K. pneumoniae dengan diameter zona hambat sebesar 6,0 mm dan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) sebesar 30,00 µg/mL.
F. LANDASAN TEORI Ekstrak etanol daun bambu dan daun ekstrak metanol daun alpukat memiliki aktivitas antibakteri terhadap Klebsiella pneumoniae. Ekstrak etanol daun bambu terbukti dapat menghambat K. pneumoniae dengan diameter daerah hambat sebesar 15,00 mm sedangkan ekstrak metanol daun bambu hanya mampu menghambat K. pneumoniae sebesar 12,00 mm (Wasnik and Tumane, 2014), golongan senyawa yang terkandung didalamnya adalah alkaloid, flavonoid, tanin, steroid, diterpen, dan saponin, sedangkan senyawa aktif yang diduga memiliki aktivitas terhadap K. pneumonia adalah alkaloid, flavonoid, dan tanin. Ekstrak metanol daun alpukat konsentrasi 50 mg/mL dapat menghambat bakteri K. pneumoniae dengan diameter daerah hambat sebesar 2,0 mm dan MIC sebesar 30,00 µg/mL dan senyawa aktif yang terkandung didalamnya adalah saponin, tanin, flavonoid, dan terpenoid (Ogundare and Oladejo, 2014). Ekstrak metanol daun salam, ekstrak metanol daun belimbing wuluh, ekstrak metanol daun sukun, dan ekstrak metanol daun binahong memiliki aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas aeruginosa. Gowri and Vasantha (2010) menyatakan bahwa ekstrak metanol daun salam sebanyak 25 µL terbukti mampu menghambat pertumbuhan P. aeruginosa dengan zona hambat sebesar 7,00 mm dan hasil penelitian Lau et al. (2014) menyatakan bahwa daun salam memiliki golongan senyawa yaitu minyak esensial, tanin, dan flavonoid. Penelitian yang dilakukan Siddique et al. (2013)
menunjukkan bahwa
ekstrak metanol daun belimbing wuluh mengandung golongan alkaloid, saponin, flavonoid dan pada konsentrasi 400 µg/disk terbukti dapat menghambat P. aeruginosa dengan diameter zona hambat sebesar 6,5 ± 0,44 mm (Das et al., 2011). Penelitian Pardhan et al. (2013) menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sukun dengan konsentrasi 30,00 mg/mL volume 20 µL mampu menghambat
9
aktivitas P. aeruginosa dengan zona hambat sebesar 10,00 mm. Penelitian tersebut menggunakan metode difusi disk, selain itu senyawa aktif yang terkandung didalamya yaitu flavonoid dan fitosterol. Ekstrak metanol daun binahong memiliki golongan senyawa flavonoid dan triterpenoid. Ekstrak metanol daun binahong terbukti berefek terhadap P. aeruginosa dengan kadar hambat minimum (KHM) sebesar 256 µg/mL (Nuryanti et al., 2014). Ekstrak metanol daun kersen dan ekstrak etanol daun rambutan memiliki aktivitas antibakteri terhadap Eschericia coli. Ekstrak etanol 95% daun kersen dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli dengan zona hambat sebesar 12,3 mm. Ekstrak metanol daun kersen memiliki golongan senyawa aktif flavonoid, alkaloid, saponin, glikosida, dan tanin (Buhian et al., 2016). Hasil penelitian yang dilakukan Nethaji et al. (2015) menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun rambutan dapat menghambat bakteri E.coli sebesar 9 mm dan golongan senyawa yang terkandung didalamnya
adalah steroid, alkaloid,
flavonoid, tanin, dan triterpenoid. Ekstrak etanol daun kelengkeng dan ekstrak etanol kayu putih memiliki aktivitas antibakteri terhadap Stapyllococcus aureus. Ekstrak etanol daun kelengkeng mampu menghambat Stapyllococcus aureus dengan diameter daerah hambat sebesar 6,8 mm (Wisitsak et al., 2012). Pada uji fitokimia yang dilakukan Khaled and Gerda (2013) golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol daun kelengkeng yaitu sterol, glikosida, flavonoid, dan tanin.Ekstrak metanol daun kayu putih dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus diameter zona hambat sebesar 12,33 mm dan golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol daun kayu putih adalah terpenoid, fenol, flavonoid, aromatik, dan seskuiterpen (Al-Abd et al., 2015). Berdasarkan penelitian sebelumnya, terbukti bahwa sepuluh sampel ekstrak daun tanaman tersebut memiliki aktivitas antibakteri.
10
G. HIPOTESIS 1. Ekstrak etanol 70% daun kersen, daun salam, daun belimbing wuluh, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong, daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu diduga mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Klebsiella pneumoniae. 2. Golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol daun bambu adalah alkaloid, flavonoid, tanin, steroid, diterpen, dan saponin. 3. Golongan senyawa aktif ekstrak etanol daun bambu yang diduga memiliki aktivitas antibakteri terhadap K. pneumoniae adalah flavonoid, alkaloid, dan tanin.
H. METODE PENELITIAN 1. Kategori Penelitian Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental.
2. Variabel penelitian a. Variabel bebas Variabel bebas penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol 70% daun tanaman kersen, daun salam, daun belimbing wuluh, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong, daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu pada uji aktivitas antibakteri.
b. Variabel tergantung Variabel tergantung pada penelitian ini yaitu diameter daerah hambat ekstrak etanol 70% daun kersen, daun salam, daun belimbing wuluh, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong, daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu terhadap Klebsiella Pneumoniae.
c. Variabel terkendali Variabel terkendali pada penelitian ini yaitu sterilitas, lama waktu inkubasi, dan suhu inkubasi
11
3. Alat dan Bahan a. Alat Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat gelas, spreader glass, ose steril, lampu bunsen, batang pengaduk, tabung reaksi dan rak tabung reaksi object glass dan kaca penutup, pipa kapiler, neraca analitik, autoklaf, LAF (Laminar Air Flow), lampu UV, pipet tetes, mikro pipet, bejana kaca, penangas air, blender, ayakan, cawan Petri, inkubator, oven, dan mikroskop.
b. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sepuluh daun tanaman seperti daun kersen, daun salam, daun belimbing wuluh, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong, daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu yang diperoleh dari daerah sekitar Kudus dan Bojonegoro, bakteri Klebsiella pneumoniae yang diperoleh dari Universitas Muhammadiyah Surakarta, etanol 70%, media Mueller Hinton (MH), media SIM (Sulphur Indole Motility), media BHI (Brain Heart Infusion), media MRVP (Methyl Red Voges Proskauer), media KIA (Kligler Iron Agar), disk kosong, NaCl 0,9%, netilmisin (kontrol positif), DMSO 10%, n-heksan, metanol, kloroform, cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, cat Gram D, H2O2, alfa naftol, KOH, silika gel GF254, pereaksi semprot FeCl3 (deteksi tanin atau polifenol), uap NH3 dan sitroborat (deteksi flavonoid) dan dragendorff (deteksi alkaloid).
4. Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
5. Jalannya Penelitian a. Penyiapan Bahan Bahan penelitian yang sudah diperoleh seperti daun kersen, daun salam, daun belimbing, daun sukun, daun kelengkeng, daun alpukat, daun binahong,
12
daun kayu putih, daun rambutan, dan daun bambu dicuci dengan air mengalir hingga bersih tujuannya untuk menghilangkan semua kotoran yang menempel pada daun-daun tersebut. Kemudian daun dikeringkan dibawah sinar matahari menggunakan penutup kain berwarna hitam. Hal tersebut dilakukan agar daundaun tersebut terhindar dari degradasi metabolit sekunder akibat sinar matahari, setelah itu daun yang sudah kering dihaluskan dengan blender untuk memperkecil ukuran.
b. Ekstraksi Sebanyak 100 gram masing-masing serbuk daun direndam dengan700 mL etanol 70%, kemudian dimaserasi selama 3x24 jam dan sesekali diaduk. Setelah itu disaring, ampas hasil penyaringan diperas dengan menggunakan kertas saring. Filtrat dari masing-masing daun dipekatkan menggunakan evaporator. Hasil dari evaporasi kemudian diuapkan diatas waterbath hingga diperoleh ekstrak yang kental.
c. Sterilisasi Alat dan Bahan Alat-alat gelas yang digunakan seperti tabung reaksi, pipet ukur, cawan petri dicuci hingga bersih lalu dikeringkan. Selanjutnya alat-alat tersebut dibungkus dengan kertas dan disterilkan dengan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 160°C-180°C selama 1 sampai 2 jam. Ose dan spreader glass yang digunakan untuk mengambil sampel dan meratakan bakteri harus disterilkan terlebih dahulu dengan cara dipanaskan diatas api bunsen. Media MH, BHI, SIM, MRVP, dan KIA serta blue tips dan yellow tips disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.
d. Pembuatan Media 1) Media MH Media padat Mueller Hinton diambil sebanyak 7,6 gram kemudian diencerkan dengan akuades sebanyak 200 mL lalu dipanaskan di atas kompor listrik hingga larut. Media kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C
13
selama 20 menit. Media selanjutnya diletakkan pada cawan Petri dengan masingmasing volume sebesar 20 mL.
2) Media cair BHI Media BHI padat diambil 3,7 g kemudian dilarutkan dengan akuades sebanyak 100 mL, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.
e. Pembuatan Stok Bakteri Bakteri Klebsiella pneumoniae yang sudah dibeli kemudian ditanam langsung pada media Mueller Hinton. Bakteri ditanam pada media dengan cara streak plate. Streak plate merupakan teknik pengenceran dengan goresan dari satu ose biakan campuran yang diinokulasikan pada permukaan agar. Berbagai bentuk goresan dapat dilakukan untuk mendapatkan koloni-koloni yang terpisah (koloni-koloni yang saling terpisah dari yang lain hanya tumbuh pada permukaan media agar). Langkah pertama yaitu jarum ose dipanaskan hingga memijar diatas bunsen, kemudian didinginkan. Selanjutnya ose yang sudah dingin digoreskan pada permukaan media agar, lalu diambil satu ose bakteri K. pneumoniae dan digoreskan pada permukaan media agar dimulai dari satu ujung kemudian kekuadran berikutnya (setiap mengganti kuadran, ose harus dipijarkan dan didinginkan), terakhir yaitu media agar tersebut diinkubasi secara terbalik selama 24 jam pada suhu kamar dan diamati pertumbuhannya.
f. Pengecatan Bakteri Pada pengecatan bakteri didahului dengan pembuatan preparat, yakni dengan cara mengambil bakteri menggunakan ose yang sudah steril (dipanaskan diatas api bunsen) kemudian digoreskan pada object glass setipis mungkin, selanjutnya object glass dijepit meggunakan penjepit atau pinset dipanaskan menggunakan nyala api bunsen dengan jarak ± 20 cm hingga preparat mengering dan siap untuk dicat. Langkah pertama yang dilakukan yaitu pengecatan dengan cat Gram A selama 1-3 menit kemudian cat dibuang
14
tanpa pencucian dengan air. Kemudian pengecatan preparat dilanjutkan ditetesi dengan cat Gram B selama 0,5-1 menit kemudian cat tersebut dibuang dan dicuci dengan air. Selanjutnya preparat kemudian ditetesi cat Gram C hingga warna cat dilunturkan. Terakhir preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1-2 menit, kemudian preparat dicuci dan dikeringkan pada suhu kamar. Preparat ditetesi minyak imersiterlebih dahulu tujuannya agar mempermudah melihat bentuk, warna serta susunan sel K. pneumonia. Kemudian preparat siap diperiksa di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 1000x.
g. Uji Biokimiawi 1) Uji katalase Pada uji katalase bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya enzim katalase pada bakteri. Biakan bakteri diambil secara aseptis menggunakan jarum ose. Biakan dioleskan pada obyek glass,kemudianditeteskan H2O2 (digunakan H2O2 karena merupakan salah satu hasil respirasi aerobik bakteri, hasil respirasi tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik). Selanjutnya diamati ada atau tidaknya gelembung. Adanya gelembung menunjukkan positif katalase karena menghasilkan gelembung gas O2 sehingga bakteri uji memiliki enzim katalase yang dapat memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. 2) Uji motilitas Media SIM ditusuk dengan jarum ose yang telah dicelupkan ke dalam kultur Klebsiella pneumoniae, kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37oC dan diamati tipe pertumbuhan yang terjadi sepanjang garis tusukan. Mikroba yang motil akan tumbuh secara difusi menjauhi garis tusukan tersebut. 3) Uji glukosa Media yang digunakan adalah media KIA. Koloni diambil dengan jarum ose kemudian ditusukkan pada media KIA pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Jika K. pneumoniae tersebut memfermentasi glukosa maka akan terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning.
15
4) Uji VP (Voges Proskauer) Koloni diambil secara aseptis menggunakan jarum ose. Kemudian dihomogenkan ke dalam media MRVP dalam tabung reaksi. Tabung reaksi ditutup dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya ditambahkan 12 tetes alfa naftol dan 4 tetes KOH. Jika terbentuk cincin berwarna merah muda menandakan terbentuknya asetoin (Abdulkadir and Waliyu, 2012).
h. Pembuatan Suspensi Bakteri Bakteri Klebsiella pneumoniae diambil koloninya dengan ose yang sudah steril dari persediaan stok bakteri, selanjutnya disuspensikan ke dalam 5 mL media cair BHI. Bakteri diinkubasi selama 2-6 jam dengan suhu 37oC di shaking incubator. Selanjutnya ditambahkan salin steril hingga kekeruhan sama dengan standar McFarland 1,5 x 108 CFU/mL.
i. Pembuatan Larutan Ekstrak Pada penelitian ini menggunakan sepuluh ekstrak daun tanaman dengan konsentrasi 80% b/v. Ekstrak daun tanaman diambil sebanyak 800 mg kemudian dilarutkan dalam 1 mL DMSO.
j. Pengujian Aktivitas Antibakteri Metode yang digunakan yaitu metode disk difusi agar. Suspensi bakteri diambil sebanyak 200 µL, diletakkan pada media MH, kemudian diratakan dengan spreader glass. Larutan ekstrak daun dengan konsentrasi 80% b/v diambil 10 µL selanjutnya diteteskan pada disk kosong. Disk kemudian diletakkan di media yang telah diinokulasi dengan bakteri Klebsiella pneumoniae. Kontrol positif menggunakan disk antibiotik netilmisin dan untuk kontrol negatif menggunakan disk yang ditetesi DMSO 10 µL. Kemudian media diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C dan diamati diameter zona hambat yang terbentuk.
16
k. Kromatografi Lapis Tipis Plat KLT silika gel GF254 yang telah ditotolkan ekstrak daun (yang sudah diketahui mempunyai efek antibakteri tertinggi terhadap Klebsiella pneumoniae) selanjutnya dimasukkan kedalam bejana yang berisi fase gerak. Fase gerak bertujuan untuk mengelusi atau memisahkan senyawa yang ada dalam ekstrak daun yang telah ditotolkan pada plat KLT tersebut. Plat KLT
hasil elusi
diletakkan pada suhu ruang hingga kering. Kemudian diamati dibawah sinar tampak, UV 254 nm dan UV 366 nm. Setiap plat KLT disemprot dengan reagen FeCl3 untuk mendeteksi adanya tannin, uap NH3 dan sitroborat untuk mengetahui adanya flavonoid, serta dragendorff untuk mendeteksi adanya alkaloid.
l. Bioautografi Metode bioautografi bertujuan untuk mengidentifikasi golongan senyawa antibakteri. K. pneumoniae diinokulasikan ke media MH, selanjutnya plat KLT yang telah dielusi ditempelkan pada media MH, kemudian didiamkan selama 20 menit tujuannya agar senyawa aktifnya dapat berdifusi kedalam media. Setelah itu plat KLT diambil dari media, cawan Petri diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37⁰C. Diameter daerah hambatnya diamati, jika ada dihitung nilai Rfnya. Senyawa aktif dalam ekstrak daun yang memiliki aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan adanya daerah yang bening pada media MH. Nilai Rf hasil bioautografi dibandingkan dengan nilai Rf terdekat dari ekstrak daun yang telah di KLT, sehingga golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dapat diketahui.
I. ANALISIS DATA 1. Analisis data statistik Teknik analisis menggunakan software khusus statistik SPSS (Statistical Product and Service Solution). Jika data homogen dan terdistribusi normal dengan uji parametrik oneway ANOVA pada taraf kepercayaan 95%, jika data tidak homogen dan tidak terdistribusi normal menggunakan uji non parametrik Kruskall-Wallis Test. Penentuan ekstrak pada aktivitas antibakteri tertinggi ditunjukkan dengan adanya diameter daerah hambat (area yang jernih) terbesar.
17
2. Analisis hasil kromatografi lapis tipis Pada uji KLT nilai Rf, pengamatan yang telah dilakukan dibawah sinar tampak, UV 254 nm, dan UV 366 nm dibandingkan dengan penelitian empiris dan golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak daun dapat dilihat sesuai atau tidaknya pada penelitian yang sudah ada sebelumnya.
3. Analisis hasil bioautografi Zona hambat pada uji bioautografi dihitung nilai Rfnya. Hasil nilai Rf pada bioautografi dibandingkan dengan Rf pada KLT. Golongan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Klebsiella pneumoniae dapat diketahui dari nilai Rf bioautografi dan KLT yang seharusnya sama.
J. JADWAL PENELITIAN Tahapan penelitian Persiapan Pelaksanaan Penyelesaian
Uraian Kegiatan Studi pustaka Persiapan bahan Pengumpulan data Analisis data Penyusunan laporan
Bulan ke1 2 3 4 5
6
K. DAFTAR PUSTAKA Abdulkadir M. and Waliyu S., 2012, Screening and Isolation of the Soil Bacteria for Ability to Produce Antibiotics, European Journal of Applied Sciences, 4 (5), 211–215. Al-Abd, N.M., Mohammed Nor Z., Mansor M., Azhar, F., Hasan, M.S. and Kassim, M., 2015, Antioxidant Antibacterial Activity and Phytochemical Characterization of Melaleuca cajuputi Extract, Journal of BMC Complementary and Alternative Medicine,15 (1), 385. Buhian W.P.C., Rubio R.O., Valle D.L. and Puzon J. J. M., 2016, Bioactive Metabolite Profiles and Antimicrobial Activity of Ethanolic Extracts From Muntingia calabura L. Leaves and Stems, Article in Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 6 (8), 682-685. Das S.C., Sultana S., Roy S. and Hasan, S.S., 2011, Antibacterial and cytotoxic
18
activities of methanolic extracts of leaf and fruit parts of the plant Averrhoa Bilimbi (Oxalidaceae), American Journal of Scientific and Industrial Research, 531–536. Elfidasari D., Noriko., Anita, M., Feroza A., Fauziah S.C., 2014, Deteksi Bakteri Klebsiella pneumonia pada Beberapa Jenis Rokok Konsumsi Masyarakat. Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi, 2 (1), 41-47. Elmer W., Koneman., Stephen D., Allen, Willian M., Paul C., Schrecken berger and Washington C., Winn., 2006,Color Atlas And Textbook of Diagnostic Microbiology. 6th edition, Baltimore, Lippincott Williams Wilkins. Gowri, S. S., and Vasantha, K., 2010, Phytochemical Screening and Antibacterial Activity of Syzygium cumini (L.) (Myrtaceae) Leaves Extracts, International Journal of PharmTech Research, 2 (2), 1569 1573 Khaled N.R. and Gerda Fouche, 2013, Anticancer Activity of Dimocarpus longan Lour Leaf Extracts in vitro and Phytochemical Profile. Greener Journal of Medicinal Plant Research, 1 (1), 001-005. Lau K.Y., Zainin N.S., Abas F. and Rukayadi F., 2014, Original Research Article Antibacterial and Sporicidal Activity of Eugenia polyantha Wight against Bacillus cereus and Bacillus subtilis, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 3 (12), 499– 510. Nethaji R., Thooyavan G., Nilla M. and Ashok K., 2015, Phytochemical Profiling, Antioxidant and Antimicrobial Activity of Methanol Extract In Rambutan Fruit (Nephelium Lappacium) Epicarp Against The Human Pathogens, International Journal of Current Innovation Research, 1 (9), 201-206. Nuryanti A., Yulinah E. and Firdianti I., 2014, Activity of Several Plant Extract Agains Drug-Sensitive and Drug-Resistant Microbes, International of Seminar on Natural Product Medicines, Procedia Chemistry, 13, 164169. Ogundare A. and Oladejo B., 2014, Antibacterial Activities of the Leaf and Bark Extract of Persea americana, American Journal of Ethnomedicine, 1 (1), 064-071.
19
Pradhan C., Mohanty M. and Rout A., 2013, Assesment of The Antibacterial Potential of Breadfruit Leaf, International Journal of Pharmacy, 3 (2), 374-379. Podschun R. and Ullman U., 1998, Klebsiella spp. as Nocosomial Pathogens, Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors, Journal of American Society for Microbiology, 11, 589-603. Siddique K.I., Muhmmad, M., Uddin N., Islam S., Parvin S., and Shahriar M., 2013, Phytochemical Screenings Thrombolytic Activity and Antimicrobial Properties of The Bark Extracts of Averrhoa Bilimbi, Journal of Applied Pharmaceutical Science,3 (3), 94-96. Sirkawar A.S., and Batra H.V., 2011, Identification of Klebsiella pneumoniae by Capsular Polysaccharide Polyclonal Antibodies. International Journal of Chemical Engineering and Aplications, 2 (2), 130-134. Shaik, G., Sujatha, N., and Mehar, S. K., 2014, Medicinal plants as Source of Antibacterial Agent to Counter Klebsiella pneumoniae, Journal of Applied Pharmaceutial Science, 4 (1), 135-147. Sonita A. and Masri M., 2014, Artikel Penelitian Pola Resistensi Bakteri pada Sputum Pasien PPOK Terhadap Beberapa Antibiotika di Laboraturium Mikrobiogi RSUP Dr. M. Djamil Periode 2010-2012, Jurnal Kesehatan Andalas,3 (3), 354-357. Wasnik D.D. and Tumane P.M., 2014, Antibacterial Activity of Bambusa bambose L. against Multiple Drug Resistant (MDR) Bacteria Isolated from Clinical Specimen, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 25 (1),215-218. WHO., 2011, World Health Organization (WHO). Burden of COPD cit. Sonita A., and Masri M., 2014, Artikel Penelitian Pola Resistensi Bakteri pada Sputum Pasien PPOK Terhadap Beberapa Antibiotika di Laboraturium Mikrobiogi RSUP Dr. M. Djamil Periode 2010-2012, Jurnal Kesehatan Andalas,3 (3), 354-357. Wisitsak P., Nimkamnerd J., Thitipramote N., Saewan T., Chaiwut P. and Pintathong P., 2012, Comparison The Bioactive Compounds And Their Activities Between Longan And Litchi Seeds Extracts, Journal of1st Mae Fah Luang University International Conference.
20
LAMPIRAN 1) Identifikasi Bakteri Bakteri Klebsiella pneumoniae
Bakteri Klebsiella pneumoniae
Tabel 1. Uji pengecatan Gram Jenis Gram
Uji Katalase
Bentuk Susunan Sel
Tabel 2. Uji biokimia Uji Motilitas Uji Glukosa
Uji VP
2) Uji Aktivitas Antibakteri Tabel 3. Aktivitas antibakteri sepuluh ekstrak daun tanaman, kontrol positif dan kontrol negatif terhadap Klebsiella pneumoniae Diameter Zona Hambat (mm) Daun alpukat Daun sukun Daun belimbing wuluh Daun kayu putih Daun binahong Daun kersen Daun bambu Daun rambutan Daun kelengkeng Daun salam Kontrol positif Kontrol negatif
3) Uji KLT dan Bioautografi Ekstrak aktivitas antibakteri tertinggi
Nilai Rf
Tabel 4. Uji Kromatografi Lapis Tipis Sinar UV 254 UV 366 Reagen Semprot Tampak
Golongan senyawa
21
Tabel 5. Uji Bioautografi Ekstrak aktivitas antibakteri tertinggi Nilai Rf
Golongan senyawa
22
