UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN JERUK BALI (Citrus maxima Merr.) TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI PADA JERAWAT

perpustakaan.uns.ac.id

digilib.uns.ac.id

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN JERUK BALI (Citrus maxima Merr.) TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI PADA JERAWAT

TUGAS AKHIR Diajukan untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Ahli Madya D3 Farmasi

Oleh : KHARISMA QONITAH NIM. M3509037

DIPLOMA 3 FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2013

i


digilib.uns.ac.id

ii


digilib.uns.ac.id

PERNYATAAN

Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) terhadap Pertumbuhan Bakteri pada Jerawat

adalah penelitian saya sendiri dan tidak

terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar apapun disuatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Apabila di kemudian hari dapat ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut.

Surakarta, Desember 2012

Kharisma Qonitah NIM. M3509037

iii


digilib.uns.ac.id

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN JERUK BALI (Citrus maxima Merr.) TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI PADA JERAWAT KHARISMA QONITAH Jurusan D3 Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta INTISARI Jerawat merupakan salah satu penyakit yang disebabkan oleh bakteri dan umumnya ditemukan pada usia remaja. Walaupun telah banyak antibiotik ditemukan, kenyataan menunjukkan bahwa masalah penyakit terus berkelanjutan, sehingga diperlukan senyawa antibakteri baru yang dapat mengatasi jerawat. Flavonoid merupakan salah satu kandungan daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) yang dikenal memiliki potensi sebagai agen antibakteri. Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui : a. bentuk dan susunan sel serta sifat Gram bakteri pada jerawat yang diisolasi dari apusan darah jerawat, b. potensi aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol daun jeruk bali terhadap pertumbuhan bakteri pada jerawat, c. konsentrasi optimum ekstrak etanol daun jeruk bali yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri pada jerawat. Senyawa aktif yang terkandung dalam daun jeruk bali diekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 75%. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali dilakukan dengan metode difusi agar dengan seri konsentrasi 10-100%. Sebagai kontrol digunakan CMC-Na 0,1%, etanol 75% dan klindamisin 0,025%. Hasil isolasi dari apusan darah jerawat didapatkan bakteri bentuk kokus Gram positif, bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif. Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukan bahwa aktivitas penghambatan optimum terjadi pada konsentrasi 80% dengan DDH sebesar 5,29 mm terhadap bakteri bentuk kokus Gram positif, pada konsentrasi 90% dengan DDH sebesar 4,39 mm terhadap bakteri bentuk basil Gram positif dan pada konsentrasi 90% dengan DDH sebesar 4,34 mm terhadap bakteri bentuk basil Gram negatif. Dari hasil penelitian ini ekstrak etanol daun jeruk bali memiliki daya hambat yang bersifat lemah namun memiliki spektrum kerja antibakteri luas yaitu mampu menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif.

Kata kunci : daun jeruk bali, flavonoid, antibakteri, diameter daya hambat

iv


digilib.uns.ac.id

THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF POMELO (Citrus maxima Merr.) LEAF ON THE GROWTH OF BACTERIA IN ACNE KHARISMA QONITAH Departement of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences Sebelas Maret University, Surakarta ABSTRACT Acne is disease caused by bacteria and is commonly found in adolescence. Although many antibiotics have been discovered, the reality shows that still ongoing disease problems, so needed new antibacterial compounds that can treat acne. Flavonoids are a compound of pomelo (Citrus maxima Merr.) leaf are known to have potential as an antibacterial agent. The purpose of this study to determine : a. shape and arrangement of cells and the Gram of bacteria in acne that isolated from blood smears acne, b. potential antibacterial activity of ethanol extract of pomelo leaf on the growth of bacteria in acne, c. the optimum concentration of ethanol extract of pomelo leaf were able to inhibit the growth of bacteria in acne. The active compound contained in pomelo leaf extracted using maceration with ethanol 75%. The antibacterial activity of ethanol extract of pomelo leaf conducted by agar diffusion method with a series of concentration of 10-100%. As a control used CMC-Na 0.1%, ethanol 75% and Clindamycin 0.025%. The result of isolation from blood smears acne obtained Gram-positive cocci bacteria form, Gram-positive bacilli bacteria form and Gram-negative bacilli bacteria form. The result of the antibacterial activity showed that the optimum inhibitory activity occurred at concentrations of 80% with DDH at 5.29 mm against Gram-positive cocci bacteria form, at concentration of 90% with DDH at 4.39 mm against Gram-positive bacteria bacilli form and at concentration of 90% with DDH at 4.34 mm against Gram-negative bacteria bacilli form. From the results of this study ethanol extract of pomelo leaf has weak potency to inhibit bacteria but has broad spectrum to the test bacteria.

Keyword : pomelo leaf, flavonoid, antibacterial, diameter of inhibition

v


digilib.uns.ac.id

MOTTO

Orang-orang yang berhenti belajar akan menjadi pemilik masa lalu. Orangorang yang masih terus belajar, akan menjadi pemilik masa depan --Mario Teguh--

Tugas kita bukanlah untuk berhasil. Tugas kita adalah untuk mencoba, karena didalam mencoba itulah kita menemukan dan belajar membangun kesempatan untuk berhasil --Mario Teguh--

Verily, along with every hardship is relief So And to your Lord (Alone) turn (all your) intentions and hopes (Q.S Alam Nasyrah : 6-8)

vi


digilib.uns.ac.id

PERSEMBAHAN

vii


digilib.uns.ac.id

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) terhadap Pertumbuhan Bakteri pada Jerawat dengan baik dan lancar. Penyusunan laporan tugas akhir merupakan salah satu syarat untuk dapat memperoleh gelar Ahli Madya Farmasi di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta. Dalam penulisan laporan Tugas Akhir ini penulis telah berusaha semaksimal mungkin untuk memberikan hasil yang terbaik. Dan tak mungkin terwujud tanpa adanya dorongan, bimbingan, semangat, motivasi serta bantuan baik mori kesempatan ini mengucapkan terima kasih dan penghargaan serta penghormatan setinggi-tingginya kepada: 1. Prof. Ir. Ari Handono Ramelan, M.Sc.(Hons), Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta. 2. Bapak Ahmad Ainurofiq, M.Si., Apt., selaku Ketua Program Studi D3 Farmasi Universitas Sebelas Maret Surakarta. 3. Ibu Estu Retnaningtyas N., S.TP., M.Si., selaku pembimbing Tugas Akhir atas segala ketulusan, kesabaran dan keikhlasannya dalam memberikan arahan pengertian, saran, dan ilmunya yang tiada tara nilainya. 4. Ibu Nestri Handayani, S.Si., M.Si., Apt., selaku pembimbing akademik yang telah memberikan motivasi, arahan, bimbingan, saran, dan ilmunya.

viii


digilib.uns.ac.id

5. Seluruh staf pengajar dan karyawan Program Studi D3 Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta. 6. Ayah, Ibu dan adik-adikku tersayang yang telah memberikan dukungan dan semangat. 7. Sahabat-sahabatku yang selalu ada disehat dan sakitku, disuka dan dukaku, disantai dan sibukku. 8. Teman-teman seperjuangan khususnya teman-teman angkatan 2009 yang telah berbagi suka dan duka serta pengalaman selama masa-masa kuliah. 9. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah membantu pelaksanaan Tugas Akhir dan penyusunan laporan ini. Penulis hanya dapat

membalas dengan yang terbaik. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan laporan Tugas Akhir ini. Untuk itu penulis mengharapkan adanya kritik dan saran yang membangun dari semua pihak untuk perbaikan sehingga akan menjadi bahan pertimbangan dan masukan untuk penyusunan tugas-tugas selanjutnya. Penulis berharap semoga laporan Tugas Akhir ini dapat bermanfaat bagi pembaca pada umumnya dan dapat menjadi bekal bagi penulis dalam pengabdian Ahli Madya Farmasi di masyarakat pada khususnya.

Surakarta, Desember 2012

Penulis

ix


digilib.uns.ac.id

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ....................................................................................

i

HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................

ii

HALAMAN PERNYATAAN ......................................................................

iii

INTISARI .....................................................................................................

iv

ABSTRACT .................................................................................................

v

MOTTO ........................................................................................................ vi PERSEMBAHAN ......................................................................................... vii KATA PENGANTAR .................................................................................. viii DAFTAR ISI .................................................................................................

x

DAFTAR TABEL.......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR .................................................................................. . xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xvi DAFTAR SINGKATAN ............................................................................. BAB I. PENDAHULUAN

xvii 1

A. Latar Belakang Masalah.................................................................

1

B. Perumusan Masalah .......................................................................

3

C. Tujuan Penelitian............................................................................

4

D. Manfaat Penelitian..........................................................................

4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

5

A. Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.)

.............................................

5

A.1. Klasifikasi Tumbuhan ............................................................

5

A.2. Nama Lokal dan Sinonim ......................................................

5

A.3. Morfologi Tumbuhan..............................................................

6

A.4. Kandungan Kimia dan Manfaat..............................................

6

A.5. Flavonoid................................................................................

7

B. Metode Penyarian............................................................................

9

B.1. Ekstraksi.................................................................................

9

B.2. Maserasi..................................................................................

10

x


digilib.uns.ac.id

C. Jerawat............................................................................................. C.1.

..........................................................

C.2. D.

10 10

............................................................ 11 ..................................................................

E. Pewarnaan Gram Bakteri

12 13 15

G. Antibakteri.......................................................................................

16

H. Uji Aktivitas Antibakteri.................................................................

18 18

I. Kerangka Pemikiran........................................................................... 19 J. Keterangan Empiris............................................................................ 21 BAB III. METODE PENELITIAN

23

A. Desain Penelitian............................................................................. 23 B. Waktu dan Tempat Penelitian........................................................... 23 C. Alat dan Bahan................................................................................. 23 C.1 Alat yang digunakan ................................................................ 23 C.2 Bahan yang digunakan.............................................................. 24 D. Cara Kerja.......................................................................................... 25 D.1. Penyiapan Alat......................................................................... 26 D.2. Determinasi dan Preparasi Sampel........................................... 26 D.3. Ekstraksi .................................................................................. 27 D.4. Pengambilan Apusan, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji

28 31

D.6. Uji Aktivitas Antibakteri......................................................... 34 E. Analisis Hasil

..................................... 42

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................

43

A.

Determinasi dan Pengumpulan Sampel .........................................

43

B.

Penyiapan Bahan ............................................................................

43

C.

44

D.

Pengambilan Apusan Darah Jerawat .............................................

E.

Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji ...................................

xi

46 47


digilib.uns.ac.id

F.

Pembuatan S

54

G.

Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Citrus maxima ....... 55

BAB V. PENUTUP.......................................................................................

63

A.

Kesimpulan ...................................................................................

63

B.

Saran ..............................................................................................

63

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................

64

LAMPIRAN .................................................................................................

68

xii


digilib.uns.ac.id

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I.

Kategori daya hambat bakteri .......................................................

19

Tabel II. Komposisi Bahan dalam Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) ............................ 37 Tabel III. Hasil Pengecatan Gram Koloni Bakteri yang Tumbuh dari Apusan Darah Jerawat ..................................................................

49

Tabel IV. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap pertumbuhan bakteri bentuk kokus Gram positif, bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif ........................

xiii

57


digilib.uns.ac.id

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Jeruk bali (Citrus maxima Merr.) ............................................... 5 Gambar 2. Stuktur Kimia Senyawa Flavonoid ............................................ 8 Gambar 3. Struktur Kimia Senyawa Naringin ............................................. 9 Gambar 4. Alur Kerangka Pemikiran ........................................................... 21 Gambar 5. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Jeruk Bali ........................... 27 Gambar 6. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali .............................. 28 Gambar 7. Tahap Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji ................................ 30 Gambar 8. Pengecatan Gram Bakteri Uji .................................................... 33 Gambar 9. Pembuatan Stok Bakteri Uji ...................................................... 36 Gambar 10. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali .. 38 Gambar 11. Pengujian Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Padat .............. 41 Gambar 12. Koloni bakteri yang tumbuh dari apusan darah jerawat ............ 47 Gambar 13. Sepuluh stok bakteri hasil isolasi tahap I .................................. 48 Gambar 14. (A) Pertumbuhan koloni bakteri nomor 1-9 (B) Hasil pengecatan stok bakteri tabung 1-9 (C) Pertumbuhan koloni bakteri nomor 10 (D) Hasil pengecatan stok bakteri tabung 10 ............................. 50 Gambar 15. Pertumbuhan koloni bakteri tabung 10 pada (A) media MacConkey Agar (B) media Agar Darah ........................................................ 51 Gambar 16. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk kokus Gram positif. (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk kokus Gram positif. (C) Stok bakteri bentuk kokus Gram positif.

52

Gambar 17. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk basil Gram positif. (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk basil Gram positif. (C) Stok bakteri bentuk

. 53

Gambar 18. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk basil Gram negatif. (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk basil Gram negatif. (C) Stok bakteri bentuk basil Gram negatif.

xiv

54


digilib.uns.ac.id

Gambar 19. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap pertumbuhan bakteri bentuk kokus Gram positif, bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif ...................... 60

xv


digilib.uns.ac.id

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Determinasi Tanaman Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.)

69

Lampiran 2. Perhitungan Rendemen

70

Lampiran 3. Hasil Pemindahan 10 Koloni Bakteri dari Apusan Darah Jerawat

71

Lampiran 4. Ekstrak Etanol Daun Citrus maxima dan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Citrus maxima

72

Lampiran 5. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) terhadap Bakteri Bentuk Kokus Gram Positif

73

Lampiran 6. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) terhadap Bakteri Bentuk Basil Gram Positif

74

Lampiran 7. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) terhadap Bakteri Bentuk Basil Gram Negatif

75

xvi


digilib.uns.ac.id

DAFTAR SINGKATAN

µL

: mikroliter

cm

: centimeter

CMC-Na

: Natrium Carboxymetilcellulose

DDH

: Diameter Daya Hambat

LAF

: Laminar Air Flow

MHA

: Mueller Hinton Agar

mm

: milimeter

ml

: mililiter

NA

: Nutrient Agar

NB

: Nutrient Broth

TSA

: Tryptone Soya Agar

TSB

: Tryptone Soya Broth

xvii


digilib.uns.ac.id

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Penyakit infeksi merupakan salah satu jenis penyakit yang banyak diderita masyarakat luas. Infeksi dapat ditularkan dari satu orang ke orang lain atau dari hewan ke manusia. Infeksi dapat disebabkan oleh berbagai mikroorganisme seperti bakteri, virus, riketsia, jamur, dan protozoa (Gibson, 1996). Jerawat merupakan salah satu penyakit yang disebabkan oleh bakteri dan umumnya ditemukan pada usia remaja. Penyakit ini dijumpai pada hampir semua (90%) periode akil baliq yang menginjak masa pubertas pada usia 15-19 tahun, orang dewasa dan dapat juga pada usia lanjut. Jerawat adalah peradangan kronik folikel pilosebaseus dengan gambaran klinis berupa komedo, papul, pustul, nodus dan kista yang terutama didapatkan di daerah kulit yang kaya akan kelenjar sebasea seperti muka, leher, dada dan punggung (Djuanda dkk., 2007). Menurut Athikomkulchai, et al. (2008) faktor utama yang terlibat dalam pembentukan jerawat adalah peningkatan produksi sebum, peluruhan keratinosit, pertumbuhan bakteri dan inflamasi. Bakteri yang sering berperan pada pertumbuhan jerawat yaitu Propionibacterium acne dan Staphylococcus epidermidis (Djuanda dkk., 2007). Pengobatan jerawat dilakukan dengan cara memperbaiki abnormalitas folikel, menurunkan produksi sebum, menurunkan jumlah koloni bakteri serta menurunkan inflamasi pada kulit. Menurut Wyatt, et al. (2001) populasi bakteri

1

2 digilib.uns.ac.id


Propionibacterium acne dapat diturunkan dengan memberikan suatu zat antibakteri seperti eritromisin, klindamisin dan benzoil peroksida. Sampai saat ini belum ada cara penyembuhan yang tuntas terhadap jerawat, meskipun ada beberapa cara yang sangat menolong. Salah satunya penggunaan antibiotik sebagai solusi untuk jerawat yang beberapa dekade ini masih banyak diresepkan (Yang, et al., 2009). Walaupun telah banyak antibiotik ditemukan, kenyataan menunjukkan bahwa masalah penyakit terus berkelanjutan. Hal tersebut terjadi akibat pergeseran pada bakteri penyebab penyakit dan perkembangan resistensi bakteri terhadap antibiotik. Karena berkembangnya populasi bakteri yang resisten, maka antibiotik yang pernah efektif untuk mengobati penyakit-penyakit tertentu kehilangan nilai kemoterapeutiknya (Pelczar dan Chan, 1988). Pemanfaatan bahan alam sebagai obat tradisional di Indonesia akhir-akhir ini meningkat, bahkan beberapa bahan alam telah diproduksi secara fabrikasi dalam skala besar. Penggunaan obat tradisional dinilai memiliki efek samping yang lebih kecil dibandingkan dengan obat yang berasal dari bahan kimia, di samping itu harganya lebih terjangkau (Tampubolon, 1981). Buah jeruk dikenal memiliki potensi sebagai agen antimikroba terhadap bakteri dan jamur. Buah jeruk ini kaya akan flavonone dan polymetholxylate flavone yang sangat langka pada tumbuhan lain (Ahmed, 2006). Pada penelitian Ekwenye dan Edeha (2010) ekstrak etanol daun jeruk manis (Citrus sinensis) yang mengandung tanin, alkaloid, saponin, flavonoid, steroid dan triterpen memiliki

aktivitas

antibakteri

terhadap

2

Escherichia

coli,

Pseudomonas

3 digilib.uns.ac.id


aeruginosa, Klebsiella pneumonia dan Staphylococcus aureus. Penelitian yang dilakukan oleh Pinkee Pandey, et al. (2010) menyatakan bahwa ekstrak etanol daun jeruk lemon (Citrus limon) yang mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, steroid dan glikosida juga memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Salmonella typhimurium. Pada penelitian Thavanapong (2006) kandungan dalam daun jeruk bali diantaranya adalah: asam amino, n-methylanthranilate, karbohidrat, flavonoid, monoterpen, sesquiterpen, triterpen, asam fumarat, asam malonat, asam oksalat, asam suksinat, asam tartrat. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Thavanapong (2006), Ekwenye dan Edeha (2010) dan Pinkee Pandey, et al. (2010), penelitian ini dimaksudkan untuk menguji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) terhadap pertumbuhan bakteri pada jerawat karena di dalam daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) terdapat kandungan senyawa metabolit yang hampir sama dengan yang terkandung dalam daun jeruk manis (Citrus sinesis) dan daun jeruk lemon (Citrus limon) diantaranya adalah flavonoid yang memiliki potensi sebagai agen antibakteri. B. Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang masalah di atas maka dirumuskan beberapa permasalahan sebagai berikut: 1.

Bagaimanakah bentuk dan susunan sel serta sifat Gram bakteri pada jerawat yang diisolasi dari apusan darah jerawat ?

4 digilib.uns.ac.id


2.

Apakah ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri pada jerawat ?

3.

Berapakah konsentrasi optimum ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri pada jerawat ? C. Tujuan Penelitian

1.

Mengetahui bentuk dan susunan sel serta sifat Gram bakteri pada jerawat yang diisolasi dari apusan darah jerawat.

2.

Mengetahui potensi aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) terhadap pertumbuhan bakteri pada jerawat.

3.

Mengetahui konsentrasi optimum ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri pada jerawat. D. Manfaat Penelitian

1.

Melalui penelitian ini diharapkan ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dapat digunakan sebagai agen antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri pada jerawat.

2.

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pertimbangan untuk penelitian lain dalam usaha mengembangkan ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) sebagai suatu sediaan farmasi yang dapat mengatasi masalah jerawat.


digilib.uns.ac.id

BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) 1. Klasifikasi Tumbuhan Divisi

: Spermatophyta (berbiji)

Sub Divisi

: Angiospermae (berbiji tertutup)

Kelas

: Dicotylendonae (berkeping dua)

Sub kelas

: Choripetalae

Bangsa

: Geraniales

Suku

: Rutaceae

Marga

: Citrus maxima

Jenis

: Citrus maxima (Burm. Fz) Merr

(Van Steenis, 1978).

Gambar 1. Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) (Anonim, 2012)

2. Nama Lokal dan Sinonim Nama lokal: Jeruk bali, jeruk besar, jeruk cikoneng, jeruk limau makan, jeruk limau besar, dan jeruk pamelo (Nuraini, 2011).

5


6 digilib.uns.ac.id

Sinonim: Citrus Celebia, koord, Sin; Citrus decumanus L, Sin; Citrus grandis L, Osbeck (Nuraini, 2011). 3. Morfologi Tumbuhan Jeruk bali (Citrus maxima Merr.) merupakan tumbuhan menahun (perennial) dengan karakteristik tinggi pohon 5-15 meter. Batang tanaman agak kuat, garis tengah 10-30 cm, berkulit agak tebal, dimana kulit bagian luarnya berwarna coklat kekuningan dan bagian dalamnya berwarna kuning. Pohon jeruk mempunyai banyak cabang yang terletak saling berjauhan dan merunduk pada bagian ujungnya. Cabang yang masih muda bersudut dan berwarna hijau, tetapi lama-lama menjadi berbentuk bulat dan berwarna hijau tua (Nuraini, 2011). Daun tanaman berbentuk bulat telur dan berukuran besar dengan bagian puncak atau ujung tumpul dan bagian tepi hampir rata, serta bagian dekat ujung agak berombak. Lerak daun terpencar dengan tangkai daun bersayap lebar, warna kekuningan, dan berbulu agak suram. Buah berbentuk bulat atau bola yang tampak tertekan dan berkulit agak tebal, berisi 11-16 segmen. Warna daging buah merah muda atau merah jambu dengan tekstur keras sampai lunak, rasa manis sampai sedikit asam, dan berbiji sedikit (Nuraini, 2011). 4. Kandungan Kimia dan Manfaat Jeruk bali mengandung vitamin B, provitamin A, vitamin B1, vitamin B2 dan asam folat. Setiap 100 gram mengandung 53 kkal energi , protein 0,6 gram, lemak 0,2 gram, karbohidrat 12,2 gram, retinol 125 mcg, kalsium 23 mg


7 digilib.uns.ac.id

dan fosfor 27 mg. Kandungan lain seperti flavonoid, pektin dan lycopene (Sekar, T. R., 2011). Kandungan senyawa kimia dalam daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) diantaranya adalah: asam amino (alanine, asparagine, asam aspartat, coline, asam glutamat, glycine, proline), n-methylanthranilate, karbohidrat (phytol, fructose, glucose), flavonoid (acacetin, cosmosiin, luteolin, naringenin, naringin, narirutin, neoriocitrin, neohesperidin, poncirin, rhoifolin, rutin), monoterpen ( -pinene, -pinene, citral, citronellal, geraniol acetate, limonene, linalool, linalyl acetate, myrcene, neral), sesquiterpen ( -caryophyllene), triterpen (limonin, nomilin, obacunone), asam fumarat, asam malonat, asam oksalat, asam suksinat, asam tartrat (Thavanapong, 2006). Senyawa yang terkandung di dalam jeruk bali mampu mencegah kanker, menurunkan resiko penyakit jantung, melancarkan saluran pencernaan, menjaga kesehatan kulit, mencegah konstipasi, menurunkan kolesterol dan mencegah anemia (Sekar, T. R., 2011). Manfaat lain jeruk bali, yakni membersihkan sel darah merah yang telah tua didalam tubuh dan menormalkan hematokrit (persentase sel darah per volume darah) (Yanuarta, I. M., 2007). Kandungan kalium dari jeruk bali dapat menyehatkan prostat dan kandungan bioflavonoidnya dapat menghentikan penyebaran sel-sel kanker payudara (Anonim, 2009). 5. Flavonoid Flavonoid merupakan kelompok utama dari antioksidan alami. Sumber utama flavonoid termasuk buah-buahan (misalnya jeruk, apel, anggur), sayuran

8 digilib.uns.ac.id


(misalnya bawang merah, kale, brokoli, paprika hijau, bayam), kedelai dan rempah-rempah. Flavonoid terdapat di sebagian besar tanaman dengan konsentrasi tinggi ditemukan pada kulit buah, daun dan bunga. Dalam beberapa tahun terakhir, flavonoid telah menarik perhatian karena flavonoid memiliki berbagai keuntungan efek farmakologi termasuk antiinflamasi, anti-alergi, antivirus, antikanker dan antioksidan. Naringin merupakan konstituen flavonoid utama dari buah Citrus aurantium dan Citrus grandis atau Citrus maxima. Sedangkan Hesperidin merupakan konstituen flavonoid utama dari buah Citrus reticulata (Lee Chao, et al., 2002). Kandungan flavonoid yang terdapat pada daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) terdiri atas berbagai komponen yaitu acacetin, cosmosiin, luteolin, naringenin,

naringin,

narirutin,

neoriocitrin,

neohesperidin,

poncirin,

rhoifolin, rutin (Thavanapong, 2006). Struktur kimia senyawa flavonoid dan naringin dapat dilihat pada Gambar 2 dan Gambar 3.

Gambar 2. Stuktur Kimia Senyawa Flavonoid (Maher, 2006)

9 digilib.uns.ac.id


Gambar 3. Struktur Kimia Senyawa Naringin (Anonim, 2008)

B. Metode Penyarian 1.

Ekstraksi Ekstraksi adalah penarikan zat aktif yang diinginkan dari bahan mentah obat menggunakan pelarut yang dipilih sehingga zat yang diinginkan akan larut. Pemilihan sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang maksimal dari zat aktif dan seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Ansel, 1989). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian rupa hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Ansel, 1989 ). Ada beberapa metode dasar ekstraksi yang dipakai untuk penyarian diantaranya yaitu maserasi, perkolasi, sokletasi, dan refluks. Penelitian terhadap metode tersebut disesuaikan dengan kepentingan dalam memperoleh sari yang baik (Anonim, 1986).

10 digilib.uns.ac.id


2.

Maserasi Maserasi merupakan metode ekstraksi yang sederhana. Maserasi merupakan proses merendam bahan simplisia yang telah dihaluskan dalam pelarut sampai meresap dan melunakkan susunan sel, sehingga zat-zat yang mudah larut akan terlarut. Proses ini dilakukan dalam bejana bermulut lebar, serbuk ditempatkan lalu ditambah pelarut dan ditutup rapat, isinya diaduk berulang-ulang kemudian disaring. Proses ini dilakukan pada temperatur kamar selama tiga hari (Ansel, 1989). Pada umumnya maserasi dilakukan dengan mencampur

10 bagian

simplisia dengan 75 bagian pelarut/cairan penyari. Metode ini memiliki keuntungan yaitu cara pengerjaannya mudah, alat yang digunakan sederhana dan cocok untuk bahan yang tidak tahan panas (Anonim, 1986).

C. Jerawat 1. Definisi Jerawat Jerawat adalah penyakit peradangan menahun dari unit pilosebaseus disertai penyumbatan dan penimbunan bahan keratin yang biasanya terjadi pada daerah muka, leher, dada dan punggung bagian atas, yang ditandai dengan adanya komedo, papul yang tidak beradang dan pustul, nodus dan kista yang beradang, dapat juga disertai rasa gatal. Penyakit ini dijumpai pada hampir semua (90%) orang akil baliq yang menginjak masa pubertas pada usia 15-19 tahun, orang dewasa dan dapat juga pada orang dengan usia lanjut (Djuanda dkk., 2007).



Jerawat terbatas pada folikel pilosebacea kepala dan badan bagian atas karena kelenjar sebacea di wilayah ini sangat aktif (Webster, 2002). Apabila folikel pilosebacea tersumbat, maka sebum tidak dapat keluar dan terkumpul di dalam folikel sehingga folikel membengkak, dan terjadilah komedo yang merupakan bentuk permulaan dari jerawat (Tranggono, 1996). Komedo adalah gejala bagi jerawat berupa papul miliar yang di tengahnya merupakan sumbatan sebum, bila berwarna hitam akibat mengandung unsur melanin disebut komedo hitam atau komedo terbuka. Bila berwarna putih karena letaknya lebih dalam sehingga tidak mengandung unsur melanin disebut sebagai komedo putih atau komedo tertutup (Djuanda dkk., 2007). 2. Patogenesis Faktor-faktor yang mempengaruhi terjadinya penyakit jerawat (acne vulgaris) adalah penyumbatan ductus pilosebaseus, meningkatnya produksi sebum, perubahan biokimia susunan lemak-lemak permukaan kulit dan kolonisasi kuman di dalam folikel sebaseus (Halim dan Sambijono, 1986). Mikroorganisme yang sering berperan adalah Propionibacterium acne, Staphylococcus epidermidis atau Pitysrosporum ovale dan P. orbiculare. Kadang-kadang jerawat menyebabkan rasa gatal yang mengganggu atau rasa sakit kecuali bila terjadi pustul atau nodus yang besar (Djuanda dkk., 2007). Mekanisme terjadinya jerawat adalah bakteri Propionibacterium acne merusak

stratum

korneum

dan

stratum

germinativum

dengan

cara

mengekskresikan bahan kimia yang menghancurkan dinding pori. Kondisi ini dapat menyebabkan inflamasi. Asam lemak dan minyak kulit tersumbat dan



mengeras. Jika jerawat disentuh maka inflamasi akan meluas sehingga padatan asam lemak dan minyak kulit yang mengeras akan membesar (Anonim, 2007).

D. Bakteri Bakteri adalah organisme uniseluler yang berkembang biak dengan cara pembelahan

diri dan

dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop

(Dwijoseputro, 1994). Bentuk dan ukuran bakteri bervariasi, ukuran berkisar 0,4-2 µm (Pelczar dan Chan , 1988). Bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan morfologi, biokimia dan perwarnaan (bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif) (Jawetz et al., 2005). Bakteri dapat didefinisikan secara morfologi yaitu dengan mempelajari bentuk, ukuran dan susunan sel. Perubahan lingkungan mungkin dapat sedikit mempengaruhi bentuk dan ukuran sel, misalnya bakteri berbentuk batang dapat menjadi lebih panjang atau lebih pendek. Bentuk dasar bakteri, yaitu bulat (tunggal: coccus, jamak: cocci), batang atau silinder (tunggal: bacillus, jamak: bacilli), dan spiral yaitu berbentuk melingkar-lingkar atau batang melengkung (Pratiwi , 2008). Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibedakan menjadi bakteri Gram positif dan Gram negatif. 1. Bakteri Gram Negatif Bakteri Gram negatif terdiri dari dinding sel yang mengandung satu atau beberapa lapis peptidoglikan tipis dan membran luar, membran dalam dan membran sitoplasma. Bakteri Gram negatif memiliki sistem membran ganda di



mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeable. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. Sel bakteri Gram negatif mungkin berbentuk bulat, lonjong, batang lurus atau lengkung, helix, dan filamen (seperti tali) (Jawetz et al., 2005). 2. Bakteri Gram Positif Bakteri Gram positif terdiri dinding sel yang mengandung banyak lapisan peptidoglikan dengan membentuk struktur tebal dan kaku, membran dalam, membran sitoplasma. Bakteri Gram positif hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90 persen dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat (Pratiwi, 2008).

E. Pewarnaan Gram Bakteri Sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna, maka untuk dapat melakukan

pengamatan

di

bawah

mikroskop

diperlukan

pewarnaan

mikroorganisme dengan menggunakan pewarna. Pewarnaan mikroorganisme pada

dasarnya

adalah

prosedur

mewarnai

mikroorganisme

dengan

menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan struktur tertentu dari mikroorganisme yang akan diamati. Sebelum mikroorganisme dapat diwarnai, mikroorganisme tersebut harus terlebih dahulu difiksasi agar terikat atau menempel pada kaca objek. Tanpa adanya fiksasi, maka pemberian zat warna



pada mikroorganisasi yang dilanjutkan dengan prosedur pencucian zat warna dengan air mengalir dapat menyebabkan mikroorganisme ikut tercuci. Ada tiga macam prosedur pewarnaan: 1.

Pewarnaan Sederhana Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam pewarna dan

bertujuan mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terlihat. Contoh pewarna sederhana adalah carbol fuchsin dan safranin. 2.

Pewarnaan Diferensial Pewarnaan diferensial menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki

reaksi berbeda untuk setiap bakteri, sehingga digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan diferensial yang sering digunakan adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. 3.

Pewarnaan Primer Pada pewarnaan Gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga

membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu kristal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka dinamakan pewarnaan primer. Selanjutnya pewarna dicuci, baik bakteri Gram positif maupun negatif tampak berwarna ungu. selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan senyawa peluntur pewarna yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan warna basa berwarna



merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam Gram negatif. Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakteri Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif, alkohol akan merusak lapisan lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin pada bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008).

F. Media Media adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi/nutrien/zat makanan yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Susunan dan kadar nutrien dalam suatu media untuk mikroba harus seimbang agar pertumbuhan mikroba dapat sebaik mungkin. Hal ini perlu dikemukakan mengingat banyak senyawa-senyawa yang menjadi penghambat atau menjadi racun bagi mikroba apabila kadarnya terlalu tinggi (misalnya garam-garam dari asam lemak, gula, dan lain-lain) (Anonim, 1989).



Supaya mikroba dapat tumbuh dengan baik dalam suatu media, perlu dipenuhi syarat-syarat sebagai berikut: 1. Media harus mengandung semua nutrien yang mudah digunakan oleh mikroba. 2. Media harus mempunyai tekanan osmose, tegangan permukaan dan pH yang sesuai. 3. Media tidak mengandung zat-zat penghambat. Media harus steril (Anonim, 1989).

G. Antibakteri Antibakteri adalah zat atau senyawa kimia yang digunakan untuk membasmi bakteri, khususnya bakteri yang merugikan manusia. Berdasarkan sifat toksisitas selektif (daya kerjanya), ada antibakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba dikenal sebagai aktivitas bakterostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisida. Konsentrasi minimal yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri atau membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM). Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisida bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KBM (Ganiswara, dkk., 1995).



Target mekanisme antibakteri adalah sebagai berikut: 1.

Kerusakan pada dinding sel Struktur

dinding

sel

dapat rusak

dengan

cara menghambat

pembentukannya atau setelah selesai terbentuk. Antibiotik yang bekerja dengan mekanisme ini diantaranya adalah penisilin (Pelczar dan Chan, 1988). 2.

Perubahan permeabilitas sel Membran sitoplasma mempertahankan bagian-bagian tertentu dalam sel serta mengatur aliran keluar masuknya bahan-bahan lain, kemudian memelihara integritas komponen komponen seluler. Kerusakan pada membran ini akan mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel (Jawetz et al., 2005).

3.

Perubahan molekul protein dan asam nukleat Hidup suatu sel tergantung pada terpeliharanya molekul-molekul protein dan asam nukleat dalam keadaan alamiahnya. Suatu antibakteri dapat mengubah keadaan ini dengan mendenaturasikan protein dan asamasam nukleat sehingga merusak sel tanpa dapat diperbaiki lagi (Pelczar dan Chan, 1988).

4.

Penghambatan sintesis asam nukleat dan protein DNA, RNA, dan protein memegang peranan amat penting didalam proses kehidupan normal sel. Hal ini berarti bahwa gangguan apapun yang terjadi pada pembentukan sel atau pada fungsi sel zat-zat tersebut mengakibatkan kerusakan total pada sel (Jawetz et al., 2005).



5.

Penghambatan kerja enzim Sulfonamid merupakan zat kemoterapi sintesis yang bekerja dengan cara bersaing dengan PABA, sehingga dapat menghalangi sintesis asam folat yang merupakan asam esensial yang berfungsi dalam sintesis purin dan pirimidin. Dengan demikian karena tidak adanya enzim, maka aktivitas seluler yang normal akan terganggu (Jawetz et al., 2005).

H. Uji Aktivitas Antibakteri Potensi antibakteri dari suatu zat dapat diketahui melalui uji aktivitas antibakteri yang dilakukan dengan metode difusi agar. Prinsip metode difusi agar yaitu uji potensi yang berdasarkan pengamatan luas daerah hambatan pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri dari titik awal pemberian ke daerah difusi. Media yang dipakai adalah agar Mueller Hinton. Pada metode difusi ini ada beberapa cara, yaitu: a. Cara Kirby Bauer b. Cara Sumuran c. Cara Pour Plate (Anonim, 1993). Difusi Agar dengan Cara Sumuran Pada agar tersebut dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu menurut kebutuhan, ke dalam sumuran tersebut dimasukkan atau diteteskan larutan antibiotik yang digunakan. Kemudian agar diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 18-24 jam (Anonim, 1993).



Hasil inkubasi dibaca sebagai berikut : a. Zona radikal yaitu suatu daerah di sekitar disk di mana sama sekali tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibakteri diukur dengan mengukur diameter dari zona radikal. b. Zona irradikal yaitu suatu daerah di sekitar disk dimana pertumbuhan bakteri dihambat oleh antibakteri, tetapi tidak dimatikan (Anonim, 1993). Berikut ini adalah kategori daya hambat bakteri menurut Davis dan Stout (1971). Tabel I. Kategori daya hambat bakteri (Davis dan Stout, 1971)

Daya hambat bakteri

Kategori Sangat kuat

10-20 mm

Kuat

5-10 mm

Sedang Lemah

I. Kerangka Pemikiran Daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) merupakan salah satu bagian dari tanaman yang memiliki khasiat antibakteri. Salah satu senyawa aktif pada daun jeruk bali yang memiliki aktivitas antibakteri adalah flavonoid. Diketahui dari penelitian sebelumnya, ekstrak etanol 75% daun jeruk lemon (Citrus limon) yang mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, steroid dan glikosida memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Salmonella



typhimurium. Ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) didapatkan dengan cara maserasi menggunakan etanol 75%. Jerawat merupakan salah satu penyakit yang disebabkan oleh bakteri, sehingga salah satu pengobatan jerawat dapat dilakukan dengan cara menurunkan jumlah koloni bakteri dan menurunkan inflamasi pada kulit. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) terhadap bakteri uji yang diambil dan diisolasi dari apusan darah jerawat. Pada bakteri uji tersebut dilakukan pewarnaan Gram bakteri untuk mengetahui bentuk, susunan sel dan sifat Gram-nya. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dilakukan dengan metode difusi agar (sumuran). Berdasarkan latar belakang dapat disusun suatu alur kerangka pemikiran yang disajikan dalam bentuk bagan yang dapat dilihat pada Gambar 4.



Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.)

Senyawa antibakteri meliputi : flavonoid, tanin, alkaloid, steroid, glikosida

Aktivitas Antibakteri

Jerawat

Isolasi Bakteri Penyebab Jerawat

Pewarnaan Gram Bakteri

Simplisia

Maserasi dengan Etanol 75%

Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali

Bakteri Gram

Bakteri Gram

Uji Aktivitas Antibakteri

Metode Difusi Agar (Sumuran)

Senyawa Antibakteri Alternatif Gambar 4. Alur Kerangka Pemikiran

J. Keterangan Empiris Daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) merupakan bagian dari salah satu tanaman obat tradisional Indonesia yang dipercaya mampu mencegah kanker, menurunkan resiko penyakit jantung, melancarkan saluran pencernaan, menjaga kesehatan kulit, mencegah konstipasi, menurunkan kolesterol dan



mencegah anemia. Flavonoid merupakan salah satu kandungan daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) yang dikenal memiliki potensi sebagai agen antibakteri. Berdasarkan penelitian sebelumnya daun jeruk lemon (Citrus limon) mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, steroid dan glikosida yang merupakan senyawa antibakteri, hal ini terbukti dengan penelitian Pinkee Pandey, et al. (2010) terhadap ekstrak etanol daun jeruk lemon (Citrus limon) yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Salmonella typhimurium dengan konsentrasi ekstrak 200 mg/ml menghasilkan diameter zona hambat masing-masing sebesar 17 mm; 11,6 mm; 16 mm; 17 mm; 15,1 mm dan 10 mm.


digilib.uns.ac.id

BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif laboratorium yaitu dengan melakukan isolasi bakteri pada apusan darah jerawat, mengamati sifat morfologinya dan menguji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) terhadap bakteri uji. B. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan di Laboratorium Biologi Pusat Sub Lab Mikrobiologi UNS dan Laboratorium Teknologi Farmasi FMIPA UNS. C. Alat dan Bahan 1. Alat yang digunakan a. Penyarian (Ekstraksi) Seperangkat alat maserasi, timbangan analit (Mettler Toledo®), grinder, ayakan nomor 40 dan 60, kain flanel, corong kaca, rotary evaporator (Bibby RE 200®), beaker glass (Pyrex®), gelas ukur (Pyrex®), labu ukur (Pyrex®), batang pengaduk, cawan porselen, eksikator. b. Preparasi Alat dan Pembuatan Media Bakteri Erlenmeyer (Pyrex®), gelas ukur (Pyrex®)), batang pengaduk, timbangan analit (Mettler Toledo®), autoclave (Sturdy®), LAF cabinet (Labconco ®), oven (Memmert®).

23



c. Pengambilan Apusan dan Isolasi Bakteri Uji Cotton budd steril, cawan petri , bunsen burner, jarum ose, inkubator suhu 37°C (J.P. Selecta Hotcold M®), masker, , handscoon, LAF cabinet (Labconco ®) . d. Pengecatan Gram Bakteri Kertas label, handscoon, masker, jarum ose, object glass, degglass, tabung reaksi (Pyrex®), pipet tetes, bunsen burner, mikroskop (Olympus CX-21®), spidol. e. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Erlenmeyer (Pyrex®), jarum ose, LAF cabinet (Labconco ®), shaker (IKA Labortechnik ®), tabung reaksi (Pyrex®), gelas ukur (Pyrex®). f. Uji Aktivitas Antibakteri Tabung reaksi (Pyrex®), rak tabung reaksi, flakon, handscoon, masker, cawan petri, jarum ose, mikropipet 10-100 µL (Master ptt®), yellow tips, bunsen burner, hot-plate, timbangan analit (Mettler Toledo®), gelas ukur (Pyrex®), pipet tetes, pelubang gabus, autoclave (Sturdy®), Laminar Air Flow (LAF) cabinet (Labconco®), inkubator suhu 4°C (J.P. Selecta Hotcold M®), inkubator (P-Selecta ®), jangka sorong digital (Bdq ®). 2. Bahan yang digunakan a. Bahan Utama Daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) yang diperoleh dari kebun jeruk bali di Tamanan, Sukomoro, Magetan, Jawa Timur.



b. Bahan Penyari Bahan penyari yang digunakan adalah Etanol 75% (Pinkee Pandey, et al., 2010). c. Bakteri Uji Bakteri yang diambil dari apusan darah jerawat. d. Pengambilan Apusan dan Isolasi Bakteri Uji Alkohol 70%, aquadest steril, media NA (Nutrient Agar) (Merck®), Media TSB (Tryptone Soya Broth) (Merck®), Media MC ( MacConkey) (Merck®), Media Agar Darah. e. Pengecatan Gram Bakteri Bakteri yang telah diisolasi dari apusan darah jerawat, cat Gram A (Kristal violet), cat Gram B (Lugol/Iodine), cat Gram C (Alkohol 96% dan Aceton), cat Gram D (Safranin), tissue, kapas. f. Pembuatan Stok Bakteri Media NA (Nutrient Agar) (Merck®), aquadest. g. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Media NB (Nutrient Broth) (Merck®), aquadest. h. Uji Aktivitas Antibakteri Media MHA (Muller Hinton Agar) (Merck®), aquadest steril, etanol 75%, suspensi CMC-Na 0,1% b/v, antibiotik Klindamisin 0,025%, kapas. D. Cara Kerja Tahap dari penelitian ini meliputi penyiapan alat, determinasi dan preparasi sampel, pembuatan ekstrak, pengambilan apusan darah jerawat, isolasi



bakteri uji, pengecatan Gram bakteri dan uji aktivitas antibakteri secara in vitro dengan metode difusi agar. 1. Penyiapan Alat Alat yang digunakan untuk penelitian ini adalah alat yang dipinjam dari Laboratorium Biologi Pusat Sub Lab Mikrobiolgi UNS dan Laboratorium Teknologi Farmasi FMIPA UNS. Alat yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. 2. Determinasi dan Preparasi Sampel Langkah ini bertujuan untuk memastikan kebenaran sampel daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.), dengan mencocokkan ciri-ciri morfologis yang ada pada tanaman jeruk bali (Citrus maxima Merr.) terhadap kepustakaan yang dibuktikan oleh Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat (LPPM) Universitas Setia Bu

Flora

Daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dipetik, disortir, dan dibersihkan dengan cara dicuci di bawah air mengalir yang bersih. Pengeringan daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dilakukan dengan cara dijemur dibawah sinar matahari dengan dilapisi kain hitam. Daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) yang telah kering dipisahkan dari pengotor (sortasi kering), selanjutnya diserbuk menggunakan grinder dan diayak menggunakan ayakan nomor 40 dan 60. Diagram alir pembuatan serbuk simplisia daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dapat dilihat pada Gambar 5.



Daun Jeruk Bali

Disortasi basah

Dicuci dibawah air mengalir

Dikeringkan dibawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam

Dipisahkan dari pengotor (sortasi kering)

Diserbuk

Diayak dengan ayakan 40 dan 60 mesh

Serbuk Simplisia Daun Jeruk Bali Gambar 5. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Jeruk Bali

3. Ekstraksi Pembuatan ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dilakukan dengan metode maserasi yakni serbuk simplisia daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) sebanyak 800 gram dimasukkan ke dalam bejana dan direndam dalam pelarut (Etanol 75%) sebanyak 6 liter selama 3 hari sambil diaduk. Dalam 3 hari tersebut dilakukan penggantian pelarut setiap 24 jam supaya penyarian berlangsung lebih optimal dan senyawa bioaktif dapat terlarut sempurna. Hasil maserasi (maserat) disaring menggunakan kain flanel kemudian maserat yang didapat dihilangkan pelarutnya menggunakan rotary evaporator pada suhu



55°C dengan kecepatan 5 rpm. Hasil ekstrak yang didapat kemudian dikentalkan menggunakan waterbath pada suhu 55°C hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) kemudian ditimbang dan disimpan di dalam eksikator. Diagram alir pembuatan ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dapat dilihat pada Gambar 6. 800 gram Serbuk Simplisia Daun Jeruk Bali

Dimaserasi dengan pelarut Etanol 75% sebanyak 6 liter selama 3 hari

Dalam 3 hari dilakukan penggantian pelarut setiap 24 jam

Maserat disaring menggunakan kain flanel

Dihilangkan pelarutnya menggunakan rotary evaporator pada suhu 55°C dengan kecepatan 5 rpm

Dikentalkan menggunakan waterbath pada suhu 55°C

Ekstrak kental

Disimpan dalam eksikator Gambar 6. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali

4. Pengambilan Apusan, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji Pengambilan apusan dilakukan dengan cara mengusap darah pada jerawat probandus menggunakan cotton budd steril yang sebelumnya telah dicelupkan



ke dalam aquadest steril, kemudian diratakan dengan metode streak pada media NA (Nutrient Agar) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Masing-masing koloni yang tumbuh diisolasi pada media NA (Nutrient Agar) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Dari tiap-tiap koloni yang tumbuh diambil 1 ose untuk dilakukan pengecatan dan pengamatan morfologi. Apabila dari hasil pengecatan dan pengamatan morfologi hanya terdapat satu jenis bakteri maka dapat langsung dibuat stok dan digunakan sebagai bakteri uji, sedangkan apabila hasilnya menunjukkan bahwa masih terdapat lebih dari satu jenis bakteri maka harus dilakukan pemisahan terlebih dahulu menggunakan media yang sesuai. Diagram alir isolasi dan identifikasi bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 7.



Apusan darah jerawat

Ditanam dalam Media NA (Nutrient Agar) dan diratakan dengan metode streak diinkubasi 24 jam suhu 37°C Tumbuh koloni bakteri lebat dari 4 apusan darah jerawat yang berbeda

Dikulturkan dalam Media NA dan diinkubasi 24 jam pada suhu 37°C

Diambil 10 koloni berbeda dengan melihat bentuk dan warna koloni

Diperoleh biakan 10 koloni

Dilakukan pengecatan Gram dan pengamatan morfologi bakteri

Bakteri bentuk kokus Gram positif pada stok tabung 1 sampai 9

Dibuat 10 stok bakteri dalam bentuk agar miring

Bakteri bentuk basil Gram positif dan negatif pada stok tabung 10

Dibuat stok dalam TSA Ditanam pada media MacConkey Agar

Ditanam pada media Agar Darah

Uji aktivitas antibakteri Koloni bakteri Gram negatif

Koloni bakteri Gram positif (tidak hemolisis)

Koloni bakteri Gram negatif (tidak hemolisis)

Dilakukan Pengecatan Gram dan pengamatan morfologi bakteri pada tiap koloni yang berbeda

Bakteri bentuk basil Gram positif

Bakteri bentuk basil Gram negatif

Masing-masing dibuat stok agar miring Gambar 7. Tahap Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji



5. Pengecatan Gram Bakteri Uji Langkah pengecatan Gram bakteri uji dimulai dengan membersihkan object glass dan degglass dengan alkohol kemudian masing-masing ujung object glass diberi label untuk membedakan bakteri yang akan dicat. Pada bagian bawah object glass digambar bulatan berdiameter 1 cm dengan spidol (daerah ini digunakan untuk pengecatan bakteri). Pada sisi sebaliknya diteteskan 1 tetes aquadest dalam daerah bulatan, kemudian diambil sedikit biakan bakteri dengan jarum ose secara aseptis dan digoreskan pada daerah bulatan lalu diratakan pada seluruh area bulatan kemudian dikering anginkan hingga membentuk noda. Tahap selanjutnya dilakukan fiksasi panas dengan melewatkan object glass pada nyala api beberapa kali (jangan terkena api secara langsung). Setelah difiksasi, preparat digenangi dengan cat Gram A (kristal violet) selama 1-3 menit kemudian cat dibuang (tanpa menggunakan air), selanjutnya preparat digenangi cat Gram B (lugol/iodine) selama 1 menit kemudian sisa cat B dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Object glass dimiringkan dan dicuci dengan cat Gram C (alkohol 96% dan aceton) dengan cara meneteskan cat Gram C pada permukaan noda sampai warna cat tepat dilunturkan (tidak berwarna) selama 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir secara singkat dan dikering anginkan. Preparat digenangi dengan cat Gram D (safranin) dan didiamkan selama 2 menit selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan.



Permukaan object glass ditutup dengan deglass dan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat dengan minyak imersi. Sel bakteri diamati bentuk dan warnanya. Sel berwarna merah muda merupakan Gram negatif dan sel berwarna biru-ungu merupakan Gram positif. Diagram alir pengecatan Gram bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 8.



Dibersihkan dengan alkohol

Ditempeli label

Object Glass

Digambar bulatan diameter ±1cm Daerah pengecatan mikroba Ditetesi 1 tetes akuades

Object Glass dibalik

Ditambahakan dan disuspensikan 1 ose biakan bakteri

Diratakan sebesar area bulatan Difiksasi di atas nyala api

Preparat kering

Digenangi Cat Gram A selama 1-3 menit Cat Gram A buang tanpa dicuci air kemudian digenangi cat Gram B selama 1 menit

Dicuci air kemudian dikering-anginkan, Ditetesi cat Gram C selama 30 detik hingga warna hilang

Dikering-anginkan Dicuci cepat dengan air mengalir

Ditetesi cat Gram D selama 2 menit

Ditutup dengan Degglass Diamati dengan mikroskop perbesaran 1000x minyak imersi Diperoleh Morfologi bakteri, Gram negatif (merah muda), Gram positif (biru-ungu) Gambar 8. Pengecatan Gram Bakteri Uji



6. Uji Aktivitas Antibakteri Langkah-langkah pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) adalah sebagai berikut : a. Penyiapan Alat Alat uji yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm selama 15 menit. b. Pembuatan Media 1) Media NA (Nutrient Agar) Media NA dibuat dengan cara mensuspensikan 20 gram NA dalam aquadest sampai volume 1 liter. Larutan media dipanaskan hingga larut, dan dimasukkan dalam

erlenmeyer, kemudian dilakukan sterilisasi

menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit. 2) Media NA (Nutrient Agar) dalam bentuk agar miring Media NA dibuat dengan cara mensuspensikan 20 gram NA dalam aquadest sampai volume 1 liter, kemudian dipanaskan hingga larut dan dimasukkan dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Selanjutnya media tersebut disterilkan terlebih dahulu sebelum digunakan. Media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C. Tabung reaksi selanjutnya dimiringkan agar media NA didalamnya membeku berbentuk miring. 3) Media TSA (Tryptone Soya Agar) Tryptone Soya Broth sebanyak 3 gram dilarutkan dalam 100 ml akuades dan ditambahkan 1 gram agar, kemudian dipanaskan hingga



larut. Untuk membuat media agar miring yang akan digunakan untuk stok bakteri, media TSA yang telah larut dimasukan kedalam tabung reaksi steril sebanyak 5 ml kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC. Tabung reaksi selanjutnya dimiringkan agar media TSA didalamnya membeku berbentuk miring. 4) Media NB (Nutrient Broth) Media NB dibuat dengan cara mensuspensikan 8 gram bubuk media NB dalam aquadest, sampai volume 1 liter. Larutan media dipanaskan hingga larut, dan dimasukkan dalam erlenmeyer, kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit, jika diperlukan dapat dibagi terlebih dahulu kedalam wadah yang lebih kecil sebelum disterilkan kemudian disimpan pada suhu 25oC dengan pH penyimpanan 7±0,2. 5) Media MHA (Muller Hinton Agar) Media MHA dibuat dengan cara sebanyak 38 gram bubuk media MHA dilarutkan dalam aquadest, sampai volume 1 liter. Larutan dipanaskan hingga larut, selanjutnya dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit. Media MHA yang sudah steril, didiamkan sampai kisaran suhu 40-50ºC, kemudian secara aseptis dicampurkan kultur bakteri uji dengan perbandingan 1:100 (bakteri : media).



c. Pembuatan Stok Bakteri Uji Memindahkan dan membiakan koloni bakteri yang berasal dari hasil pemisahan bakteri apusan darah jerawat dengan cara digoreskan 1-2 mata ose pada media agar miring yaitu media agar miring NA dan TSA dalam tabung reaksi yang kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Diagram alir pembuatan stok bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 9. Kultur bakteri bentuk kokus Gram positif

Kultur bakteri bentuk basil Gram positif

distreak pada Media Agar miring TSA

Kultur bakteri bentuk basil Gram negatif

Masing-masing kultur distreak pada Media Agar miring NA

Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam Digunakan sebagai stok Gambar 9. Pembuatan Stok Bakteri Uji

d. Pembuatan Suspensi Bakteri Bakteri uji diambil 1-2 mata ose dari stok bakteri, dicampurkan dalam 25 ml media NB (Nutrient Broth) steril. Dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu kamar dengan cara digoyang-goyang menggunakan shaker dengan kecepatan 200 rpm selama 18-24 jam. e. Pembuatan Suspensi CMC-Na 0,1% b/v Suspensi CMC-Na 0,1% b/v dibuat dengan cara melarutkan 0,05 gram serbuk CMC-Na dilarutkan dalam 50 ml aquadest.



f. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) Ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dibuat 11 seri konsentarsi (0%-100%) dengan menggunakan suspensi CMC-Na 0,1% b/v. Setiap seri konsentrasi dibuat dengan menambahkan suspensi CMCNa 0,1% b/v kedalam beberapa gram ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.), sampai volumenya 5 ml. Komposisi bahan yang digunakan dalam pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dapat dilihat dalam Tabel II. Tabel II. Komposisi Bahan dalam Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.)

Konsentrasi akhir ekstrak (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Berat ekstrak etanol daun jeruk bali (gram) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

Suspensi CMC-Na 0,1% b/v (ml) ad 5 ad 5 ad 5 ad 5 ad 5 ad 5 ad 5 ad 5 ad 5 ad 5 ad 5

Diagram alir pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) dapat dilihat pada Gambar 10.



Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali Diambil

0,5 gram

0 gram gram Ditambah Suspensi CMCNa sampai 5 ml

Didapat Konsentrasi Ekstrak 0% b/v

1,5 gram gram

1 gram gram

Ditambah

Ditambah

Suspensi CMCNa sampai 5 ml

Suspensi CMCNa sampai 5 ml

Didapat

Didapat

Konsentrasi Ekstrak10% b/v

Konsentrasi Ekstrak 20% b/v

Ditambah Suspensi CMCNa sampai 5 ml


(A)


2,5 gram



3,5 gram gram

3 gram gram





(B)






4,5 gram







(C) Gambar 10. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Jeruk Bali. (A) Pembuatan Konsentrasi Ekstrak 0-30% b/v. (B) Pembuatan Konsentrasi Ekstrak 40-70% b/v. (C) Pembuatan Konsentrasi Ekstrak 80-100% b/v

g. Larutan Kontrol Kontrol yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri ini terdiri dari : 1) Kontrol suspensi CMC-Na 0,1% b/v 2) Kontrol etanol 75% 3) Kontrol antibiotik Klindamisin 0,025% h. Pengujian Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Padat Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode difusi padat dengan langkah kerja sebagai berikut : 1) Menyiapkan media uji MHA disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit kemudian didinginkan hingga 40-50°C



2) Suspensi bakteri uji yang berusia 24 jam dipindahkan ke dalam MHA yang bersuhu 40-50°C sebanyak 1% dari volume total MHA, kemudian dihomogenkan. 3) Menuang media MHA ke dalam cawan petri sebanyak 15 ml dan dibiarkan memadat. 4) Membuat lubang sumuran dengan menggunakan pelubang gabus dengan diameter lubang sebesar 6 mm pada media MHA padat. 5) Memasukkan 20µL seri konsentrasi ekstrak etanol daun jeruk bali, kontrol pelarut ekstrak (CMC-Na 0,1% b/v), etanol 75% dan antibiotik Klindamisin 0,025% ke dalam masing-masing lubang, kemudian diberi label dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. 6) Mengukur diameter zona hambat pada masing-masing sumuran menggunakan jangka sorong dengan pengukuran sebanyak 3 kali untuk tiap lubang. 7) Replikasi dilakukan sebanyak 2 kali pada tiap pengujian. Nilai diameter zona hambat dari kedua replikasi tersebut dirata-rata. 8) Membandingkan nilai diameter zona hambat antar bakteri uji. Diagram alir pengujian aktivitas antibakteri metode difusi padat dapat dilihat pada Gambar 11.



Media uji MHA disterilisasi Suspensi bakteri uji

Media MHA yang bersuhu 40-50ºC

Bakteri dan media dihomogen Dituang sebanyak 15 ml ke cawan petri

Dibiarkan hingga media memadat Dibuat lubang pada media

Dimasukkan 20µL larutan seri konsentrasi ekstrak dan larutan kontrol CMC-Na, kontrol etanol dan kontrol antibiotik ke dalam lubang Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam Diukur diameter zona hambat

Perhitungan 3 kali masing-masing lubang

Replikasi 2 kali Dibandingkan hasil pada sampel uji dengan kontrol suspensi CMC-Na 0,1% , kontrol etanol 75 % dan kontrol antibiotik Klindamisin 0,025%

Membandingkan nilai diameter zona hambat antar bakteri uji Gambar 11. Pengujian Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Padat



E. Analisis Hasil Analisis data dilakukan secara eksploratif melalui pengamatan morfologi koloni (bentuk dan warna), sifat Gram bakteri pada jerawat dan diameter daya hambat ekstrak terhadap pertumbuhan bakteri uji. Bakteri hasil isolasi dari apusan darah jerawat dilakukan pengecatan Gram untuk

mengetahui

sifat

Gram-nya,

kemudian

dilakukan

pengamatan

morfologinya secara mikroskopis untuk mengetahui bentuk dan susunan selnya. Uji Aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar melalui pengukuran diameter zona hambat pertumbuhan bakteri uji. Semakin besar diameter zona hambat menunjukan bahwa aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun jeruk bali (Citrus maxima Merr.) semakin besar.


digilib.uns.ac.id

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengumpulan dan Determinasi Tanaman Tanaman yang digunakan untuk penelitian diambil dari kawasan perkebunan jeruk bali di Tamanan, Sukomoro, Magetan, Jawa Timur. Sampel yang akan digunakan dikumpulkan dari tempat dan waktu tertentu untuk menghindari adanya variasi kandungan kimia tumbuhan yang terlalu besar karena perbedaan kondisi tempat tumbuh. Sampel tanaman Citrus maxima dideterminasi untuk mengetahui kebenaran bahan dan menghindari adanya kesalahan dalam pengambilan sampel. Determinasi tanaman dilakukan oleh Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat (LPPM) Universitas Setia Budi, Surakarta dengan mencocokkan ciri-ciri morfologis yang ada pada tanaman Jeruk Bali (Citrus maxima Merr.) dengan

Flora .

B. Penyiapan Bahan Bahan utama penelitian ini diperoleh dalam bentuk segar. Daun Citrus maxima yang digunakan dipilih yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua yaitu dipilih daun pada urutan ke 3, 4, 5 dan 6 dari ujung tangkai pohon dengan tujuan mendapatkan kandungan kimia daun yang optimal. Daun Citrus maxima kemudian disortir dan dibersihkan dengan cara dicuci di bawah air mengalir yang bersih. Pengeringan daun dilakukan dengan cara menjemur daun Citrus maxima menggunakan kain hitam dengan tujuan agar kandungan kimia yang ada pada

43



sampel tidak rusak oleh sinar ultraviolet (UV) dari sinar matahari, selain itu kain hitam dapat menyerap panas secara optimal. Daun Citrus maxima yang telah kering dipisahkan dari pengotor kemudian diserbuk dan diayak. Pembuatan serbuk simplisia daun Citrus maxima bertujuan untuk memperluas permukaan partikel yang berinteraksi dengan pelarut sehingga penetrasi pelarut ke dalam jaringan tanaman berlangsung efektif, hal ini mempermudah melarutkan metabolit sekunder (Cannell, 1998), serta senyawa metabolit sekunder dapat terekstrak dengan sempurna. Serbuk tidak boleh terlalu halus karena akan mempersulit penyarian, butir-butir yang terlalu halus akan membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dengan hasil penyarian. Dengan demikian hasil penyarian tidak murni lagi tetapi bercampur dengan partikelpartikel yang terlalu halus tadi. Setelah diserbuk dan diayak dengan ayakan nomor 40 dan 60 diperoleh serbuk simplisia daun Citrus maxima sebanyak 800 gram.

C. Tahap Ekstraksi Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi. Metode ini merupakan metode perendaman sampel dengan pelarut yang sesuai pada temperatur ruang. Maserasi dipilih karena metode ini dapat menghasilkan ekstrak dalam jumlah banyak, serta terhindar dari perubahan kimia senyawa-senyawa tertentu karena pemanasan (Pratiwi, 2009). Pelarut yang digunakan dalam proses maserasi ini adalah etanol 75% (Pandey et al., 2010). Konsentrasi etanol yang digunakan sebagai pelarut dalam proses maserasi adalah etanol 75% karena pada penelitian yang dilakukan oleh



Pinkee Pandey, et al. (2010) digunakan etanol 75% untuk mengekstraksi daun jeruk lemon (Citrus limon) yang mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, steroid dan glikosida, dan terbukti bahwa ekstrak etanol daun jeruk lemon (Citrus limon) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Salmonella typhimurium dengan konsentrasi ekstrak 20% b/v. Maserasi dengan etanol 75% dilakukan selama 24 jam dan diulang sebanyak tiga kali. Tujuan dari pengulangan maserasi supaya penyarian berlangsung lebih optimal dan senyawa bioaktif dapat terlarut sempurna. Proses maserasi disertai dengan pengadukan untuk mempermudah kontak pelarut pada rongga sel tumbuhan, sehingga senyawa-senyawa yang terkandung di dalamnya dapat ditarik keluar oleh pelarut. Pengadukan dapat menimbulkan sirkulasi pelarut sehingga ekstraksi dapat berlangsung optimal. Adanya perbedaan konsentrasi antara cairan di dalam sel dan cairan di luar sel akan menyebabkan senyawa aktif terdesak ke luar sel yang memiliki konsentrasi yang lebih rendah. Proses ekstraksi akan terus berlanjut hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara cairan di dalam dan di luar sel sehingga cairan menjadi jenuh dan proses ekstraksi terhenti (Ristiningsih, 2009). Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan kain flannel untuk memisahkan antara residu dengan filtratnya. Filtrat maserasi kemudian di uapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 55°C dengan kecepatan 5 rpm dengan tujuan memisahkan ekstrak dengan pelarutnya. Prinsip kerja dari rotary evaporator adalah menguapkan pelarut sehingga didapatkan ekstrak yang kental.



Hasil ekstrak yang didapat kemudian dikentalkan menggunakan waterbath pada suhu 55°C hingga diperoleh ekstrak etanol daun Citrus maxima yang kental. Ekstrak etanol daun Citrus maxima yang diperoleh adalah 86,64 gram dengan rendemen 10,83%.

D. Pengambilan Apusan Darah Jerawat Pengambilan apusan darah jerawat dilakukan secara aseptis terhadap 4 jerawat probandus. Kulit wajah probandus harus dibersihkan terlebih dahulu, kemudian jerawat dipencet hingga keluar darah dan nanahnya, selanjutnya darah yang keluar dari jerawat probandus diusap menggunakan cotton budd steril yang sebelumnya telah dicelupkan ke dalam aquadest steril. Penggunaan aquadest steril bertujuan untuk mensuspensikan darah agar koloni yang tumbuh pada media dapat tumbuh secara terpisah. Darah yang telah diusap dengan cotton budd steril diapus pada media NA (Nutrient Agar) dengan metode streak. Prinsip metode streak atau cawan gores yaitu mendapatkan koloni yang terpisah dari koloni lain sehingga mempermudah proses isolasi. Media NA yang telah diapus darah jerawat dari probandus kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C hingga muncul pertumbuhan koloni lebat yang berasal dari 4 apusan darah jerawat yang berbeda seperti pada Gambar 12. Untuk mendapatkan isolat bakteri maka perlu dilakukan pemisahan koloni.



Gambar 12. Koloni bakteri yang tumbuh dari apusan darah jerawat (A) Apusan darah jerawat 1. (B) Apusan darah jerawat 2. (C) Apusan darah jerawat 3. (D) Apusan darah jerawat 4.

E. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji Proses isolasi tahap I dilakukan terhadap 4 biakan bakteri yang tumbuh dari 4 apusan darah jerawat yang berbeda. Pemisahan koloni biakan dilakukan dengan melihat bentuk dan warna koloninya. Masing-masing koloni yang tumbuh diisolasi pada media NA menggunakan metode streak dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Pada isolasi tahap I diperoleh biakan 10 koloni bakteri. Hasil dari biakan 10 koloni bakteri yang diperoleh, selanjutnya dibuat stok dalam bentuk agar miring menggunakan media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Sepuluh stok bakteri yang diperoleh dari isolasi tahap I dapat dilihat pada Gambar 13.



Gambar 13. Sepuluh stok bakteri hasil isolasi tahap I

Langkah selanjutnya adalah melakukan pengecatan Gram terhadap 10 stok bakteri yang diperoleh untuk mengidentifikasi morfologi dan jenis Gram bakteri yang telah diisolasi. Proses pengecatan Gram menggunakan 4 macam cat. Cat Gram A yang terdiri dari kristal violet, alkohol dan amonium oksalat berfungsi sebagai pewarna primer. Cat Gram B yang terdiri dari iodium, kalium iodida dan akuades berfungsi sebagai penguat warna. Cat Gram C yang terdiri dari aseton dan alkohol berfungsi sebagai peluntur. Cat Gram D yang terdiri dari safranin, alkohol dan akuades berfungsi sebagai pewarna kontras atau pembeda (Pelczar & Chan,1988). Pengecatan Gram atau pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni Gram positif dan Gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada bakteri Gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri Gram negatif berwarna merah. Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan sehingga kompleks kristal violet-



iodin yang masuk ke dalam sel bakteri Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel, sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida sehingga alkohol akan merusak lapisan lipopolisakarida. Kompleks kristal violetiodin pada bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008). Hasil dari pengecatan Gram menunjukkan bahwa ditemukan bakteri bentuk kokus Gram positif pada tabung 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan campuran antara bakteri bentuk basil Gram positif dan bakteri bentuk basil Gram negatif pada tabung 10 seperti pada Tabel III dan Gambar 14. Tabel III. Hasil Pengecatan Gram Koloni Bakteri yang Tumbuh dari Apusan Darah Jerawat

NO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

SAMPEL Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5 Tabung 6 Tabung 7 Tabung 8 Tabung 9 Tabung 10

HASIL Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) Diketemukan bakteri Coccus Gram (+) a. Diketemukan bakteri batang (Bacillus) Gram (+) b. Diketemukan bakteri batang (Bacillus) Gram (-)



(A)

(B)

(C)

(D)

Gambar 14. (A) Pertumbuhan koloni bakteri nomor 1-9. (B) Hasil pengecatan stok bakteri tabung 1-9. (C) Pertumbuhan koloni bakteri nomor 10. (D) Hasil pengecatan stok bakteri tabung 10.

Stok bakteri pada tabung 1 sampai 9 dapat langsung digunakan untuk uji aktivitas antibakteri karena hanya terdapat 1 koloni bakteri di dalamnya. Sebelum digunakan untuk uji aktivitas antibakteri, stok bakteri pada tabung nomor 1 sampai 9 harus di-refresh atau diregenerasi terlebih dahulu menggunakan media TSA (Tryptone Soya Agar) dalam bentuk agar miring. Digunakan media TSA untuk membuat stok bakteri bentuk kokus Gram positif sebelum digunakan untuk uji karena bakteri ini lebih tumbuh subur pada media TSA daripada pada media NA (Gentry, D., et.al, 2000). Regenerasi ini bertujuan untuk memperbanyak jumlah bakteri yang digunakan sebagai bahan uji dan stok serta untuk mencegah bakteri mati selama penyimpanan.



Proses isolasi tahap II dilakukan terhadap stok bakteri dalam tabung 10 sehingga didapatkan koloni bakteri bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif yang terpisah. Proses ini diawali dengan memindahkan campuran antara bakteri bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif pada tabung 10 ke media selektif yaitu media MacConkey Agar dan media Agar Darah. Media MacConkey Agar merupakan media selektif dan diferensial yang mempunyai keistimewaan memisahkan bakteri enterik Gram negatif dari campuran bakteri yang memfermentasikan laktosa, karena dalam MacConkey Agar ini terdapat laktosa, crystal violet dan neutral red bile salt. Bile salt yang terkandung dalam media ini digunakan sebagai penghambat tumbuhnya bakteri Gram positif sehingga koloni yang tumbuh pada media ini adalah koloni bakteri Gram negatif. Media Agar Darah adalah media diperkaya yang menyediakan nutrisi ekstra untuk pertumbuhan bakteri. Media Agar Darah termasuk dalam media differensial dimana dapat membedakan bakteri yang memiliki kemampuan untuk hemolisis dan tidak, yang ditandai oleh adanya zona (halo) disekitar koloni. Pertumbuhan koloni bakteri tabung 10 pada media MacConkey Agar dan media Agar Darah dapat dilihat pada Gambar 15.

(A) (B) Gambar 15. Pertumbuhan koloni bakteri tabung 10 pada (A) media MacConkey Agar (B) media Agar Darah



Langkah selanjutnya dilakukan penggambilan koloni yang berbeda kemudian dilakukan pengecatan Gram untuk pengamatan morfologi serta sifat Gram-nya. Hasil pengecatan yang menunjukan koloni bakteri bentuk basil Gram positif dan koloni bakteri bentuk basil Gram negatif yang sudah terpisah masingmasing dibuat stok agar miring menggunakan media NA. Bakteri bentuk basil Gram positif memiliki ciri berbentuk batang dan berwarna ungu setelah dilakukan pengecatan, sedangkan bakteri bentuk basil Gram negatif memiliki ciri berbentuk batang dan berwarna merah setelah dilakukan pengecatan. Tahap selanjutnya adalah identifikasi bakteri uji yang dilakukan melalui pengamatan bentuk dan warna koloninya serta pengamatan morfologi bakteri yang dilakukan di bawah mikroskop. Pengamatan bentuk dan warna koloni bakteri uji dilakukan secara langsung terhadap pertumbuhan bakteri pada media agar. Sedangkan pengamatan morfologi bakteri uji dilakukan di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 1000x dengan minyak imersi dengan cara mengamati bentuk, susunan dan sifat Gram bakteri setelah dilakukan pengecatan terhadap bakteri uji. Hasil identifikasi bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 16, 17 dan 18.

(A)

(B)

(C)

Gambar 16. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk kokus Gram positif. (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk kokus Gram positif. (C) Stok bakteri bentuk kokus Gram positif.



Gambar 16 menunjukkan ciri-ciri bakteri hasil isolasi sebagai berikut : Bentuk koloni

: bulat

Warna koloni

: krem

Susunan sel

: bergerombol

Morfologi sel

: bulat

Bentuk tepian

: rata

Warna pengecatan Gram

: ungu

Jenis Gram

: positif

(A)

(B)

(C)

Gambar 17. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk basil Gram positif. (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk basil Gram positif. (C) Stok bakteri bentuk basil Gram positif.


: bulat

Warna koloni

: krem

Susunan sel

: berderet

Morfologi sel

: batang

Bentuk tepian

: bergelombang


: ungu

Jenis Gram

: positif



(A)

(B)

(C)

Gambar 18. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk basil Gram negatif. (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk basil Gram negatif. (C) Stok bakteri bentuk basil Gram negatif.


: bulat

Warna koloni

: krem

Susunan sel

: monobasil (sel bakteri basil tunggal)

Morfologi sel

: batang

Bentuk tepian

: bergelombang


: merah

Jenis Gram

: negatif

F. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Ekstrak etanol daun Citrus maxima dibuat 11 seri konsentarsi yaitu konsentrasi 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 100% menggunakan pelarut suspensi CMC-Na 0,1% b/v. Setiap seri konsentrasi dibuat dengan menambahkan suspensi CMC-Na 0,1% b/v kedalam sejumlah tertentu ekstrak etanol daun Citrus maxima sampai volumenya 5 ml. Digunakan suspensi CMC-Na 0,1% b/v sebagai pelarut ekstrak karena ekstrak etanol mempunyai sifat



sukar larut dalam pelarut air, maka diperlukan suspending agent agar didapatkan suatu suspensi yang baik antara media dan ekstrak. CMC-Na dipilih sebagai suspending agent karena CMC-Na mensuspensikan dengan baik antara media dengan ekstrak etanol. Selain itu, sesuai dengan prinsip like dissolve like dimana CMC-Na bersifat polar sehingga dapat melarutkan ekstrak yang polar seperti ekstrak etanol daun Citrus maxima.

G. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Citrus maxima Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri bentuk kokus Gram positif, bakteri bentuk basil Gram positif dan bakteri bentuk basil Gram negatif yang diperoleh dari isolasi apusan darah jerawat. Bakteri tersebut diregenerasikan dalam media TSA dan media NA dengan metode agar miring. Regenerasi ini bertujuan untuk memperbanyak jumlah bakteri yang digunakan sebagai bahan uji dan stok serta untuk mencegah bakteri mati selama penyimpanan. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dalam kondisi yang steril agar tidak terjadi kontaminasi. Sterilisasi dilakukan terhadap alat, bahan dan ruangan yang akan digunakan. Sterilisasi alat dan bahan dilakukan menggunakan autoklaf dengan suhu 121°C pada tekanan 1 atm. Panas yang dihasilkan oleh autoklaf adalah panas uap sehingga proses sterilisasi dapat merata yaitu tidak hanya di bagian luar permukaan peralatan tetapi juga di bagian dalam dari peralatan tersebut ikut disterilkan. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar/sumuran (well diffusion method). Media yang digunakan dalam uji aktivitas



antibakteri ekstrak etanol daun Citrus maxima adalah media MHA (Mueller Hinton Agar) karena media ini mengandung nutrisi yang cukup untuk kultur kebanyakan spesies bakteri dan bersifat netral sehingga tidak menimbulkan pengaruh terhadap prosedur uji. Menurut Bauer et al., (1966) media Mueller Hinton (MH) digunakan sebagai standarisasi uji kepekaan antibakteri, selain itu media ini juga direkomendasikan oleh FDA (Food and Drug Administration), WHO (World Health Organization) dan NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) untuk uji terhadap kontaminasi bakteri aerob dan anaerob pada makanan dan alat-alat kesehatan. Uji aktivitas antibakteri ini dilakukan menggunakan metode difusi agar terhadap bakteri uji yaitu bakteri bentuk kokus Gram positif, bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif dengan menggunakan sumuran berdiameter 6 mm. Prinsip pengujian dengan metode difusi agar adalah terbentuk atau tidaknya zona bening disekitar sumuran setelah media agar yang ditanami bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam, sehingga besarnya daya hambat terhadap bekteri uji dapat teramati dengan jelas. Seri konsentrasi ekstrak etanol daun Citrus maxima, kontrol CMC-Na 0,1% b/v, kontrol etanol 75% dan kontrol antibiotik Klindamisin 0,025% masing-masing dimasukan pada sumuran berdiameter 6 mm yang telah dibuat pada media yang telah ditanami bakteri, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam dan diamati besarnya daya hambat yang terjadi dari masing-masing konsentrasi ekstrak etanol daun Citrus maxima, kontrol CMC-Na 0,1% b/v, kontrol etanol 75% dan kontrol antibiotik Klindamisin 0,025%.



mm tergolong kategori sangat kuat, 10-20 mm tergolong kategori kuat, 5-10 mm tergolong kategori sedang dan yang besarnya kurang dari 5 mm tergolong lemah. Pada pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap bakteri bentuk kokus Gram positif dan bentuk basil Gram positif terbentuk dua macam zona hambatan yaitu zona radikal dan zona irradikal. Zona radikal yaitu suatu daerah di sekitar sumuran di mana sama sekali tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibakteri diukur dengan mengukur diameter dari zona radikal. Zona irradikal yaitu suatu daerah di sekitar sumuran dimana pertumbuhan bakteri dihambat oleh antibakteri, tetapi tidak dimatikan (Anonim, 1993). Daya hambat ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap pertumbuhan bakteri bentuk kokus Gram positif terbentuk dua zona, pada zona radikal tergolong kategori lemah karena hampir seluruh konsentrasi ekstrak memiliki diameter daya hambat kurang dari 5 mm, hanya pada konsentrasi ekstrak 80% saja yang tergolong kategori sedang karena memiliki diameter daya hambat sebesar 5,29 mm, sedangkan pada zona irradikal semua konsentrasi ekstrak tergolong kategori lemah karena hanya memiliki diameter daya hambat kurang dari 5 mm. Daya hambat ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap pertumbuhan bakteri bentuk basil Gram positif juga terbentuk dua zona, pada zona radikal tergolong kategori lemah karena dari semua konsentrasi ekstrak hanya memiliki diameter daya hambat kurang dari 5 mm, sedangkan pada zona irradikal tergolong kategori sedang karena dari semua konsentrasi ekstrak memiliki diameter daya hambat antara 5 sampai 10 mm. Daya hambat ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap



pertumbuhan bakteri bentuk basil Gram negatif tidak terbentuk dua zona dan hanya tergolong kategori lemah karena dari semua konsentrasi ekstrak hanya memiliki diameter daya hambat kurang dari 5 mm. Aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap bakteri bentuk kokus Gram positif, bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif cenderung lemah karena bakteri yang digunakan pada pengujian ini adalah bakteri klinis yang langsung dibiakkan dari apusan darah jerawat. Bakteri tersebut bukan biakan murni bakteri yang sudah terbiasa hidup pada media yang kaya akan nutrisi. Akibatnya diameter daya hambat yang dihasilkan cenderung kecil dan membentuk dua macam zona hambatan yaitu zona radikal dan zona irradikal pada bakteri bentuk kokus Gram positif dan bakteri bentuk basil Gram positif karena bakteri yang digunakan sudah terbiasa hidup di lingkungannya sehingga lebih sukar dihambat pertumbuhannya oleh ekstrak etanol daun Citrus maxima. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun Citrus maxima terhadap pertumbuhan bakteri bentuk kokus Gram positif cenderung meningkat sebanding dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak hingga konsentrasi 80% kemudian menurun pada konsentrasi 90% dan kembali meningkat pada konsentrasi 100% pada

zona

radikal.

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN JERUK BALI (Citrus maxima Merr.) TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI PADA JERAWAT

Recommend Documents