045

NIZO-RAPPORT E2014/045 Sporen

van

thermofiele

aërobe

sporenvormers in compost en andere beddingmaterialen bij melkveebedrijven met een vrijloop- of ligboxenstal F. Driehuis, E. Lucas-van den Bos, A. Wagendorp, M.H.J. Wells-Bennik Mei 2014

NIZO-Rapport E 2014/045

VERTROUWELIJK

Titel:

Sporen van thermofiele aërobe sporenvormers in compost en andere beddingmaterialen bij melkveebedrijven met een vrijloop- of ligboxenstal

Opdrachtgever:

Nederlandse Zuivel Organisatie P.O.Box 165 2700 AD Zoetermeer

Louis Braillelaan 80 2719 EK Zoetermeer Nederland

Contactpersoon:

T.a.v. mevr. ir. M. Hovenkamp

Onderzoeksperiode:

Januari – December 2013

Auteurs:

Dr. F. Driehuis, E. Lucas-van den Bos, M.H.J. WellsBennik

Akkoord: Mei 2014

Project Nr. 104358 / 105494  NIZO food research B.V. (2013). Alle rechten voorbehouden. Het is niet toegestaan om zonder schriftelijke toestemming van NIZO food research B.V. delen uit dit rapport of dit rapport als geheel op enigerlei wijze te publiceren.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 2 van 37

SPOREN VAN THERMOFIELE AËROBE SPORENVORMERS IN COMPOST EN ANDERE BEDDINGMATERIALEN

BIJ

MELKVEEBEDRIJVEN

MET

EEN

VRIJLOOP-

OF

LIGBOXENSTAL Auteurs: F. Driehuis, E. Lucas-van den Bos, M.H.J. Wells-Bennik Trefwoorden: zaagsel, stro, koemest, rauwe melk, tankmelk, bacteriesporen, Geobacillus, Aeribacillus, Bacillus thermoamylovorans SAMENVATTING Dit onderzoek heeft aangetoond dat het gebruik van compost en composterende materialen als bedding in stallen voor melkvee een nadelig effect heeft op concentraties van sporen van thermofiele aërobe sporenvormers in tankmelk. Deze sporen vormen een bedreiging voor de kwaliteit van lang-houdbare zuivelproducten, maar zijn niet van belang voor de voedselveiligheid van zuivelproducten. Stalbodemmateriaal of bedding is een potentiële besmettingsbron van rauwe melk op melkveebedrijven. Zaagsel en stro zijn veel gebruikte materialen, maar steeds vaker worden andere typen bedding gebruikt. Dit rapport beschrijft een onderzoek naar sporen van thermofiele aërobe sporenvormers (TAS) en een subpopulatie met extreem hitteresistente sporen (XTAS) in verschillende beddingmaterialen en staltypen. De doelstellingen van het onderzoek waren enerzijds het identificeren van belangrijke bronnen van TAS en XTAS sporen en anderzijds het vergelijken van verschillende methoden van stalbodemmanagement bij bedrijven met een vrijloopstal. Speciale aandacht in het onderzoek ging uit naar de XTAS populatie, omdat deze sporen sterilisatie en UHT-behandeling van melk kunnen overleven en verantwoordelijk zijn voor kwaliteitsproblemen bij bepaalde zuivelproducten. Een deel van het onderzoek vond plaats bij een groep van tien melkveebedrijven met een vrijloopstal, vier met GFT-compost als bedding, vijf met een bodem van composterende houtsnippers en één met stro. Bij deze bedrijven werden concentraties van TAS en XTAS sporen in de stalbodem en TAS sporen in tankmelk bepaald in het voorjaar en najaar van 2013. Daarnaast werden bedrijven met een ligboxstal met zaagsel, stro, gescheiden mest (‘biobedding’) of digestaat onderzocht. Compost en composterende houtsnippers bevatten hoge concentraties TAS en XTAS sporen. GFT-compost bevatte gemiddeld ongeveer een 1000 keer hogere concentratie XTAS sporen dan zaagsel en stro. Concentraties TAS en XTAS sporen in composterende houtsnippers waren gemiddeld lager dan in GFT-compost. Met name de concentratie XTAS sporen in composterende houtsnippers varieerde sterk van bedrijf tot bedrijf. Waarschijnlijk wordt dit verklaard door verschillen in de intensiteit van compostering. Voor GFT-compost geldt dat TAS en XTAS sporen reeds waren gevormd tijdens het composteringsproces bij compostbedrijven en NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 3 van 37

in de stallen geen toe- of afname meer plaatsvindt. Technische mogelijkheden om vorming van TAS en XTAS sporen in compost en composterende materialen te voorkomen lijken beperkt. De meest voorkomende XTAS soorten in GFT-compost waren Aeribacillus en Geobacillus species. De meest voorkomende TAS soort was Bacillus thermoamylovorans. Tankmelk van bedrijven met compost of composterende houtsnippers bevatte verhoogde concentraties TAS sporen. Dit wordt verklaard omdat het in de praktijk onontkoombaar is dat tijdens de melkwinning enige overdracht van sporen uit bedding naar melk optreedt. Vanwege de lage concentraties konden XTAS sporen niet in tankmelk worden bepaald, maar er is alle reden om aan te nemen dat TAS en XTAS sporen dezelfde besmettingsroute hebben. Daarom vormt het gebruik van compost, composterende houtsnippers en andere composterende materialen in melkvee stallen een bedreiging voor de kwaliteit van melk. Op basis van bestaande kennis kan worden geconcludeerd dat extra voorbehandeling van spenen bij melkwinning met de huidige stand van de techniek onvoldoende effect heeft om verhoogde sporenconcentraties in melk ten gevolge van hoge sporenconcentraties in bedding te kunnen compenseren. Uit het onderzoek bij bedrijven met een ligboxstal bleek dat de gemiddelde concentraties TAS en XTAS sporen in bedding met gescheiden mest, digestaat, stro of zaagsel onderling vergelijkbaar waren en substantieel lager (factor 100 tot 1000) dan in GFT-compost. Ook bleek het gebruik van zaagsel en stro in ligboxen met een diepstrooiselsysteem geen nadelig effect te hebben op de concentraties van TAS en XTAS sporen. Geconcludeerd werd dat het gebruik van gescheiden mest, digestaat, stro of zaagsel als bedding in vergelijking met compost geen belangrijke bron vormt van TAS en XTAS sporen. Anderzijds werd in vier van de in totaal 67 monsters bedding van deze bedrijven een duidelijk verhoogde concentratie XTAS sporen bepaald, te weten één maal in zaagsel, stro, gescheiden mest en digestaat. Dit resultaat is een aanwijzing dat er naast compost en composterende materialen andere relevante bronnen van XTAS sporen kunnen zijn. De oorzaak van de verhoogde XTAS concentratie in de vier monsters is niet vastgesteld. Niet uitgesloten is dat bepaalde methoden van bewerking en opslag van gescheiden mest en digestaat, bijvoorbeeld compostering of langdurige opslag bij hoge temperatuur, zouden kunnen leiden tot toename van TAS en XTAS. Dit is onderwerp van vervolgonderzoek in 2014. De concentraties van TAS en XTAS sporen in grond en verse koemest waren laag. Op basis van dit laatste resultaat werd geconcludeerd dat het rantsoen van melkvee geen belangrijke bron is van TAS en XTAS sporen. De conclusie van dit onderzoek is dat het gebruik van compost als bedding vanwege de consistent hoge concentratie XTAS sporen een bedreiging vormt voor de kwaliteit van melk. Dit geldt ook voor composterende bodems, tenzij de compostering zodanig zou kunnen worden uitgevoerd dat vorming van XTAS sporen wordt voorkomen. De haalbaarheid van dit concept is NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 4 van 37

onderwerp van vervolgonderzoek in 2014. Het onderzoek heeft geen nadelige gevolgen van het gebruik van gescheiden mest en digestaat voor de melkkwaliteit aangetoond. Maar het is niet uitgesloten dat opslag of bewerking van gescheiden mest en digestaat bij hoge temperatuur zou kunnen leiden tot toename van TAS en XTAS sporen. Dit is onderwerp van vervolgonderzoek in 2014. Ook vindt er onderzoek plaats naar verbetering van de bepalingsmethode van XTAS sporen.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 5 van 37

SPORES OF THERMOPHILIC AEROBIC SPOREFORMERS IN COMPOST AND OTHER BEDDING MATERIALS USED BY DAIRY FARMS WITH A BEDDED PACK OR FREESTALL BARN Authors: F. Driehuis, E. Lucas-van den Bos, M.H.J. Wells-Bennik Keywords: sawdust, straw, cow feces, raw milk, farm tank milk, bacterial spores, Geobacillus, Aeribacillus, Bacillus thermoamylovorans SUMMARY The results of the study showed that the use of compost and composting materials as a bedding material for dairy cattle has detrimental effects on the concentration of spores of thermophilic aerobic sporeformers in farm tank milk. These spores pose a risk for the shelf-life of sterilized milk products but not a health risk for consumers. Bedding materials are potential sources of microbial contaminants of raw milk. Sawdust and straw are the most frequently used bedding materials in the Netherlands, but other organic materials such as compost and cattle manure solids has seen an increase in popularity. This study reports on the occurrence of spores of thermophilic aerobic sporeformers (TAS) and a subpopulation with extremely heat-resistant spores (XTAS) in different bedding materials and barn types for dairy cattle. The objectives of the study were, firstly, to identify important sources of TAS and XTAS spores and, secondly, to compare different methods of management of the floor surface of bedded pack barns. The research focus was on XTAS spores, because these spores survive milk sterilization conditions and cause non-sterility problems in certain dairy products. Samples of bedding and farm tank milk of 10 farms with a bedded pack barn were collected in spring and autumn 2013. Four farms used a compost bedding (derived from source-separated municipal biowaste), five a bedding of composting wooden chips and one a straw bedding. TAS and XTAS spores were determined in bedding samples and TAS spores in farm tank milk. XTAS spores could not be determined in tank milk because concentrations were below the limit of detection. In addition, bedding samples from dairy farms with a freestall barn using sawdust, straw, cattle manure solids (‘biobedding’) or digestate as a bedding material were analyzed. High concentrations of TAS and XTAS spores were detected in compost and composting wooden chips. XTAS spores were, on average, 1000 times higher in compost than in sawdust and straw bedding. Generally, TAS and XTAS spores were lower in composting wooden chips than in compost. In addition, a high variability of the level of XTAS spores in composting wooden chips between different farms was detected. A likely explanation for this result was variability of the NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 6 van 37

intensity of the composting process. In contrast, a consistent and constant high level of TAS and XTAS spores was detected in compost bedding, indicating that these spores were already formed during the composting process of municipal biowaste by compost manufacturers, which is probably inevitable. Aeribacillus and Geobacillus were the predominant XTAS species in compost, whereas Bacillus thermoamylovorans was predominant TAS species. Elevated levels of TAS spores were detected in tank milk of farms using compost or composting wooden chips. This is explained by unavoidable transfer of bedding micro-organisms to milk via contaminated teats during milking operations. Since TAS and XTAS spores share the same contamination route, milk of these farms can be expected to contain elevated levels of XTAS also. For that reason, the use of compost, composting wooden chips, and other composting materials is a threat to milk quality. Based on the current knowledge about efficiencies of removal of micro-organisms for different teat cleaning methods, it is deduced that additional teat cleaning operations will be insufficient to compensate for the high levels of spores in compost bedding. Mean concentrations of TAS an XTAS spores in cattle manure solids, digestate, straw and sawdust used as bedding materials at farms with a freestall barn were identical and substantially lower than in compost (factor 100 to 1000 difference). Low concentrations were detected also in fresh cow feces and soil from grassland pastures. The use of sawdust or straw in deep-bedded freestalls had no effect on the concentrations of TAS an XTAS spores in the bedding. Thus, with the exception of compost and composting wooden chips, all bedding materials appeared to be unimportant sources of XTAS spores. Unexpectedly, elevated concentrations of XTAS spores were detected in four out of 67 samples of bedding from freestall barns (once in sawdust, straw, cattle manure solids and digestate). No explanation for this result was found in the current study, but the finding indicates that there may be relevant sources of XTAS spores in addition to compost and composting wooden chips. It cannot be excluded that certain processing or storage methods of bedding materials, for instance composting of extended storage at a high temperature, may cause growth of TAS and XTAS. This subject is investigated in 2014. The study showed no detrimental effects with regard to TAS and XTAS spores of the use of cattle manure solids and digestate as a bedding material in comparison with sawdust and straw. Further investigations into the effects of processing and storage methods of these materials are ongoing. Furthermore, improvement of methods of detection of XTAS spores are being investigated.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 7 van 37

INHOUDSOPGAVE 1. 2.

3.

4. 5. 6. 7.

INLEIDING .............................................................................................................................. 9 MATERIALEN EN METHODEN ............................................................................................ 13 2.1 Bedrijven en monsters .................................................................................................... 13 2.2 Onderzoek bij bedrijven met vrijloopstallen.................................................................. 13 2.3 Microbiologische analyses .............................................................................................. 14 2.3.1 Voorbehandeling bedding en koemest ................................................................. 14 2.3.2 Hittebehandeling .................................................................................................. 14 2.3.3 Bepaling sporen van mesofiele en thermofiele sporenvormers .......................... 14 2.4 Identificatie bacterie-isolaten ........................................................................................ 15 RESULTATEN ........................................................................................................................ 15 3.1 Sporen met hoge hitteresistentie in compost en verse koemest ................................... 15 3.2 Identificatie van meest voorkomende sporenpopulaties in compost .......................... 18 3.3 Definitie TAS en XTAS.................................................................................................... 20 3.4 TAS, XTAS en MAS sporen in stalbodem en tankmelk van bedrijven met een vrijloopstal ............................................................................................................................. 20 3.4.1 Stalbodems en ongebruikte beddingmaterialen .................................................. 21 3.4.2 Tankmelk .............................................................................................................. 25 3.5 Andere bronnen van TAS en XTAS sporen..................................................................... 27 3.5.1 Zaagsel, stro, gescheiden mest en digestaat uit ligboxstallen ............................. 27 3.5.2 Grond .................................................................................................................... 30 DISCUSSIE ............................................................................................................................. 31 CONCLUSIES ......................................................................................................................... 34 DANKWOORD ....................................................................................................................... 36 REFERENTIES........................................................................................................................ 36

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 8 van 37

SPOREN VAN THERMOFIELE AËROBE SPORENVORMERS IN COMPOST EN ANDERE BEDDINGMATERIALEN

BIJ

MELKVEEBEDRIJVEN

MET

EEN

VRIJLOOP-

OF

LIGBOXENSTAL 1. INLEIDING Melk aanwezig in de uiers van gezonde koeien is steriel. De rauwe melk die wordt geproduceerd op melkveebedrijven is echter niet steriel. Dit is een gevolg van contact van melk met nietsteriele oppervlakken tijdens melkwinning, in het bijzonder de huid van de spenen van de koe en melkwinningsapparatuur. Hierdoor wordt de melk besmet met micro-organismen die aanwezig zijn op deze oppervlakken. In de praktijk is het niet mogelijk deze besmetting volledig te voorkomen. Wél kan de mate van besmetting worden beperkt door consequente toepassing van hygiënische werkwijzen van melkwinning en bewaring en adequate reinigingsprocedures. Alle rauwe melk die door Nederlandse zuivelondernemingen wordt verwerkt tot zuivelproducten ondergaat vóór verwerking een hittebehandeling van minstens 15 sec bij 72°C. Deze zogenoemde HTST-pasteurisatie vermindert het aantal bacteriën met ongeveer een factor 100.000 en heeft als belangrijkste doelen het doden van eventueel aanwezige pathogene bacteriën en het verkrijgen van een grondstof van constante kwaliteit vóór de verdere verwerking. HTST-pasteurisatie inactiveert echter niet sporen van sporenvormende bacteriën. Bepaalde eindproducten zijn gevoelig voor bepaalde sporen. Na ontkieming van de sporen kunnen de bacteriën zich vermeerderen en kwaliteitsverlies of bederf veroorzaken. Voorbeelden zijn sporen van boterzuurbacteriën die boterzuurgisting in Goudse kaas kunnen veroorzaken en sporen van psychrofiele Bacillus soorten die de houdbaarheid van gepasteuriseerde melkproducten kunnen verminderen. Om lang-houdbare zuivelproducten te kunnen produceren passen zuivelondernemingen een intensieve hittebehandeling van de melk toe, bijvoorbeeld UHT-pasteurisatie (minstens 2 sec bij 138°C) en autoclaveren (in het algemeen 5 tot 20 min bij 121°C). De overgrote meerderheid van de in rauwe melk aanwezige sporen wordt door deze hittebehandeling geïnactiveerd, maar een kleine groep van sporen met hoge hitteresistentie kan de behandeling overleven. Voor een goed begrip van bederf van voedingsmiddelen door bacteriesporen en van inactiveren van sporen door hittebehandeling is het van belang te realiseren dat inactiveren van sporen volgens een logaritmische reductie verloopt: van sporen met dezelfde hitteresistentie wordt per tijdseenheid een vaste fractie van het aantal aanwezige sporen geïnactiveerd. In Figuur 1 is dit weergegeven voor drie groepen sporen met een verschillende hitteresistentie. De hitteresistentie wordt uitgedrukt in de zogenoemde D-waarde of decimale reductietijd. Des te hoger de NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 9 van 37

hitteresistentie van de sporen, des te groter de fractie die een bepaalde hittebehandeling overleeft. In de praktijk zullen in een product vaak meerdere groepen sporen met verschillende hitteresistenties tegelijkertijd aanwezig zijn. Theoretisch kan het verloop van het aantal sporen in de tijd dan worden beschreven door een samengestelde functie (zie Figuur 1). Behalve de Dwaarde zijn de z-waarde en de F0-waarde belangrijke parameters in de mathematische beschrijving van de hitte-inactivatie van micro-organismen. De definities van deze parameters staan vermeld in het kader hieronder.

z-waarde F0-waarde

tijd in minuten bij een bepaalde temperatuur om het aantal sporen met een factor 10 te reduceren (‘decimal reduction time’) aantal graden Celsius welke een 10-voudige verandering van de D-waarde veroorzaakt (‘temperature coefficient of microbial destruction’) de overeenkomstige incubatietijd bij 121°C van een bepaalde temperatuurtijd combinatie (‘equivalent exposure time at 121°C’)

Kve/mL

D = 0,2 min

D = 1 min

D = 5 min

MIX

100000

5.0

10000

4.0

1000

3.0

100

2.0

10

1.0

1

0.0

0.1

Log10 kve/mL

D-waarde

-1.0 0

1

2

3

4

5

6

7

Verhittingstijd (min) Figuur 1. Schematische weergave van de thermische inactivatie van drie groepen bacteriesporen met verschillende D-waarde. Des te lager de D-waarde, des te stijler de curve en des te lager de hitteresistentie. MIX is een (fictief) mengsel bestaande uit 99% sporen met D=12 sec, 0,99% sporen met D=1 min en 0,01% sporen met D=5 min. In dit voorbeeld is de initiële sporenconcentratie 100 000 kve/mL. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 10 van 37

Een belangrijk gevolg van het logaritmische verloop van het inactiveren van sporen is dat een sporenconcentratie nooit de absolute waarde nul kan bereiken, hoewel na een bepaalde tijd een concentratie wordt bereikt die niet meer meetbaar is. In de praktijk betekent dit bijvoorbeeld dat er altijd een kans is dat van een bepaalde sporenpopulatie in een volume van bijvoorbeeld 10.000 liter één spore een UHT-behandeling overleeft. Vanwege dit gegeven is in de voedingsmiddelenindustrie het begrip ‘commercial sterility’ geïntroduceerd. Hiermee wordt bedoeld dat een dusdanige hittebehandeling wordt toegepast dat het aantal eindproductverpakkingen waarin nog één micro-organisme aanwezig is die tot een bedorven of afwijkend product leidt wordt gereduceerd tot een economisch acceptabel aantal (uitval of ‘defect rate’). Bij veel producten wordt een defect rate van 1 op 10.000 als een acceptabel niveau beschouwd. De afgelopen jaren diverse publicaties verschenen zijn over het voorkomen van zogenoemde hoog-hitteresistente sporenvormers in voedingsmiddelen, ingrediënten en het milieu en hun impact tijdens processing van melk tot zuivelproducten, in het bijzonder publicaties over hooghitteresistente sporenvormers in gedroogde melkproducten zoals melkpoeder, weiproducten en infant formulae. Er bestaat een grote diversiteit aan soorten hoog-hitteresistente sporenvormers die uit rauwe melk, eindproducten en proceslijnen van zuivelfabrieken zijn geïsoleerd [2, 3, 4]. Soorten die frequent uit gesteriliseerde of UHT-behandelde zuivelproducten zijn geïsoleerd zijn Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Bacillus sporothermodurans, B. subtilis, B. licheniformis en B. thermoamylovorans [5]. Deze soorten zijn allen thermofiel (groei bij 55°C), maar alleen G. stearothermophilus en A. flavithermus zijn obligaat thermofiel (geen groei bij een temperatuur lager dan 40-45°C). Het is bekend dat G. stearothermophilus en A. flavithermus biofilms kunnen vormen in proceslijnen van zuivelfabrieken die geëvaporeerde of gedroogde producten produceren. Deze biofilmvorming treedt vooral op in warmtewisselaar en evaporator units [6, 7]. Via deze biofilms kan hittebehandelde melk worden besmet met sporen van deze bacteriën. Deze vorm van nabesmetting is een bekende oorzaak van hoge sporenconcentraties van deze bacteriën in melkpoeders en van bederf van geëvaporeerde producten [4, 5, 8]. Een zuivelonderneming die lang-houdbare geëvaporeerde zuivelproducten (evap-producten) produceert en exporteert naar markten met een tropisch of subtropisch klimaat ondervindt sinds enkele jaren toenemende economische en reputatieschade door productuitval en marktklachten. Dit probleem wordt veroorzaakt door bederf van producten tijdens transport of opslag ten gevolge van de aanwezigheid van extreem hitteresistente sporen van thermofiele sporenvormers. Door de onderneming is vastgesteld dat de meerderheid van de problemen werd veroorzaakt door besmetting van sporen vanuit de (rauwe) melk. Één van de aanwijzingen NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 11 van 37

hiervoor was de vaststelling dat de problemen substantieel verminderden als de melk vóór verdere verwerking in de fabriek werd gebactofugeerd. Ook toonde intern onderzoek aan dat de problemen niet werden veroorzaakt door nabesmetting van hoog-hitteresistente sporen van G. stearothermophilus of A. flavithermus vanuit productielijnen van de fabriek (zie hierboven), maar door sporen van diverse andere Geobacillus soorten en andere hoog-hitteresistente sporenvormers. Ook werd besmetting vanuit andere ingrediënten dan melk uitgesloten. In eerder GRZ-onderzoek werd vastgesteld dat tankmelk van melkveebedrijven met boxcompost als beddingmateriaal in de melkveestal hoge concentraties van sporen van thermofiele aërobe sporenvormers (TAS) bevatten [1]. Boxcompost is een speciaal voor stallen met diepstrooiselligboxen geproduceerd beddingmateriaal op basis van GFT-compost. Gemiddeld was bij deze bedrijven de concentratie TAS sporen in tankmelk ongeveer een factor 100 hoger dan bij bedrijven die zaagsel als beddingmateriaal gebruikten. Een zelfde effect werd in dat onderzoek vastgesteld bij drie bedrijven met een vrijloopstal, die GFT-compost of gecomposteerde houtsnippers als bodemmateriaal gebruikten [1]. Geconcludeerd werd dat door het directe contact van de koeien met compost overdracht van micro-organismen uit compost naar melk plaatsvond. Geconcludeerd werd ook dat de hoge concentratie van TAS sporen in tankmelk werd niet zozeer veroorzaakt door een hoge overdracht van compost naar melk, maar door de bijzonder hoge concentratie TAS sporen in compost. Daarnaast werd vastgesteld dat een hoge concentratie TAS sporen reeds aanwezig was in de compost zoals die werd ontvangen van compostbedrijven en in de stal geen toename van TAS sporen in compostbedding plaatsvond. Uit de literatuur is bekend dat thermofiele sporenvormers, waaronder verschillende thermofiele Bacillus, Geobacillus en Brevibacillus soorten, belangrijke populaties vormen van de microflora van compost [9, 10, 11, 12]. In dit onderzoek werden verschillende organische beddingmaterialen afkomstig van melkveebedrijven onderzocht op aanwezigheid van TAS sporen en TAS sporen met verhoogde hitteresistentie. Het onderzoek richtte zich in het bijzonder op sporen die aantoonbaar zijn na een hittebehandeling van 20 min bij 115°C (XTAS; eXtreem hitteresistente Thermofiele Aërobe Sporenvormers). Deze hittebehandeling is gelijkwaardig aan de hittebehandeling die bij de productie van geëvaporeerde zuivelproducten wordt toegepast. Dit betekent dat XTAS sporen in principe de hittebehandeling van geëvaporeerde zuivelproducten kunnen overleven. In het onderzoek werden monsters verzameld bij bedrijven met een traditionele ligboxstal en bij bedrijven met zogenoemde diepstrooiselboxen. Bijzondere aandacht in het onderzoek was er voor bedrijven met een vrijloopstal (zie Hoofdstuk 3.4).

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 12 van 37

2. MATERIALEN EN METHODEN 2.1 Bedrijven en monsters De monsters die in dit onderzoek zijn onderzocht werden verzameld bij reguliere melkveebedrijven in Nederland tussen 2011 en 2013. Een serie van 40 monsters verse koemest werden verzameld bij 20 melkveebedrijven verspreid door Nederland tussen juli en oktober 2012. Alle bedrijven gebruikten zaagsel of stro als beddingmateriaal in de stal. In de melkveestal werd op 10 verschillende posities mest aanwezig op roosters en looppaden verzameld, wat vervolgens werd gecombineerd tot een mengmonster. Bij elk bedrijf werd twee maal een monster genomen, met een tussenperiode van één tot zes weken. Monsters Boxcompost waren afkomstig uit een GRZ onderzoek beschreven door Driehuis et al. [1]. Monsters zaagsel, stro en gescheiden mest bedding waren afkomstig uit een GRZ onderzoek beschreven door Driehuis et al. [3]. Monsters Stalcompost, composteringsbodem op basis van houtsnippers, houtsnippers, en riet waren afkomstig uit van melkveebedrijven met een vrijloopstal, alle deelnemer in het project Vrijloopstallen van Wageningen UR Livestock Research (zie Hoofdstuk 2.2). Monsters werden tot het moment van onderzoek opgeslagen bij 20°C. Boxcompost en Stalcompost zijn producten van Orgaworld, Den Bosch en worden geproduceerd met GFT-compost als uitgangsmateriaal. 2.2 Onderzoek bij bedrijven met vrijloopstallen Bij tien melkveebedrijven met een vrijloopstal werden monsters van de stalbodem en tankmelk verzameld. Vier bedrijven gebruikten een speciaal voor vrijloopstallen bestemde GFT-compost als beddingmateriaal (‘Stalcompost’; Comgoed, Dirksland), vijf bedrijven hadden een zogenoemde composteringsbodem op basis van houtsnippers en één bedrijf gebruikte stro in een soort potstalsysteem. Deze bedrijven waren deelnemer in het project Vrijloopstallen van Wageningen UR, Livestock Research (zie informatie op de website www.vrijloopstallen.nl [21]). De monstername bij de bedrijven werd uitgevoerd door medewerkers van Wageningen UR Livestock Research. De toplaag van de stalbodem werden op tien verschillende posities handmatig bemonsterd (50-100 g), en vervolgens gecombineerd tot een mengmonster. Daarnaast werden bij de bedrijven monsters verzameld van in voorraad zijnde, ongebruikte beddingmaterialen. Monsters werden tot het moment van onderzoek opgeslagen bij -20°C. De eerste monstername van stalbodems vond plaats tussen april en juni 2012, de tweede tussen september en november 2012. Monsters van tankmelk van de 10 bedrijven werden, na toestemming van zuivelonderneming en veehouder, door Qlip verzameld. Dit betrof restmonsters van het reguliere kwaliteitsonderzoek NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 13 van 37

van boerderijmelk. Per bedrijf werden in twee periodes monsters van vier tankmelkleveranties verzameld. De eerste serie monsters werden verzameld tussen 19 juni en 26 juli 2012, de tweede tussen 30 september en 17 oktober 2012. In de eerste serie werden van elk bedrijf twee monsters melk in onderzoek genomen. Hierbij kon een monster afkomstig zijn van één leverantie, of een mengmonster zijn van twee of drie opeenvolgende leveranties. In de tweede serie werden monsters van alle leveranties (vier per bedrijf) in onderzoek genomen. Monsters werden tot het moment van onderzoek opgeslagen bij -20°C. 2.3 Microbiologische analyses 2.3.1 Voorbehandeling bedding en koemest Vijfentwintig gram beddingmateriaal of koemest werd gemengd met 225 gram pepton fysiologisch zout oplossing (PFZ) en gedurende 5 min gehomogeniseerd in een Stomacher. 2.3.2 Hittebehandeling Vijf ml tankmelk of extract van beddingmateriaal of mest in PFZ werd 10 min bij 80°C verhit in een waterbad of 30 min bij 100°C in stoompan. Hittebehandeling van extracten van beddingmateriaal of mest bij temperaturen boven 100°C werd uitgevoerd door incubatie van 5 ml extract in een glazen, luchtdicht afgesloten monsterflesje in een oliebad gedurende 20 of 30 min bij 106°C, 110°C, 115°C of 120°C (zie Hoofdstuk 2.3.3). Na de hittebehandeling werden monsters direct afgekoeld op ijswater en vervolgens eventueel decimaal verdund in PFZ. Bij de hittebehandeling werd rekening gehouden met de opwarmtijd van het monster. Bijvoorbeeld bij een opwarmtijd van 8 min bij hittebehandeling van 20 min bij 115°C was de totale incubatie 28 min. 2.3.3 Bepaling sporen van mesofiele en thermofiele sporenvormers Sporen van mesofiele aërobe sporenvormers (MAS) werden bepaald volgens NEN 6813 en NIZO SOP A-MB022: 5 mL rauwe melk of extract werd 10 min gepasteuriseerd bij 80°C en, na decimale verdunning in PFZ, uitgeplaat op Plate Count Milk Agar (PCMA). De concentratie werd bepaald na 48 uur dagen incubatie bij 37°C. Sporen van thermofiele aërobe sporenvormers (TAS) werden bepaald volgens NEN 6809 en NIZO SOP A-MB021: 5 mL melk of extract werd 30 min verhit bij 100°C en vervolgens, eventueel na decimale verdunning in PFZ, uitgeplaat op DTA medium. De platen werden 2 dagen geïncubeerd bij 55°C. Bij analyse van TAS sporen in melk werd een aangepaste werkwijze toegepast: 5 mL hittebehandelde melk werd gemengd met circa 45 ml DTA medium en overgebracht naar petrischalen van 200 mm doorsnede. In totaal werd 25 mL uitgeplaat. De detectiegrens van TAS sporen in melk bedroeg 1 spore per 25 ml, ofwel 40 kolonievormende NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 14 van 37

eenheden (kve) per L. De detectiegrens van TAS sporen in beddingmateriaal en mest bedroeg 10 kve per g. Sporen van mesofiele en thermofiele aërobe sporenvormers werden ook bepaald na een hittebehandeling van 30 min bij 106°C, 110°C, 115°C of 120°C (zie hoofdstuk 2.3.2) en uitplaten op Brain Heart Infusion medium met 1 mg/L vitamine B12 (BHI+) [18]. Sporen van thermofiele aërobe sporenvormers aantoonbaar na 20 min bij 115°C en 4 dagen incubatie bij 55°C op BHI+ medium werden gedefinieerd als XTAS sporen. 2.4 Identificatie bacterie-isolaten Bacteriekoloniën aanwezig op de verschillende kweekmedia werden rein gekweekt. Isolatie van DNA van bacteriën en identificatie door middel van partiële 16S rRNA DNA sequentieanalyse werden uitgevoerd volgens interne NIZO protocollen en gebruik makend van de vergelijking met sequenties van type strains in de database van het Ribosomal Database Project, Michigan State University [19, 20]. 3. RESULTATEN 3.1 Sporen met hoge hitteresistentie in compost en verse koemest Om sporenpopulaties in verschillende typen GFT-compost, composteringsbodem op basis van houtsnippers en verse koemest te karakteriseren ten aanzien van hitteresistentie werden deze materialen onderworpen aan hittebehandelingen met toenemende intensiteit, te weten 30 min bij 100°C, 106°C, 110°C, 115°C of 120°C. In voorbereidende experimenten was geconstateerd dat met het standaardmedium voor bepaling van TAS sporen op DTA medium gemiddeld ongeveer 10 maal lagere sporenconcentraties werden bepaald dan met BHIA met 1 mg/L vitamine B12 (BHI+ medium; REF Coorevits; Scheldeman) (zie Tabel 1). Het onderzoek werd daarom uitgevoerd met BHI+ medium. Platen werden bij 37°C en 55°C geplaatst voor bepaling van, respectievelijk, mesofiele en thermofiele populaties.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 15 van 37

Tabel 1. De gemiddelde, minimum- en maximumconcentratie (log10 kve/g) van sporen van thermofiele en mesofiele sporenvormers in GFTcompost (9 monsters, afkomstig van 9 bedrijven, 5 met Boxcompost en 4 met Stalcompost), composteringsbodem op basis van houtsnippers (3 monsters, afkomstig van 1 bedrijf) en koemest (40 monsters, afkomstig van 20 bedrijven), na verschillende hittebehandelingen en gekweekt op DTA medium (alleen sporen thermofiele sporenvormers na 30 min 100°C) en BHI+ medium. Thermofiel Hittebehandeling: 100°C

Mesofiel

100°C

106°C

110°C

115°C

100°C

106°C

110°C

115°C

Medium: DTA

BHI+

BHI+

BHI+

BHI+

BHI+

BHI+

BHI+

BHI+

Groeitemperatuur: 55°C

55°C

55°C

55°C

55°C

37°C

37°C

37°C

37°C

5,3 5,1 6,0

3,4 3,0 3,9

7,2 6,7 7,9

6,1 5,4 7,0

4,8 4,3 5,9

3,1 2,3 4,0

2,6 1,6 4,0

<1,0 <1,0 <1,0

5,5 5,4 5,6

2,5 2,2 3,0

<1,0 <1,0 <1,0

<1,0 <1,0 <1,0

4,3 5,4 2,4 6,1

2,0 3,1 <1,0 3,7

0,9 1,2 <1,0 2,0

<1,0 <1,0 <1,0 1,0

GFT-compost (n=91) 6,7 7,8 6,3 Gemiddelde 5,8 7,4 6,0 Minimum 7,9 8,1 6,7 Maximum Composteringsbodem op basis van houtsnippers (n=3) Gemiddelde Minimum Maximum

6,2 6,0 6,7

6,2 4,9 7,4

4,0 3,1 5,7

Koemest (n=40) nb2 4,2 2,6 1,3 <1,0 Gemiddelde 3 Nb 5,4 3,9 2,5 <1,0 Gemiddelde top 3 Nb 2,6 1,0 <1,0 <1,0 Minimum Nb 6,1 4,2 2,8 1,7 Maximum 1 Aantal geanalyseerde monsters (zie ook legenda) 2 Niet bepaald 3 Gemiddelde concentratie van de drie bedrijven met de hoogste sporenconcentraties

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 16 van 37

De resultaten toonden dat bij elke hittebehandeling GFT-compost een 1000 tot 10.000 maal hogere sporenconcentratie bevatte dan verse koemest (Tabel 1). Voor thermofiele sporenpopulaties zijn de resultaten ook weergegeven in Figuur 2. De meeste sporen die aanwezig zijn in voer passeren het maagdarmkanaal van de koe en worden uitgescheiden in de mest. Sporenconcentraties in koemest zijn daarom indicatief voor de sporenbelasting via het rantsoen. De resultaten tonen dat compost een veel belangrijkere bron van sporen van thermofiele sporenvormers is dan het rantsoen c.q. mest. Zelfs voor de mestmonsters met de hoogste sporenconcentraties (‘top 3’ in Tabel 1) waren de niveaus ongeveer 1000 maal lager dan in compost. Na een hittebehandeling van 30 min 115°C waren slechts in 3 van de 40 mestmonsters sporen aantoonbaar (hoogste concentratie 1,7 log10 kve/g), terwijl de hoogste en gemiddelde concentratie in compost respectievelijk 4,0 en 3,6 log10 kve/g bedroeg. Na een hittebehandeling van 30 min bij 120°C waren ook in monsters GFT-compost geen sporen meer aantoonbaar (detectiegrens 10 sporen/g).

8,0 7,0

log KVE/g

6,0 5,0 4,0

Compost

3,0

Koemest

2,0 1,0 0,0 100°C

106°C 110°C 115°C Hittebehandeling - 30 min

Figuur 2. Gemiddelde concentratie (log10 kve/g) sporen van thermofiele sporenvormers in GFTcompost en koemest, na verschillende hittebehandelingen en gekweekt op BHI+ medium. De error bars tonen geven de standaard deviatie van het gemiddelde weer. Details met betrekking tot de geanalyseerde monsters staan vermeld in Tabel 1.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 17 van 37

3.2 Identificatie van meest voorkomende sporenpopulaties in compost Van de negen monsters GFT-compost en drie monsters composteringsbodem op basis van houtsnippers, die in Hoofdstuk 3.1 zijn beschreven, werden na de verschillende hittebehandelingen koloniën van mesofiele en thermofiele sporenvormers op BHI+ medium rein gekweekt en geïdentificeerd op basis van sequentie-analyse van het 16S rRNA gen. In totaal werden 178 stammen geïdentificeerd, waarvan het merendeel (82%) afkomstig was uit GFTcompost. Tabel 2 geeft een overzicht van de thermofiele isolaten, Tabel 3 van de mesofiele isolaten. Hieronder worden de mesofiele en thermofiele populaties na 30 min 115°C en 30 min 100°C nader toegelicht. Thermofiele populatie na 30 min 115°C: in totaal werden 29 koloniën geïsoleerd, waarvan er 17 (59%) werden geïdentificeerd als Aeribacillus pallidus, Bacillus sp./Aeribacillus pallidus of Bacillus sp./Aeribacillus. Het genus Aeribacillus is recent afgesplitst van Geobacillus en bevat op dit moment slechts één species, te weten Aeribacillus pallidus (voorheen Geobacillus pallidus). Verder werden 5 isolaten geïdentificeerd als Geobacillus, waaronder Geobacillus debilis en Geobacillus toebii. Tezamen vormden de Geobacillus en Aeribacillus isolaten 76% van de totale populatie. De overige isolaten in deze populatie behoorden tot Brevibacillus, Paenibacillus en Bacillus (Tabel 2). Thermofiele populatie na 30 min 100°C: Bacillus thermoamylovorans vormde de meerderheid van deze populatie, namelijk twee-derde van de isolaten (Tabel 2). De overige isolaten in deze populatie behoorden tot Bacillus licheniformis, Geobacillus thermodenitrificans subsp. thermodenitrificans en Ureibacillus thermosphaericus. Deze populatie vormde de meest omvangrijke populatie van de monsters GFT-compost (Tabel 1). In combinatie met de vaststelling dat B. thermoamylovorans de meerderheid van de populatie vormde betekenen deze resultaten dat deze soort de meest voorkomende thermofiele sporenvormer in de monsters was, met een sporenconcentratie van ongeveer 50 miljoen per gram. Van B. thermoamylovorans is bekend dat stammen in het algemeen bij zowel 37°C als 55°C groeien [13]. Mesofiele populatie na 30 min 115°C: deze populatie (32 isolaten) bestond voor iets meer dan de helft uit Bacillus soorten (Tabel 3), waarvan de twee grootste groepen werden gevormd door B. thermoamylovorans en een soort die wordt aangeduid als Bacillus sp. SgZ-9 (respectievelijk 7 en 6 isolaten). In een recente publicatie werd, op basis van onderzoek van een serie Bacillus sp. SgZ-9 isolaten geïsoleerd uit compost uit China, de naam Bacillus composti voorgesteld voor deze soort [14]. De overige isolaten in deze populatie behoorden tot Brevibacillus en Paenibacillus. Mesofiele populatie na 30 min 100°C: de meerderheid van deze populatie werd gevormd door B. licheniformis, maar B. thermoamylovorans werd ook frequent aangetoond (Tabel 3). De resultaten van dit onderzoek bevestigen dat. De overige isolaten in deze populatie behoorden tot Bacillus firmus, Paenibacillus lactis en Paenibacillus sp.. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 18 van 37

Tabel 2. Identificatie van thermofiele sporenvormers uit compost na 30 min 100°C, 106°C, 110°C of 115°C en groei op BHI+ medium bij 55°C. 30 min 100°C 30 min 106°C 30 min 110°C 30 min 115°C Totaal aantal isolaten: 12 Totaal aantal isolaten: 17 Totaal aantal isolaten: 22 Totaal aantal isolaten: 29 - Aeribacillus pallidus 1 - Bacillus licheniformis 2 - Bacillus licheniformis 4 - Aeribacillus pallidus (T) 1 - Bacillus sp./Aeribacillus pallidus 4 - Bacillus thermoamylovorans 8 - Bacillus thermoamylovorans 9 - Bacillus sp./Aeribacillus pallidus 2 - Geobacillus thermodenitrificans - Bacillus sp./Aeribacillus pallidus 2 - Bacillus sp./Aeribacillus 8 - Bacillus sp./Aeribacillus 12 subsp. thermodenitrificans 1 - Bacillus sp./Aeribacillus 2 - Bacillus subtilis subsp. subtilis 2 - Bacillus sp./shackletonii (T) 1 - Ureibacillus thermosphaericus 1 - Brevibacillus sp. phR 4 - Bacillus thermoamylovorans 6 - Brevibacillus sp. phR 1 - Geobacillus sp. C170/toebii 2 - Geobacillus thermodenitrificans - Geobacillus debilis 1 subsp. thermodenitrificans 2 - Geobacillus sp. 2 - Paenibacillus sp. R-7652 1 Tabel 3. Identificatie van mesofiele sporenvormers uit compost na 30 min 100°C, 106°C, 110°C of 115°C en groei op BHI+ medium bij 37°C. 30 min 100°C 30 min 106°C 30 min 110°C 30 min 115°C Totaal aantal isolaten: 16 Totaal aantal isolaten: 18 Totaal aantal isolaten: 12 Totaal aantal isolaten: 32 - Bacillus firmus 1 - Bacillus sp. IP-14 1 - Bacillus sp. IP-14 1 - Bacillus sp. IP-14/fortis (T) 1 - Bacillus sp. IP-14 1 - Bacillus licheniformis 10 - Bacillus licheniformis 4 - Bacillus subtilis subsp. subtilis 3 - Bacillus sp. SgZ-9/fordii (T) 1 - Bacillus thermoamylovorans 3 - Bacillus subtilis subsp. subtilis 7 - Bacillus thermoamylovorans 2 - Paenibacillus lactis 1 - Bacillus thermoamylovorans 4 - Oceanobacillus sp./Virgibacillus sp. 2 - Bacillus sp. SgZ-9 5 - Paenibacillus sp. ASC668/ - Oceanobacillus caeni (T) 1 - Paenibacillus lactis 1 - Bacillus subtilis subsp. subtilis 2 fonticola (T) 1 - Oceanobacillus sp./Virgibacillus sp. 1 - Paenibacillus pueri 3 - Bacillus thermoamylovorans 5 - Brevibacillus sp. phR/panacihumi (T) 1 - Brevibacillus sp. phR 5 - Brevibacillus sp. R-7152 4 - Paenibacillus pueri 1 - Paenibacillus sp. R-7652/tarimensis (T) 1 - Paenibacillus sp. R-7652 3 NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 19 van 37

Resumerend toonden de resultaten dat sporen van B. thermoamylovorans de meest voorkomende populatie in de monsters compost was na een hittebehandeling van 30 min bij 100°C, terwijl sporen van Aeribacillus en Geobacillus de meerderheid vormden van de meest hitteresistente thermofiele populatie (30 min 115°C). Hoewel in deze experimenten niet bevestigd, is het niet uitgesloten dat ook B. thermoamylovorans tot deze meest hitteresistente thermofiele populatie behoort, aangezien B. thermoamylovorans stammen frequent in de mesofiele populatie na 30 min 115°C werden geïdentificeerd en de soort zowel bij 37°C als bij 55°C kan groeien [13]. 3.3 Definitie TAS en XTAS TAS sporen zijn in dit en in eerder GRZ onderzoek [1] gedefinieerd als sporen die aantoonbaar zijn na een hittebehandeling van 30 min bij 100°C en 2 dagen incubatie bij 55°C op DTA medium. De resultaten in Tabel 1 tonen aan dat in de meeste monsters hogere sporenconcentraties werden aangetroffen na uitplaten op BHI+ medium dan na uitplaten op DTA medium. Ondanks deze constatering werd in samenspraak met de WECO Task Force Hitteresistente Sporen besloten om in vervolgonderzoek DTA medium te blijven gebruiken voor bepaling van TAS sporen. De belangrijkste argumenten hiervoor waren dat nieuwe resultaten direct kunnen worden vergelijken met resultaten van eerder GRZ-onderzoek [1] en dat de methode is beschreven in een NEN norm en daarom eenvoudig overdraagbaar naar andere laboratoria. Verder werd in samenspraak met de WECO Task Force Hitteresistente Sporen besloten om in vervolgonderzoek ook de populatie XTAS sporen te bepalen, waarbij deze populatie wordt gedefinieerd als sporen die aantoonbaar zijn na een hittebehandeling van 20 min bij 115°C en 4 dagen incubatie bij 55°C op BHI+ medium. Een hittebehandeling van 20 min bij 115°C is gelijkwaardig aan een F0-waarde van 5 min (5 min bij 121°C; zie Hoofdstuk 1), wat voor zuivelondernemingen een relevante praktijkconditie is, in het bijzonder voor de productie van geëvaporeerde zuivelproducten. 3.4 TAS, XTAS en MAS sporen in stalbodem en tankmelk van bedrijven met een vrijloopstal In eerder GRZ-onderzoek in 2011 en 2012 naar de invloed van bedding op besmetting van melk met sporen waren drie bedrijven met een vrijloopstal betrokken [1]. Een vrijloopstal is een stal zonder ligboxen, waar het lig- en loopgedeelte is gecombineerd. In een vrijloopstal hebben de dieren meer ruimte en meer mogelijkheden voor natuurlijk gedrag. Door de zachte bodem is er minder kans op verwondingen of (klauw)gebreken. Vanwege het ontbreken van een roostervloer of vergelijkbaar systeem zoals in ligboxstallen, wordt in vrijloopstallen de mest en urine die de dieren uitscheiden in de stalbodem verwerkt. Meer informatie over vrijloopstallen is beschikbaar op de website www.vrijloopstallen.nl [21]. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 20 van 37

Dit hoofdstuk beschrijft de resultaten van onderzoek bij tien bedrijven met een vrijloopstal: vier bedrijven met een speciaal voor vrijloopstallen bestemde GFT-compost (‘Stalcompost’) als bedding, vijf bedrijven met een zogenoemde composteringsbodem op basis van houtsnippers en één bedrijf dat stro gebruikte in een soort potstalsysteem. Monsters van tankmelk, stalbodem en nog ongebruikte beddingmaterialen aanwezig op het bedrijf werden verzameld in het voorjaar an najaar van 2012 en geanalyseerd op concentraties van sporen van TAS, XTAS en, in enkele monsters, mesofiele aërobe sporenvormers (MAS). Twee bedrijven hadden ook een ligboxstal met zaagsel als beddingmateriaal. Ook uit deze stallen zijn monsters bedding verzameld en geanalyseerd. 3.4.1 Stalbodems en ongebruikte beddingmaterialen De concentraties van TAS en XTAS sporen in de stalbodem van de tien bedrijven met vrijloopstal zijn weergegeven in Figuur 3 en 4. De vier bedrijven met compost als beddingmateriaal vertoonden consistent hoge concentraties TAS en XTAS sporen in de stalbodem, variërend van 6 tot 12 miljoen kve/g TAS (6,8 - 7,1 log10 kve/g; gemiddeld 6,9 log10 kve/g) en 2400 tot 64.000 kve/g XTAS (3,4 - 4,8 log10 kve/g; gemiddeld 4,1 log10 kve/g). De laagste concentraties TAS en XTAS sporen werden bepaald bij het bedrijf met stro als bedding: 15.000 - 40.000 kve/g TAS (4,2 - 4,6 log10 kve/g) en 15 - 20 kve/g XTAS (1,2 - 1,3 log10 kve/g). Ook in zaagselbedding afkomstig van twee bedrijven die behalve een vrijloopstal ook een ligboxstal hadden werden relatief lage concentraties TAS en XTAS sporen bepaald (Figuur 3 en 4). De samenstelling van de stalbodem van de vijf bedrijven met een composteringsbodem op basis van houtsnippers vertoonde een wisselend beeld: de concentratie TAS sporen was lager dan in compost, maar duidelijk hoger dan in stro- en zaagselbedding. De concentratie XTAS sporen was bij twee bedrijven verhoogd, maar bij drie bedrijven net zo laag als in stro- en zaagselbedding. De twee bedrijven met verhoogde XTAS concentraties gebruikten beide een afzuigsysteem voor het beluchten van de bodem. Concentraties in ongebruikte beddingmaterialen afkomstig van de bedrijven zijn weergegeven in Tabel 4. TAS en XTAS concentraties in GFT-compost uit de voorraad van de bedrijven (gemiddeld respectievelijk 6,7 en 3,9 log10 kve/g) waren vergelijkbaar met de concentraties in compostbedding uit de stal (Figuur 3 en 4), wat bevestigt dat de sporen niet in de stal werden gevormd maar reeds aanwezig waren in compost zoals dat werd geleverd door compostbedrijven. Deze concentraties waren ook vergelijkbaar met TAS en XTAS concentraties bepaald in ongebruikte Boxcompost (gemiddeld respectievelijk 6,2 en 4,0 log10 kve/g) (Tabel 5).

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 21 van 37

TAS in bodem (kve/gram x 1000)

12.500

10.000

7.500

5.000

2.500

TAS in bodem (kve/gram x 1000)

0

12.500

10.000

7.500

5.000

2.500

0

Figuur 3. De concentratie TAS sporen in de stalbodem van bedrijven met een vrijloopstal met composteringsbodem met houtsnippers (bedrijf 1-5), GFT-compost (bedrijf 6-9) of stro (bedrijf 10) in de periode april-juni (boven) en oktober-november (onder). Van bedrijf 3 en 5 werd ook een monster uit de ligboxstal met zaagsel geanalyseerd en van bedrijf 7 ook een monster uit een deel van de vrijloopstal met composteringsbodem met houtsnippers.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 22 van 37

12.500 30.000

XTAS in bodem (kve/g)

10.000

7.500

5.000

2.500

0

12.500 64.000

XTAS in bodem (kve/g)

10.000

7.500

5.000

2.500

0

Figuur 4. De concentratie XTAS sporen in de stalbodem van bedrijven met een vrijloopstal met composteringsbodem met houtsnippers (bedrijf 1-5), GFT-compost (bedrijf 6-9) of stro (bedrijf 10) in de periode april-juni (boven) en oktober-november (onder). Van bedrijf 3 en 5 werd ook een monster uit de ligboxstal met zaagsel geanalyseerd en van bedrijf 7 ook een monster uit een deel van de vrijloopstal met composteringsbodem met houtsnippers.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 23 van 37

Tabel 4. Concentraties van TAS en XTAS sporen in ongebruikte compost, houtsnippers, stro en riet, afkomstig van bedrijven met een vrijloopstal. Per type beddingmateriaal zijn de monsters gesorteerd op toenemende XTAS concentratie en vervolgens op toenemende TAS concentratie. TAS XTAS kve/g [log10 kve/g] kve/g [log10 kve/g] 4 200 000 [6,6] 1 900 [3,3] 12 600 000 [7,1] 3 400 [3,5] 4 300 000 [6,6] 4 600 [3,7] 13 300 000 [7,1] 21 300 [4,3] 1 950 000 [6,3] 22 100 [4,3] 1 665 000 [6,2] 25 350 [4,4]

Omschrijving monster

Herkomst1

GFT-compost GFT-compost GFT-compost GFT-compost GFT-compost GFT-compost

Bedrijf 7, vj Bedrijf 9, vj Bedrijf 6, vj Bedrijf 7, nj Bedrijf 8, nj Bedrijf 8, vj

Groenafval-compost, kleine fractie

Bedrijf 4, nj

25 300 000 [7,4]

950 [3,0]

Houtsnippers, vers Houtsnippers, vers Houtsnippers Houtsnippers Houtsnippers Houtsnippers Houtsnippers, verontreinigd/broei2 Houtsnippers, verontreinigd/broei2 Houtsnippers, vers Houtsnippers, warm Houtsnippers

Bedrijf 3, nj WUR, vj Bedrijf 1, nj Bedrijf 7, nj Bedrijf 2, nj Bedrijf 3, nj Bedrijf 3, vj Bedrijf 2, vj WUR, vj Bedrijf 3, nj Bedrijf 4, nj

<10 000[<4,0] <10 000[<4,0] 10 000 [4,0] 10 000 [4,0] 520 000 [5,7] 880 000 [5,9] 2 900 000 [6,5] 4 900 000 [6,7] <10 000[<4,0] 18 900 000 [7,3] 4 600 000 [6,7]

<10[<1,0] <10[<1,0] <10[<1,0] <10[<1,0] <10[<1,0] <10[<1,0] <10[<1,0] <10[<1,0] 10 [1,0] 10 [1,0] 70 [1,8]

Stro Stro Stro Stro-stof Stro, gemalen

Bedrijf 1, vj Bedrijf 10, nj Bedrijf 10, vj Bedrijf 4, vj Bedrijf 3, nj

<10 000[<4,0] 10 000 [4,0] 545 000 [5,7] 70 000 [4,8] 20 000 [4,3]

<10[<1,0] <10[<1,0] 15 [1,2] 50 [1,7] 100 [2,0]

Riet Bedrijf 8, nj <10 000[<4,0] <10[<1,0] Riet Bedrijf 10, nj <10 000[<4,0] <10[<1,0] Riet Bedrijf 8, vj 900 000 [6,0] 40 [1,6] 1 WUR: monsters aangeleverd door Wageningen UR Livestock Research; vj: voorjaar; nj: najaar 2 Monsters visueel verontreinigd met grond of andersoortig materiaal, of onderhevig geweest aan broei

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 24 van 37

Tabel 5. Concentraties van TAS en XTAS sporen in ongebruikte Boxcompost, afkomstig van bedrijven met ligboxstal (monsters uit 2011 en 2012; opgeslagen bij -20°C). TAS kve/g [log10 kve/g] Boxcompost, bedrijf A Boxcompost, bedrijf B Boxcompost, bedrijf C Boxcompost, bedrijf D Boxcompost, bedrijf E

1 130 000 510 000 730 000 3 900 000 5 000 000

[6,1] [5,8] [5,9] [6,6] [6,7]

XTAS kve/g [log10 kve/g] 2 900 4 000 11 200 20 000 30 000

[3,5] [3,6] [4,0] [4,3] [4,5]

De concentratie TAS sporen in ongebruikte houtsnippers varieerde sterk, namelijk van <10 000 tot bijna 5 000 000 kve/g (<4,0 - 6,7 log10 kve/g). Mogelijk is het optreden van broei tijdens opslag de oorzaak van hoge concentraties TAS sporen in houtsnippers. Lage TAS concentraties werden bepaald in schone, verse houtsnippers. De concentraties XTAS sporen was daarentegen laag in alle monsters ongebruikte houtsnippers. Het feit dat in sommige composteringsbodems op basis van houtsnippers verhoogde concentraties XTAS sporen werden vastgesteld, is een aanwijzing dat de XTAS sporen werden gevormd tijdens het composteringsproces in de stal. In twee van de in totaal acht monsters stro en riet werden relatief hoge concentraties TAS sporen bepaald. De concentratie XTAS sporen was echter laag in deze monsters, evenals in de overige monsters riet en stro. 3.4.2 Tankmelk Figuur 5 toont de concentraties TAS sporen in monsters tankmelk van de bedrijven. Uit eerder GRZ onderzoek in 2011 en 2012 was gebleken dat de concentratie TAS sporen in tankmelk van bedrijven met een ligboxstal met zaagsel of stro lager dan 100 kve/L is [1]. Dit werd bevestigd in het onderzoek beschreven in Hoofdstuk 5 van dit rapport. In het najaar werden in totaal 16 tankmelkleveranties van de vier bedrijven met GFT-compost geanalyseerd. De TAS concentratie in deze monsters varieerde van 840 tot 34 240 kve/L (Figuur 5, onder). De gemiddelde concentratie na log-conversie van deze data bedroeg 3,3 log10 kve/L (1980 kve/L). In het voorjaar waren van deze bedrijven eveneens monsters van 16 tankmelkleveranties verzameld, maar werden acht mengmonsters geanalyseerd. De TAS concentratie in deze monsters varieerde van 40 tot 1360 kve/L (Figuur 5, boven), met een gemiddelde concentratie na log-conversie van 2,7 log10 kve/L (497 kve/L). Deze resultaten zijn vergelijkbaar met resultaten van onderzoek in 2011 en 2012, toen bij bedrijven met een vrijloopstal met compost en bedrijven met een ligboxstal met Boxcompost gemiddelde TAS concentraties in tankmelk werden gemeten van respectievelijk 3,3 log10 en 3,1 log10 kve/L [1]. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 25 van 37

1.500

TAS in tankmelk (kve/liter)

1.250

1.000

750

500

250

LB-za LB-bc

1-a 1-b 2-a 2-b 3-a 3-b 4-a 4-b 5-a 5-b 6-a 6-b 7-a 7-b 8-a 8-b 9-a 9-b 10-a 10-b

0

Bedrijf/monstercode 5.000 12.400

12.440

5.720

34.240

3.000

2.000

0

LB-za LB-bc

1.000

1-a 1-b 1-c 1-d 2-a 2-b 2-c 2-d 3-a 3-b 3-c 3-d 4-a 4-b 4-c 4-d 5-a 5-b 5-c 5-d 6-a 6-b 6-c 6-d 7-a 7-b 7-c 7-d 8-a 8-b 8-c 8-d 9-a 9-b 9-c 9-d 10-a 10-b 10-c 10-d

TAS in tankmelk (kve/liter)

4.000

Bedrijf/monstercode Figuur 5. De concentratie TAS sporen in monsters tankmelk van bedrijven met een vrijloopstal met composteringsbodem met houtsnippers (bedrijf 1-5), GFT-compost (bedrijf 6-9) of stro (bedrijf 10) in het voorjaar/zomer (19 juni-18 juli; figuur boven) en het najaar (30 september-17 oktober; figuur onder). Monsters uit het najaar betroffen monsters van individuele tankmelkleveranties (a t/m d), monsters uit het voorjaar betroffen mengmonsters (a en b) (zie tekst). Tijdens monstername in het voorjaar bij bedrijf 1 en 3 werden koeien dag en nacht beweid, maar waren tijdens de momenten van melken in de stal (zie tekst). Ter vergelijking zijn uiterst rechts in de figuur de gemiddelde concentratie TAS sporen in tankmelk van bedrijven met een ligboxstal met zaagsel (LB-za) of boxcompost (LB-bc) weergegeven (data afkomstig uit [1]). De rode stippellijn markeert een concentratie van 100 kve/L. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 26 van 37

De TAS concentratie in de 20 tankmelkleveranties van de vijf bedrijven met een composteringsbodem met houtsnippers in het najaar varieerde van 40 tot 12 440 kve/L (Figuur 5, onder), met een gemiddelde concentratie na log-conversie van 2,9 log10 kve/L (726 kve/L). net als bij de bedrijven met GFT-compost was bij deze bedrijven de gemiddelde TAS concentratie in het voorjaar (2,5 log10 kve/L; 329 kve/L) lager dan in het najaar. De TAS concentratie in de vier tankmelkleveranties van het bedrijf met stro in het najaar varieerde van 160 tot 1520 kve/L (Figuur 5, onder), met een gemiddelde concentratie na log-conversie van 2,8 log10 kve/L (651 kve/L). In het voorjaar bevatte de tankmelk van dit bedrijf lage TAS concentraties (<50 kve/L). In het voorjaar werden in de monsters tankmelk en stalbodem ook de concentratie MAS sporen bepaald. Bij de bedrijven met GFT-compost was de gemiddelde concentratie MAS sporen in stalbodem en tankmelk respectievelijk 7,1 log10 kve/g en 4,1 log10 kve/L, terwijl bij bedrijven met een composteringsbodem deze concentraties respectievelijk 7,0 log10 kve/g en 4,3 log10 kve/L waren. Deze resultaten waren overeenkomstig de resultaten van het eerdere onderzoek [1]. Een complicerende factor bij de interpretatie van de resultaten van het tankmelkonderzoek is dat in het voorjaar bij twee bedrijven (bedrijf 3 en 10) in de periode van de monstername van tankmelk de dieren dag en nacht werden beweiden. Dit betekent dat de dieren van deze bedrijven in deze periode waarschijnlijk in beperkte mate fysiek contact hebben gehad met de stalbodem. Echter, tijdens het melken verbleven de dieren op de momenten van melken enige tijd in de stal en, volgens informatie van de veehouders, afhankelijk van de weersomstandigheden soms ook langer. Het is niet duidelijk in hoeverre de beweiding invloed heeft gehad op de concentratie TAS sporen in tankmelk. XTAS sporen in tankmelk konden in dit onderzoek niet worden bepaald omdat de concentraties aanmerkelijk lager waren dan de bepalingsgrens. Samenvattend tonen de resultaten dat GFT-compost consistent hoge concentraties XTAS en TAS sporen bevat, terwijl in composteringsbodems op basis van houtsnippers XTAS en in mindere mate TAS sterk variëren. Ook bevestigen de resultaten de conclusie van eerder onderzoek dat tankmelk van bedrijven met een compost- of composteringsbodem sterk verhoogde concentraties TAS sporen kan bevatten [1], waarbij in dit onderzoek enkele malen extreem hoge concentraties zijn gemeten (>10 000 kve/L). 3.5 Andere bronnen van TAS en XTAS sporen 3.5.1 Zaagsel, stro, gescheiden mest en digestaat uit ligboxstallen Zoals hierboven beschreven werden GFT-compost en composteringsbodems op basis van houtsnippers in het onderzoek geïdentificeerd als belangrijke bronnen van TAS en XTAS sporen. Om eventuele andere bronnen van deze sporen te identificeren werden verschillende typen stalbedding verzameld bij melkveebedrijven met een ligboxstal en geanalyseerd op concentraties van TAS en XTAS sporen. Dit betrof alternatieve beddingmaterialen, zoals de vaste fractie van NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 27 van 37

gescheiden mest (ook biobedding genoemd), digestaat (de restfractie van mestvergistingsinstallaties) en paardenmest, maar ook meer traditionele beddingmaterialen, zoals zaagsel en stro. Daarnaast werd onderscheid gemaakt tussen stallen met diepstrooiselboxen en stallen met ligboxen met een matras of betonvloer. Stallen met diepstrooiselboxen bevatten een laag bedding van 25 tot 35 cm dikte, die bij de meeste bedrijven een jaar of langer wordt gebruikt. Gebruikelijk is om verontreinigingen dagelijks te verwijderen en het bed aan te vullen met vers materiaal. Bij stallen met een matras of betonvloer bevatten de bozen een dun laagje beddingmateriaal, dat dagelijks of minstens enkele keren per week vervangen. Beddingmaterialen zoals gescheiden mest, digestaat en paardenmest worden bijna altijd toegepast in diepstrooiselboxen, terwijl zaagsel en stro zowel worden toegepast in ligboxen met een matras of betonvloer als in diepstrooiselboxen. Zaagsel en stro worden toegepast met of zonder toevoeging van kalk. De reden voor toevoeging van kalk is dat het een bacteriedodende werking heeft en daarmee de hygiëne bevordert. In totaal werd bij 67 bedrijven met een ligboxstal monsters van zaagsel, stro, gescheiden mest of digestaat bedding uit de stal verzameld. Bij 10 bedrijven die gescheiden mest of digestaat gebruikten werden tevens monsters genomen van de voorraad bij het bedrijf. De gemiddelde en maximum concentraties van TAS en XTAS sporen zijn weergegeven in Tabel 6. Zowel de gemiddelde als de maximum concentraties in de verschillende beddingtypen waren aanmerkelijk lager dan in GFT-compost. Voor de gemiddelde TAS en XTAS concentraties was het verschil tussen GFT-compost en de andere beddingmaterialen een factor 100 tot 1000. Op zes monsters na bevatten alle monsters een XTAS concentratie lager dan 100 kve/g. Twee monsters gescheiden mest bevatten 110 en 120 kve/g XTAS, terwijl de overige vier monsters duidelijke hogere concentraties bevatten. Dit betrof vier verschillende beddingmaterialen: zaagsel, stro, gescheiden mest en digestaat en concentraties variërend van 600 tot 3900 kve/g XTAS (Tabel 7). De oorzaak van de hoge concentratie XTAS sporen in deze vier monsters is nog niet bekend. Dit resultaat is een aanwijzing dat er naast compost en composterende houtsnippers andere relevante bronnen van XTAS sporen kunnen voorkomen. Voor een goede kwaliteitsborging van Nederlandse boerderijmelk ten aanzien van XTAS sporen is het van belang dat alle relevante bronnen van XTAS worden geïdentificeerd. Daarom is dit onderwerp onderdeel van het GRZ programma van 2014, waarin onder andere wordt onderzocht of bepaalde opslagof bewerkingcondities van gescheiden mest zouden kunnen leiden tot hoge XTAS concentraties.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 28 van 37

Tabel 6. Gemiddelde en maximum concentraties van TAS en XTAS sporen in bedding van bedrijven met een ligboxstal en ongebruikte gescheiden mest en digestaat uit de voorraad van enkele bedrijven. Gemiddelde concentraties zijn berekend na log-conversie van de data. Omschrijving

Aantal

Bedding uit stal Zaagsel Stro Gescheiden mest Digestaat

23 10 29 5

Voorraad Gescheiden mest Digestaat

5 5

1

TAS kve/g [log10 kve/g] Gemiddeld Maximum 16 000 15 000 41 000 69 000

[4,2] [4,2] [4,6] [4,8]

140 000 230 000 320 000 149 000

[5,1] [5,4] [5,5] [5,2]

XTAS kve/g [log10 kve/g] XTAS Gemiddeld Maximum >100 kve/g1 <10[<1,0] 14 [1,1] 14 [1,2] 45 [1,7]

14 000 [4,1] 35 000 [4,5] 13 [1,1] 29 000 [4,5] 97 000 [5,0] 16 [1,2] Aantal monsters met een concentratie XTAS sporen hoger dan 100 kve/g

660 2020 3900 600

[2,8] [3,3] [3,6] [2,8]

1 1 3 1

20 [1,3] 80 [1,9]

0 0

Tabel 7. Concentraties van TAS en XTAS sporen in vier beddingmonsters met een hoge XTAS concentratie. Gemiddelde concentraties zijn berekend na log-conversie van de data. TAS XTAS Omschrijving kve/g [log10 kve/g] kve/g [log10 kve/g] Bedding uit stal Zaagsel Stro Gescheiden mest Digestaat

49 000 [4,7] 67 000 [4,8] 77 000 [4,9] 149 000 [5,2]

660 [2,8] 2020 [3,3] 3900 [3,6] 600 [2,8]

Van de 29 beddingmonsters gescheiden mest waren 8 monsters afkomstig van materiaal dat op het betreffende bedrijf ingekuild werd bewaard. De overige 21 monsters werden, volgens opgave van het bedrijf, direct na mestscheiding in de stal gebruikt. Ten aanzien van gemiddelde TAS en XTAS concentraties waren er geen verschillen tussen ingekuild en niet-ingekuild materiaal (resultaten niet getoond). Het monster gescheiden mest met hoge XTAS concentratie (Tabel 6) betrof niet-ingekuild materiaal. Van de 23 beddingmonsters zaagsel waren 10 monsters met toevoeging van kalk en 13 monsters zonder kalk of ander toevoegmiddel. Van de 10 beddingmonsters stro waren vijf monsters met kalk en vijf monsters zonder kalk. Ten aanzien van gemiddelde TAS en XTAS concentraties waren er geen verschillen tussen materiaal met of zonder kalk (resultaten niet getoond). Het NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 29 van 37

monster zaagsel met hoge XTAS concentratie betrof zaagsel zonder kalk, terwijl het monsters stro met hoge XTAS concentratie stro met kalk betrof. Van de 23 beddingmonsters zaagsel waren 19 monsters afkomstig van bedrijven met een ligboxstal met matrassen of een betonvloer, terwijl de overige vier monsters afkomstig waren van bedrijven met diepstrooiselligboxen. Bij de 10 bedrijven die stro gebruikten was deze verhouding zes om vier. Ten aanzien van de gemiddelde XTAS concentraties waren er geen verschillen tussen bedrijven met diepstrooiselligboxen en bedrijven met ligboxen met matrassen of betonvloer. Ten aanzien van de gemiddelde TAS concentraties werden zowel bij zaagsel als bij stro lagere niveaus bepaald bij de bedrijven met diepstrooiselligboxen (resultaten niet getoond). Echter, het aantal monsters van bedrijven met diepstrooiselligboxen was té gering om dit als een structureel effect te kunnen beschouwen. De monsters zaagsel en stro met hoge XTAS concentratie betroffen monsters van bedrijven met ligboxen met matrassen of betonvloer. 3.5.2 Grond De gemiddelde en maximum concentraties van TAS en XTAS sporen in negen monsters grond, afkomstig uit grasland van melkveebedrijven staan vermeld in Tabel 8. De niveaus waren vergelijkbaar met de niveaus zoals die in beddingmonsters zaagsel en stro werden bepaald, en derhalve veel lager dan de niveaus in GFT-compost en composterende houtsnippers. Één monster grond bevatte relatief hoge concentraties TAS en XTAS sporen (zie Tabel 8).

Tabel 8. Gemiddelde en maximum concentraties van TAS en XTAS sporen in negen grondmonsters afkomstig uit weiland van melkveebedrijven (serie A) en in dezelfde monsters exclusief het monster met de hoogste concentraties (serie B). Gemiddelde concentraties zijn berekend na log-conversie van de data. Omschrijving Serie A (n=9) Serie B (n=8)

TAS kve/g [log10 kve/g] Gemiddeld

XTAS kve/g [log10 kve/g]

Maximum

Gemiddeld

Maximum

20 000 [4,3] 510 000 [5,7] 13 000 [4,1] 40 000 [4,6]

12 [1,1] <10[<1,0]

1330 [3,1] 10 [1,0]

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 30 van 37

4. DISCUSSIE De resultaten van dit onderzoek tonen aan dat het gebruik van compost en andere composterende materialen als bedding in stallen voor melkvee een belangrijke bron is van sporen van TAS en XTAS in melk. Het type stal (vrijloopstal of ligboxstal) lijkt hierbij van geen of weinig belang; van belang is de aanwezigheid van een besmettingsbron in de direct omgeving van de dieren. De concentraties van XTAS sporen in beddingmaterialen op basis van GFT-compost, zoals de commerciële producten Stalcompost en Boxcompost, zijn gemiddeld ongeveer een factor 1000 hoger dan in traditionele beddingmaterialen, zoals zaagsel en stro, alternatieve beddingmaterialen, zoals de vaste fractie van gescheiden mest en digestaat, en grond. De vorming van XTAS en TAS populaties in compost is waarschijnlijk inherent aan het composteringsproces. Daarom lijken de technische mogelijkheden van composteerbedrijven om GFT-compost met een laag niveau van XTAS/TAS sporen te produceren beperkt. De meest voorkomende TAS soort in GFT-compost was Bacillus thermoamylovorans. De meest voorkomende XTAS soorten waren Aeribacillus en Geobacillus species. Een aantal van deze soorten, waaronder Aeribacillus pallidus, Geobacillus debilis en Geobacillus toebii, zijn door een zuivelonderneming herhaaldelijk aangetroffen in bedorven evap-producten (persoonlijke communicatie). De identificatie van deze soorten in zuivelproducten wordt beschouwd als ongebruikelijk omdat ze zelden in de zuivelketen worden aangetroffen, in tegenstelling tot bijvoorbeeld Geobacillus stearothermophilus en Anoxybacillus flavithermus waarvan bekend is dat ze via nabesmetting vanuit proceslijnen bederf van evap-producten kunnen veroorzaken. Deze micro-organismen vormen geen risico ten aanzien van de voedselveiligheid van melk en zuivelproducten. De methode die in dit onderzoek voor de bepaling van XTAS sporen is gebruikt is in de loop van het onderzoek ontwikkeld. In tegenstelling tot TAS sporen was bij de start van het onderzoek was in de literatuur geen gevalideerde methode beschikbaar voor bepaling van extreem hitteresistente sporen van thermofiele sporenvormers. De intensiteit van de hittebehandeling waaraan een monster vóór uitplaten wordt blootgesteld is een belangrijke factor om onderscheid te kunnen maken tussen minder en meer hitteresistente sporenpopulaties. Daarnaast is het wel of niet kunnen aantonen van de sporen die niet geïnactiveerd zijn afhankelijk van de samenstelling van de voedingsbodem en de incubatiecondities. Bij het analyseren van complexe monsters met een grote diversiteit aan soorten is het altijd een mogelijkheid dat een deel van de niet-geïnactiveerde sporen niet ontkiemen en uitgroeien op de voedingsbodem, bijvoorbeeld omdat een essentiële groeifactor voor een bepaalde bacteriesoort ontbreekt. Illustratief hiervoor is bijvoorbeeld de waarneming dat na een voorbehandeling van 30 min bij 100°C bij veel compostmonsters een lager aantal sporen werd bepaald op DTA dan op BHIA met vitamine B12 (Tabel 1). Maar daarmee is nog niet zeker dat alle niet-geïnactiveerde sporen op de NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 31 van 37

laatstgenoemde medium worden aangetoond. In dit onderzoek werd toch besloten om de TAS sporen te bepalen met DTA medium (zie argumentatie in Hoofdstuk 3.1). Dezelfde methodeafhankelijke beperkingen gelden voor de bepaling van XTAS sporen: het is niet uitgesloten dat na de voorbehandeling 20 min bij 115°C een deel van de niet-geïnactiveerde sporen niet wordt aangetoond op BHIA met vitamine B12. Het bepalen van sporen heeft dus een onvermijdelijke onzekerheid. Dit geldt met name in situaties waarin populaties worden bepaald waarover nog relatief weinig bekend is (zoals XTAS) en wanneer monsters met een grote diversiteit aan soorten worden onderzocht. In het hier beschreven onderzoek zijn de gebruikte methoden naar beste inzicht gekozen. Tegelijkertijd wordt zowel binnen als buiten NIZO onderzoek verricht naar verbetering van methoden voor de bepaling van sporen van thermofiele sporenvormers. Een goed hygiëne in de stal en bij de melkwinning zijn van belang voor de productie van kwalitatief hoogwaardige melk. Maar met de huidige melkwinningstechnieken kan besmetting van melk met micro-organismen vanuit stalbedding in de praktijk niet volledig worden voorkomen. Dit geldt ook indien optimale methoden van voorbehandeling van spenen worden toegepast of melkrobots worden gebruikt. De beschikbare informatie over de voorbehandelingsmethoden toont dat de efficiëntie van verwijdering van en micro-organismen van spenen gemiddeld ongeveer 70% is en onder optimale omstandigheden ongeveer 90% [15, 16, 17]. Dit betekent dat een verhoogde overdracht van sporen naar melk vanuit bijvoorbeeld compost onvoldoende kan worden gecompenseerd door een optimale voorbehandeling en dat een hoge concentratie sporen in bedding daarom onvermijdelijk zal leiden tot een verhoogde concentratie sporen in melk. Dit wordt schematisch geïllustreerd in Figuur 6. Behalve in compost werden XTAS sporen in lage concentraties ook aangetroffen in anderen bronnen op de boerderij, bijvoorbeeld in grond, mest (waarschijnlijk vanuit voer) en traditionele beddingmaterialen. Compost is dus niet uniek als bron van deze sporen, maar wel zijn alleen in compost consistent hoge concentraties aangetoond. Een meer gecompliceerde situatie doet zich voor in composteringsbodems van vrijloopstallen. XTAS sporen waren niet aantoonbaar in verse houtsnippers die als uitgangsmateriaal werden gebruikt. Bij sommige bedrijven werd in de stalbodem XTAS wel aangetoond, wat duidt op groei en sporulatie van XTAS bacteriën. Waarschijnlijk spelen factoren als temperatuur, beschikbaarheid van zuurstof en zuurtegraad een rol bij groei en sporulatie van XTAS in composteringsbodems. Mogelijk kan kennis over de invloed van deze factoren bijdragen aan beheersing van XTAS sporen in composteringsbodems. Dit is onderwerp zijn van lopend GRZ-onderzoek, in samenwerking met Wageningen UR Livestock Research.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 32 van 37

Figuur 6. Schematische weergave van de invloed van voorbehandeling van spenen op de besmetting van melk met micro-organismen uit stalbedding. Twee situaties zijn weergegeven: bedding met een hoge concentratie XTAS sporen (1000 kve/g), bijvoorbeeld compost, en bedding met een lage concentratie XTAS sporen (10 kve/g), bijvoorbeeld zaagsel. De mate van besmetting van melk bij geen, standaard en optimale voorbehandeling (respectievelijk 0%, 70% en 90% verwijdering van micro-organismen) wordt weergegeven door het oppervlak van de cirkels. Een aanname is dat de bevuilingsgraad van spenen met beddingmateriaal in beide situaties gelijk is.

De bepalingen van TAS sporen in tankmelk van bedrijven met een vrijloopstal (Hoofdstuk 3.4.2) bevestigen de relatie tussen sporenniveau’s in bedding en tankmelk. Deze resultaten waren in overeenstemming met de resultaten van eerder onderzoek bij bedrijven met een ligboxstal met compost als beddingmateriaal [1]. De variatie in de concentratie TAS sporen die bij vrijloopstalbedrijven in monsters van opeenvolgende tankmelkleveranties werd waargenomen is waarschijnlijk een gevolg van de variabiliteit van verschillende factoren die het besmettingsniveau van melk bepalen, zoals heterogeniteit van beddingmaterialen en onvermijdelijke variatie van de hygiëne bij melkwinning. Vanwege de bijzonder lage concentraties in melk kon XTAS niet in monsters tankmelk worden bepaald. Maar er is alle reden om voor TAS en XTAS dezelfde besmettingsroute van bedding naar melk te veronderstellen. Mogelijk kunnen in toekomstig onderzoek gevoelige bepalingsmethoden voor XTAS sporen worden ontwikkeld. In ‘alternatieve’ organische beddingmaterialen, zoals de vaste fractie van gescheiden mest en digestaat, werden gemiddeld lage XTAS concentraties bepaald en waren de TAS concentraties niet of weinig verhoogd in vergelijking met zaagsel- en strobedding. Daarom lijken deze beddingmaterialen geen structureel belangrijke bron van XTAS en TAS sporen. In twee monsters NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 33 van 37

van deze alternatieve beddingmaterialen (één maal gescheiden mest en één maal digestaat) werd echter een verhoogde concentratie XTAS sporen aangetoond. Maar ook in een monster zaagselbedding en een monster strobedding werd een XTAS concentratie aangetoond. Dit betrof vier van 67 monsters afkomstig van bedrijven met een ligboxstal (6%). De oorzaak van de verhoogde concentratie XTAS sporen bij deze bedrijven is niet bekend en is onderwerp van lopend vervolgonderzoek. Daarin wordt ook onderzoek gedaan naar specifieke methoden van bewerking en opslag van bijvoorbeeld gescheiden mest of digestaat die potentieel zouden kunnen leiden tot vorming van XTAS sporen, bijvoorbeeld methoden waarbij sprake is van langdurige blootstelling aan hoge temperaturen (range 40-75°C) of compostering. Een voorbeeld van een dergelijk fenomeen, maar dan met betrekking tot TAS sporen, werd in dit onderzoek waargenomen in houtsnippers waarin broei had plaatsgevonden en hoge TAS concentraties werden bepaald (Tabel 4). Relevant is dat in deze monsters geen hoge XTAS concentraties werden aangetoond, wat overigens niet uitsluit dat in dergelijke monsters onder bepaalde condities ook XTAS sporen gevormd zouden kunnen worden. In het lopende vervolgonderzoek wordt ook nader onderzoek gedaan naar bedrijven met diepstrooiselligboxen met zaagsel of stro. Het resultaat dat XTAS en TAS sporen in verse mest van melkkoeien niet aantoonbaar waren c.q. in lage concentratie werden aangetoond is een aanwijzing dat het rantsoen van melkvee in het algemeen geen belangrijke bron is van deze sporen. Echter, bij de verhoogde XTAS concentraties in vier beddingmonsters van bedrijven met een ligboxstal (zie hierboven) is een besmetting vanuit diervoeders via mest niet uitgesloten. 5. CONCLUSIES - Compost en composterende houtsnippers bevatten hoge concentraties TAS en XTAS sporen. De concentratie XTAS sporen in GFT-compost is gemiddeld ongeveer 1000 keer hoger dan in traditionele beddingmaterialen zoals zaagsel en stro. - Tankmelk van bedrijven met compost en composterende houtsnippers bevat verhoogde concentraties TAS sporen. Dit wordt verklaard omdat enige overdracht van microorganismen uit bedding naar melk in de praktijk onontkoombaar is. Daarbij wordt de melk tegelijkertijd met TAS sporen ook besmet met XTAS sporen uit compost. Het gebruik van compost, composterende houtsnippers of andere composterende beddingmaterialen in stallen voor melkvee vormt daarom een bedreiging voor de kwaliteit van melk. Deze sporen vormen geen bedreiging voor de voedselveiligheid van zuivelproducten voor consumenten. - De bovenstaande twee conclusies zijn onafhankelijk van het type stal en gelden daarom zowel voor ligboxstallen als voor vrijloopstallen. - De vorming van populaties van thermofiele sporenvormers is waarschijnlijk inherent aan composteringsprocessen. Technische mogelijkheden om vorming van TAS en XTAS sporen tijdens compostering te voorkomen lijken daarom beperkt. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 34 van 37

- De meest voorkomende TAS soort in GFT-compost was Bacillus thermoamylovorans. De meest voorkomende XTAS soorten waren Aeribacillus en Geobacillus species. - Gevalideerde methoden voor bepaling van XTAS sporen ontbreken nog. Onderzoek naar verbeterde bepalingsmethoden is gaande; - Bij de in dit onderzoek onderzochte bedrijven met een vrijloopstal met een composteringsbodem op basis van houtsnippers werden gemiddeld lagere concentraties TAS en XTAS sporen in de bodem bepaald dan bij bedrijven met een vrijloopstal met een compostbodem. Tussen de bedrijven met een composteringsbodem werd veel variatie in de concentratie XTAS sporen in de bodem waargenomen. Dit was waarschijnlijk een gevolg van verschillen in de intensiteit van compostering. - Voor bedrijven met een vrijloopstal zijn er twee opties om een XTAS-arme bodem te creëren: o Vrijloopstal met niet-composterende bodem: XTAS-arm materiaal gebruiken, bijvoorbeeld stro, en compostering vermijden o Vrijloopstal met composteringsbodem: XTAS-arm materiaal gebruiken, bijvoorbeeld houtsnippers, en compostering zodanig uitvoeren dat vorming van XTAS sporen wordt voorkomen. Op dit moment is niet bekend of dit haalbaar is en met welke composteringscondities dit kan worden bereikt. Dit is onderwerp van vervolgonderzoek in GRZ. - Extra voorbehandeling van spenen bij melkwinning heeft met de huidige stand van de techniek onvoldoende effect om verhoogde sporenconcentraties in melk ten gevolge van hoge sporenconcentraties in bedding te kunnen compenseren. - In vergelijking met compost vormen de vaste fractie van gescheiden mest (‘biobedding’) en digestaat minder belangrijke bronnen van TAS en XTAS sporen. De gemiddelde concentraties van TAS en XTAS sporen in deze beddingmaterialen en zaagsel- en strobedding waren vergelijkbaar. - Ten aanzien van concentraties van TAS en XTAS sporen in zaagsel- en strobedding was er geen verschil tussen bedrijven met diepstrooiselligboxen en bedrijven met ligboxen met matrassen of een betonvloer. - In 6% van de onderzochte beddingmonsters van bedrijven met een ligboxstal werd een verhoogde concentratie XTAS sporen bepaald. Dit betrof verschillende materialen (zaagsel, stro, gescheiden mest en digestaat). De oorzaak van deze verhoogde XTAS concentratie is niet geïdentificeerd. Dit resultaat is een aanwijzing dat er naast compost en composterende houtsnippers andere relevante bronnen van XTAS sporen kunnen voorkomen. - Niet uitgesloten is dat bepaalde methoden van bewerking en opslag van gescheiden mest en digestaat, bijvoorbeeld compostering of langdurige opslag bij hoge temperatuur, zouden kunnen leiden tot toename van TAS en XTAS. Dit is onderwerp van vervolgonderzoek in GRZ. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 35 van 37

6. DANKWOORD De auteurs van dit rapport bedanken de veehouders die hebben meegewerkt aan dit project en aan Paul Galama, Klaas Blanken, Hendrik Jan van Dooren, Wijbrand Ouweltjes, Herman de Boer en Judith Poelarends van Wageningen UR Livestock Research voor de prettige samenwerking en vruchtbare inhoudelijke discussies.

7. REFERENTIES 1.

2.

3. 4. 5.

6.

7.

8.

9. 10. 11.

12.

13.

Driehuis, F., Lucas-van den Bos, E. & Wells-Bennik, M.H.J. (2012) Risico's van microbiële contaminanten van strooisels: compost, gescheiden mest, paardenmest en vrijloopstallen. NIZOrapport E2012-119. Klijn, N., Herman, L., Langeveld, L.P.M., Vaerewijck, M., Wagendorp, A.A., Huemer, I. & Weerkamp, A. H. (1997) Genotypical and phenotypical characterization of Bacillus sporothermodurans strains, surviving UHT sterilization. International Dairy Journal 7, 421-428. Scheldeman, P., Herman, L., Foster, S. & Heyndrickx, M. (2006) Bacillus sporothermodurans and other highly heat-resistant spore formers in milk. Journal of Applied Microbiology 101, 542-555. Burgess, S.A., Lindsay, D. & Flint, S.H. (2010) Thermophilic bacilli and their importance in dairy processing. International Journal of Food Microbiology 144, 215-225. Lücking, G., Stoeckel, M., Zeynep, A., Hinrichs, J. & Ehling-Schulz, M. (2013) Characterization of aerobic spore-forming bacteria associated with industrial dairy processing environments and product spoilage. International Journal of Food Microbiology 166, 270-279. Scott, S.A., Brooks, J.D., Rakonjac, J., Walker, K.M.R. & Flint, S.H. (2007) The formation of thermophilic spores during the manufacture of whole milk powder. International Journal of Dairy Technology 60, 109-117. Zhao, Y., Caspers, M.P.M., Metselaar, K.I., Boer, P. de, Roeselers, G., Moezelaar, R., Nierop Groot, M., Montijn, R.C., Abee, T. & Kort, R. (2013) Abiotic and microbiotic factors controlling biofilm formation of thermophilic spore formers. Applied and Environmental Microbiology, published online ahead of print on 12 July 2013. doi:10.1128/AEM.00949-13. (Burgess 2010, Lucking 2013, Ronimus, R.S., Parker, L.E., Turner, N., Poudel, S., Rückert, A. & Morgan, H.W. (2003) A RAPD-based comparison of thermophilic bacilli from milk powders. International Journal of Food Microbiology 85, 45-61. Strom, P.F. (1985) Identification of thermophilic bacteria in solid-waste composting. Applied and Environmental Microbiology 50, 906-913. Herrmann, R.F. & Shann, J.F. (1997) Microbial community changes during the composting of municipal solid waste. Microbial Ecology, 33, 78-85. Dees, P.M. & Ghiorse, W.C. (2001) Microbial diversity in hot synthetic compost as revealed by PCRampli¢ed rRNA sequences from cultivated isolates and extracted DNA. FEMS Microbiology Ecology 35, 207-216. Ryckeboer, J., Mergaert, J., Vaes, K., Klammer, S., De Clerq, D., Coosemans, J., Insam, H. & Swings, J. (2003) A survey of bacteria and fungi occurring during composting and self-heating processes. Annals of Microbiology 53, 349-410. Combet-Blanc, Y., Ollivier, B., Streicher, C., Patel, B.K.C., Dwivedi, P.P., Pot, B., Prensier, G. & Garcia, J.L. (1995) Bacillus thermoamylovorans sp. nov., a moderately thermophilic and amylolytic bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 45, 9-16. NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 36 van 37

14. Yang, G., Chen, M., Yu, Z., Lu, Q. & Zhou, S. (2013) Bacillus composti sp. nov. and Bacillus thermophilus sp. nov., two thermophilic Fe(III)-reducing bacteria isolated from a compost. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Published online ahead of print February 8, 2013, doi: 10.1099/ijs.0.049106-0. 15. Magnusson, M., Christiansson, A., Svensson, B. & Kolstrup, C. (2006) Effect of different premilking manual teat-cleaning methods on bacterial spores in milk. Journal of Dairy Science 89, 3866–3875. 16. Vissers, M.M.M. & Driehuis, F. (2009) On-farm hygiene milk production. In: Milk Processing and Quality Management (Ed. A.Y. Tamime). Wiley-Blackwell, Chichester, UK, pp. 1-22. 17. Schuiling, E., Ipema, B., Slaghuis, B. & Driehuis, F. (2010) Methodes voor het testen van de efficiëntie van speenreinigingssystemen van melkrobots. Vertrouwelijk rapport 235. Wageningen UR Livestock Research, Lelystad. 18. Scheldeman, P., Pil, A., Herman, L., De Vos, P. & Heyndrickx, M. (2005) Incidence and diversity of potentially highly heat-resistant spores isolated at dairy farms. Applied and Environmental Microbiology 71, 1480-1494. 19. Ribosomal Database Project: Release 10 (2012) http://rdp.cme.msu.edu 20. Cole, J.R., Wang, Q., Cardenas, E., Fish, J., Chai, B., Farris, R.J., Kulam-Syed-Mohideen, A.S., McGarrell, D.M., Marsh, T., Garrity, G.M. & Tiedje, J.M. (2009) The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 37 (Database issue), D141-145.

21. Vrijloopstallen.nl. http://www.vrijloopstallen.nl/ Geraadpleegd 28 oktober 2013.

NIZO-Rapport E 2014/045 pag. 37 van 37