Doktori értekezés. Dr. Reiniger Lilla. I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet

Az aktiváció-indukált citidin deamináz és az aberráns szomatikus hipermutáció szerepe a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformációjában Doktori értekezés

Dr. Reiniger Lilla I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológia Tudományok Doktori Iskolája

Témavezető: Dr. Szepesi Ágota, egyetemi adjunktus, PhD Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Demeter Judit, egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Kulka Janina, egyetemi docens, PhD Dr. László Terézia, egyetemi adjunktus, PhD Hivatalos bírálók: Dr. Tarkovács Gábor, egyetemi docens, PhD Dr. Kappelmayer János, egyetemi docens, PhD

Budapest, 2007

I. TARTALOMJEGYZÉK I.

TARTALOMJEGYZÉK...........................................................................2

II.

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...................................................................4

III.

IRODALMI HÁTTÉR..............................................................................7 1. A krónikus lymphocytás leukaemia és agresszív lymphomába történő transzformációja .....................................................................7 1.1 A krónikus lymphocytás leukaemia .................................................7 1.1.1

A CLL előfordulása és klinikai jellegzetességei.....................7

1.1.2

A CLL stádiumbeosztása ........................................................8

1.1.3

A CLL kezelése.......................................................................9

1.1.4

A CLL morfológiája .............................................................10

1.1.5

A CLL immunfenotípusa ......................................................12

1.1.6

A CLL genotípusa.................................................................13

1.1.7

A CLL prognózisa, prognosztikai faktorok ..........................13

1.1.8

A CLL eredete.......................................................................14

1.2 A krónikus lymphocytás leukaemia transzformációja – Richter és prolymphocytás transzformáció.................................................15 1.2.1

A Richter transzformáció......................................................16

1.2.2

A prolymphocytás transzformáció........................................19

2. A genom instabilitás szerepe a lymphomák kifejlődésében ................21 2.1

Az aberráns szomatikus hipermutáció ...........................................22

2.2

Az aktiváció-indukált citidin deamináz .........................................24

IV.

CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................29

V.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .............................................................30 1. Beteganyagok.......................................................................................30 2. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mRNS expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval ............32 2.1

Lézer mikrodisszekció ...................................................................32

2.2

RNS izolálás...................................................................................33

2.3

Reverz transzkripció ......................................................................34

2.4

Kvantitatív RT-PCR és az AID mRNS expressziós szintek meghatározása................................................................................34

2.5

Statisztikai analízis.........................................................................38 2

3. Az IgVH, c-MYC, Pax-5 és RhoH gének szekvencia vizsgálata..........39

VI.

3.1

DNS izolálás ..................................................................................39

3.2

Az IgVH, c-MYC, Pax-5 és RhoH gének PCR amplifikációja ......40

3.3

A PCR termékek detektálása .........................................................43

3.4

A PCR termékek tisztítása .............................................................43

3.5

A szekvenáló reakció .....................................................................43

3.6

A szekvenáló reakció termékeinek tisztítása .................................45

3.7

Kapilláris elektroforézis és szekvencia analízis.............................45

EREDMÉNYEK .....................................................................................47 1. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mRNS expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval .............................47 2. A c-MYC, a Pax-5 és a RhoH gének szekvencia vizsgálata ................49 3. Az IgVH gének szekvencia vizsgálata .................................................52

VII.

MEGBESZÉLÉS ....................................................................................56

VIII.

KÖVETKEZTETÉSEK..........................................................................60

IX.

ÖSSZEFOGLALÁS ...............................................................................61

X.

SUMMARY............................................................................................62

XI.

IRODALOMJEGYZÉK .........................................................................63

XII.

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ...................................................76

XIII.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................78

3

II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A:

adenin

ABC :

aktivált B-sejtes (DLBL altípus)

AID :

aktiváció-indukált citidin deamináz

AIDS :

szerzett immunhiányos tünetegyüttes

AIHA :

autoimmun haemolyticus anaemia

ALL :

akut lymphoblastos leukaemia

AS :

antisense primer

ASHM :

aberráns szomatikus hipermutáció

BCL-1 :

„B-cell leukaemia/lymphoma 1” gén

BCL-6 :

„B-cell leukaemia/lymphoma 6” gén

bp :

bázispár

C:

citozin

CB :

centroblast

CD :

„cluster of differentiation”, sejtdifferenciálódási antigének

cDNS :

komplementer DNS

CDR :

„complementarity determining region”, antigén kötődéséért felelős régió

CG :

centrum germinativum, csíraközpont

CLL :

krónikus lymphocytás leukaemia

Cµ :

az immunglobulin nehézlánc gén konstitutív szakasza

c-MYC :

protoonkogén

CT :

„cycle treshold”

CSR :

„class switch” rekombináció, izotípusváltás

D:

„diversity”, diverzitás régió, az IgH gén kapcsolódási szakasza

DEPC :

dietil-pirokarbonát

DLBL :

diffúz nagy B-sejtes lymphoma

DNS :

dezoxiribonukleinsav

dNTP :

dezoxi-nukleotidtrifoszfát

EDTA :

etilén-diamin-tetraecetsav

FISH :

fluoreszcens in-situ hibridizáció

FL :

follicularis lymphoma

4

FR :

„framework”, szerkezeti régió

G:

guanin

g:

nehézségi gyorsulás

GAPDH :

glyceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz

GCB :

centrum germinatívum B-sejtes (DLBL altípus)

GTP :

guanozin-trifoszfát

Hb :

haemoglobin

HE :

hematoxilin-eozin

HL :

Hodgkin-lymphoma

IB :

immunoblast

Ig :

immunglobulin

IgH :

immunglobulin nehézlánc gén

IgVH :

immunglobulin nehézlánc gén variábilis regió

IL :

interleukin

IMGT:

International imMunoGeneTics Information System

JAK :

Janus-kináz

JH :

joining régió, az IgH gén kapcsolódási szakasza

kb :

kilobázis

LDH :

laktát dehidrogenáz

LPS :

lipopoliszacharid

M:

mutált (IgVH gén)

MALT:

mucosa asszociált lymphoid szövet

MGG :

May-Grünwald-Giemsa

m.perc :

másodperc

mRNS :

messenger (hírvivő)-RNS

NA :

nem amplifikált

NaCl :

nátrium-klorid

NCAM :

„nerve cell adhesion molecule”

NCBI :

„National Center for Biotechnology Information”

ND :

nem determinált

NF-κB :

nukleáris faktor-κB

NHL :

non-Hodgkin lymphoma

NM :

nem mutált (IgVH gén)

p16

INK4A

:

tumorszuppresszor gén

5

p53 :

tumorszuppresszor gén

Pax5 :

protoonkogén

PBS :

“phosphate-buffered saline”

PCR :

polimeráz láncreakció

Pim1 :

protoonkogén

Plt :

platelet, thrombocyta

PLT :

prolymphocytás transzformáció

PV :

perifériás vér

Q:

„quencher”

qRT-PCR :

kvantitatív valós-idejű PCR

R:

„reporter”

Ras :

„rat-sarcoma“ fehérje szupercsalád

RGYW :

szekvcencia-motívum (R=A/G; Y=C/T; W=A/T)

RhoH :

protoonkogén

RNS :

ribonukleinsav

rpm :

percenkénti fordulatszám

RT :

reverz transzkripció

RT :

Richter transzformáció

S:

sense primer

SDS :

nátrium-dodecil-szulfát

SHM :

szomatikus hipermutáció

SSC :

side scatter

STAT-6 :

„signal transducer and activator of transcription 6”

T:

timin

TAE :

Tris-acetát-EDTA

tart. :

tartomány

TE :

Tris-EDTA

Treg :

szabályozó T-sejt

TSR :

„template suppresion reagent”

U:

unit, nemzetközi egység

VH :

variábilis régió, az IgH gén kapcsolódási szakasza

WHO :

„World Health Organization” - Egészségügyi Világszervezet

ZAP-70 :

zéta-asszociált protein-70

6

III. IRODALMI HÁTTÉR 1. A krónikus lymphocytás leukaemia és agresszív lymphomába történő transzformációja 1.1 A krónikus lymphocytás leukaemia A krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) érett kis B-lymphocyták klonális expanziója – daganata –, amely a WHO (World Health Organization) osztályozás alapján az érett B-sejtes non-Hodgkin lymphomák (NHL) csoportjába tartozik. A CLL mérsékelt malignitású, legtöbbször leukaemiás formában zajló folyamat, mely progresszíven infiltrálja a csontvelőt és a lymphoid szerveket. Korábban a CLL definíció szerint magába foglalta a 2-3 %-ban T-sejtes folyamatokat is a B-sejtesek mellett, de ma már a T-sejtes betegség önálló kategóriát – T-sejtes prolymphocytás leukaemia – képez 1. 1.1.1 A CLL előfordulása és klinikai jellegzetességei A CLL a leggyakoribb leukaemia felnőttkorban a „nyugati országokban” és előfordulása az életkorral nő, az esetek 75 %-át 60 év feletti betegekben 2, 3

diagnosztizálják

. Incidenciája 3-5/100 000 lakos, Magyarországon kb. 400 új

beteggel lehet számolni évente. A betegség mintegy kétszer gyakoribb férfiakban 4. A betegség kezdete rendszerint lappangó, 25 %-ban tünetmentes, így a CLL-t gyakran más okból történő vérvétel során észlelt lymphocytosis vagy tünetmentes lymphadenopátia kivizsgálása során fedezik fel

4,

5

. A tünetekkel rendelkező

betegeknek általában nem specifikus panaszaik vannak, mint például láz, fáradtság, étvágytalanság, súlyvesztés és éjszakai izzadás. A megnagyobbodott lép és hasi nyirokcsomók

miatt

hasi

teltségérzés

és

a

megnagyobbodott

mediastinális

nyirokcsomók miatt terhelési nehézlégzés is jelentkezhet bevezető tünetként. A korai leletek közé tartozik a generalizált lymphadenopátia, amely gyakran először a nyaki és supraclavicularis

régiókat

érinti,

továbbá

a

minimális

vagy

mérsékelt

máj- és lépmegnagyobbodás is 5. A betegség előrehaladottabb stádiumában az anaemia miatt sápadtság és gyengeség, a hypogammaglobulinaemia és a granulocytopenia következtében bakteriális-, vírus-

7

és gombafertőzésekre való fokozott hajlam is jellemzővé válik. A fertőzés a CLL leggyakoribb szövődménye és haláloka egyben 6. A betegséget autoimmun jelenségek – leggyakrabban autoimmun haemolitikus anaemia (AIHA) és autoimmun thrombocytopenia – kísérhetik, melyek oka nem teljesen tisztázott 7. A betegek kb. 5-10 %-ában a CLL magasabb malignitású lymphomába transzformálódik

8

,

ez a fejezet második részében bővebb kifejtésre kerül. Előrehaladottabb stádiumban a tumor a parenchymás szerveket is infiltrálhatja jelentős mértékű organomegáliát okozva. A CLL-ben szenvedő betegekben nagyobb valószínűséggel alakul ki másodlagos daganat, leggyakrabban bőr-, tüdő-, vastagbél- vagy méhnyakrák 4. A laboratóriumi eltérések közül a CLL vezető tünete a perifériás vérben folyamatosan

fennálló

abszolút

lymphocytosis

(5-500

G/l)

és

a

csontvelő

megemelkedett lymphocyta aránya (> 30 %). A CLL-ben nagyon gyakran észlelhetünk szérum fehérje eltéréseket. Az esetek kb. 50 %-ában antitesthiányos szindróma alakul ki a B-sejt defektus következtében. Monoklonális immunglobulinok is megjelenhetnek, leggyakoribb az IgM felszaporodása 4, 5. Differenciáldiagnosztikai

szempontból

a

CLL-t

minden

perifériás

lymphocytaszaporulattal és nyirokcsomó megnagyobbodással járó betegségtől el kell különíteni, így leggyakrabban a reaktív lymphocytosistól, köpenysejtes lymphomától, hajas sejtes leukaemiától, lymphoplasmocytás lymphomától és a T-sejtes NHL-től 4. 1.1.2 A CLL stádiumbeosztása A klinikai stádiumbeosztás fontos a prognózis és a kezelés megítélése szempontjából. A két leggyakrabban használt stádiumbeosztás a Rai, amely elsősorban a haematológiai változásokon alapul, valamint a Binet, amely inkább a betegség kiterjedését veszi figyelembe (1. táblázat) 9.

8

1. táblázat.

A CLL klinikai stádiumbeosztása

osztályozás és stádium

Leírás

Rai 0. stádium

a vérben >10.000/µl abszolút lymphocytosis és ≥30 % lymphocyta a csontvelőben

I. stádium

0. stádium és megnagyobbodott nyirokcsomók

II. stádium

I. stádium és máj- és/vagy lépmegnagyobbodás

III. stádium

II. stádium és anaemia (Hb <110 g/l)

IV. stádium

III. stádium és thrombocytopenia (Plt <100.000/µl)

Binet Stádium A

a vérben >10.000/µl abszolút lymphocytosis és ≥30 % lymphocyta a csontvelőben Hb ≥100 g/l, Plt >100.000/µl, ≤ 2 érintett regió#

Stádium B

Stádium A-hoz hasonló, de 3-5 érintett régió#

Stádium C

Stádium A- és B-hez hasonló, de Hb <100 g/l vagy Plt <100.000/µl # : figyelembe vett régiók: cervicalis, axillaris, inguinalis, hepatikus, splenikus, lymphatikus Rövidítések: Hb, haemoglobin; Plt, platelet (thrombocyta)

1.1.3 A CLL kezelése A betegek egy része (Binet szerinti A stádiumú és a tünetmentes B stádiumú betegek) nem igényel kezelést, csak rendszeres megfigyelést. A kezelésre szoruló betegek (a tünetes Binet szerinti B és minden C stádiumú beteg) kemo- vagy polikemoterápiában részesülnek, amit olykor szteroiddal kombinálnak. Alkilálószerek, purin analógok és újabban monoklonális antitestek képezik a kemoterápia alapját

10

.

Szteroid kezelés indikációját képezi továbbá az immunhaemolytikus anaemia és thrombocytopenia jelentkezése. Ezekben az esetekben, ha a szteroid kezelés hatástalan, splenectomia segíthet. Radioterápia alkalmazható lokálisan alacsony dózisban a megnagyobbodott nyirokcsomók, máj illetve lép okozta tünetek enyhítésére. Amennyiben a CLL kezelésében a hagyományos kemoterápia nem hoz eredményt, autológ illetve fiatalabb betegeknél allogén őssejt transzplantáció is felmerül

5

.

A betegek többsége a fertőzések, az anaemia és a thrombocytopenia miatt szupportív terápiát igényel 6.

9

1.1.4 A CLL morfológiája A perifériás vérkenetben nagyszámú kis lymphocyta látható keskeny citoplazmával és kerek maggal. A sejtek kromatinja kompakt és rögös, nukleolusz nem azonosítható. A kenetekben gyakran láthatók Gumprecht rögök, amik a mechanikailag károsodott lymphocyták maradványai (1. ábra). A prolymphocyták száma rendszerint 2 %-nál kevesebb. Atípusos CLL esetében előfordul, hogy a keringő tumorsejtek nagyobbak, a sejtmagjuk hasadt vagy behúzódásokkal rendelkezik és a citoplazma bővebb 4.

A

B

1. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL), perifériás vérkenet (May Grünwald Giemsa, MGG). A: abszolút lymphocytosis és Gumprecht-rögök (mechanikusan károsodott lymphocyták) (400x). B: a CLL sejtek citoplazmája keskeny; magja kompakt, kerek és heterokromatinizált 4 (2000x).

A csontvelő aspirációs technikával nyert keneteiben vagy a csontbiopsziás minták lenyomati készítményeiben a lymphocyták morfológiája megfelel a perifériás vérkenetben látottaknak (2. ábra). A CLL-es sejtek mieloperoxidáz negatívak. A csontvelői infiltráció mintázata a betegség korai szakában elsősorban noduláris vagy interstitialis. Előrehaladott betegségnél az infiltráció diffúz, a tumoros sejtproliferáció fokozatosan kiszorítja a velőűrökből a normális haemopoesist és a zsírsejteket 4.

10

2. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL), csontvelőkenet (MGG, 1000x). A csontvelő aspirációs mintában a CLL sejtek vannak túlnyomó többségben 4.

A nyirokcsomó szövettani képére jellemző, hogy follicularis alapszerkezete eltűnik és állományát diffúzan infiltrálják a kis CLL lymphocyták. A CLL proliferáló sejtjei ún. pseudofolliculusokat képeznek, amelyek lazább magszerkezetű sejtekből álló világosabb festődésű területek (3. ábra) 4.

3. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) nyirokcsomó hisztológiája (hematoxilin-eozin, HE, 40x). A nyirokcsomó állományát diffúzan infiltrálják a CLL sejtek, a normális follicularis szerkezet felbomlik 4.

11

1.1.5 A CLL immunfenotípusa A daganatos sejtek CD19, CD20, CD5, és CD23 sejtfelszíni B-sejt markereket hordoznak. Az esetek többségében sejtfelszíni monoklonális Ig könnyű lánc (gyakrabban kappa) expresszió is kimutatható. A CLL-es sejtek zéta-asszociált protein-70-t (ZAP-70) is expresszálnak különböző mértékben. A CLL-re jellegzetes immunfenotípus

meghatározása

áramláscitometriai

mérésekkel

(4.

ábra)

és

immunhisztokémiai módszerekkel történik 4, 5.

A

B

C

D

4. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia, áramláscitometria, perifériás vér. A : a CD45/SSC diagramon a

reaktív

lymphocyták

és

a

leukaemiás

sejtek

(piros)

elkülönülnek

a

granulocytáktól

és monocytáktól (fekete). A további vizsgálatok (B-D) a piros színnel ábrázolt sejtpopuláción történtek. B : A leukaemiás sejtek lambda-könnyűlánc monoklonális reakciót mutatnak, az expresszió intenzitása alacsony (jobb alsó kvadráns). C : A leukaemiás sejtek CD5 és CD23 pozitívak (jobb felső kvadráns). D : A leukaemiás sejtek CD5 és CD19 pozitívak (jobb felső kvadráns) 4.

12

1.1.6 A CLL genotípusa A CLL genetikai szerveződését tekintve heterogén betegségcsoport 4. Fluoreszcens in-situ hibridizációs (FISH) vizsgálattal a CLL-es esetek kb. 80 %-ában mutatható ki valamilyen genetikai eltérés

11

. A CLL-es betegekben a leggyakoribb kromoszóma

eltérések közé tartozik a 12-es triszómia, és a 13q14, 17p és 11q22-23 deléciók

12, 13

.

A CLL genetikai jellegzetességei közé tartozik továbbá a tumorsejtek által expresszált immunglobulin nehéz lánc (IgH) gén variábilis régiójának (VH) (egyben IgVH gén) mutációs státusza, mely lehet mutálatlan, vagy szomatikus mutációkat hordozhat 14, 15. 1.1.7 A CLL prognózisa, prognosztikai faktorok A

betegség

prognózisának

megítélésére

a

klinikai

stádiumbeosztások

és a citogenetikai eltérések használhatók. A CLL indolens lymphoma/leukaemia, a betegek átlagos túlélése 10 év körül van. A diagnózis időpontjában Rai szerinti 0-II. stádiumú betegek kezelés nélkül 5-25 évig is élhetnek. A III-IV. stádiumú betegek a diagnózistól számított 3-4 éven belül nagy valószínűséggel meghalnak. A csontvelő-elégtelenségbe torkolló kórkép is rendszerint rövid túléléssel társul. Jelen terápiás lehetőségeink közül végleges gyógyulást csak az egyébként ritkán alkalmazható és magas halálozási aránnyal járó allogén csontvelő transzplantáció eredményezhet 9. A citogenetikai eltérések kimutatása is segítséget nyújt a betegség lefolyásának megítélésében. Kedvező a CLL klinikai viselkedése azokban az esetekben, ahol az IgH gén variábilis régiójában szomatikus mutációk halmozódtak fel. Amennyiben az IgVH gén mutálatlan, a betegség rossz prognózisú csoportba sorolandó

14-16

. Az IgVH gén

mutációs státuszának vizsgálata szekvenálással történik, ami nem terjedt el a rutin diagnosztikában.

Az

IgVH

mutációs

státusszal

szoros

összefüggést

mutató

és könnyebben hozzáférhető marker, a ZAP-70 expresszió vizsgálata a rutin diagnosztika részét képezi. Ha a ZAP-70 expresszió a sejtek kevesebb mint 20 %-ában észlelhető áramlás cytometriai vizsgálattal, akkor a CLL jó prognózisúnak számít, ha pedig az aktivitás a sejtek több mint 20 %-ában detektálható, a betegség klinikai lefolyása kedvezőtlen 17-19. A kromoszómaeltérést nem hordozó és a 13q14 kromoszómarégió delécióját hordozó betegeknek általában jobb prognózisú a betegségük és a túlélési idejük hosszabb

13

. A 17p deléciót hordozó betegek a kezelésre kevésbé reagálnak

összehasonlítva a 11q deléciót vagy a 12-es triszómiát hordozó betegekkel

13

13

.

A 11q22-23 kromoszómarégió deléciójával járó esetek prognózisa rossz

2, 12, 13

.

A 12-es kromoszóma triszómiája és a 6q21 kromoszómarégió deléciója is kedvezőtlen kimenetellel hozható összefüggésbe

4

. A prognosztikus citogenetikai eltérések

kimutatása leggyakrabban FISH vizsgálattal történik 4. 1.1.8 A CLL sejteredete A CLL eredete a mai napig sem teljesen ismert. A sejteredet pontos tisztázása fontos lenne a CLL-es betegekben kifejlődő immunregulációs zavarok pontos megértéséhez

és

a

felborult

immunműködés

helyreállítási

lehetőségeinek

tisztázásához 20. A daganatos lymphocyták felszaporodása valószínűleg a csontvelőben kezdődik, és innen terjed rá a nyirokcsomókra és a lépre 9. A CLL-nek két altípusát különböztetjük meg az IgVH gén mutációs státusza alapján: mutált (M) és nem mutált (NM) CLL-es esetek. Az M és NM CLL-es sejtek eredetének azonos vagy különböző volta is még kutatás tárgyát képezi 14, 15. A mutált CLL-es esetekben az IgVH gén a normális szomatikus hipermutációs (SHM) folyamattal egyező jellegzetességeket mutat

21, 22

, így feltehetően ezek a sejtek

bejutottak a centrum germinatívumba (CG) és ott antigén stimulus érte őket. A nem mutált eseteknél ugyanakkor nem egyértelmű, hogy a sejtek esetleg éretlen B-sejtekből származnának. Érdekes, hogy az NM esetek IgVH génjei közül gyakori az IgVH 1-69 overexpressziója

15, 21-23

, ami úgy függhet össze a betegséggel, hogy pl. egy speciális

antigén vagy antigén-szerű elem is részt vesz ezen alcsoport genezisében. A sejteredetek különbözőségére utal továbbá az is, hogy az NM esetek gyakran expresszálnak erősen polireaktív antitesteket, míg az M esetekben ez ritka 24. Az M és NM CLL sejteredetének azonosságára utal az a tény, miszerint az IgVH gén mutációs státuszától függetlenül minden CLL-es sejt azonos sejtfelszíni fenotípust mutat, ami az antigén stimuluson átesett, aktivált B-sejtek fenotípusához hasonlít

25

.

Ugyanezt támasztják alá a génexpressziós vizsgálatok eredményei, melyek szerint az M és NM CLL-es sejtek nagymértékben hasonlítanak egymásra B-sejtekre is

19

26

és a memória

. Ezek alapján a CLL sejtek a memória B-sejtekből is származhatnak.

Ez a feltételezés a CLL sejtek posztgerminális eredetére utalna, de az NM CLL sejtek – éppen azért, mert az IgVH génjük nem mutált – nem valószínű, hogy bejutottak volna a CG-be 19. Más elképzelés szerint a CLL sejtek prekurzorai a marginális zóna B-sejtjeiből is származhatnak, ugyanis a sejtek funkcionális és fenotípusos tulajdonságai nagyon

14

hasonlítanak a CLL sejtekéhez (pl.: polireaktivitás)

23

. Ez utóbbi elképzelés alapján

az M CLL sejtek a szomatikus mutációkat T-sejt független antigén válasz során halmozzák fel a CG-n kívül, a marginális zónában 27. Egy újabb elképzelés szerint a CLL immunszabályozó B-sejt eredetű tumor

28

.

Ezek a sejtek hasonlítanak a szabályozó T-sejtekre (Treg), amiket eddig még csak egerekben sikerült kimutatni, és hatásukat tekintve az IL-10 termelésén keresztül a T-helper 1 választ gátolják

29

. Ezt a hipotézist támogatja a CD25 és CD26

expressziója a CLL és a Treg -sejtek felszínén. Az elképzelés talán segít fetárni azokat az ismeretlen mechanizmusokat, amik a CLL-ben jellemző immunszabályozási zavarokat okozzák. Bár a CLL sejteredetére vonatkozó tanulmányok eredményei sokrétűek, a legújabb kutatások alapján összesítve elmondható, hogy a CLL-sejtek valószínűleg antigén stimuluson átesett érett B-sejtekből alakulnak ki. 1.2 A krónikus lymphocytás leukaemia transzformációja – Richter és prolymphocytás transzformáció A CLL egyik szövődménye, amikor a betegség magas malignitású non-Hodgkin lymphomába alakul át. Szövettanilag leggyakrabban diffúz nagy B-sejtes lymphoma (DLBL) (Richter szindróma, Richter transzformáció, RT) és prolymphocytás leukaemia (prolymphocytás transzformáció, PLT) lymphoblastos leukaemia

30,

31

1

, ritkábban Hodgkin-lymphoma és akut

is előfordul a transzformált CLL-ek között.

Ezek az agressziv lymphomák leggyakrabban nyirokcsomóban fejlődnek ki és onnan disszeminálnak más szervekbe. Ritkán csontvelőben is kialakulhatnak, vagy esetleg extranodális szövetben

32

. A transzformált esetekre a szövettani típustól függetlenül

jellemző az agresszív lefolyás és a rossz prognózis 8. A transzformáció okát és a transzformációban szerepet játszó molekuláris mechanizmusokat jelenleg kevéssé ismerjük. A továbbiakban a munkám szempontjából fontosabb RT-ről és PLT-ről értekezem részletesebben.

15

1.2.1 A Richter transzformáció A

Richter

szindrómát

először

1928-ban

Maurice

N.

Richter

írta

le.

A tanulmányában jellemzett CLL-ben szenvedő férfibetegnél gyorsan zajló, fatális kimenetelű

generalizált

megfigyelhető

33

lymphadenopathia

és

masszív

organomegália

volt

. A szövettani vizsgálat a CLL-re jellemző kis sejtek mellett nagy,

polimorf endotheloid tumorsejtek jelenlétét igazolta, melyek széles, bazofil citoplazmával, rendelkeztek

33

jól

körülhatárolt

maggal

és

több

prominens

nukleolusszal

. Ez a szövettani kép a B-sejtes NHL-ek jelenlegi WHO osztályozása

szerint a DLBL centroblasztos variánsának felel meg 1. A CLL DLBL-be történő átalakulása a betegek mintegy 5-10 %-ában következik 8

be . Az RT-t klinikailag gyors állapotromlás jellemzi, az általános klinikai tünetek közül magas láz, súlyvesztés és/vagy éjszakai izzadás fordul elő leggyakrabban. Jellemző,

hogy

a

megnagyobbodnak

nyirokcsomók

34, 35

hirtelen

nagymértékben

és

disszemináltan

. A betegek további klinikai tüneteit okozhatja a lép- ill.

májmegnagyobbodás, és a transzformáció által érintett egyéb régiók elváltozásai. Az RT extranodális megjelenését leírták már mellhártyában bélrendszerben

39

, központi idegrendszerben

40-42

, tüdőben

36

43

, bőrben

, szemben

37, 38 44

, gyomor-

, herében

45

,

vesében 32 és orrüregben 46. Nyirokcsomó érintettség esetén a szövettani vizsgálat során homogén, kis lymphocytás CLL-es területeket változó mértékben infiltráló centroblasztos (CB) vagy immunoblasztos (IB) sejtszaporulat látható

1, 4

. A CLL-es kissejtes komponens

kiszorulásával a folyamat DLBL képét mutatja. A transzformált DLBL sejtek nagyok, kerek vagy enyhén szabálytalan alakúak, valamint mérsékelten széles citoplazmával, laza magszerkezettel, a magban nagy, centrálisan elhelyezkedő erősen bazofil magvacskával (IB), vagy több, a maghártya mentén elhelyezkedő nukleolusszal (CB) rendelkeznek (5. ábra).

16

B

A

5. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia (CLL), diffúz nagy B-sejtes (Richter) transzformáció. A : A csontvelő aspirációs mintában nagy, centroblasztokra és immunoblasztokra emlékeztető sejtek láthatók (csontvelőkenet, MGG, 1000x) B : a kis CLL-es lymphocyták keverednek a diffúz nagy B-sejtes lymphoma sejtjeivel (nyirokcsomó, HE, 200x) 4.

Az RT immunfenotípusára vonatkozó szegényes irodalmi adatok arra utalnak, hogy bizonyos esetekben az RT megőrzi a megelőző CLL immunfenotípusát (IgM+, IgD+/-, CD5+, CD19+, CD23+)

47, 48

, más esetekben viszont az RT immunhisztokémiai

megjelenése eltér a CLL-től (CD5-, IgD-, Ki-67+) 49-51. A DLBL nem mindig az eredeti CLL-es tumorklónból alakul ki, „de novo” is kifejlődhet, ilyenkor kompozit lymphomáról beszélünk. Különféle tanulmányok alapján feltételezhető, hogy az RT az esetek 50-60 %-ában valódi klonális evolúció során fejlődik ki a megelőző CLL-ből

36, 52, 53

és 40-50 % -ban alakul ki „de novo”.

A CLL és az agresszív lymphoma klonális kapcsolatának igazolása az IgH gén harmadik komplementaritást determináló régiójának (CDR3) polimeráz láncreakciós (PCR) vizsgálatával (esetenként a szekvenciák analízisével) történik. A CDR3 régió tartalmazza a B-sejtekben átrendeződő variábilis (VH), diverzitás (D) és joining (JH) génszakaszok egyedi, sejtre jellemző kombinációját B-sejt fejlődésének folyamatát

56

54, 55

, mely végigkíséri az adott

. A CDR3 régió PCR-amplifikációja a VH és JH

génekre specifikus primerpárokkal érhető el

57

. A megegyező hosszúságú termékek

a lymphomák közös klonális eredetére utalnak, míg a különböző hosszúságúak kizárják a klonális kapcsolatot

49, 58

. A PCR termékek szekvencia analízisével akkor igazolt

a CLL és RT közötti klonális kapcsolat, ha a szekvenciák bázissorrendje azonos. A CLL-es esetek 50-60%-ában a B-sejtek az IgVH régióban szomatikus mutációkat hordoznak, 40-50%-uk nem tartalmaz mutációkat 59. Kutatócsoportunk erre vonatkozó tanulmánya szerint valódi klonális evolúció csak a szomatikus mutációkat nem hordozó CLL-es eseteknél valósul meg 60.

17

A klonális evolúciót újabb kromoszóma vagy genetikai abnormalitások, vagy vírusinfekciók válthatják ki

61

. RT-ben többféle kromoszóma és genetikai eltérést

leírtak már, amelyek mind szerepet játszhatnak a lymphoma progresszióban (2. táblázat). A heterogén genetikai eltérések jelenléte arra utal, hogy a CLL sejtek a sejtciklus szabályozásának zavara miatt újabb és újabb genetikai hibákat halmoznak fel, általános genetikai instabilitás alakul ki bennük, és a szelektív növekedési előnyhöz jutó sejtek végül kialakítják az RT-re jellemző agresszív lymphoma képét 62-64.

2. táblázat. RT-ben leírt genetikai abnormitások és összefüggésük a transzformációval genetikai elváltozás 12-es triszómia 11q deléció t(11;14) transzlokáció mikroszatellita instabilitás P53 mutáció p16INK4A mutáció P21 mutáció P27 expresszió elvesztése Rb deléció c-MYC kópiaszám emelkedés a-MYB expresszió csökkenés

összefüggés a transzformációval bizonyos tanulmányok szerint néhány CLL-es betegben ez lehet az első eltérés a transzformáció során 65, 66, de valószínűleg nincs direkt szerepe a transzformációban gyakran a 23-as régiót érinti, ami olyan génekben gazdag, amelyek kiesése transzformációt okozhat (pl: NCAM) 67 az IgH promoter szabályozása alá kerül a BCL-1 gén, így a ciklin D1 overexpresszálódik és a sejtciklus felgyorsul 68 jelenléte bizonyított RT-ben, oka valószínűleg a mismatch repair rendszer károsodása 69 új malignus klón kialakulásával hozható összefüggésbe, a transzformációval kevésbé 68, 70 ezen tumor szupresszor géneknek a kiesése, illetve funkciójuk megváltozása • a sejtciklus szabályozásban • a DNS repair mechanizmusokban és/vagy • a sejtdifferenciálódásban okoz kárt, elősegítve ezzel további genetikai eltérések felhalmozódását a sejtekben és a transzformációt 71-73

Rövidítések: BCL-1, B-cell leukaemia/lymphoma 1 gén; CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; IgH, immunglobulin nehézlánc gén; NCAM, nerve cell adhesion molecule; p53, p16INK4A, p21, p27, tumor szupresszor gének; Rb, retinoblastoma gén; RT, Richter transzformáció

18

A citogenetikai vizsgálatok eredményei megerősítették azt a feltételezést, miszerint a CLL-ben detektálható komplex kariotípus-eltérések nagyobb valószínűséggel vezetnek RT-hez, mint a kromoszomális eltérések hiánya, vagy a 12. triszómia önmagában

66,

74

. Összességében elmondható, hogy az RT-ben leírt genetikai

elváltozások egyike sem tehető elsődlegesen felelőssé a CLL transzformációjáért 8. Az RT-k egy kis részében Epstein-Barr vírus fertőzést is leírtak

53, 75

. Az Epstein-Barr

vírus többféle módon okozhat lymphoma progressziót, de szerepe a transzformációban még nem bizonyított8. Az RT kezelése egyelőre nem megoldott, jelenleg az egyébként NHL-ben és akut lymphoblastos leukaemiában használt cytotoxikus szereket alkalmazzák

35

, amire

4

a betegeknek csak kb. 50 %-a reagál . Az RT prognózisa kifejezetten rossz, a betegek átlagos túlélése 5 hónap 4. 1.2.2 A prolymphocytás transzformáció A CLL lefolyása során kb. 15-30 %-ban következik be PLT 4. A PLT klinikai tünetei hasonlóak az RT tüneteihez, a beteg állapotának romlása jelzi a transzformációt. A fáradtság, súlyvesztés és éjszakai izzadás mellett jellemző a lépmegnagyobbodás és a magas fehérvérsejtszám. Nyirokcsomó megnagyobbodás ritkán fordul elő 76. A PLT-nél a perifériás vérben, a csontvelőben vagy a nyirokszövetekben a prolymphocyták aránya a tumoros sejtpopuláción belül meghaladja a 30 %-ot

4, 76

.

A PLT sejtek a CLL sejteknél nagyobbak, citoplazmájuk bővebb, kerek maggal és prominens nukleolusszal rendelkeznek 4 (6. ábra).

19

A

B

6. ábra. Krónikus lymphocytás leukaemia, prolymphocytás transzformáció. A: a perifériás vérkenetben felszaporodtak a nagyobb, bővebb citoplazmával és prominens nukleolusszal rendelkező prolymphocyták a leukaemiás sejtek mellett. A kenetben Gumprecht-rögök is megfigyelhetők (perifériás vérkenet, MGG, 200x). B: a csontbiopsziás mintában az infiltráló prolymphocyták világos, laza magkromatinnal és prominens nukleoluszokkal rendelkeznek (csontbiopszia HE, 200x) 4.

A PLT-s betegek agresszívebb terápiát igényelnek; ezeknél az eseteknél is – mint az RT-nél – NHL-ben és akut lymphoblastos leukaemiában alkalmazott cytotoxikus szerekkel történik a kezelés. Ritkán őssejt transzplantáció is szóba kerül 35. A PLT jelentősen csökkenti a betegek túlélését.

20

2. A genom instabilitás szerepe a lymphomák kifejlődésében A genom (vagy genetikai) instabilitás központi szereppel bír a daganatos betegségek kialakulásában és lefolyásuk során – a tumorok majdnem mindegyike genetikailag instabil. A tumorok progressziójának motorja és heterogenitásuk oka is a genom instabilitás. Az instabilitás jelzi, hogy a genom épségét fenntartó mechanizmusok a sejtben meghibásodtak.

A genom instabilitás a kromoszómák

és a nukleotidok szintjén nyilvánulhat meg a humán daganatokban 77. A nukleotidok szintjén kialakuló genetikai instabilitás egy vagy néhány bázispárt érint a DNS-ben. A humán daganatokban ez a típus ritkán fordul elő, de súlyos következményekkel járhat 77, 78. Főbb formái a következők: A

hibajavító

(mismatch-repair)

gének

és

a

tumorszupresszor

gének

működésének zavarával vagy inaktivációjával járó változás (pontmutáció, deléció vagy hipermetiláció) gyakran eredményez aberrációkat a genomban. DNS szekvenciát érintő változás továbbá a tandem ismétlődő DNS-szakaszok (mikroszatelliták)

kópiaszámának

megváltozása,

amit

mikroszatellita

instabilitásnak nevezünk. Az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM) a genom instabilitás egy újabban leírt formája 79, melyről bővebben a 2.1 fejezetben írok. A kromoszómák szintjén kialakuló genom instabilitás a kromoszóma-szegregáció zavarain keresztül vezet szám- vagy szerkezetbeli kromoszóma eltérésekhez

77

.

Ide tartoznak: A

kromoszómaszám

eltérések

–

kromoszóma-nyerés

vagy

-vesztés

(aneuploiditás) – nagyon gyakran fordulnak elő humán daganatokban. A kromoszóma-transzlokációk olyan kromoszómahibák, amelyeknél azonos vagy különböző kromoszómán levő, egymástól távol eső DNS-szakaszok kapcsolódnak össze. Ez a folyamat fúziós gének kialakulásával járhat. A génamplifikáció egy meghatározott génszakasz több kópiában való megjelenése, amely 0,5-10 megabázis hosszúságú járulékos örökítőanyagot jelent.

21

2.1 Az aberráns szomatikus hipermutáció A nukleotidok szintjén kialakuló genom instabilitás legújabban leírt formája az aberráns szomatikus hipermutáció. Az ASHM-et a normál B-sejt érés során lezajló 79

szomatikus hipermutáció hibás működésének tartják

. Az SHM a nyirokcsomók

csíraközpontjaiban (centrum germinatívum, CG) zajló alapvető immunológiai folyamat, melynek során a B-lymphocyták átrendeződött immunglobulin nehézláncgénjeinek variábilis régióiban szomatikus mutációk halmozódnak fel (7. ábra). Ez a folyamat része a B-sejtek affinitás-érésének, melynek eredményeképpen az antigénnel egyre magasabb aviditással reagáló antitestek keletkeznek

80

. Az SHM a fiziológiás B-sejt

fejlődés során a BCL-6 gén 5’ nem-kódoló régióját is érinti

81, 82

, de ennek jelentősége

még nem ismert. VH

JH

D

Cµ 3'

5'

5'

3' Leader

FR1

CDR1 FR2

FR3

CDR2

FR4

CDR3

SHM 5'

3'

5'

3'

5'

3' CDR1

CDR2

CDR3

7. ábra. Az immunglobulin nehézlánc (IgH) génátrendeződés és a szomatikus hipermutáció. A B-sejtek érésének korai stádiumában, a csontvelőben történik az IgH génátrendeződés, melynek

során

a

variábilis,

diverzitás

és

joining

géncsaládok

egy-egy

tagjának

összekapcsolódása zajlik. A B-sejt érés későbbi szakaszában antigén inger hatására aktiválódik a megfelelő

specificitású

B-sejt,

melynek

átrendeződött

IgH

génjei

a

nyirokcsomó

csíraközpontjában szomatikus mutációk sorozatán mennek át. A folyamat eredménye intraklonális divergencia, vagyis heterogén B-sejt populáció kialakulása. A szomatikus mutációk elsősorban az antigén kötődéséért felelős régiókat (CDR) érintik az antigén-szelektált B-sejtekben. Rövidítések: Cµ, konstans régió; CDR, komplementaritást meghatározó szakasz; D, diverzitás („diversity”) géncsalád; FR, „framework” régió; JH, „joining” géncsalád; SHM, szomatikus hipermutáció; VH, variábilis géncsalád

22

Az ASHM során a hipermutációs aktivitás átterjed más, a fiziológiás célgéneken kívüli lókuszokra, például protoonkogénekre is. A vizsgált gének közül az ASHM leggyakrabban a c-MYC, a PAX-5, a RhoH és a Pim1 protoonkogéneket érinti

79

.

Az érintett gének jellemzőit a 3. táblázatban foglaltam össze.

3. táblázat. Az ASHM által érintett gének jellegzetességei. gén

c-MYC

PAX-5

RhoH

ASHM által érintett régió P1/P2 major promotertől, illetve a P3 minor promotertől downstream található 1,5 illetve ~0,9 kb hosszúságú szakaszok

B-sejt irányba való elköteleződés során szabályozás

kis lymphocytás lymphoma, DLBL

1B exon környezetében mintegy 1 kb hosszú szakasz

extracelluláris szignálok továbbítása

non-Hodgkin lymphomák

1B exon 3’ irányban található nem kódoló régió

DLBL

a transzkripciót iniciáló régió 3’ végétől 2 kb-ra található kb. 1,2 kb hosszú szakasz

funkció

transzkripciós faktor B-sejt specifikus transzkripciós faktor kis GTP-kötő fehérje (Ras szupercsalád) protein kináz

Pim1

sejtnövekedés, proliferáció, differenciáció és apoptózis szabályozás

összefüggés betegséggel Burkittlymphoma és más haematopoetikus daganatok

Fehérje

bizonyos fehérjék aktivitásának szabályozása

Rövidítések: ASHM, aberráns szomatikus hipermutáció; DLBL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; kb, kilobázis

Az ASHM által érintett régiókban detektált mutációk mintázata megegyezik az IgVH és a BCL-6 génekre jellemző SHM mintázatával 83, 84: a mutációk nagy része egyszerű nukleotid szubsztitúció, ritka az inszerció vagy deléció előfordulása, a transzkripciót iniciáló régiótól kb. 2 kb-ig terjedő távolságban lokalizálódnak, gyakran érintik az RGYW (R=A/G; Y=C/T; W=A/T) szekvcencia-motívumot, gyakrabban érintik a G+C nukleotid párokat, mint az A+T párokat, a tranzíciók aránya valamivel gyakoribb a transzverzióknál.

23

Az ASHM a felsorolt géneken kívül valószínűleg még más lókuszokat is érint, melynek következtében ún. genom szintű instabilitást hoz létre 79. Az ASHM többféle mechanizmus

útján

vezethet

malignus

transzformáció

kialakulásához,

ilyen

pl. a fehérjeszerkezet megváltoztatása, gének inaktiválása és génexpresszió szabályozása. A mutációk lokalizációja az egyes génekben átfedést mutathat a különböző transzlokációkra jellemző fő kromoszóma-töréspontokkal. Az ASHM-et eddig különféle NHL-ekben írták le: a DLBL-ek mintegy 50%-ában 79 primer központi idegrendszeri DLBL-ben 85 AIDS-asszociált NHL-ekben 86 hepatitis-C vírus fertőzéssel társult NHL-ekben 87 Mediastinalis B-sejtes lymphomában 88 Több kutatócsoport is leírta, hogy az ASHM nem érinti a CLL-t

79, 85-87

. A CLL

magas malignitású lymphomába átalakult eseteiben, így RT-ben és PLT-ben viszont az ASHM-et korábban nem vizsgálták. 2.2 Az aktiváció-indukált citidin deamináz Az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) enzim esszenciális szerepet tölt be alapvető immunológiai folyamatokban, az SHM-ben és az izotípusváltásban („class-switch”

rekombináció,

germinatívumában zajlanak

CSR),

89, 90

amelyek

a

nyirokcsomó

centrum

. Az izotípusváltás is a B-sejt érés folyamatához

tartozik, melynek során az immunglobulin osztályok típusa megváltozik: IgM- és IgD mellett IgE, IgG és IgA keletkezik. Az AID fiziológiásan a centrum germinatívum B-sejtjeiben – melyek CD19 és CD38 sejtfelszíni markereket hordoznak – expresszálódik. Az AID fehérje a citoplazmában lokalizálódik chaperonok segítségével mindaddig, amíg valamilyen B-sejt aktiváló stimulus hatására be nem kerül a sejtmagba. B-sejt aktiváló stimulusok lehetnek

például

az

IL-4,

CD40

ligand

és

lipopoliszacharidok,

amelyek

az NF-κB és a JAK-STAT-6 jelátviteli úton keresztül fejtik ki hatásukat 91, 92 (8. ábra).

24

CD38 CD19

AID AID

NF-κB

IL-4 CD40 ligand LPS JAK-STAT-6

8. ábra. Az AID fiziológiásan a centrum germinatívum B-sejtjeiben expresszálódik. Az AID fehérje a citoplazmában raktározódik, amíg valamilyen B-sejt aktiváló stimulus hatására be nem kerül a magba (piros nyíl). B-sejt aktiváló stimulusok például az IL-4, CD40 ligand és lipopoliszacharidok, amelyek az NF-κB és a JAK-STAT-6 jelátviteli úton keresztül fejtik ki hatásukat. Rövidítések: AID, aktiváció indukált citidin deamináz; CD, „cluster differentiation“; IL, interleukin; JAK, Janus-kináz; LPS, lipopoliszacharid; NF-κB, nukleáris faktor-κB; STAT-6, „signal transducer and activator of transcription 6”.

Az AID erősen mutagén enzim, hatására deaminálással a citidinből uridin képződik (9. ábra). Hatásmechanizmusa még nem teljesen tisztázott, több elképzelés is született erre vonatkozóan. Az egyik elgondolás szerint az AID az mRNS „editálásán” keresztül fejti ki hatását 93. Valószínűbbnek tűnik ma már az az elképzelés, mely szerint az AID a transzkripció során közvetlenül az egyszálú DNS molekulán képes citidin deamináz aktivitását

kifejteni,

különböző,

többségében

még

ismeretlen

kofaktorok

segítségével 94, 95.

O

NH2 C N O

C

C

H

C

H

C

AID

H

N

O

C

C

H

C

H

N

N

NH2

R

citidin

R

uridin

9. ábra. Az AID hatására a citidinből uridin keletkezik deaminálással. Rövidítések: AID, aktiváció indukált citidin deamináz

25

A deaminálás során a DNS molekulában guanin-uracil (G-U) bázispárosodási hibák (mismatchek) keletkeznek

96

, amelyek intermedierei lesznek az SHM és a CSR

folyamatainak. A G-U mismatchek feloldására különféle javító folyamatok aktiválódnak, melyek a jellegüktől függően vagy kijavíthatják a hibát, vagy különböző típusú szomatikus mutációk vagy DNS törések létrejöttét eredményezik A javító folyamatok és eredményeik hiba kijavítása

101

97-100

.

:

DNS integritásának helyreállítása (G-C bázispár)

javítás nélküli replikáció

C-T és G-A tranzíciók

bázis-excíziós rendszer aktiválódása

tranzíciók és transzverziók

uracil-N-glikoziláz enzim aktiválódása, majd transzléziós replikáció tranzíciók és transzverziók uracil-N-glikoziláz

enzim

endonukleáz működése

aktiválódása,

majd

apurin/apirimidin

tranzíciók és transzverziók

bármelyik javító folyamat (ha a hibák „megfelelő” pozícióban vannak) duplaszálú DNS törés Ezek alapján érthető, hogy az AID enzim inadekvát aktivitása helytelen DNS rekombinációk kialakulásán keresztül genom instabilitást hozhat létre, mely különféle B-sejtes lymphomák kialakulásához vezethet. Nagy valószínűség szerint az inadekvát AID aktivitás tehető felelőssé az ASHM kialakulásáért is, melynek során különböző protoonkogénekben szomatikus mutációk halmozódnak fel 102 (10. ábra).

26

SHM

IgM, IgD

IgG, IgA, IgE

AID

IgVH-régió

3 B-lymphocyta

nyirokcsomó csíraközpont

ASHM

c-MYC, Pax-5, RhoH és Pim1 protoonkogének

B-sejtes daganatok

10. ábra. Az AID alapvető fontosságú enzim az izotípusváltás és az SHM folyamatában, melyek a B-sejt érés során valósulnak meg a nyirokcsomó csíraközpontjában. Az AID inadekvát működése (piros nyíl) ASHM-hez vezet, melynek következtében B-sejtes lymphomák fejlődhetnek ki. Rövidítések: AID, aktiváció-indukált citidin deamináz; ASHM, aberráns szomatikus hipermutáció; Ig, immunglobulin; IgVH, immunglobulin nehézlánc gén variábilis régió; SHM, szomatikus hipermutáció.

27

Fokozott (4. táblázat)

AID 103-106

expressziót

különböző

típusú

lymphomákban

leírtak

. Az egyes munkacsoportok az AID expressziót különböző

mértékűnek találták CLL-ben

91, 104, 107-109

. Albesiano és mtsai

107

határhigításos

módszerrel bebizonyították, hogy a CLL-es tumorsejt populációban az AID expresszió heterogén és csak a sejtek egy kis része expresszál AID-et. Ugyanakkor a CLL magas malignitású lymphomába transzformálódott eseteinél (RT, PLT) az AID expressziójára vonatkozó adat az irodalomban nem található.

4. táblázat. Az AID expresszió mértéke különféle lymphomákban lymphoma eredete

centrum germinativum

nem centrum germinativum

AID expresszió

magas

DLBL GCB-altípus

DLBL ABC-altípus

Burkitt-lymphoma

extranodalis marginális zóna

follicularis lymphoma

lymphoma (MALT)

mediastinalis B-sejtes lymphoma CLL myeloma multiplex

alacsony

MALT lymphoma köpenysejtes lymphoma

Rövidítések: ABC, aktivált B-sejtes; AID, aktiváció-indukált citidin deamináz; CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; DLBL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; GCB, centrum germinatívum B-sejtes; MALT, mucosa asszociált lymphoid szövet

Összesítve elmondható, hogy az AID inadekvát aktivitása összefügghet az ASHM-mel, amely különféle B-sejtes lymphomák patogenezisében vesz részt. Az AID és az ASHM szerepét korábban nem vizsgálták a CLL Richter és prolymphocytás transzformációjában.

28

IV. CÉLKITŰZÉSEK

Az aktiváció-indukált citidin deamináz mRNS expressziójának vizsgálata krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben. Az aberráns szomatikus hipermutáció vizsgálata a c-MYC, Pax-5 és RhoH protoonkogénekben

a

krónikus

lymphocytás

leukaemia

Richter

és prolymphocytás transzformált eseteiben. Az IgVH gének mutációs státuszának feltérképezése és azok összevetése a c-MYC, Pax-5 és RhoH protoonkogének mutációs státuszával a krónikus lymphocytás leukaemia Richter és prolymphocytás transzformált eseteiben.

29

V. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 1. Beteganyagok Tanulmányunkban 29 krónikus lymphocytás leukaemiás beteg perifériás vér (PV) mintáját vagy frissen fagyasztott nyirokcsomó biopsziás mintáját használtuk. Valamennyi minta diagnózisát az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben állították fel a World Health Organization (WHO) lymphoid szövetek daganatos megbetegedéseinek

klasszifikációjára

vonatkozó

kritériumainak

megfelelően,

hisztopatológiai és immunfenotípus vizsgálatok alapján (3). A CLL-es betegek közül 8 eset a betegség klinikai lefolyása alatt nem transzformálódott (1-8. esetek). 13 esetben Richter transzformáció (9-21. esetek), míg 8 esetben prolymphocytás transzformáció (22-29. esetek) fejlődött ki. Az RT-s betegek közül 7 esetben (9-15. esetek) a CLL-es és a DLBL-es minta is elérhető volt a vizsgálatokra. Ezekben az esetekben a CLL és a hozzátartozó DLBL minták egyforma IgVH génátrendeződést mutattak, igazolva ezzel a tumor minták azonos klonális eredetét. A vizsgált mintákban a malignus sejtek aránya több mint 90 % volt. A betegek klinikai adatait (nem, kor, mintavétel ideje, klinikai stádium, lymphocyta szám, thrombocyta szám és hemoglobin szint) az 5. táblázat foglalja össze.

30

5. táblázat. A betegek klinikai adatai Mintavétel ideje Stádium (Binet) (év, hó)

Lymphocyta (G/l)

Thrombocyta Hemoglobin (G/l) (g/l)

Eset szám

Minta

Nem

Kor

1 2 3 4 5 6 7 8

CLL CLL CLL CLL CLL CLL CLL CLL

nő ffi ffi nő nő ffi ffi nő

70 89 79 72 82 60 53 77

2003 10 2004 06 2004 03 2004 03 2004 02 2003 11 2004 03 2003 09

A A C A C B A A

25,07 14,63 14,03 21,17 39,67 13,68 22,77 8,06

125 138 121 214 32 586 218 228

131 104 65 142 85 113 135 138

9

CLL RT

ffi

60 60

2004 09 2004 03

B B

2,25 1,33

122 153

134 137

10

CLL RT

ffi

61 63

2002 10 2004 11

A B

7,57 56,32

571 216

131 123

11

CLL RT

ffi

64 64

2002 02 2002 02

B B

14,94 22,01

178 230

115 123

12

CLL RT

ffi

62 62

2003 02 2003 02

B B

36,33 7,84

320 286

139 130

13

CLL RT

ffi

52 52

2003 10 2003 06

C C

4,48 2,84

67 38

129 125

14

CLL RT

ffi

41 40

2003 10 2002 02

C B

442,70 1,65

45 115

55 114

15

CLL RT

nő

73 73

2005 03 2005 02

B B

19,88 26,98

170 341

119 128

16 17 18 19 20 21

RT RT RT RT RT RT

ffi ffi nő ffi ffi nő

63 51 53 71 68 55

2003 02 2004 02 2004 01 1996 11 1998 05 2004 03

C B C C B B

80,22 18,40 5,50 8,36 11,45 3,77

0,6 176 36 113 303 285

77 118 101 98 126 109

22 23 24 25 26 27 28 29

PLT PLT PLT PLT PLT PLT PLT PLT

nő ffi ffi nő ffi nő ffi ffi

69 75 66 49 83 76 60 74

1998 12 1998 01 2002 03 2004 08 2004 09 2004 06 2002 02 2004 08

B A A B B B A B

6,32 27,53 2,15 346,00 1,72 6,89 2,62 38,14

241 189 148 263 144 200 158 170

128 134 127 126 134 149 135 130

Rövidítések: CLL, krónikus lymphocytás leukemia; NA, nem amplifikált; ffi, férfi; PLT, prolymphocytás transzformáció; RT, Richter transzformáció

31

2. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mRNS expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval Összesen 12 CLL-es (1-12. esetek), 13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s minta (22-29. esetek) AID mRNS expresszióját analizáltuk kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval

(real-time

PCR,

qRT-PCR).

Négy

esetben

(9-12.

esetek)

a CLL-es és a hozzátartozó RT-s minta is elérhető volt a vizsgálatra. A vizsgálathoz kontrollként 8 egészséges önkéntes PV-ének mononukleáris sejtjeit és 2 humán reaktív nyirokcsomó CG B-sejtjeit használtuk. Az mRNS expressziós vizsgálat munkamenetét a 11. ábra foglalja össze.

RNS izolálás

RT

qRT-PCR

11. ábra. Az mRNS expresszió analíziséhez először a kontroll és a tumor szövetekből RNS-t izoláltunk klasszikus módszerrel, majd ebből reverz transzkripcióval cDNS-t szintetizáltunk. A cDNS mintákkal elvégeztük a valós-idejű PCR reakciót, majd a ΔΔCT módszer segítségével meghatároztuk a relatív expressziós szinteket. Rövidítések: RT, reverz transzkripció; qRT-PCR, kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakció

2.1 Lézer mikrodisszekció A Leica lézer mikrodisszekciós rendszer (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) segítségével 2 humán reaktív nyirokcsomóból centrum germinatívum sejteket izoláltunk, a gyártó utasításai alapján. A munka során minden eszközt RNA later (Qiagen, USA) reagenssel kezeltünk, hogy megakadályozzuk az RNS degradációját. A

frissen

fagyasztott

nyirokcsomó

mintákból

metszeteket

készítettünk

mikrodisszekcióra alkalmas tárgylemezre. A tárgylemezeket toluidin-kék festékkel megfestettük, majd a centrum germinatívumokból sejteket vágtunk ki. Az izolált sejteket Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) reagensbe gyűjtöttük.

32

2.2 RNS izolálás Totál RNS izolálást végeztünk Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) reagens alkalmazásával a 8 egészséges PV mononukleáris sejtjeiből, a 2 reaktív nyirokcsomó CG B-sejtjeiből valamint a 12 CLL-es (1-12. esetek), 13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s (22-29. esetek) mintából a gyártó utasításainak megfelelően. A PV-ek esetében első lépés volt a mononukláris sejtkomponens szeparálása sűrűség gradiens centrifugálással. Steril üvegkémcsőben 2ml szobahőmérsékletű Histopaque (Sigma, St. Louis, USA) reagensre rárétegeztünk 2 ml EDTA-val alvadásgátolt teljes vért, majd 30 percig centrifugálást végeztünk 400 g-vel, szobahőmérsékleten. A centrifugálás során elkülönült mononukleáris sejteket tartalmazó fázist leszívtuk és egy másik steril üvegkémcsőbe pipettáztuk, ahol a sejteket 5 ml DEPC (dietil-pirokarbonát) –PBS-ben (phosphate-buffered saline) reszuszpendáltuk. Az ezt követő 10 perces, szobahőmérsékleten 250 g-vel végzett centrifugálás után a felülúszót leöntöttük, és a kémcső alján maradt tisztított mononukleáris frakcióhoz 1 ml Trizol reagenst adtunk. A fagyasztott nyirokcsomó mintákból először mikrotómmal 15 darab 30 μm vastag metszetet készítettünk, és a szövetmetszeteket egy steril eppendorf csőben 1 ml Trizol reagensben homogenizáltuk. Miután

a

kémcsövekben

a

vér

és

a

nyirokcsomó

mintákból

nyert

homogenizátumban a sejtek teljesen feloldódtak (a csövek tartalma viszkózussá vált) hozzámértünk 200 μl kloroformot. Vortexelés és 3 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 15 percig 4 oC-on 10 000 g-vel centrifugáltuk a csöveket, majd a felső vizes fázist egy új steril eppendorf csőbe szívtuk át és hozzámértünk 0.5 ml izopropanolt. 10 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 10 percig 4 oC-on 10 000 g-vel centrifugálást végeztünk, majd a felülúszó leöntése után 1 ml 75 %-os etanolt mértünk a csövekbe és a csövek falát megpöcögtettük, hogy az RNS üledék leváljon a cső faláról. Egy újabb 10 perces, 4 oC-on 10 000 g-vel végzett centrifugálás után a felülúszó leszívását követően az RNS precipitátumot tartalmazó csövet jégbe állítva hagytuk megszáradni. Az RNS precipitátumot 30-50 μl DEPC-kezelt vízben feloldottuk és 37 oC-os vízfürdőben 15 percig inkubáltuk. Az RNS koncentrációját spektrofotométer (Gene Quant II, Cambridge, UK) segítségével 260 nm hullámhosszon megmértük. Az RNS mintákat -70 °C-on tároltuk a további felhasználásig.

33

2.3 Reverz transzkripció Az RNS minták cDNS-sé történő kvantitatív átírását, vagyis a reverz transzkripciót a High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével végeztük. A reverz transzkripciós reakció a MiniCyclerTM (MJ Research Inc., USA) készülékben zajlott, hőprofilja: 10 perces 25 oC-on történő inkubációt követő 37 oC-on zajló 120 perces szintézis. A reakció során 2.5 μg RNS átírása történt 100

μl

végtérfogatban.

A

reakció

összetétele

a

6.

táblázatban

látható.

A megszintetizálódott cDNS mintákat -20 oC-on tároltuk a további felhasználásig.

6. táblázat. A reverz transzkripciós reakció összetétele összetevők

mennyiség/cső

Reverse Transcription Buffer (10x)

10 μl

dNTPs (25x)

4 μl

Random Primers (10x)

10 μl

MultiScribe Reverse Transcriptase (50U/ μl)

5 μl

RNS templát

2.5 μg

Nukleáz mentes víz

100 μl-ig

2.4 Kvantitatív RT-PCR és az AID mRNS expressziós szintek meghatározása A 12 CLL-es, a 13 RT-s, a 8 PLT-s valamint a kontroll minták kvantitatív RT-PCR reakcióit az ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) valós-idejű PCR készülék segítségével végeztük el. Az AID mRNS

amplifikációjához

a

TaqMan®

alapú

Assays-on-Demand™

(Applied

Biosystems) génexpressziós rendszert használtunk. A kitben az AID gén amplifikálni kívánt szakaszára specifikus TaqMan® próba mellett olyan AID-re specifikus primerpár található, amely a vad típusú gén és több splice-variáns amplifikációjára is alkalmas. Az AID értékek normalizálásához belső kontrollként a glyceralaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) háztartási gén amplifikációját is elvégeztük előre kifejlesztett (pre-developed)

TaqMan®

Control

Reagent

34

(Applied

Biosystems)

rendszer

segítségével. Ez a kit egy GAPDH-ra specifikus primerpárt és egy TaqMan® próbát tartalmaz. A TaqMan® próba egy olyan kb 20-30 bp hosszúságú oligonukleotid, amelynek az 5’ végén egy ún. „reporter” fluoreszcens molekula, a 3’ végén pedig egy ún. „quencher” nem-fluoreszcens molekula található. A TaqMan® próba mindig a target génszakasszal komplementer, úgy tervezik, hogy nagyjából a génszakasz középső részéhez tudjon specifikusan kötődni. A „reporter” és a „quencher” fluorokrómok egymáshoz való fizikai közelségéből adódóan a „quencher” molekula Förster típusú energia átvitellel kioltja a „reporter” molekula fluoreszcenciáját, így fluoreszcens jel nem detektálható mindaddig, amíg a TaqMan® próba intakt (12. ábra).

R 5’

S

5’

Q P

3’

3’

5’ 3’

5’ AS

5’

12. ábra. A kvantitatív RT-PCR reakció elméleti alapja. A primerpár bekötődik az amplifikálandó génszakasz 2 végéhez, a próba pedig a génszakaszon belül a két primer közé az egyik szálhoz. Fluoreszcens jel nem detektálható, amíg az R és a Q molekulák közel vannak egymáshoz. Rövidítések: S, sense primer; AS, antisense primer; P, TaqMan® próba; R, „reporter” molekula; Q, „quencher” molekula. A szaggatott nyilak a PCR reakció irányát jelzik.

A kvantitatív RT-PCR reakcióban olyan DNS polimeráz enzimet használnak, amelynek 5’ exonukleáz aktivitása van, így az a reakció során a próbát el tudja hasítani. A TaqMan® próba elhasadásával a 2 fluorokróm távolodik egymástól, ezáltal csökken a „quencher” molekula miatt létrejött gátlás, és a „reporter” molekula által emittált fluoreszcencia detektálhatóvá válik. A fluoreszcens jel emelkedése nyilvánvalóan csak akkor detektálható, ha a próba be tudott kötődni a target szekvenciához és az amplifikálódik a PCR reakció során (13. ábra).

35

R Q 5’

S

P

3’

3’

5’ 3’

5’ AS

5’

13. ábra. A kvantitatív RT-PCR reakció előrehaladtával a DNS polimeráz enzim az 5’ exonukleáz aktivitása segítségével hasítja a próbát, így megszűnik a „quencher” molekula gátló hatása, és a „reporter” molekula fluoreszcenciája erősödik, detektálhatóvá válik. Rövidítések: S, sense primer; AS, antisense primer; P, TaqMan® próba; R, „reporter” molekula; Q, „quencher” molekula. A szaggatott nyilak a PCR reakció irányát jelzik.

A PCR termékek exponenciális mértékű felszaporodása a „reporter” molekula egyre erősödő fluoreszcens emissziójának detektálásával mérhető. Az emittált jel arányos a felszaporodó PCR termékek mennyiségével, végeredményben pedig a kiindulási cDNS és az RNS mennyiségével is. A kvantitatív RT-PCR során minden mintából 3 párhuzamos reakciót futtattunk, és egy reakcióhoz 100 ng kiindulási cDNS templát mennyiséget használtunk 20 µl végtérfogatban. A reakcióelegyek összetétele a 7. táblázatban látható. A reakció egy kétlépéses PCR amplifikációnak felel meg, ahol az anelláció és az extenzió ugyanazon a hőmérsékleten zajlik. A reakció szakaszai és hőprofilja a 8. táblázatban látható.

7. táblázat. A kvantitatív RT-PCR reakció összetétele. összetevők

mennyiség/cső

TaqMan Universal PCR Master Mix (2x)

10 µl

Assays-on-Demand (AID/GAPDH) (20x)

1 µl

cDNS templát

100 ng

nukleáz mentes víz

20 µl-ig

36

8. táblázat. A kvantitatív RT-PCR reakció hőprofilja. lépés

hőmérséklet

idő

kezdeti denaturáció

95 oC

10 perc

denaturáció

95 oC

15 m.perc

anelláció-extenzió

60 oC

1 perc

ciklus 50

Rövidítések: m.perc, másodperc

A kvantitatív RT-PCR amplifikáció során nyert adatokat a Sequence Detection Software version 1.3 (Applied Biosystems) program segítségével értékeltük ki. Az eredményeket ún. „threshold cycle” (CT) értékek formájában kaptuk. A CT érték azt a ciklus számot jelöli, ahol a relatív fluoreszcencia-szint eléri az általunk beállított küszöbértéket. Ez a reakció exponenciális (első) fázisában történik meg, vagyis abban a szakaszban, amikor az amplifikáció hatékonysága még nagy és konstans. A valós-idejű PCR reakció szakaszait a 14. ábra mutatja be.

3. fázis 2. fázis

x

1. fázis

14. ábra. A kvantitatív valós-idejű PCR reakció fázisai. 1. fázis: exponenciális fázis, ebben a szakaszban az amplifikáció hatékonysága nagy és konstans és ebben a fázisban határozhatók meg a CT értékek. Az x-szel jelölt zöld vonal a ’threshold’, vagyis az a küszöbérték, ahol az amplifikációt konstansnak vesszük, és ami alapján a CT értékeket meghatározzuk. 2. fázis: lineáris fázis, ebben a szakaszban az amplifikáció hatékonysága csökken, mert a reakció néhány komponensének a koncentrációja a kritikus érték alá esik. 3. fázis: plató fázis, ebben a szakaszban a PCR reakció leáll. A képen 4 Richter transzformációt mutató minta AID amplifikációs görbéi láthatók 3-3 párhuzamos futással, belső kontrollok nélkül. Az ábra csak demonstratív jellegű.

37

Az eredményül kapott CT értékekkel úgy dolgoztunk tovább, hogy először kiszámoltuk az egy mintához tartozó 3 párhuzamos reakcióból származó CT értékek átlagát az AID-re (CT AID(minta)) és a GAPDH-ra (CT GAPDH(minta)) vonatkozóan és ezeket az átlagolt CT értékeket használtuk fel a relatív expressziós szintek meghatározásához a ΔΔCT módszer alkalmazásának segítségével. Kiszámoltuk a negatív kontrollok CT átlagértékeinek átlagát is az AID-re (CT AID(kontroll)) és a GAPDH-ra (CT GAPDH(kontroll)) vonatkozóan, és a minták mRNS expressziós értékeit ezekhez az értékekhez viszonyítottuk. Az alkalmazott formula a 2-ΔΔCT, e képlet segítségével számolható ki a target mennyisége a kontrollhoz képest a belső kontrollra normalizálva. Lépésenként: ΔCT(minta) = CT AID(minta) - CT GAPDH(minta) ΔCT(kontroll) = CT AID(kontroll) - CT GAPDH(kontroll) ΔΔCT = ΔCT(minta) - ΔCT(kontroll) 2-ΔΔCT = 2- (ΔCT(minta) - ΔCT(kontroll)) A képletekkel kiszámolt expressziós érték azt fejezi ki, hogy az adott mintában az AID mRNS expressziója hányszorosa a kontroll mintákban mérthez képest. A GAPDH-ra való normalizálásnak az a lényege, hogy elkerüljük az egyes minták közötti esetleges templát bemérési különbségekből, illetve az RNS degradációból adódó expressziós különbségek valós értékként kezelését. 2.5 Statisztikai analízis Az AID mRNS expressziós értékeket statisztikai szempontból a Student-féle kétszélű heteroszcedasztikus t-próba segítségével analizáltuk. Az expressziós értékek közötti különbségeket statisztikailag szignifikánsnak vettük, ha a p érték kisebb volt, mint 0.05.

38

3. Az IgVH, c-MYC, Pax-5 és RhoH gének szekvencia vizsgálata Az IgVH, a c-MYC (exon 1 és exon 2), a Pax-5 és a RhoH gének mutációs státuszát a 12 CLL-es (1-12. esetek), 13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s (22-29. esetek) mintában direkt szekvenálással vizsgáltuk meg. A munka menetét a 15. ábra foglalja össze.

DNS izolálás

PCR

szekvenálás

15. ábra. A mutációk analíziséhez először a tumor szövetekből DNS-t izoláltunk klasszikus kisózásos módszerrel, majd az általunk vizsgálni kívánt gén régiókat PCR technikával amplifikáltuk. A megtisztított termékeket kapilláris elektroforézissel megszekvenáltuk, majd a kapott szekvenciákat kielemeztük. Rövidítések: PCR, polimeráz láncreakció.

3.1 DNS izolálás A genomiális DNS-eket fagyasztott nyirokcsomó mintákból vagy PV-ek mononukleáris sejtjeiből izoláltuk a hagyományos kisózásos módszerrel, telített NaCl felhasználásával

110

. A PV minták esetében először a teljes vérhez hozzáadtunk

2 térfogat hemolizáló oldatot (ammónium-klorid, EDTA, kálium hidrogénkarbonát) és alaposan összekevertük, majd a kémcsöveket 1000 rpm fordulatszámmal szobahőmérsékleten 15 percig centrifugáltuk. A felülúszó leöntése után a sejteket 1 ml PBS oldatban megmostuk. A kémcsöveket ismét centrifugáltuk (25 oC, 1000 rpm, 10 perc), majd a felülúszót leöntöttük. A fagyasztott nyirokcsomókból először 15 darab, 30 μm vastagságú metszetet készítettünk mikrotommal. A mononukleáris sejteket és a fagyasztott metszeteket egyenként 3 ml mag-lízis pufferben (10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl és 2 mM EDTA) szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz hozzámértünk 125 µl 20 %-os SDS-t (natrium-dodecil-szulfát), 52 µl proteináz-K oldatot (1 mg proteináz-K, 2 mM EDTA) és 423 µl steril desztillált vizet,

39

majd az elegyet egy éjszakán át 37 oC-on rotálással inkubáltuk azért, hogy az emésztés teljes legyen. Másnap az elegyhez 1 ml telített, 6 mM-os NaCl oldatot kevertünk, majd a csöveket 20 percig centrifugáltuk 2500 rpm fordulatszámmal, szobahőn. A felülúszót egy másik kémcsőbe öntöttük és hozzámértünk kétszeres térfogatú abszolút alkoholt, amelyben a DNS kicsapódott. A DNS precipitátumot steril injekciós tű segítségével áthelyeztük egy másik kémcsőbe és kétszer megmostuk 80 %-os etanolban, majd áthelyeztük egy steril eppendorf csőbe és hozzámértünk 150 µl TE oldatot (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA). Az eppendorf csöveket 1 órán át 55 oC-os vízfürdőbe helyeztük azért, hogy a DNS a TE oldatban tökéletesen feloldódjon, majd megmértük a DNS koncentrációját 260 nm hullámhosszon fotométer (Gene Quant II, Cambridge, UK) segítségével. Az izolált DNS mitákat 4 oC-on tároltuk a további felhasználásig. 3.2 Az IgVH, c-MYC, Pax-5 és RhoH gének PCR amplifikációja A célgének PCR amplifikációját a Triple Master PCR System kit (Eppendorf, Hamburg, Németország) segítségével végeztük. Ez a kit egy másolási hűséggel rendelkező ún. „low error” DNS-polimeráz enzimet tartalmaz, amely a megfelelő szekvencia analízist lehetővé teszi. Minden esetben két párhuzamos reakciót futtattunk, amelyek a PE 2400 Gene Amp (Perkin-Elmer, USA) PCR készülékben játszódtak le. Valamennyi PCR reakcióhoz 100 ng DNS templátot használtunk 25 µl végtérfogatban. A reakcióelegy összetétele a 9. táblázatban látható.

9. táblázat. A PCR reakciók összetétele. Összetevők

mennyiség/cső

High fidelity puffer (10x)

2 µl

dNTP mix (2 mM)

2 µl

forward primer (10 µM)

1 µl

reverse primer (10 µM)

1 µl

Triple Master polimeráz (5U/µl)

2 µl

DNS templát

100 ng

desztillált víz

25 µl-ig

40

A PCR amplifikációs reakciók hőprofiljait a 10. és a 11. táblázat mutatja be. A reakciók anellációs lépésének hőmérsékletét a primerek olvadáspontjának figyelembevételével határoztuk meg. Ennek megfelelően a PCR amplifikációk során az anellációs hőmérséklet az IgVH1, 2, 3, 6, PAX-5, c-MYC exon-1 és RhoH esetében 58 °C, IgVH4 és 5 esetében 55 °C és a c-MYC exon-2 esetében 68 °C volt.

10. táblázat. Az IgVH génamplifikáció hőprofilja lépés

hőmérséklet

idő

ciklus

kezdeti denaturáció

95 oC

10 perc

-

denaturáció

95 oC

40 m.perc

anelláció

55/58 oC

40 m.perc

extenzió

72 oC

50 m.perc

végső extenzió

72 oC

10 perc

35

-

Rövidítések: m.perc, másodperc

11. táblázat. A c-MYC, a Pax-5 és a RhoH gének amplifikációs reakciójának hőprofilja lépés

hőmérséklet o

94 C

kezdeti denaturáció

o

idő

ciklus

2 perc

-

94 C

30 m.perc

anelláció

o

58/68 C

45 m.perc

extenzió

72 oC

50 m.perc

végső extenzió

72 oC

7 perc

denaturáció

35

-

Rövidítések: m.perc, másodperc

Az IgVH gének PCR amplifikációjához sense primerként az IgH gén 1. ″framework″ (FR1) régiójára tervezett IgVH géncsaládokra (VH1-6) specifikus primereket, és antisense primerként az IgH variábilis régiójának kapcsolási részére (JH) tervezett konszenzus primert használtuk

111

. A PCR reakció során a primerpárok

segítségével kb 300-400 bázispár hosszúságú termékeket kaptunk az adott mintában detektálható IgVH géncsalád típusától függően. A PCR termék tartalmazta az Ig gén FR1, CDR1, FR2, CDR2 és FR3 régióit. A primerek szekvenciája és olvadáspontja a 12. táblázatban található.

41

12. táblázat. Az IgVH gének amplifikációjánál és szekvenálásánál alkalmazott primerek szekvenciája és olvadáspontja gén régió VH1-FR1 VH2-FR1 VH3-FR1 VH4-FR1 VH5-FR1 VH6-FR1 JH consensus

primer szekvencia 5’-GGC CTC AGT GAA GGT CTC CTG CAA G-3’ 5’-GTC TGG TCC TAC GCT GGT GAA ACC C-3’ 5’-CTG GGG GGT CCC TGA GAC TCT CCT G-3’ 5’-CTT CGG AGA CCC TGT CCC TCA CCT G-3’ 5’-CGG GGA GTC TCT GAA GAT CTC CTG T-3’ 5’-TCG CAG ACC CTC TCA CTC ACC TGT G-3’ 5'-CTT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C-3'

olvadáspont 63 oC 63 oC 66 oC 65 oC 60 oC 63 oC 54 oC

A c-MYC, Pax-5 és RhoH gének meghatározott szakaszainak PCR amplifikációjához a primereket irodalmi adatok alapján választottuk ki 86. A c-MYC génre specifikus két primerpárral egy 1300 bp (c-MYC exon 1) illetve egy 580 bp (c-MYC exon 2) hosszúságú szakasz amplifikálását végeztük el. A Pax-5 génre specifikus primerpár egy 859 bp hosszú régiót zár közre. A RhoH gén esetében egy 844 bp hosszúságú szakaszt

amplifikáltunk.

A

reakciókhoz

használt

primerek

szekvenciája

és olvadáspontja a 13. táblázatban látható. A lezajlott PCR reakció után a termékeket 4 oC-on tároltuk a további felhasználásig.

13. táblázat. A c-MYC, Pax-5 és RhoH gének amplifikációjánál és szekvenálásánál alkalmazott primerek szekvenciája és olvadáspontja gén régió c-MYC exon-1 c-MYC exon-2 PAX-5 RhoH

primer szekvencia 5´-CAC CGG CCC TTT ATA ATG CG-3´ 5´-CGA TTC CAG GAG AAT CGG AC-3´ 5´-CTT TGT GTG CCC CGC TCC AG-3´ 5´-GCG CTC AGA TCC TGC AGG TA-3´ 5´-CCC AGA GAC TCG GAG AAG CA-3´ 5´-AAG AGC TGA AAT GTC GCC GCC G-3´ 5´-CCT TAA AAG TAT TTC TTT GGT GTC-3´ 5´-AAC TCT TCA AGC CTG TGC TG-3´

42

olvadáspont 62 oC 59 oC 66 oC 61 oC 60 oC 64 oC 55 oC 55 oC

3.3 A PCR termékek detektálása A

PCR

reakciót

követően

az

amplifikált

termékek

detektálása

agaróz-gélelektroforézissel történt. A termékek futtatásához 2 %-os, ethidium-bromidot tartalmazó agaróz gélt készítettünk (2 g agaróz, 100 ml 1x TAE puffer, 1,7 µl ethidium-bromid), futtató pufferként 1x TAE oldatot használtunk (10x TAE törzsoldat: 0,4 M TRIS, 0,2 M ecetsav, 0,01M EDTA). A futás 120 V feszültségen zajlott 50 percig. Az elektroforézis után a migrációs mintázat detektálásához a Kodak 4400 MM (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA) géldokumentációs rendszert használtuk. 3.4 A PCR termékek tisztítása A tisztítási lépésre azért van szükség, hogy a reakcióelegyből eltávolítsuk a feleslegben megmaradt és továbbiakban zavaró reakció komponenseket (dNTP-k, primerek, nem specifikus PCR termékek). A PCR termékek tisztítását a Montage PCR Filter Device (Millipore, Billerica, USA) kit segítségével végeztük el, a gyártó utasításainak megfelelően. A kitben található filteres csövet egy gyűjtőcsőbe helyeztük és rámértünk 400 µl TE puffert, amelybe a tisztítandó PCR terméket (17 µl) is belemértük, majd a csövet 15 percig, 1000 g-vel szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A filteres csövet megfordítottuk és egy tiszta gyűjtőcsőbe helyeztük át, majd rámértünk 35 µl TE puffert. A csövet 2 percig, 1000 g-vel szobahőmérsékleten centrifugáltuk, melynek során a membránon fennmaradt PCR termékek a gyűjtőcsőbe eluálódtak. A tisztítási lépés után a PCR termékek meglétét agaróz-gélektroforézissel ellenőriztük a 3.3 fejezetben leírtakkal megegyezően. A tisztított PCR termékeket a további felhasználásig 4 oC-on tároltuk. 3.5 A szekvenáló reakció A szekvenáló reakcióhoz (úgynevezett cycle sequencing) a Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems) kitet használtuk a gyártó utasításainak megfelelően, és a tisztított PCR termékek direkt szekvenálását mindkét irányból elvégeztük. A cycle sequencing reakció egy egyirányú PCR reakció, amely a Sanger-féle dideoxi elven alapul. A 4 féle dideoxi nukleotid különböző fluoreszcens festékekkel jelölt. A reakció lényege, hogy

43

a DNS-polimeráz enzim a 2’-3’ dideoxi nukleotidokat is be tudja építeni a növekvő láncba, de ahová beépül egy dideoxi analóg, ott terminálódik a DNS szintézis. A lánctermináció oka az, hogy a dideoxi nukleotidnak nincs 3’-OH csoportja, így a következő nukleotid nem tud foszfátkötéssel hozzákapcsolódni. Ennek megfelelően a reakció során különböző hosszúságú DNS fragmentek keletkeznek, melyek utolsó eleme egy floureszcens festékkel jelölt dideoxi nukleotid. A cycle sequencing reakció a MiniCyclerTM (MJ Research Inc., USA) készülékben zajlott. A reakció pontos összetétele és az amplifikáció hőmérsékleti paraméterei a 14. illetve a 15. táblázatban láthatóak. A szekvenáláshoz is a 12. és 13. táblázatban feltüntetett primereket használtuk. A cycle sequencing reakció után az elegyre (5 µl) rámértünk 12 µl steril desztillált vizet, és a mintákat a további felhasználásig 4 oC-on tároltuk.

14. táblázat. A szekvenáló reakció összetétele összetevők

mennyiség/cső

BigDye Terminator

1 µl

BigDye Puffer

1 µl

primer (10 µM)

1 µl

PCR termék

2 µl

15. táblázat. A szekvenáló reakció hőprofilja lépés

hőmérséklet o

idő

ciklus -

kezdeti denaturáció

94 C

2 perc

denaturáció

94 oC

30 m.perc

o

anelláció

51/55 C

15 m.perc

extenzió

60 oC

4 perc

Rövidítések: m.perc, másodperc

44

25

3.6 A szekvenáló reakció termékeinek tisztítása A tisztítási lépéssel a reakcióelegyből eltávolításra kerültek a feleslegben megmaradt és a kapilláris elektroforézist zavaró komponensek. A cycle sequencing termékek tiszítását a DyeEx Spin 2.0 kittel (Qiagen, USA) végeztük el a gyártó utasításai szerint. A speciális oszlopokat (Spin Column) először vortexeltük, a buborékoktól mentesítettük és gyűjtőcsövekbe helyeztük, majd a csöveket centrifugáltuk 3 percig, 750 g-vel szobahőmérsékleten. Ezután az oszlopokat tiszta eppendorf csövekbe helyeztük, rámértük a 17 µl-re kiegészített szekvenáló reakció terméket, majd a csöveket ismét 3 percig, 750 g-vel szobahőmérsékleten centrifugáltuk. Az eluátum tartalmazta a tisztított cycle sequencing reakció terméket. A termékeket a további felhasználásig 4 oC-on tároltuk. 3.7 Kapilláris elektroforézis és szekvencia analízis A minták futtatását és a szekvenciák leolvasását az ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) genetikai analizátor segítségével végeztük el a gyártó utasításainak megfelelően. A nyers adatok értékeléséhez a Sequencing Analysis 3.7 illetve a BioEdit programokat használtuk. A futtatáshoz a tisztított cycle seqencing reakció termékeket 20 μl TSR (template suppresion reagent) reagensben vettük fel és alapos összekeverés után szekvenáló csövekbe pipettáztuk. A mintákat 95 oC-on másfél percig denaturáltuk, majd azonnal jégre helyeztük. A minták ezután készen álltak a futtatásra. A futtatás során a készülék kapilláris elektroforézissel analizálja a fluoreszcensen jelölt DNS fragmenteket. A fragmentek egy ún. „separation polymer” anyaggal telt kapillárisban haladnak a katódtól az anód felé. Amikor a DNS fragmentek elérik a detektor-ablakot a kapillárisban, akkor lézer fény gerjeszti a fluoreszcens festéket, és az emittált fény hullámhossza alapján különíti el a program az adott fluorokrómnak megfelelő bázist. A

kapott

IgVH

gén

szekvenciákat

az

IMGT/V-QUEST

(International

ImMunoGeneTics Information System, http://imgt.cines.fr) program segítségével hasonlítottuk az egészséges donoroktól származó germline IgVH gén szekvenciákhoz. Az analízis során megkerestük a mintában előforduló IgVH génhez legközelebb álló germline gént. A vizsgálat alkalmas az egy adott betegből származó CLL-es és RT-s minták klonális kapcsolatának igazolására is. Abban az esetben, ha a VH-D-JH

45

rekombináció

egy

adott

beteg

mintapárjaiban

megegyezik,

tehát

azonos

az immunglobulin nehézlánc gén, az a két betegség közös klonális eredetére utal. A c-MYC, Pax-5 és RhoH gének szekvenciáit az NCBI (National Centre for Biotechnology Information) GenBank adatbázisban található, egészséges donoroktól származó referencia szekvenciákhoz hasonlítottuk. Kizártuk a mutáció analízisből a már korábban leírt polimorfizmusokat, valamint azokat a mutációkat, amelyek több különálló esetben is előfordultak - ezeket polimorfizmusoknak tekintettük, mivel szomatikus

eredetük

valószínűsége

rendkívül

alacsony.

A

mutációk

az elektroferogramokon kettős csúcsok formájában jelentkeztek, vagyis a vad és a mutáns típust reprezentáló bázisok egyszerre voltak láthatóak. Ez egyrészt azzal magyarázható, hogy a mutációk heterozigóta formában voltak jelen, másrészt azzal, hogy a tumorsejtek között jelen voltak mutációt nem hordozó normál sejtek is. A mutációk jelenlétét két párhuzamos PCR termékből való kimutatással igazoltuk, ezzel kizártuk azt, hogy az enzim esetleges másolási hibájából adódó változást valós mutációnak tekintsük. Egy adott génnél az átlagos mutációs frekvenciák számolása során csak a mutációkat hordozó eseteket vettük figyelembe. Az alább látható képlet szerint számoltunk, a mutációk számát (n) elosztottuk a megszekvenált bázispárok számával (N), mindkét allél figyelembevételével.

mutációs gyakoriság / 100 bp =

46

n 2N

x 100

VI. EREDMÉNYEK 1. Az aktiváció-indukált citidin deamináz mRNS expressziójának vizsgálata kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakcióval Az

AID

mRNS

expresszió

analíziséhez

12

CLL-es

(1-12.

esetek),

13 RT-s (9-21. esetek) és 8 PLT-s (22-29. esetek) esetben végeztünk kvantitatív RT-PCR reakciót. Negatív illetve pozitív kontrollként 8 egészséges önkéntes perifériás véréből izolált mononukleáris sejtjeinek, és 2 humán reaktív nyirokcsomóból lézer-mikrodisszekcióval szeparált CG B-sejteknek az AID mRNS expressziós szintjeit használtuk. Összehasonlításképp 12 „de novo” DLBL-es minta AID mRNS expressziós szintjeit is analizáltuk. Az AID mRNS expressziós eredmények relatív expressziós értékekként a 16. ábrán láthatók. A vártnak megfelelően az AID mRNS expressziós szintek a CG-kben magasak, míg az egészséges önkéntesek PV-ében alacsonyak voltak. Habár látszólag van különbség az egészséges önkéntesek PV-ében és a CLL-es esetekben kapott AID mRNS expressziós értékek között (16. ábra), a Student-féle kétszélű t-próba eredménye alapján ez a különbség nem szignifikáns (p=0.05709). A transzformálódó és a nem transzformálódó CLL-es esetek AID mRNS expressziós szintjei között nem volt különbség (p=0.38524). Az

AID

mRNS

expressziós

értékek

szignifikánsan

magasabbak

voltak

az RT-s (p=0.00063) és a PLT-s (p=0.04723) esetekben a CLL-es esetek expressziós értékeihez viszonyítva. Annál a 4 esetnél (9-12. esetek), amelyeknél a transzformáció előtti CLL-es és a transzformáció utáni RT-s minta is elérhető volt qRT-PCR vizsgálatra, az RT-s mintákban az AID mRNS expressziós szintek 5.5-976-szor magasabbak voltak a CLL-es mintákban mért értékekhez képest. A „de novo” DLBL-es és az RT-s mintákban az AID mRNS expressziós értékek nem mutattak különbséget (p=0,16).

47

AID/GAPDH

4

3

2

1

0

10

3

60

2 (CLL)

100

CLL RT

PLT DLBL

p=0,00063

19 (RT)

20 (RT)

21 (RT)

18 (RT)

17 (RT)

16 (RT)

ASHM

400

p=0,047

122

36 ( DLBL)

37 ( DLBL) 31 (DLBL) 32 (DLBL) 33 (DLBL)

30 (DLBL) 29 ( PLT)

27 (PLT)

28 (PLT) 26 (PLT)

24 (PLT)

25 (PLT)

2 3 (PLT)

22 (P LT)

ND

ND 7 (CLL)

8 (CLL)

5 (CLL) 6 (CLL)

3 (CLL) 4 (CLL)

1 (CLL)

PV

CG

CG

AID mRNS expressziós expression units szintek

ND, nem detektált; PLT, prolymphocytás transzformáció; PV, perifériás vér; RT, Richter transzformáció

hipermutáció; CG, centrum germinatívum; CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; DLBL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; GAPDH, glyceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz;

a tanulmányban megvizsgált 8 egészséges perifériás vérminta expressziós értékeit. Rövidítések: AID, aktiváció-indukált citidin deamináz; ASHM, aberráns szomatikus

és PLT-s esetekben. Az AID relatív expressziós értékeit logaritmikus skálán ábrázoltam. Az egészséges kontrollok AID expressziós értékeit ábrázoló 2 oszlop csak reprezentálja

16. ábra. Az AID mRNS expressziójának és a c-MYC, Pax-5 és RhoH génekben detektált mutációk számának összehasonlítása transzformáció nélküli CLL-es, valamint RT-s

RhoH genes

eset (minta )

AID/GAPDH - 10000

mutációk száma of mutations number and inc-MYC, c-MYC, Pax5 a Pax-5

ND

(CLL) 9 (R ) T (CLL) 10 ( RT) (CLL) 11 (RT) (CLL) 12 (R ) T (CLL) 13 (R ) T (CLL) 14 (R ) T (CLL) 15 (RT)

1000

és RhoH génekben

CG PV

34 (DLBL) 35 (DLBL)

10000

PV

48

2. A c-MYC, a Pax-5 és a RhoH gének szekvencia vizsgálata A c-MYC, a Pax-5 és a RhoH génekben detektált mutációk típusa és eloszlása a 16. táblázatban és a 16. ábrán került bemutatásra; a mutációk általános jellemzőit a 17. táblázatban foglaltam össze. A 17. ábrán egy mutációt hordozó minta elektroferogramja látható. A c-MYC gén szekvencia variánsai a „major” P1/P2 promotertől (c-MYC exon 1) és/vagy a „minor” P3 promotertől (c-MYC exon 2) kezdődő régiókban helyezkedtek el. A RhoH génben levő mutációk a nemkódoló szakaszokban oszlottak el, beleértve az 1-es intron 5’ részét. A Pax-5 génben detektált mutációk az 1B exon 3’ részén (rövid szakasz) és az 1-es intronban helyezkedtek el. A 15 CLL-es mintában összesen 4 mutációt detektáltunk, amelyek közül 3 a nem-transzformálódó (3., 4. és 6. esetek) és 1 a transzformálódó (14. eset) esetekben volt. A 13 RT-s mintában összesen 32 és a 8 PLT-s mintában összesen 16 mutációt találtunk. Minden mutáció szubsztitúciónak bizonyult egy mutációt kivéve, ami inzerció volt. A megfigyelt 51 szubsztitúció közül 23 tranzíciót és 28 transzverziót találtunk. A tranzíció-transzverzió arány a CLL-ekben 1.0, az RT-kben 0.6 és a PLT-kben 1.5 volt. A nukleotid cserék mintázata a G+C/A+T arányra vonatkozóan 1.0 volt a CLL-ekben, 1.54 az RT-kben és 2.0 a PLT-kben. Az RGYW motívum érintettsége a CLL-ek 25 %-ában, az RT-k 38 %-ában és a PLT-k 19 %-ában volt megfigyelhető. A transzformált esetek átlagos mutációs frekvenciája a 4 vizsgált gén régióra vonatkozóan a 0.04/100 - 0.11/100 bázispár tartományba esett. A CLL-es esetekben csak a c-MYC gén, de az RT-s és a PLT-s esetekben mind a 3 vizsgált gén hordozott mutációt. A mutált gének száma a CLL-es esetekben 0 és 1, az RT-s és PLT-s esetekben 1 és 3 közé esett. 7 esetben (9-15. esetek) a transzformáció előtti CLL-es és a transzformáció utáni RT-s minta is elérhető volt mutációs analízisre. Ebben a csoportban csak egyetlen CLL-es minta (14. eset) hordozott egy szubsztitúciót (4552 A>G), amit a hozzátartozó RT-s mintában is kimutattunk. Ez az RT-s minta egy addícionális mutációt is szerzett. Az összes többi RT-s minta is 1-4 mutációt hordozott.

49

16. táblázat. A c-MYC, Pax-5 és RhoH génekben talált mutációk eloszlása és típusa transzformáció nélküli krónikus lymphocytás leukaemiás, valamint Richter és prolymphocytás transzformációs esetekben Eset szám Minta

c-MYC exon 1 pozíció (típus)

c-MYC exon 2 pozíció (típus)

Pax-5 pozíció (típus)

RhoH pozíció (típus)

1 2 3 4 5 6 7 8

CLL CLL CLL CLL CLL CLL CLL CLL

— — — 2510 (C>T) — — — —

— — 4722 (G>T) — — 4591 (A>C) — —

— — — — — ND — ND

— — — — — — — —

9

CLL RT

— —

— —

— 714 (G>T)

— 354 (A>C), 680 (A>C), 950 (T>C)

10

CLL RT

ND —

— 4756 (C>G)

— 940 (G>A)

— 670 (G>A)

11

CLL RT

— —

— —

— ND

— 508 (G>C), 586 (A>C)

12

CLL RT

— 3258 (C>A)

— —

ND 971 (G>A)

ND —

13

CLL RT

— —

— 4582 (C>A), 4794 (A>C)

— —

— 621 (T>A)

14

CLL RT

— 3511 (G>A)

4552 (A>G) 4552 (A>G)

— —

— —

15

CLL RT

— —

— —

— 953 (C>T), 975 (G>A)

— —

16 17 18 19 20 21

RT RT RT RT RT RT

— — — — — —

— — 4820 (G>T) — 4993 (A>G) 4681 (A>T)

1139 (C>T) — 729 (G>A) 828 (C>A), 852 (G>T), 1087 (C>A) 720 (A>T) 911 (C>T)

— 467 (A>C), 873 (C>G), 982 (A>C) — 730 (A>T) — —

22 23 24 25 26 27 28 29

PLT PLT PLT PLT PLT PLT PLT PLT

3030 (G>C), 3184 (T>A) 3512 (A>G) 2599 (C>T), 3425 (G>A) 3501 (T>G) 2616 (C>T) 3472 (T>G) — 2646 (C>G)

— — 4982 (T>C) — — — — —

— 1248 (C>T) — 1262 (C>T) — 829 (C>A) 1026 (C>T) —

404 (G ins) — 882 (G>A) — — — — —

Rövidítések: CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; ND, nem determinált; PLT, prolymphocytás transzformáció; RT, Richter transzformáció

50

17. táblázat. A c-MYC, Pax-5 és RhoH génekben detektált mutációk jellemzői transzformáció nélküli krónikus lymphocytás leukaemiás, valamint Richter és prolymphocytás transzformációs esetekben szubsztitúciók

Inzerciók és deléciók

Tranzíciók/ transzverziók

G+C/A+T

RGYW (%)

c-Myc exon 1 CLL 0.04 (0.04-0.04) RT 0.04 (0.04-0.04) PLT 0.05 (0.04-0.08)

1 2 9

0 0 0

1/0 1/1 (1.0) 4/5 (0.8)

1/0 3/0 5/4

0 (0) 1 (50) 2 (22)

c-Myc exon 2 CLL 0.09 (0.09-0.09) RT 0.11 (0.09-0.18) PLT 0.09 (0.09-0.09)

3 7 1

0 0 0

1/2 (0.5) 2/5 (0.4) 1/0

1/2 3/4 0/1

1 (33) 4 (57) 1 (100)

Lókusz

Mutációk/ 100 bp (tart.) #

Pax-5 CLL RT PLT

0 0.08 (0.06-0.17) 0.06 (0.06-0.06)

0 12 4

0 0 0

0/0 7/5 (1.4) 3/1 (3.0)

0/0 11/1 4/0

0 (0) 5 (42) 0 (0)

RhoH CLL RT PLT

0 0.11 (0.06-0.19) 0.06 (0.06-0.06)

0 11 1

0 0 1

0/0 2/9 (0.22) 1/0

0/0 3/8 1/0

0 (0) 2 (18) 0 (0)

Minden gén CLL RT PLT

— — —

4 32 15

0 0 1

2/2 (1.0) 12/20 (0.6) 9/6 (1.5)

2/2 (1.0) 20/13 (1.54) 10/5 (2.0)

1 (25) 12 (38) 3 (19)

Rövidítések: CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; PLT, prolymphocytás transzformáció; RT, Richter transzformáció; tart., tartomány; tart., tartomány; # a mutációs frekvenciák kiszámítása a teljes vizsgált régióra kiterjedően és csak a mutált esetekre vonatkozóan történt, mindkét allélt figyelembe véve; RGYW azon mutációk számát mutatja, amelyek érintik ezt a mutációs motívumot (R=A, G; Y=C, T; W=A, T)

51

17. ábra. A 29-es PLT-s esetnél a c-MYC génben detektált C>G mutáció.

3. Az IgVH gének szekvencia vizsgálata Az IgVH gének mutációs frekvenciáját az 1. táblázat foglalja össze. Az eseteket 2 csoportra osztottuk az alapján, hogy mekkora a nukleotid eltérések száma a germline génekhez képest. Mutálatlanok azok a minták, amelyekben az adott szekvencia legalább 98 %-os homológiát mutatott a VH gének konszenzus szekvenciájával (1., 3., 7., 9-21. és 24-28. esetek). Mutáltnak tekintettük azokat a mintákat, amelyek esetében a VH gének konszenzus szekvenciájával való egyezés kisebb, mint 98 % (2., 4., 5. és 8. esetek)

14

. A kontroll CLL csoportban, ahol a CLL-ek nem

transzformálódtak magasabb malignitású lymphomába, 4 mutált és 3 mutálatlan eset volt. Minden transzformálódó CLL-es, RT-s és PLT-s eset a mutálatlan csoportba tartozott. Az IMGT/V-QUEST program segítségével elemzett szekvenciák közül egy mutálatlan és egy mutált példát mutat be a 18. és a 19. ábra. Az IgVH gének szekvencia analízisével bebizonyosodott az is, hogy minden CLL-RT mintapárban (9-15. esetek) azonos az IgVH gén, vagyis a betegségek klonális eredete azonos (18. táblázat).

52

18. táblázat. Az IgVH gén mutációs profilja transzformáció nélküli krónikus lymphocytás leukaemiás, valamint Richter és prolymphocytás transzformációs esetekben Eset szám

Minta

IgVH gén A legközelebbi

Az összes

Szekvencia

germline gén

mutációk száma

homológia (%)

1 2 3 4 5 6 7 8

CLL CLL CLL CLL CLL CLL CLL CLL

VH1-69*01 VH3-23*01 VH3-21*02 VH3-30*18 VH3-33*01 NA VH1-2*04 VH4-61*01

2 20 3 9 8 — 0 8

99,1 90,2 98,5 95,6 96,0 — 100 96,1

9

CLL RT

VH4-59*01 VH4-59*01

2 2

99,0 99,0

10

CLL RT

VH3-33*01 VH3-33*01

1 1

99,5 99,5

11

CLL RT

VH4-31*04 VH4-31*04

2 2

99,0 99,0

12

CLL RT

VH3-11*01 VH3-11*01

1 1

99,5 99,5

13

CLL RT

VH7-4-1*02 VH7-4-1*02

1 1

99,5 99,5

14

CLL RT

VH3-48*02 VH3-48*02

0 0

100 100

15

CLL RT

VH1-69*01 VH1-69*01

2 2

99,0 99,0

16 17 18 19 20 21

RT RT RT RT RT RT

VH1-24*01 VH4-39*05 VH3-33*01 VH1-69*01 VH4-34*02 VH4-39*01

0 0 1 2 0 0

100 100 99,5 99,0 100 100

22 23 24 25 26 27 28 29

PLT PLT PLT PLT PLT PLT PLT PLT

NA NA VH4-b*01 VH1-69*01 VH1-69*01 VH3-66*04 VH3-30*18 NA

— — 0 2 2 2 1 —

— — 100 99,0 99,0 99,0 99,5 —

Rövidítések: CLL, krónikus lymphocytás leukaemia; NA, nem amplifikált; PLT, prolymphocytás transzformáció; RT, Richter transzformáció

53

18. ábra. Az IMGT/V-QUEST program segítségével kapott eredmény a 16-os RT-s esetben. A mintához legközelebb álló Ig germline gén a VH1-24*01. A minta nem tér el ettől a szekvenciától egy bázisban sem, vagyis mutálatlan. A beadott szekvenciát („input”) kékkel, a hozzá legközelebb álló germline szekvenciát narancssárgával emeltem ki. A „-” vonal a bázisok azonosságát jelzi.

54

19. ábra. Az IMGT/V-QUEST program segítségével kapott eredmény a 4-es CLL-es esetben. A mintához legközelebb álló Ig germline gén a VH3-30*18. A minta 9 bázisban tér el ettől a szekvenciától, vagyis mutált. A beadott szekvenciát („input”) kékkel, a hozzá legközelebb álló germline szekvenciát narancssárgával emeltem ki. A „-” vonal a bázisok azonosságát jelzi, az eltéréseket piros keretekkel emeltem ki.

55

VII. MEGBESZÉLÉS Jelen tanulmányban az aktiváció-indukált citidin deamináznak és az aberráns szomatikus hipermutációnak a CLL Richter és prolymphocytás transzformációjának kifejlődésében betöltött szerepét vizsgáltuk. A vizsgálathoz az AID RT-PCR-rel történő analízisét és a c-MYC, a Pax-5 és a RhoH gének mutációs státuszának analízisét végeztük el transzformáció nélküli CLL-es, RT-s és PLT-s esetekben. Eredményeink arra utalnak, hogy a magas AID mRNS expresszió és az ASHM összefügghet a CLL-es betegek Richter és prolymphocytás transzformációjával. 107, 108

Korábbi közleményekkel összhangban

, a tanulmányunkban megvizsgált

minden CLL-es mintában detektálható volt az AID mRNS expressziója. Az expressziós értékek

jóval

a

normál

CG

B-sejtek

expressziós

szintjei

alatt

maradtak.

A transzformációt nem mutató és a végül magasabb malignitású lymphomába transzformálódó CLL-es esetek az AID-et azonos mértékben expresszálták. Érdekes módon az RT-s és a PLT-s esetekben is szignifikánsan magasabb volt az AID mRNS expresszió a CLL-ek expressziójához viszonyítva, ezek az expressziós szintek

elérték

a

„de

novo”

DLBL-ek

AID

mRNS

expressziós

szintjét.

A transzformációval összefüggő AID expresszió emelkedés annál a 4 esetnél is kimutatható volt, ahol az azonos klonalitású CLL és transzformált DLBL minták is elérhetők voltak expressziós vizsgálatra. Ezekben az esetekben a CLL-ek AID mRNS expressziója 5.5-976-szorosára emelkedett a transzformált sejtekben. Habár az AID expresszió az egészséges CG B-sejtekre korlátozódik

90

és az AID

konstitutív expressziója elsősorban a CG eredetű lymphomákat jellemzi

103, 104

,

eredményeink azt bizonyítják, hogy az AID expresszió szignifikánsan megemelkedhet a daganatos B-sejt populáció klonális fejlődése során is, ami a CLL magasabb malignitású transzformációjához vezethet. A transzformált CLL-es esetekben detektálható emelkedett AID expresszió alternatív folyamatok szerepét feltételezi az RT és PLT kifejlődésében. Albesiano és mtsai

107

határhigításos módszerrel bebizonyították, hogy a CLL-es tumorsejt

populációban az AID expresszió heterogén és csak a sejtek egy kis része expresszál AID-et. Erre a megfigyelésre alapozva elképzelhető az is, hogy a transzformált

56

esetekben detektált magas AID expresszió az AID-et expresszáló CLL-es sejtek intenzív klonális szelekciója eredményeként alakul ki. Egy másik lehetséges elképzelés az, hogy a CLL transzformációja során olyan jelpályák aktiválódnak, amelyek az AID expresszióját fokozzák. Ezt az elképzelést támogatják azok a megfigyelések, melyek szerint a CLL-es sejtek AID expressziója megemelkedik a CD40 ligandhoz és az IL-4-hez kapcsolódó jelátviteli utak aktiválását követően

91, 92, 107

, továbbá az a megfigyelés is, miszerint a CLL-es sejteknek magas

az AID expressziós szintjük szöveti mikrokörnyezetben

112

. Mivel a CLL magasabb

malignitású lymphomába történő transzformációja leggyakrabban a nyirokcsomókban megy végbe, lehetséges az is, hogy a szöveti mikrokörnyezet szolgáltat olyan jeleket, amelyek az AID expresszióját fokozzák. A megváltozott szabályozást követő fokozott AID aktivitás különböző onkogének mutációját okozza, amely végül a CLL-es sejtek klonális fejlődéséhez vezet. Vizsgálataink során a transzformált CLL-es esetekben észlelt emelkedett AID expresszió alapján felmerült a kérdés, hogy vajon az AID általánosan szerepet játszik-e a tumor progresszió folyamatában és az alacsony malignitású lymphomák transzformációjában. A különböző kutatócsoportok által vizsgált korlátozott számú esetek ellentmondásos irodalmi adatokhoz vezettek. Egy tanulmányban a 7 megvizsgált follicularis lymphoma (FL) közül 3-ban a klinikai progresszió és a magasabb malignitású lymphomába történő transzformáció összefüggést mutatott az emelkedett AID expresszióval 104, ugyanakkor az FL DLBL-be történő transzformációja során nem mutatkozott

észrevehető

AID

expresszió

emelkedés

106

.

Eredményeinkkel

egyetértésben ezek a tanulmányok azt feltételezik, hogy az FL-es esetek egy részében az AID-nek szerepe lehet a tumor progresszióban. Jóllehet, a transzformált FL-es esetekben megfigyelt AID expresszió emelkedés hiánya nem jelenti szükségszerűen azt, hogy az AID-nek nincs szerepe a transzformációban, mivel az FL-ek alap AID expressziója általában magasabb a CLL-es esetekénél, és ez az AID expressziós szint talán elegendő ahhoz, hogy genom instabilitást és tumor progressziót idézzen elő 103. A DLBL-ek egy részében az ASHM gyakori előfordulását írták le

79, 85-88

,

ugyanakkor az indolens lymphomákban – beleértve a CLL-t – az ASHM ritkán figyelhető meg

79, 85-88

. Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy a CLL Richter

és prolymphocytás transzformációja összefüggést mutat-e az ASHM aktiválódásával, megvizsgáltuk a c-MYC, a Pax-5 és a RhoH gének mutációs státuszát transzformáció nélküli és RT-s vagy PLT-s CLL-es esetekben. 57

A korábbi közleményeknek megfelelően

79, 85-87

a CLL-es mintákban alacsony

mutációs frekvenciát detektáltunk a c-MYC, a Pax-5 és a RhoH génekben, támogatva ezzel azokat az eredményeket, miszerint az ASHM nem játszik szerepet a CLL kialakulásában, még azokban az esetekben sem, amik később agresszívebb betegségbe transzformálódnak. A „de novo” DLBL-es esetekhez hasonlóan a c-MYC, a Pax-5 és a RhoH gének az RT-s és a PLT-s esetekben több mutációt hordoztak. A meghatározott mutációs frekvencia, a nukleotid szubsztitúciók G+C/A+T túlsúlya és az RGYW motívum érintettsége is hasonlóak voltak ahhoz, amit korábban ASHM-ként írtak le 79, 85-88. A c-MYC, Pax-5 és RhoH gének transzformált CLL-ekben leírt mutációi arra engednek következtetni, hogy a transzformáció során az ASHM aktiválódik, de annak a lehetőségét sem lehet kizárni, hogy az ASHM a transzformáció után alakul ki a már transzformálódott magas malignitású lymphoma sejtekben. Azon 7 eset közül, amelyeknél a CLL-es és az azonos klonalitású RT-s minta is elérhető volt mutáció analízisre csak 1 CLL-ben volt 1 mutáció, ami a betegség transzformált stádiumában is megfigyelhető volt. E mutáción felül az RT-ben 1 újabb mutációt is detektáltunk, ami alapján feltételezhető, hogy az ASHM hozzájárult a transzformáció folyamatához. Ráadásul a transzformált CLL-es esetekben hiányzik a mutációk „ongoing” jellege, ami arra enged következtetni, hogy az ASHM számára csak egy rövid időszak állt rendelkezésre – talán éppen a transzformáció kifejlődésekor – és a mutációs mechanizmus a betegség transzformálódott stádiumában már inaktív volt. Kutatócsoportunk egy korábbi közleményével összhangban a transzformálódó CLL-ek, a transzformált RT-k és PLT-k IgVH génjei mutálatlanok voltak 60. Az IgVH gén szomatikus mutációs mechanizmusa tehát nem aktiválódott a CLL-ek magasabb malignitású lymphomába történő transzformációja során sem. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az SHM fiziológiás folyamata és az ASHM nem feltétlenül összekapcsolt események és az ASHM az Ig gének mutációitól függetlenül is fennálhat. Habár ez a tanulmány azt feltételezi, hogy az AID expresszió és az ASHM között van összefüggés a CLL magasabb malignitású lymphomába történő transzformációja során, mégis nehéz megállapítani, hogy melyik esemény indítja el a transzformációt, mivel a

transzformációval

kapcsolatos

aktivitásuk

időpontját

nem

lehet

könnyen

meghatározni. A lymphoma kialakulásának molekuláris eseményeiben az AID expresszió kezdeményező szerepét kimutatták transzgén egerekben, ahol az AID konstitutív

expressziója

pontmutációk

felhalmozódását 58

idézte

elő

különböző

onkogénekben 102, 113. Továbbá, a CLL-es B-sejtekben az Ig gének preswitch régiójában a mutációk megjelenését az AID expressziójának változtatásával indukálni lehet

91

.

Mindezen megfigyelések mellett nem zárhatjuk ki annak a lehetőségét, hogy a genetikailag megváltozott CLL sejtek egy része képességet szerez arra, hogy AID-et expresszáljon. E legutóbbi elképzelésnek a létjogosultságát támogatják azon „in vitro” kísérletek eredményei, ahol a CLL sejteknek csak egy részét lehetett AID expresszióra serkenteni 107, 108. Mindazonáltal ez a tanulmány újabb bizonyítékot nyújt arra, hogy az AID expresszió és az ASHM előfordulhatnak együtt, és feltételezi, hogy szerepük lehet a CLL magasabb malignitású lymphomába – RT, PLT – történő transzformációjában.

59

VIII. KÖVETKEZTETÉSEK

Az aktiváció-indukált citidin deamináz mRNS expressziója szignifikánsan magasabb a Richter és prolymphocytás transzformált esetekben a krónikus lymphocytás leukaemiás esetekhez viszonyítva. Az aberráns szomatikus hipermutáció aktív a Richter és prolymphocytás transzformált esetekben, míg a krónikus lymphocytás leukaemiás esetekben nem. Az IgVH gének mutációs státusza nem mutat összefüggést az aberráns szomatikus hipermutációval. Az aktiváció-indukált citidin deamináz expressziója és az aberráns szomatikus hipermutáció összefüggenek a krónikus lymphocytás leukaemia magasabb malignitású lymphomába történő transzformációjával.

60

IX. ÖSSZEFOGLALÁS

A krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) egy indolens B-sejtes non-Hodgkin lymphoma,

amely

magasabb

malignitású

lymphomába

transzformálódhat.

A transzformáció során kifejlődhet diffúz nagy B-sejtes lymphoma - másnéven Richter transzformáció

(RT)

-,

vagy

az

emelkedett

prolymphocyta

számmal

járó

prolymphocytás transzformáció (PLT). Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk, hogy az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) – amely a normál B-sejtek szomatikus hipermutációjához (SHM) nélkülözhetetlen – és az SHM hibás működése – másnéven aberráns

szomatikus

hipermutáció

(ASHM)

–

összefüggenek-e

a

CLL

transzformációjával, analizáltuk az AID mRNS expressziót valamint a c-MYC, a Pax5 és a RhoH gének mutációs státuszát 8 nem-transzformálódó CLL-es esetben és 21 RT vagy PLT esetben. A nem-transzformálódó és a transzformálódó CLL-es esetekben alacsony AID mRNS expressziós szinteket mértünk, és a c-MYC, a Pax5 és a RhoH gének mutációs frekvenciája is alacsony volt. A RT és PLT esetekben magas AID mRNS expressziós szinteket, és a c-MYC, a Pax5 és a RhoH génekben magas mutációs frekvenciát detektáltunk. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az AID mRNS expresszió és az ASHM összefüggenek a CLL magasabb malignitású lymphomába történő transzformációjával, és további bizonyítékot nyújtanak arra, hogy az AID expresszió és az ASHM aktiválódhat a B-sejtes lymphomák klonális fejlődése során.

61

X. SUMMARY

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is an indolent B-cell non-Hodgkin lymphoma (NHL) that may transform into higher-grade lymphoma. The transformation involves an increased number of prolymphocytic cells, termed prolymphocytic transformation (PLT) or the development of diffuse large B-cell lymphoma (DLBL), also referred to as Richter’s transformation (RT). To analyze whether activation-induced cytidine deaminase (AID) which is essential for somatic hypermutation (SHM) of normal B-cells, and malfunction of SHM termed aberrant somatic hypermutation (ASHM) are associated with higher-grade transformation of CLL, AID mRNA expression and the mutation pattern of c-MYC, Pax-5 and RhoH genes were analyzed in 8 cases of CLL without transformation and in 21 cases that showed RT or PLT. CLL cases which showed no transformation or eventually transformed into higher-grade lymphoma showed low levels of AID mRNA expression and low frequency of mutations of c-MYC, Pax-5 and RhoH genes. In both RT and PLT, high-levels of AID mRNA expression and high-frequency mutations of c-MYC, Pax-5 and RhoH genes were detected. These results indicate that AID expression and ASHM are associated with higher-grade transformation of CLL and provide further evidences that AID expression and ASHM may be activated during the clonal history of B-cell lymphomas.

62

XI. IRODALOMJEGYZÉK

1. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. Pathology and genetics of tumours of haemopoetic and lymphoid tissues. In: World Health Organisation Classification of Tumours. IARC Press: Lyon, 2001; 6. fejezet, 119-189. 2. Goorha S, Glenn MJ, Drozd-Borysiuk E, Chen Z. A set of commercially available fluorescent in-situ hybridization probes efficiently detects cytogenetic abnormalities in patients with chronic lymphocytic leukemia. Genet Med. 2004;6:48-53. 3. Glassman AB and Hayes KJ. The value of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 2005;158:88-91. 4. Matolcsy A, Udvardy M, Kopper L. Hematológiai betegségek atlasza. Medicina Könyvkiadó Rt.: Budapest, 2006; 10.1 fejezet, 222-231. 5. Abbott BL. Chronic lymphocytic leukemia: recent advances in diagnosis and treatment. Oncologist. 2006;11:21-30. 6. Wadhwa PD and Morrison VA. Infectious complications of chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol. 2006;33:240-249. 7. Hamblin TJ. Autoimmune complications of chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol. 2006;33:230-239. 8. Tsimberidou AM and Keating MJ. Richter syndrome: biology, incidence, and therapeutic strategies. Cancer. 2005;103:216-228. 9. Beers MH és Berkow R. MSD orvosi kézikönyv. Melania kiadó Kft.: Budapest, 2000; 949-953. 10. Wierda WG and O'Brien SM. Initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol. 2006;33:202-209.

63

11. Dohner H, Stilgenbauer S, Benner A, Leupolt E, Krober A, Bullinger L, Dohner K, Bentz M, Lichter P. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2000;343:1910-1916. 12. Dickinson JD, Smith LM, Sanger WG, Zhou G, Townley P, Lynch JC, Pavletic ZS, Bierman PJ, Joshi SS. Unique gene expression and clinical characteristics are associated with the 11q23 deletion in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. 2005;128:460-471. 13. Sindelarova L, Michalova K, Zemanova Z, Ransdorfova S, Brezinova J, Pekova S, Schwarz J, Karban J, Cmunt E. Incidence of chromosomal anomalies detected with FISH and their clinical correlations in B-chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 2005;160:27-34. 14. Damle RN, Wasil T, Fais F, Damle RN, Wasil T, Fais F, Ghiotto F, Valetto A, Allen SL, Buchbinder A, Budman D, Dittmar K, Kolitz J, Lichtman SM, Schulman P, Vinciguerra VP, Rai KR, Ferrarini M, Chiorazzi N. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1999;94:1840-1847. 15. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1999;94:1848-1854. 16. Krober A, Seiler T, Benner A, Bullinger L, Bruckle E, Lichter P, Dohner H, Stilgenbauer S. V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2002;100:1410-1416. 17. Crespo M, Bosch F, Villamor N, Bellosillo B, Colomer D, Rozman M, Marce S, Lopez-Guillermo A, Campo E, Montserrat E. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2003;348:1764-1775.

64

18. Rassenti LZ, Huynh L, Toy TL, Chen L, Keating MJ, Gribben JG, Neuberg DS, Flinn IW, Rai KR, Byrd JC, Kay NE, Greaves A, Weiss A, Kipps TJ. ZAP-70 compared with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status as a predictor of disease progression in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2004;351:893901. 19. Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, Simon R, Davis RE, Yu X, Yang L, Pickeral OK, Rassenti LZ, Powell J, Botstein D, Byrd JC, Grever MR, Cheson BD, Chiorazzi N, Wilson WH, Kipps TJ, BrownPO, Staudt LM. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med. 2001;194:1639-1647. 20. Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2005;352:804-815. 21. Fais F, Ghiotto F, Hashimoto S, Sellars B, Valetto A, Allen SL, Schulman P, Vinciguerra VP, Rai K, Rassenti LZ, Kipps TJ, Dighiero G, Schroeder HW Jr, Ferrarini M, Chiorazzi N. Chronic lymphocytic leukemia B cells express restricted sets of mutated and unmutated antigen receptors. J Clin Invest. 1998;102:1515-1525. 22. Schroeder HW,Jr and Dighiero G. The pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia: analysis of the antibody repertoire. Immunol Today. 1994;15:288-294. 23. Chiorazzi N and Ferrarini M. B cell chronic lymphocytic leukemia: lessons learned from studies of the B cell antigen receptor. Annu Rev Immunol. 2003;21:841-894. 24. Herve M, Xu K, Ng YS, Wardemann H, Albesiano E, Messmer BT, Chiorazzi N, Meffre E. Unmutated and mutated chronic lymphocytic leukemias derive from selfreactive B cell precursors despite expressing different antibody reactivity. J Clin Invest. 2005;115:1636-1643. 25. Damle RN, Ghiotto F, Valetto A, Albesiano E, Fais F, Yan XJ, Sison CP, Allen SL, Kolitz J, Schulman P, Vinciguerra VP, Budde P, Frey J, Rai KR, Ferrarini M, Chiorazzi N. B-cell chronic lymphocytic leukemia cells express a surface membrane phenotype of activated, antigen-experienced B lymphocytes. Blood. 2002;99:4087-4093.

65

26. Klein U, Tu Y, Stolovitzky GA, Mattioli M, Cattoretti G, Husson H, Freedman A, Inghirami G, Cro L, Baldini L, Neri A, Califano A, Dalla-Favera R. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. J Exp Med. 2001;194:1625-1638. 27. William J, Euler C, Christensen S, Shlomchik MJ. Evolution of autoantibody responses via somatic hypermutation outside of germinal centers. Science. 2002;297:2066-2070. 28. Stevenson FK and Caligaris-Cappio F. Chronic lymphocytic leukemia: revelations from the B-cell receptor. Blood. 2004;103:4389-4395. 29. Mauri C, Gray D, Mushtaq N, Londei M. Prevention of arthritis by interleukin 10producing B cells. J Exp Med. 2003;197:489-501. 30. Brecher M and Banks PM. Hodgkin's disease variant of Richter's syndrome. Report of eight cases. Am J Clin Pathol. 1990;93:333-339. 31. Pistoia V, Roncella S, Di Celle PF, Sessarego M, Cutrona G, Cerruti G, Boccaccio GP, Grossi CE, Foa R, Ferrarini M. Emergence of a B-cell lymphoblastic lymphoma in a patient with B-cell chronic lymphocytic leukemia: evidence for the single-cell origin of the two tumors. Blood. 1991;78:797-804. 32. Foucar K and Rydell RE. Richter's syndrome in chronic lymphocytic leukemia. Cancer. 1980;46:118-134. 33. Richter M. Generalized reticular cell sarcoma of lymph nodes associated with lymphatic leukemia. Am J Pathol. 1928;68:368-373. 34. Robertson LE, Pugh W, O'Brien S, Kantarjian H, Hirsch-Ginsberg C, Cork A, McLaughlin P, Cabanillas F, Keating MJ. Richter's syndrome: a report on 39 patients. J Clin Oncol. 1993;11:1985-1989. 35. Tsimberidou AM and Keating MJ. Richter's transformation in chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol. 2006;33:250-256. 36. Giles FJ, O'Brien SM, Keating MJ. Chronic lymphocytic leukemia in (Richter's) transformation. Semin Oncol. 1998;25:117-125. 66

37. Cerroni L, Zenahlik P, Hofler G, Kaddu S, Smolle J, Kerl H. Specific cutaneous infiltrates of B-cell chronic lymphocytic leukemia: a clinicopathologic and prognostic study of 42 patients. Am J Surg Pathol. 1996;20:1000-1010. 38. Ratnavel RC, Dunn-Walters DK, Boursier L, Frazer-Andrews E, Orchard G, Russell-Jones R, Calonje E. B-cell lymphoma associated with chronic lymphatic leukaemia: two cases with contrasting aggressive and indolent behaviour. Br J Dermatol. 1999;140:708-714. 39. Parrens M, Sawan B, Dubus P, Lacombe F, Marit G, Vergier B, Reiffers J, de Mascarel A, Merlio JP. Primary digestive Richter's syndrome. Mod Pathol. 2001;14:452-457. 40. Mahe B, Moreau P, Bonnemain B, Letortorec S, Menegali D, Bourdin S, De Lajartre D, Harousseau JL. Isolated Richter's syndrome of the brain: two recent cases. Nouv Rev Fr Hematol. 1994;36:383-385. 41. Resende LS, Bacchi CE, Resende LA, Gabarra RC, Niero-Melo L. Isolated Richter's syndrome in central nervous system: case report. Arq Neuropsiquiatr. 2005;63:530-531. 42. Robak T, Gora-Tybor J, Tybor K, Jamroziak K, Robak P, Kordek R, Rieske P, Majos A, Urbanska-Rys H. Richter's syndrome in the brain first manifested as an ischaemic stroke. Leuk Lymphoma. 2004;45:1261-1267. 43. Milkowski DA, Worley BD, Morris MJ. Richter's transformation presenting as an obstructing endobronchial lesion. Chest. 1999;116:832-835. 44. Hattenhauer MG and Pach JM. Ocular lymphoma in a patient with chronic lymphocytic leukemia. Am J Ophthalmol. 1996;122:266-268. 45. Smyth EF, Bartlett RJ, Shields ML, White TJ, Wengraf C. Richter's syndrome: a novel presentation. Ulster Med J. 2003;72:58-60. 46. Yamamoto Y, Tsujimoto M, Konoike Y, Nakamine H, Morii T, Kimura H. Richter's syndrome presenting as a nasal lymphoma. Leuk Lymphoma. 2004;45:19191923.

67

47. Matolcsy A, Schattner EJ, Knowles DM, Casali P. Clonal evolution of B cells in transformation from low- to high-grade lymphoma. Eur J Immunol. 1999;29:12531264. 48. Miyamura K, Osada H, Yamauchi T, Itoh M, Kodera Y, Suchi T, Takahashi T, Ueda R. Single clonal origin of neoplastic B-cells with different immunoglobulin light chains in a patient with Richter's syndrome. Cancer. 1990;66:140-144. 49. Matolcsy A, Inghirami G, Knowles DM. Molecular genetic demonstration of the diverse evolution of Richter's syndrome (chronic lymphocytic leukemia and subsequent large cell lymphoma). Blood. 1994;83:1363-1372. 50. Cordone I, Matutes E, Catovsky D. Monoclonal antibody Ki-67 identifies B and T cells in cycle in chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease activity. Leukemia. 1992;6:902-906. 51. Bayliss KM, Kueck BD, Hanson CA, Matthaeus WG, Almagro UA. Richter's syndrome presenting as primary central nervous system lymphoma. Transformation of an identical clone. Am J Clin Pathol. 1990;93:117-123. 52. Bessudo A and Kipps TJ. Origin of high-grade lymphomas in Richter syndrome. Leuk Lymphoma. 1995;18:367-372. 53. Foon KA, Thiruvengadam R, Saven A, Bernstein ZP, Gale RP. Genetic relatedness of lymphoid malignancies. Transformation of chronic lymphocytic leukemia as a model. Ann Intern Med. 1993;119:63-73. 54. Grawunder U, West RB, Lieber MR. Antigen receptor gene rearrangement. Curr Opin Immunol. 1998;10:172-180. 55. Hozumi N and Tonegawa S. Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73:3628-3632. 56. Kuppers R, Klein U, Hansmann ML, Rajewsky K. Cellular origin of human B-cell lymphomas. N Engl J Med. 1999;341:1520-1529.

68

57. Trainor KJ, Brisco MJ, Story CJ, Morley AA. Monoclonality in Blymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood. 1990;75:2220-2222. 58. Cherepakhin V, Baird SM, Meisenholder GW, Kipps TJ. Common clonal origin of chronic lymphocytic leukemia and high-grade lymphoma of Richter's syndrome. Blood. 1993;82:3141-3147. 59. Hamblin T. Chronic lymphocytic leukaemia: one disease or two? Ann Hematol. 2002;81:299-303. 60. Timar B, Fulop Z, Csernus B, Angster C, Bognar A, Szepesi A, Kopper L, Matolcsy A. Relationship between the mutational status of VH genes and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma in Richter's syndrome. Leukemia. 2004;18:326-330. 61. Koduru PR, Lichtman SM, Smilari TF, Sun T, Goh JC, Karp L, Hall W, Hashimoto S, Chiorazzi N, Broome JD. Serial phenotypic, cytogenetic and molecular genetic studies in Richter's syndrome: demonstration of lymphoma development from the chronic lymphocytic leukaemia cells. Br J Haematol. 1993;85:613-616. 62. Matolcsy A. High-grade transformation of low-grade non-Hodgkin's lymphomas: mechanisms of tumor progression. Leuk Lymphoma. 1999;34:251-259. 63. Muller-Hermelink HK, Zettl A, Pfeifer W, Ott G. Pathology of lymphoma progression. Histopathology. 2001;38:285-306. 64. Cobo F, Martinez A, Pinyol M, Hernandez L, Gomez M, Bea S, Esteve J, Rozman M, Bosch F, Lopez-Guillermo A, Montserrat E, Campo E. Multiple cell cycle regulator alterations in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2002;16:1028-1034. 65. Brynes RK, McCourty A, Sun NC, Koo CH. Trisomy 12 in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol. 1995;104:199-203. 66. Han T, Sadamori N, Ozer H, Gajera R, Gomez GA, Henderson ES, Bhargava A, Fitzpatrick J, Minowada J, Bloom ML. Cytogenetic studies in 77 patients with chronic lymphocytic leukemia: correlations with clinical, immunologic, and phenotypic data. J Clin Oncol. 1984;2:1121-1132.

69

67. Kobayashi K and Schilsky RL. Update on biochemical modulation of chemotherapeutic agents. Oncology (Williston Park). 1993;7:99-106, 109; discussion 110-4, 117. 68. Cuneo A, de Angeli C, Roberti MG, Piva N, Bigoni R, Gandini D, Rigolin GM, Moretti S, Cavazzini P, del Senno L, Castoldi G. Richter's syndrome in a case of atypical chronic lymphocytic leukaemia with the t(11;14)(q13;q32): role for a p53 exon 7 gene mutation. Br J Haematol. 1996;92:375-381. 69. Fulop Z, Csernus B, Timar B, Szepesi A, Matolcsy A. Microsatellite instability and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2003;17:411-415. 70. Ichikawa A, Hotta T, Takagi N, Tsushita K, Kinoshita T, Nagai H, Murakami Y, Hayashi K, Saito H. Mutations of p53 gene and their relation to disease progression in B-cell lymphoma. Blood. 1992;79:2701-2707. 71. Pinyol M, Cobo F, Bea S, Jares P, Nayach I, Fernandez PL, Montserrat E, Cardesa A, Campo E. p16(INK4a) gene inactivation by deletions, mutations, and hypermethylation is associated with transformed and aggressive variants of nonHodgkin's lymphomas. Blood. 1998;91:2977-2984. 72. Arranz E, Martinez B, Richart A, Echezarreta G, Roman A, Rivas C, Benitez J. Increased C-MYC oncogene copy number detected with combined modified comparative genomic hybridization and FISH analysis in a Richter syndrome case with complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 1998;106:80-83. 73. Golay J, Luppi M, Songia S, Palvarini C, Lombardi L, Aiello A, Delia D, Lam K, Crawford DH, Biondi A, Barbui T, Rambaldi A, Introna M. Expression of A-myb, but not c-myb and B-myb, is restricted to Burkitt's lymphoma, sIg+ B-acute lymphoblastic leukemia, and a subset of chronic lymphocytic leukemias. Blood. 1996;87:1900-1911. 74. Han T, Henderson ES, Emrich LJ, Sandberg AA. Prognostic significance of karyotypic abnormalities in B cell chronic lymphocytic leukemia: an update. Semin Hematol. 1987;24:257-263.

70

75. Khan G, Norton AJ, Slavin G. Epstein-Barr virus in Reed-Sternberg-like cells in non-Hodgkin's lymphomas. J Pathol. 1993;169:9-14. 76. Krishnan B, Matutes E, Dearden C. Prolymphocytic leukemias. Semin Oncol. 2006;33:257-263. 77. Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 1998;396:643-649. 78. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, Meltzer SJ, Rodriguez-Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998;58:5248-5257. 79. Pasqualucci L, Neumeister P, Goossens T, Pasqualucci L, Migliazza A, Fracchiolla N, William C, Neri A, Baldini L, Chaganti RS, Klein U, Kuppers R, Rajewsky K, Dalla-Favera R. Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphomas. Nature. 2001;412:341-346. 80. Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature. 1983;302:575-581. 81. Pasqualucci L, Migliazza A, Fracchiolla N, et al. BCL-6 mutations in normal germinal center B cells: evidence of somatic hypermutation acting outside Ig loci. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:11816-11821. 82. Shen HM, Peters A, Baron B, Zhu X, Storb U. Mutation of BCL-6 gene in normal B cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. Science. 1998;280:17501752. 83. Rogozin IB and Kolchanov NA. Somatic hypermutagenesis in immunoglobulin genes. II. Influence of neighbouring base sequences on mutagenesis. Biochim Biophys Acta. 1992;1171:11-18.

71

84. Zan H, Cerutti A, Dramitinos P, Schaffer A, Li Z, Casali P. Induction of Ig somatic hypermutation and class switching in a human monoclonal IgM+ IgD+ B cell line in vitro: definition of the requirements and modalities of hypermutation. J Immunol. 1999;162:3437-3447. 85. Montesinos-Rongen M, Van Roost D, Schaller C, Wiestler OD, Deckert M. Primary diffuse large B-cell lymphomas of the central nervous system are targeted by aberrant somatic hypermutation. Blood. 2004;103:1869-1875. 86. Gaidano G, Pasqualucci L, Capello D, Berra E, Deambrogi C, Rossi D, Maria Larocca L, Gloghini A, Carbone A, Dalla-Favera R. Aberrant somatic hypermutation in multiple subtypes of AIDS-associated non-Hodgkin lymphoma. Blood. 2003;102:18331841. 87. Libra M, Capello D, Gloghini A, Laura P, Berra E, Cerri M, Gasparotto D, Franca S, De Re V, Gaidano G, Carbone A. Analysis of aberrant somatic hypermutation (SHM) in non-Hodgkin's lymphomas of patients with chronic HCV infection. J Pathol. 2005;206:87-91. 88. Bodor C, Bognar A, Reiniger L, Szepesi A, Toth E, Kopper L, Matolcsy A. Aberrant somatic hypermutation and expression of activation-induced cytidine deaminase mRNA in mediastinal large B-cell lymphoma. Br J Haematol. 2005;129:373-376. 89. Muramatsu M, Kinoshita K, Fagarasan S, Yamada S, Shinkai Y, Honjo T. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 2000;102:553-563. 90. Muramatsu M, Sankaranand VS, Anant S, Sugai M, Kinoshita K, Davidson NO, Honjo T. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J Biol Chem. 1999;274:18470-18476. 91. Oppezzo P, Vuillier F, Vasconcelos Y, Dumas G, Magnac C, Payelle-Brogard B, Pritsch O, Dighiero G. Chronic lymphocytic leukemia B cells expressing AID display dissociation between class switch recombination and somatic hypermutation. Blood. 2003;101:4029-4032. 72

92. Oppezzo P, Dumas G, Lalanne AI, Payelle-Brogard B, Magnac C, Pritsch O, Dighiero G, Vuillier F. Different isoforms of BSAP regulate expression of AID in normal and chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood. 2005;105:2495-2503. 93. Revy P, Muto T, Levy Y, Geissmann F, Plebani A, Sanal O, Catalan N, Forveille M, Dufourcq-Labelouse R, Gennery A, Tezcan I, Ersoy F, Kayserili H, Ugazio AG, Brousse N, Muramatsu M, Notarangelo LD, Kinoshita K, Honjo T, Fischer A, Durandy A. Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell. 2000;102:565-575. 94. Pham P, Bransteitter R, Petruska J, Goodman MF. Processive AID-catalysed cytosine deamination on single-stranded DNA simulates somatic hypermutation. Nature. 2003;424:103-107. 95. Bransteitter R, Pham P, Scharff MD, Goodman MF. Activation-induced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single-stranded DNA but requires the action of RNase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:4102-4107. 96. Petersen-Mahrt SK, Harris RS, Neuberger MS. AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature. 2002;418:99-103. 97. Imai K, Slupphaug G, Lee WI, Revy P, Nonoyama S, Catalan N, Yel L, Forveille M, Kavli B, Krokan HE, Ochs HD, Fischer A, Durandy A. Human uracil-DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin classswitch recombination. Nat Immunol. 2003;4:1023-1028. 98. Martin A and Scharff MD. AID and mismatch repair in antibody diversification. Nat Rev Immunol. 2002;2:605-614. 99. Zeng X, Winter DB, Kasmer C, Kraemer KH, Lehmann AR, Gearhart PJ. DNA polymerase eta is an A-T mutator in somatic hypermutation of immunoglobulin variable genes. Nat Immunol. 2001;2:537-541. 100. Zan H, Komori A, Li Z, Cerutti A, Schaffer A, Flajnik MF, Diaz M, Casali P. The translesion DNA polymerase zeta plays a major role in Ig and bcl-6 somatic hypermutation. Immunity. 2001;14:643-653.

73

101. Rush JS, Fugmann SD, Schatz DG. Staggered AID-dependent DNA double strand breaks are the predominant DNA lesions targeted to S mu in Ig class switch recombination. Int Immunol. 2004;16:549-557. 102. Okazaki IM, Hiai H, Kakazu N, Yamada S, Muramatsu M, Kinoshita K, Honjo T. Constitutive expression of AID leads to tumorigenesis. J Exp Med. 2003;197:11731181. 103. Greeve J, Philipsen A, Krause K, Klapper W, Heidorn K, Castle BE, Janda J, Marcu KB, Parwaresch R. Expression of activation-induced cytidine deaminase in human B-cell non-Hodgkin lymphomas. Blood. 2003;101:3574-3580. 104. Smit LA, Bende RJ, Aten J, Guikema JE, Aarts WM, van Noesel CJ. Expression of activation-induced cytidine deaminase is confined to B-cell non-Hodgkin's lymphomas of germinal-center phenotype. Cancer Res. 2003;63:3894-3898. 105. Pasqualucci L, Guglielmino R, Houldsworth J, Mohr J, Aoufouchi S, Polakiewicz R, Chaganti RS, Dalla-Favera R. Expression of the AID protein in normal and neoplastic B cells. Blood. 2004;104:3318-3325. 106. Lossos IS, Levy R, Alizadeh AA. AID is expressed in germinal center B-cell-like and activated B-cell-like diffuse large-cell lymphomas and is not correlated with intraclonal heterogeneity. Leukemia. 2004;18:1775-1779. 107. Albesiano E, Messmer BT, Damle RN, Allen SL, Rai KR, Chiorazzi N. Activation-induced cytidine deaminase in chronic lymphocytic leukemia B cells: expression as multiple forms in a dynamic, variably sized fraction of the clone. Blood. 2003;102:3333-3339. 108. Cerutti A, Zan H, Kim EC, Shah S, Schattner EJ, Schaffer A, Casali P. Ongoing in vivo immunoglobulin class switch DNA recombination in chronic lymphocytic leukemia B cells. J Immunol. 2002;169:6594-6603.

74

109. Heintel D, Kroemer E, Kienle D, Schwarzinger I, Gleiss A, Schwarzmeier J, Marculescu R, Le T, Mannhalter C, Gaiger A, Stilgenbauer S, Dohner H, Fonatsch C, Jager U, German CLL Study Group. High expression of activation-induced cytidine deaminase (AID) mRNA is associated with unmutated IGVH gene status and unfavourable cytogenetic aberrations in patients with chronic lymphocytic leukaemia. Leukemia. 2004;18:756-762. 110. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16:1215. 111. Deane M and Norton JD. Immunoglobulin heavy chain variable region family usage is independent of tumor cell phenotype in human B lineage leukemias. Eur J Immunol. 1990;20:2209-2217. 112. Guikema JE, Rosati S, Akkermans K, Bende RJ, van Noesel CJ, van Krieken JH, Hansmann ML, Schuuring E, Kluin PM. Quantitative RT-PCR analysis of activationinduced cytidine deaminase expression in tissue samples from mantle cell lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia patients. Blood. 2005;105:2997-8; discussion 2998-9. 113. Nilsen H, An Q, Lindahl T. Mutation frequencies and AID activation state in Bcell lymphomas from Ung-deficient mice. Oncogene. 2005;24:3063-3066.

75

XII. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában: L Reiniger, Cs Bödör, Á Bognár, Zs Balogh, J Csomor, Á Szepesi, L Kopper, A Matolcsy: Richter’s and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mRNA expression of activation-induced cytidine deaminase and aberrant somatic hypermutation. Leukemia 20: 1089-1095, 2006. IF: 6.612 Cs Bödör, Á Bognár, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper, A Matolcsy: Aberrant somatic hypermutation and expression of activation-induced cytidine deaminase mRNA in mediastinal large B-cell lymphoma. British Journal of Haematology 129: 373-376, 2005. IF: 3.267 Az értekezés témáján túl: Zs Balogh, L Reiniger, L Deák, Cs Bödör, J Csomor, Á Szepesi, É Gagyi, L Kopper, A Matolcsy: IgVH gene mutation status and genomic imbalances in chronic lymphocytic leukaemia with increased prolymphocytes (CLL/PL). Hematological Oncology, 2007. DOI: 10.1002/hon.812. IF: 1,774 M Hajdu, A Sebestyén, G Barna, L Reiniger, J Jánosi, L Sréter, J Várkonyi, J Demeter, L Kopper: Activity of the Notch-signalling Pathway in Circulating Human Chronic Lymphocytic Leukaemia Cells. Scandinavian Journal of Immunology 65, 271–275, 2007. IF: 2.023 Á Bognár, B Csernus, Cs Bödör, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper , A Matolcsy: Clonal Selection in the bone marrow infiltration of follicular lymphoma. Leukemia 19: 1656-1662, 2005. IF: 6.612 Rajnai H, Bödör Cs, Reiniger L, Timár B, Csernus B, Szepesi Á, Csomor J és Matolcsy A: Új lehetőség a chronicus myeloproliferatív betegségek diagnosztikájában – a JAK2 mutáció kimutatása. Orvosi Hetilap 147. évf. 45. sz. 2006. november 12. 76

IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK Cs Bödör, Á Bognár, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper, A Matolcsy: Aberrant somatic Hypermutation and expression of activation-induced cytidine deaminase, RNA in mediastinal large B-cell lymphoma (abstract). Annals of Oncology 16 (Suppl.5): 144, 2005. IF: 4,335 Dr Mózes Miklós, Dr Gerő Domokos, Reiniger Lilla, Rosivall László: Relaxin transzgenikus egértörzs létrehozása és karakterizálása. Hypertonia és Nephrologia, 2001; (5) S4: 135-218 (152)

77

XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom Szüleimnek, akiknek szeretetteljes és türelmes gondoskodása végigkísérte és támogatta munkámat, és köszönettel tartozom az egész családomnak (a legkisebbtől a legnagyobbig), amiért olyan fészket szőttek, amiben az örömök és a nehézségek megélése is megosztható. Köszönöm Dr. Kopper László Professzor Úrnak, hogy befogadott az intézetbe, amellyel szakmai haladásomat támogatta, és köszönöm a bíztató és értékes szakmai és baráti beszélgetéseket. Köszönöm Dr. Matolcsy András Professzor Úrnak, hogy a laborjában dolgozhattam és hogy szakmai tanácsaival ellátott, munkámat mindvégig segítette. Köszönettel tartozom Dr. Szepesi Ágotának, témavezetőmnek, a szakmai segítségért. Köszönöm Dr. Csomor Juditnak, hogy délutántól estig gyakran segített abban, hogy vidáman teljen a munkával töltött idő. Köszönöm a baráti és szakmai beszélgetéseket. Köszönettel tartozom Prof. Kovalszky Ilonának és Dr. Sebestyén Annának, hogy dolgozhattam a laborjukban. Köszönöm az értékes szakmai támogatást. Köszönettel tartozom Laczik Cecíliának és Szilágyi Ilonának, hogy bármikor segítségért fordulhattam hozzájuk. Köszönettel tartozom közvetlen munkatársaimnak és barátaimnak Dr. Bognár Ágnesnek, Bödör Csabának, Dr. Timár Botondnak és Dr. Csernus Balázsnak az együtt eltöltött munka- és szabadidőért és az önzetlen szakmai segítségért. Köszönöm Bárányné Pallag Adriennenek és Lengyel Anikónak a labormunkában nyújtott segítséget. Külön köszönettel tartozom Dr. Diczházi Csabának, aki az éjszakákba és hétvégékbe nyúló munkáim során segített tartani bennem a lelket - beszélgetésekkel és kávéval. Köszönettel tartozom Dr. Hajdu Melindának, Dr. Füle Tibornak, Szarvas Tibornak, Dr. Barna Gábornak, Tátrai Péternek, Budai Bernadettnek, Bedi Katának, Kovács Anitának, Kánya Melindának és Cserneki Marinak a munkámhoz kapott segítségért.

78

Köszönöm, hogy segítettek a baráti és vidám hangulat megteremtésében a házon belül és azon kívül is: László Viktória, Dr. Fónyad László, Imre Gergő, Balogh Zsófia, Deák Linda, Muhari Orsolya, Szabó Orsi, Szabó Ildikó, Csizmadia Annamária, Rajnai Hajnalka, Angster Christine, Baghy Kornélia, Péterfia Bálint. Köszönöm Dr Mózes Miklósnak, hogy segített megszeretnem a kutatómunkát, és hogy laborjában elsajátíthattam a molekuláris biológiai módszerek egy részét. Köszönettel tartozom - nem utolsósorban - barátaimnak, a két Zsófimnak, Petinek, Nórcsinak, Zsuzsának és Zolinak a lelkesítésért és türelemért.

79