DNS munka a gyakorlatban 2012.10.12. Természetvédelmi genetika
Munka fázisok • • • • • •
DNS kivonás elektroforézis (fakultatív lépés) PCR Elektroforézis Szekvenálás Szekvencia elemzés faji azonosítás; variabilitás, heterozigócia, filogenetika
DNS kivonás menete • 1. szövet roncsolás • 2. sejtfeltárás • 3. további lépések módszer függőek Fotó: Velekei Balázs
Fotó: Velekei Balázs
Vér minta • Mintavétel szakértelmet és körültekintést igényel • Gyorsan feldolgozható (előny) • Invazív eljárás (hátrány) Fotó: internet
Izom szövet
Fotó: internet
Fotó: internet
• Könnyen és eredményesen feldolgozható • Hosszú ideig tartó fagyasztás után is jó eredményt ad
Májszövet
Fotó: internet
• Könnyen és eredményesen feldolgozható • Alkalmazása: elsősorban vadászható fajoknál
Szőr, toll • Genomiális DNS: szőrhagyma, tollszár • mtDNS: akár szőrhagyma nélküli részekből is • Emésztési idő és hőmérséklet sarkalatos pont
Fotó: internet
Fotó: internet
Nagy zsírtartalmú szövetek Feltárásuk nehezebb: • erősebb detergensek (guanidium, szodium citrát) használata • alacsony hőmérséklet (4 °C) • toxikus, szerves oldószerek (fenol:kloroform:izoamilalk ohol)
Fotó: internet
Fotó: internet
DNS kivonás rovarokból Fotó: internet
Fotó: internet
Probléma: • Heterogén csoport • Kis méretű minta • Eltérő szklerotinizáltság • Eltérő zsírtest tartalom • Paraziták és parazitoidok
Gombák, Növények • Vastag sejtfal • Polifenolok • Poliszaharidok
Fotó: internet
Kis méretű, alacsony DNS tartalmú minták
Fotó: internet
Fotó: Helga Schöps
• Megnövelt emésztési idő • Alacsonyabb hőmérséklet
Mintavétel védett élőlényekből • Élőlény csoportonként eltérő metodika • Nem-invazív eljárások támogatottak
Fotó: internet
Fotó: Velekei Balázs
Fotó: internet
Védett élőlények Példa: • a farkos kétéltűek esetében elfogadott módszer a farokvég néhány mm-es darabjának lemetszése • Alternatív megoldás: hám kaparék steril mintavevő pálcikával
Fotó: Velekei Balázs
DNS kivonás módszerei 1. „Ki”sózáson alapuló módszerek 2. Anion-cserélő gyanták (AIX) és társaik Fotó: internet
3. Mágneses elválasztás 4. „Charge Switch technology” 5. Direct Kit-ek
„Ki”sózáson alapuló módszerek eltérő módon csapják ki a DNS-t és a szennyező anyagokat 1. Kaotrópok: a makromolekulák térszerkezetét rongálják, így növelik a víz oldékonyságukat ("salting in") pl. guanidiumizotiocianát
2. Kozmotrópok:
stabilizálják a térszerkezetet, ezáltal csökkentik az oldékonyságot ("salting out") pl. K-acetát
Fotó: internet
Erélyes szerves oldószereket használnak
Anion-cserélő gyanták (AIX) és társaik Nukleinsavak nagyméretű negatív töltéssel rendelkező molekulák), ezért pozitív töltésű adszorbenshez kötődik Ált. kaotropok segítik a szilikához, hidroxiapatithoz kötődést Gyors, kényelmes, Hatékonyság : erősen módszer függő Fosszilis mintákból is!!!
Fotó: internet
Előre gyártott Kit-ek
Fotó: internet
„Charge Switch technology” pH-tól függően változtatják a töltésüket (alacsony pH-n pozitív, 8,5 pH –n semleges, 6,5-ös pH –n köti meg a DNS-t vagy RNS-t) DNS és RNS tisztítására is alkalmas 100%-ig vizes alapú eljárás, nem használ szerves oldószereket • Plate, Eppendorf cső belsejére bevonatként felvihető • Felesleges szennyeződéseket egy egyszerű mosási lépéssel távolítjuk el
Fotó: internet
Megj.: kis DNS tartalmú minták esetén hatékony, pl. ásatag csontokból
Mágneses elválasztás DNS és RNS a mágnesgyöngyhöz köthető Gyakran a szilika alapú elválasztást kombinálják mágneses mikrogyöngyökkel
Fotó: internet
Fotó: internet
Megj.: nagy tisztaságú DNS-t eredményez
DNS-kivonás: Kit használatával
Fotó: Velekei Balázs
Fotó: Velekei Balázs
Fotó: Velekei Balázs
Fotó: Velekei Balázs
DNS kivonás lépései módszerenként Kisózáson alapuló módszerek • szövet roncsolás • sejtfeltárás • fehérjék kicsapása, és a DNS dehidratálása • DNS tartalmú csapadék mosása • a tisztított DNS rehidratálása
Anion-cserélő gyanták (AIX) és társaik • szövetroncsolás • sejt feltárás • Adszorpció, a DNS adszorbenshez kötése • mosás • leoldás az adszorbensről
Szövetroncsolás Mechanikai eljárások • Fagyasztva törés (folyékony nitrogénnel) • Dörzs mozsár • gyöngy malmok • Kézihomogenizátorok, Potter-féle homogenizátorok
Fotó: internet
Fotó: internet
Fotó: internet
Sejt feltárás 1. Membrán detergensekkel (SDS, Triton X-100) 2. Fehérje bontó enzimekkel (proteinázK) 3. A kettőt kombinálva
Fotó: internet
Fontos: Megfelelő pH biztosítása puffer oldatokkal (EDTA, TRIS)
Hibaforrások • Kis térfogatokkal történő gyakori pipettázás • gyakori vortexelés • fenol • nehézfémek • Tökéletlen sejtfeltárás -> nukleázok • Nem megfelelő pH (pH6,00-9,00; ált. 8,6) • UV fény
• Mintában visszamaradó EtOH (elektroforézisnél, PCR-nél)
Fotó: internet
Elektroforézis • Töltéssel rendelkező molekulák elektromos térben vándorolnak • Hogyan?
Láthatóvá tétel: • EtBr + UV : toxikus!!! • Fluoreszcens festékek + gerjesztés
Polymerase Chain Reaction kezdeti denaturációs lépés 2 perc 94 °C denaturálás 30 másodperc 94 °C annealing 1 perc 47 °C polimerizáció 1 perc 30 sec 72 °C utolsó polimerizációs lépés 10 perc 72 °C 34 ciklus.
PCR
PCR • Recept: mit mérjünk össze ? végtérfogat H2O Puffer oldat MgCl2 dNTPs (10mM) F (10µM) primer R (10µM) primer Taq DNA polimeráz DNA
25 10.875 5 1.5 0.5 2.5 2.5 0.125 2
Szekvenálás Sanger-féle (1977) metódus (Hagyományos)
• Lézerrel gerjesztik a festékeket
Adatanalízis /szoftverek Lásd. „élőben „
KÖSZÖNÖM
A
FIGYELMET!
