2008.09.26.
Biochip technika a labordiagnosztikában Citokin mérési módszerek Bekő Gabriella Semmelweis Egyetem, Központi Laboratórium (Pest)
2008. szeptember 18.
A DNS-chipek története • 1995 gén-expressziós profilok meghatározására használt miniatürizált microarray • 1997-ben már egy microarray-vel kimutatott komplett eukaryota genomról az élesztőgomba genomról (Saccromyces cerevisiae) számoltak be amerikai szerzők • 2001 óta már baktériumok, élesztő, szőlőmuslica, fonálféreg és növények mellett az emberi genom, legújabban pedig az egér teljes genomiális géntérképe rendelkezésre áll, a világháló adatbázisaiból lehívható és elemezhető
1
2008.09.26.
A DNS-chip technika • A DNS-chipek egy szilárd hordozó lapocskához sakktáblaszerű elrendezésben kötött, nagyszámú, különböző nukleotidszekvenciájú DS próbából állnak. • A próbák lehetnek: • oligonukleotidok (20-25 nukleotid hosszúságúak) • DS-fragmentumok (~500-5000 nukleotidból állnak) • a próbák általában mRNS-ről reverz transzkripció segítségével, in vitro előállított komplementer DS (cDS) láncok • A jelenlegi technikai lehetőségek már több tízezer különböző próbát tartalmazó folt vagy pont (spot) kialakítását teszik lehetővé egy chip 1-2 cm2-es felületén, így egy egyed teljes genetikai állományát reprezentáló chip készíthető. (Az ember genomja 26-45 ezer gént tartalmaz.)
Összehasonlító génexpressziós kísérletek • legkritikusabb lépés a megfelelő szolubilis nukleinsavminták (targetek) előállítása • a target nukleinsavat polimeráz láncreakcióval (PCR) kell megsokszorozni • target cDNS-ek jelölése riporter molekulákkal, amik ma már (vörös és zöld) színű fluoreszcens festékek (Cγ5 és Cγ3) • Hibridizáció, mosás • a chipeket lézerrel világítják meg és a lapocskák különböző pontjai által kibocsátott fény színét, valamint intenzitását mérik konfokális mikroszkópban vagy leolvasó készülékben (scannerben) • a chipen végzett kísérlet eredményeit hierarchikus csoport(cluster) analízis (általában a CLUSTER és a TREEWIEW számítógépprogramok) segítségével értékelik
2
2008.09.26.
DNA-array
Összehasonlító génexpressziós vizsgálat
3
2008.09.26.
Génexpressziós kézjegy • Meghatározhatók a mintaként feldolgozott sejtek eredetére, funkciójára, működésére,stb. jellemző génexpressziós kézjegyek. • Minden kézjegy olyan gének csoportját (clusterét) jelenti, amelyek hasonló vagy inkább egymáshoz kapcsolódó funkciójú fehérjéket kódolnak. • Minden génexpressziós kézjegy tartalmaz néhány nevesített (named) gént, aminek ismerjük a funkcióját és ebből következtethetünk a csoportba tartozó többi – még ismeretlen– gén funkciójára is. • Ha például olyan génexpressziós kézjeggyel találkozunk, amelyben előfordul a Fas (APO-1 vagy CD95) és több kaszpáz enzim génje, biztosak lehetünk abban, hogy a csoportba tartozó többi – fokozottan expresszálódó – gén is olyan fehérjéket kódol, amelyek szerepet játszanak a Fas (CD95) –FasL (CD95L) úton indukált apoptózisban
GenBank www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez A DNS-chip technológiának köszönhetően a humán genom projekt keretében ma már korlátlan hozzáférési lehetőség van a gének szekvenciáit és lokalizációját tartalmazó adatbázisokhoz, nagyban segítve ezzel a kromoszóma rendellenességek felderítését, a génexpressziós mintázat szisztematikus meghatározását, mely nemcsak a sejtek normális működésének megértése szempontjából nagyon fontos, hanem hozzájárul olyan új gének azonosításához, melyek adott betegségcsoportra markerként jellemzőek és terápiás szempontból potenciális gyógyszercélpontok lehetnek
4
2008.09.26.
A fehérjechipek története • A fehérjechipek a cDNS microarray módszer analógiájára jöttek létre. • Kezdetben nem chip, hanem ELISA-plate méretűek voltak, amely a technika fejlődésével egyre kisebbé váltak.
• Míg a cDNS-chipeknél a reakciót a Southern- vagy Northern-hibridizáció, addig a fehérjechipek esetében a Western-hibridizáció alapján végezzük, néhány módosítással.
A fehérjechipek története • Kezdetben ELISA-tálca vályúiba (plate well) rögzítettek megfelelő antitesteket. • Az ELISA-plate-et hamarosan PBDF (polybrominated dibenzofurans)-membrán váltotta fel. Ennek meghatározott pontjaira csöppentették és rögzítették az ellenanyagot • Egy mintából akár több száz vagy ezer paramétert vizsgálhatunk (ahányféle ellenanyagot rögzítettünk előre a szilárd hordozón) • A jelölésben az áttörést a fluoreszcens festékek alkalmazása hozta. A használatos fluoreszcens festékek cianinszármazékok, leggyakoribb a monoreaktív Cy3 és Cy5 fluoreszcens festékek. (A hibridizáció után kapott fluoreszcens jel csak a bekötődött fehérjék mennyiségétől függ )
5
2008.09.26.
Fehérjechip technika • Ez a rendszer a cDNS-microarray-k analógiájaként működik, és kompatibilis is az ehhez szükséges eszközökkel (jelölés, hibridizáció, azonosítás). Leggyakrabban szilárd hordozóként üveglemezt használnak, a másik megoldást speciális membrán tárgylemezre rögzítése. A chipek felszínére rögzített fehérjéknek is két fajtája ismert: • 1.Olyan fehérjék rögzítése, amelyekkel testfolyadékellenanyagok mutathatók ki. Ez az úgynevezett reverz fázisú protein chip (RPA) rendszer • 2.Olyan ellenanyagok rögzítése, amelyekkel szöveti lizátum, sejtkultúra-lizátum, testfolyadékok bizonyos fehérjéi reagálnak, és így jelenlétükre és mennyiségükre következtethetünk
Fehérjechipek alkalmazása Fehérjechipek típusai: 1. Üveg tárgylemez-alapú nyomtatott (egyszerű alkalmazhatóság, kisebb költség) 2. SELDI MS-alapú (kis anyagmennyiségből profilkülönbség, de drága) 3. Elektroforézis-alapú (még nem kiforrott) 4. Szöveti mikroblokk módszer (egyes antitestek szöveti és betegség specificitásának meghatározását teszik lehetővé)
6
2008.09.26.
éhány fontosabb kutatási terület • Szérum tumormarker-vizsgálatok • Szérumfehérje-profilok vizsgálata távoli daganatok kimutatására (érdekes és reális lehetőség) • Colorectalis daganatos betegek szérumának fehérjespektrumát lehet vizsgálni • Ováriumdaganatok szűrésére alkalmas markereket találtak • A SELDI-alapú fehérjechipek sikeresen alkalmazhatók azzal a céllal, hogy olyan fehérjéket azonosítsanak, amelyek összefüggésben állnak a HER-2/neu-pozitív, agresszív fenotípusú mellrákkal. • Három potenciális biomarkert sikerült meghatározni gégerákban. Ezek a fehérjék (calgranulin-A, calgranulin-B és calgizzarin) az S100-as fehérjecsalád tagjai. • Húgyhólyag laphámsejtes carcinomájának fehérjemarkereit is vizsgálják chiptechnikával
éhány fontosabb kutatási terület • Autoimmun betegségekben autoantigén vizsgálatok végezhetők • A fehérjearray-ket különböző sejtélettani vizsgálatokra is alkalmazzák. Az antitestek stresszválasz, sejtciklus, apoptosis fehérjék kimutatására alkalmasak. • Gyulladásos folyamatokban citokinek, kemokinek, növekedési faktorok és NF κB aktivációját figyelik.
7
2008.09.26.
Miért fontos a citokinek mérése? • A citokinek nélkülözhetetlen mediátorai az immunválasznak és a gyulladást kiváltó reakcióknak • A növekedési faktorok pedig elsősorban sejtosztódást indukáló biológiailag aktív anyagok • Klinikai jelentőségük • a fertőzések, • az autoimmun betegségek, • az immundeficienciák • és daganatos betegségek terén kiemelkedő
Citokin mérési módszerek Intracelluláris citokinek és kemokinek kimutatása • A T-limphociták aktivációját követően a citokinek/kemokinek a citoplazmában feldúsulnak, és csak ezután választódnak ki. • Az intracelluláris citokinek a citoplazmában fluoreszcens festékekkel jelzett specifikus ellenanyagokkal, áramlási citofluorimetriával, immunhisztokémiai módszerekkel vagy immunfluoreszcens mikroszkópos technikákkal vizsgálhatók. • A sejtfelszíni markerek egyidejű kimutatásával az adott citokintermelő sejt típusa is azonosítható, és a citokint termelő sejtek aránya is megadható. • A mikroszkópos elemzés a sejten belüli lokalizáció meghatározására alkalmas.
8
2008.09.26.
Extracelluláris oldott citokinek kimutatása • biológiai aktivitásuk alapján - csak a biológiailag aktív citokinek mutathatók ki - nem elég specifikus • érzékeny ELISA módszerekkel - kettős szendvics módszer - nagy fajlagosság - az eredmény nem mindig jelzi a tényleges biológiai aktivitást -citokinek oldott formájú receptorokhoz vagy inhibitorokhoz kötött formában is előfordulhatnak
Extracelluláris citokinek meghatározása biochip és bioplex módszerekkel • A citokin funkciók komplexek, így egy citokin profil nagyon értékes információt jelenthet egy adott immunválaszban, különösen, ha az időbeni dinamikus változásokat is figyeljük .
9
2008.09.26.
A citokcinek az immunválasz minden fázisában hatnak:
Dr. Berki Tímea
Extracelluláris citokinek meghatározása biochip és bioplex módszerekkel • Nagy előrelépés: • citokin biochip panelek • Egyszerre 12 citokin növekedési faktor 100ul minta • mikrogyöngyökhöz kötött citokin antitestek, a Bio-Plex panelek • egyszerre 27 citokin, növekedési faktor 50ul minta
10
2008.09.26.
Biochip tecnika citokinek, kemokinek és növekedési faktorok kimutatására • • • • •
Háromféle immunoassay-t alkalmaz egyszerre: 1. kompetitiv immunoassay (enzimmel jelölt analit) 2. sandwich immunoassay (enzimmel jelölt antitest) 3. antibody capture immunoassay Randox Evidence Investigatort használva a chemiluminescens jeleket egyszerre méri egy készülék egy hűtött CCD (charge couple device) kamerával és standard kalibrációs görbékhez hasonlítva kiértékeli egy speciális programmal a teljes array-n
A chip-en található analitok egyedi, mennyiségi meghatározása A képkészítés folyamata
A biochip mérés folyamata az evidence investigatorTM-ral Mérésre kész biochip carrier
A biochip carrier behelyezése a készülékbe
Assay reagensek és beteg minta hozzáadása a biochip-hez A jelzı reagens hozzáadása
Thermoshakerben való inkubálás
Biochip mosása (manuálisan)
11
2008.09.26.
Biochip technika • 3-4 óra alatt 42 beteg 12 pro- és antiinflammatórikus citokinjét és növekedési faktorát (háromszintű kontrolálást használva) tudjuk lemérni (100 ul minta/ beteg)). • A Randox teljes automata (EVIDENCE) rendszerben egy chip felületére maximum 23 analit (antitest) köthető. • A citokinek mellett számos panelt fejlesztettek. •Így kardiális, pajzsmirigy, női hormonok, drog kimutató, antimikrobiális,szintetikus szteroid, többféle tumor monitorozó, a colorectalis tumorok szűrésére pedig DNA array(RanplexCRC) •Nyugat-Európában, Amerikában klinikai rutin laboratóriumokban is használják
Bio-Plex technika citokinek, kemokinek és növekedési faktorok kimutatására • Chiptechnika (sandvich és kompetitiv immunoassay) és flowcytometria • Mikrogyöngyöket ( 5um, polisztirén) vörös és infravörös festékkel színezik. (Festék arány: 100 féle gyöngytípus elméletileg 100 féle vizsgálat) • A gyöngyökhöz különböző monoklonáris antitesteket kötnek, melyek összekeverhetők és a microplate lyukaiból a chiphez hasonlóan egyszerre mérhetők • A szendvics ELISA utolsó lépése fluorescens jelölés • A készülék kapillárisán áthaladó valamennyi gyöngyöt 2 színű lézer világítja meg. ( Piros fény a gyöngy típus - zöld fény a fluoreszcens jel intenzitás) • Speciális software - standard görbékhez hasonlítás
12
2008.09.26.
Bio-Plex technika
Bio-Plex technika • A minta a szérumon, plazmán és szöveti felülúszón kívül, bármely testnedv vagy szöveti homogenizátum lehet. • A szükséges mintamennyiség 50ul. • A vizsgálatok költsége harmada az ELISA-val mért tesztekének. De minél több tesztet mérünk egy plexben, a fajlagos költség annál kisebb. • A flexibilis multiplexek nemcsak a citokinek mérésénél nyújtanak segítséget, hanem más fehérje és génexpressziós profilok , autoimmun betegségek, genetikai betegségek és HLA vizsgálatok terén is gyors, pontos, átfogó eredményekhez juthatunk.
13
2008.09.26.
Minták és vizsgált paraméterek 16 koraszülött és újszülött - 54 minta
Biochip
Közös
Bio-Plex
IL-2
IL-2
IL-2
IL-4
IL-4
IL-4
IL-6
IL-6
IL-6
IL-8
IL-8
IL-8
IL-10
IL-10
IL-10
TNF-α
TNF-α
TNF-α
IFN-γ
IFN-γ
IFN-γ
IL-1α IL-1β
EGF
GM-CSF
VEGF MCP-1
F.B. koraszülött- sepsis
IL-6 Biochip
30
1000
25
800
20
pg/ml
pg/ml
TNF-alfa Biochip
15 10
600 400 200
5 0
0 1
2
3
4
1
2
napok száma
2
4
3
4
IL-6 Bio-Plex
pg/ml
pg/ml
TNF-alfa Bio-Plex 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1
3 napok száma
3
napok száma
4
35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 1
2 napok száma
14
2008.09.26.
F.B. koraszülött- sepsis
Procalcitonin 10 8
1
2
3
4
ng/ml
pg/ml
IL-8 Biochip 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
napok száma
6 4 2 0
IL-8 Bio-Plex
1
2
3
4
napok száma
12000 10000 pg/ml
8000 6000 4000 2000 0 1
2
3
4
napok száma
K.Zs. újszülött, bakteriális majd vírusinfekció
TNF-alfa Biochip
IL-6 Biochip
20
pg/m l
pg/ml
15 10 5 0 1
3
5
7
700 600 500 400 300 200 100 0
9
1
3
5
napok száma
TNF-alfa Bio-Plex
9
IL-6 Bio-Plex 2000
60 50
1500
40
pg/ml
pg/ml
7
napok száma
30 20
1000 500
10
0
0 1
3
5 napok száma
7
9
1
3
5
7
9
napok száma
15
2008.09.26.
K.Zs. újszülött, bakteriális majd vírusinfekció
IL-2 Biochip
IL-8 Biochip 12
1000
10 8
pg/ml
pg/ml
800 600 400
6 4 2
200
0
0 1
3
5
7
1
9
3
5
7
9
7
9
7
9
7
9
napok száma
napok száma
IL-2 Bio-Plex
IL-8 Bio-Plex 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
15 pg/ml
pg/ml
20
10 5 0
1
3
5
7
1
9
3
5 napok száma
napok száma
K.Zs. újszülött, bakteriális majd vírusinfekció
Procalcitonin
25,0
25
20,0
20
15,0
15
ng/ml
pg/ml
Interferon-gamma Biochip
10,0 5,0
10 5
0,0
0 1
3
5
7
9
1
3
napok száma
Interferon-gamma Bio-Plex
CRP
200,0
500
150,0
400 mg/l
pg/ml
5 napok száma
100,0 50,0
300 200 100
0,0
0 1
3
5 napok száma
7
9
1
3
5 napok száma
16
2008.09.26.
Összefoglalás, konklúzió • A két módszerrel hasonló eredményekhez jutottunk:
n=54
IL-2
IL-4
IL-6
IL-8
IL-10
IF-γ
TF-α
r
0,82
0,84
0,92
0,88
0,83
0,83
0,90
Bio-Plex technikával a szélesebb dinamikus range miatt a változások súlyos infekcióban könnyebben követhetők A proinflamatorikus citokinek vizsgálata hamarabb jelzi az infekciót, mint a prokalcitonin és/vagy CRP Citokin panelek mérésével az infekció okára is következtethetünk Kevés minta szükséges, -70°C-on tároljuk
17
