diskový difuzní test s inhibitorem β-laktamázy (double-disc synergy test) širokospektré β-laktamázy (extended-spectrum β-lactamases)

SEZNAM ZKRATEK

DDS test

diskový difuzní test s inhibitorem β-laktamázy (double-disc synergy test)

ESBL

širokospektré β-laktamázy (extended-spectrum β-lactamases)

IRT

β-laktamázy TEM rezistentní k účinku inhibitorů (inhibitor-resistant TEM β-lactamases)

KMHA

MH agar s 5% ovčí krve

LCR

ligázová řetězová reakce (ligase chain reaction)

MBC

minimální baktericidní koncentrace (minimal bactericidal concentration)

MCMD

metoda založená na detekci mutace analýzou křivky tání (melting curve mutation detection)

MH agar

Mueller-Hinton agar

MIC

minimální inhibiční koncentrace (minimal inhibition concentration)

MRSA

Staphylococcus aureus rezistentní k methicilinu (methicilin-resistant Staphylococcus aureus)

NCCLS

National Committee for Clinical and Laboratory Standards

PBP

proteiny vázající penicilin (penicillin-binding proteins)

PCR

polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

PCR-RFLP

PCR založená na analýze polymorfismu délek restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism)

PCR-SSCP

PCR založená na analýze konformačního polymorfismu jednořetězcových vláken (single strand conformation polymorphism)

RSI-PCR

PCR využívající inserci restrikčních míst (restriction site insertion)

1. ÚVOD Antibiotika jsou přirozené látky produkované převážně mikroorganismy, které potlačují růst jiných organismů. Antibiotika se v určité formě užívaly již ve starém Egyptě, ale jejich skutečný rozvoj nastal až s Flemingovým objevem penicilinu v roce 1929. V klinické praxi byl penicilin poprvé použit až koncem druhé světové války. V roce 1940 vědci Abraham a Chain popsali první enzym schopný destrukce penicilinu u kmene Escherichia coli. Tento enzym byl pojmenován penicilináza, neboť o β-laktamové struktuře penicilinu se v té době ještě nevědělo. Dnes jsou enzymy schopné hydrolyzovat βlaktamový kruh penicilinu i jiných β-laktamových antibiotik známé pod termínem βlaktamázy. Tento objev byl prvním svědectvím o existenci bakteriální rezistence k účinku antibiotika. Během následujících desetiletí se rezistence bakterií rozšířila následkem nadměrného užívání antibiotik a také nesprávné indikaci antibiotik širokospektrých. V současné době je šíření bakteriální bakteriální rezistence k antimikrobiálním látkám jedním z nejdůležitějších a i nadále se rozvíjejících problémů v antimikrobiální léčbě. Ačkoliv se všeobecně soudí, že rozvoj bakteriální rezistence je pouze problémem nemocničního prostředí, v posledních letech se rezistence šíří i mezi původci komunitních infekcí. Rozvoj bakteriální rezistence je způsoben selekčním tlakem antibiotik. Vývoj nových antimikrobiálních látek připomíná nekonečný boj mezi schopností bakterií překonat jejich účinek a inteligencí vědců přijít s novou metodou, jak bojovat proti rezistentním mikroorganismům.

1

2. CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce bylo zpracovat přehled rozdělení β-laktamových antibiotik, popsat mechanismus jejich účinku a v návaznosti na to se věnovat mechanismům rezistence bakterií k β-laktamovým antibiotikům. Podat obecný přehled o metodách stanovení citlivosti bakterií k antimikrobiálním látkám a interpretaci získaných výsledků. Zabývat se nomenklaturou β-laktamáz a jejich klasifikací. Popsat metody průkazu rezistence bakterií k β-laktamovým antibiotikům a to jak na základě hodnocení jejich fenotypových vlastností, tak i přítomnosti genetických determinat takové rezistence.

2

3. β-LAKTAMOVÁ ANTIBIOTIKA β-laktamová antibiotika jsou nejpoužívanějšími antibakteriálními látkami. Mají schopnost usmrtit mikroorganismy blokováním syntézy buněčné stěny. V bakteriální buňce se βlaktamy vážou na enzymy transpeptidázy a karboxypeptidázy, které se účastní tvorby peptidoglykanu, základní složky buněčné stěny. β-laktamová antibiotika obsahují βlaktamový kruh, čtyřčlennou strukturu skládající se ze tří atomů uhlíku a jednoho atomu dusíku. Jednotlivé typy β-laktamů se liší složením dalšího kruhu připojeného na kruh βlaktamový (Walsh, 2003). 3.1 Mechanismus účinku β-laktamových antibiotik Poškození buněčné stěny probíhá třístupňovým mechanismem. Proteiny vázající penicilin (PBP, z angl. penicillin-binding proteins) jsou bílkoviny buněčné stěny bakterií, které vážou penicilin a jsou zásahovými místy β-laktamů. Každá bakteriální buňka má těchto bílkovin několik. Jedná se o enzymy, které se účastní biosyntézy buněčné stěny a buněčného růstu. Některé z nich potřebuje buňka k přežití. Proteiny vázající penicilin vytváří s antibiotikem stálé komplexy a sami přestávají být aktivní. Přerušení transpeptidace peptidoglykanu způsobí inhibici syntézy buněčné stěny. Zároveň se aktivují enzymy působící lyticky na buněčnou stěnu (Ferrari a Turnidge, 2003). Účinek β-laktamů na buněčnou stěnu bakteriální buňky včetně účinků jiných typů antibiotik na buněčné struktury a funkce znázorňuje Obrázek 1. Obrázek 1 Účinek antibiotik na bakteriální buňku (převzato z práce: Walsh, 2003)

3

3.2 Rozdělení β-laktamových antibiotik 3.2.1 Peniciliny Peniciliny jsou skupina přírodních nebo semisyntetických antibiotik obsahujících ve svém jádře kyselinu 6-aminopenicilanovou, která se skládá z β-laktamového kruhu připojeného ke kruhu thiazolidinovému. Strukturní vzorce penicilinů včetně vzorců ostatních typů βlaktamových antibiotik jsou znázorněny na Obrázku 2 na konci kapitoly 3. Peniciliny jsou produkovány mnoha druhy Penicillium spp. Jednotlivé skupiny penicilinů se navzájem liší substituenty v pozici 6, které modifikují jejich farmakokinetické a antimikrobiální vlastnosti. Peniciliny jsou účinné proti většině grampozitivních bakterií, některým gramnegativním bakteriím a anaerobům (Ferrari a Turnidge, 2003). Rozdělení penicilinů a jejich spektrum účinku Jednotlivé skupiny penicilinů se liší spektrem antimikrobiálního účinku, stabilitě vůči nízkému pH a citlivostí k β-laktamázám (enzymům inaktivujícím β-laktamová antibiotika, více v kapitole 6.3) (Mascaretti, 2003). Na základě těchto odlišností je můžeme členit do několika

skupin

zahrnujících

přírodní

peniciliny,

antistafylokokové

peniciliny,

aminopeniciliny a protipseudomonádové peniciliny. Přehledné rozdělení penicilinů a shrnutí jejich antimikrobiálních vlastností znázorňuje Tabulka 1. Přírodní peniciliny Penicilin G (benzylpenicilin) je efektivní proti kmenům Staphylococcus aureus citlivým k penicilinu, streptokokům, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, některým anaerobním kokům a tyčkám. Penicilin je lékem volby při syfilis (Ferrari a Turnidge, 2003). V léčbě bakteriálních infekcí se také používají intramuskulárně aplikované injekce sloučenin, které postupně uvolňují benzylpenicilin. Do této skupiny řadíme benzathin penicilin, clemizol penicilin a prokain penicilin (Finch a kol., 2003). Penicilin V (phenoxymethylpenicilin) má spektrum aktivity podobné penicilinu G. Od penicilinu G se odlišuje nižším antimikrobiálním účinkem proti streptokokům, gonokokům a stafylokokům (Finch a kol., 2003). Je stabilnější vůči působení β-laktamáz. Na rozdíl od penicilinu G je acidorezistentní, proto se podává per os (Ferrari a Turnidge, 2003) Antistafylokokové peniciliny Antistafylokokové peniciliny jsou méně aktivní než benzylpenicilin, ale rezistentní k

4

účinku penicilináz, proto slouží jako efektivní antibiotikum při léčbě infekcí způsobených kmeny Staphylococcus aureus produkujících penicilinázu. Jejich charakteristickou vlastností je schopnost inhibovat růst stafylokoků, streptokoků, gonokoků a meningokoků. Mají nízkou antimikrobiální aktivitu proti enterokokům, Haemophilus influenzae nebo enterobakteriím. Jako první byl do praxe zaveden methicilin. Později byl nahrazen acidorezistentními isoxazolyl peniciliny (Ferrari a Turnidge, 2003). Aminopeniciliny Aminopeniciliny mají spektrum účinku podobné penicilinu G, ale jsou více aktivní proti enterokokům, Listeria monocytogenes a působí i na gramnegativní bakterie. Ačkoliv mají schopnost inhibovat kmeny H. influenzae, více než 25% izolátů je rezistentních obvykle z důvodu produkce β-laktamáz. Salmonely, shigely, mnoho kmenů Escherichia coli a Proteus mirabilis jsou k těmto látkám citlivé (Ferrari a Turnidge, 2003). Aminopeniciliny nejsou odolné působení β-laktamáz, ale v kombinaci s inhibitorem vykazují vysokou aktivitu proti izolátům produkujícím tyto enzymy (Finch a kol., 2003). Protipseudomonádové peniciliny Karboxypeniciliny jsou náchylné ke stafylokokovým β-laktamázám, ale naopak více hydrolyticky stabilní k β-laktamázám enterobakterií a Pseudomonas aeruginosa. Nejsou účinné na Klebsiella spp. Ureidopeniciliny jsou in vivo efektivnější proti streptokokům a enterokokům než karboxypeniciliny a inhibují více než 75% kmenů Klebsiella spp. Jsou vysoce účinné na enterobakterie a anaeroby (Ferrari a Turnidge, 2003).

3.2.2 Cefalosporiny Cefalosporiny jsou antimikrobiální látky produkované Cephalosporium acremonium. Základem cefalosporinových antibiotik je kyselina 7-aminocefalosporanová, která se skládá z β-laktamového kruhu spojeného s dihydrothiazinovým cyklem. V pozici 3 a 7 se mohou nacházet různé substituenty, které mění antimikrobiální aktivitu jednotlivých cefalosporinů (Ferrari a Turnidge, 2003). Rozdělení cefalosporinů a jejich spektrum účinku Cefalosporiny se dělí do čtyř skupin neboli generací. Jednotlivé skupiny se liší svým

5

spektrem účinku, farmakokinetickými vlastnostmi a stabilitou vůči β-laktamázám (Mascaretti, 2003). Přehled generací cefalosporinů včetně jejich zástupců znázorňuje Tabulka 2. Cefalosporiny 1. generace Jednotlivá antibiotika této skupiny mají podobnou aktivitu proti grampozitivním bakteriím, zejména stafylokokům, na gramnegativní mikroorganismy působí slaběji. Používají se k léčbě infekcí vyvolaných k penicilinu citlivými i rezistentními kmeny S. aureus a streptokokům. Enterokoky, stafylokoky rezistentní k methicilinu a Staphylococcus epidermidis jsou k těmto cefalosporinům rezistentní. Infekce způsobené některými druhy čeledi Enterobacteriaceae jako E. coli, Klebsiella spp. a P.

mirabilis je možné léčit

cefalosporiny 1. generace.

Pseudomonády a Enterobacter spp. jsou k jejich účinku rezistentní. Mají rovněž nízkou aktivitu proti H. influenzae (Ferrari a Turnidge, 2003). Cefalosporiny 2. generace Cefalosporiny 2. generace jsou odolné vůči β-laktamázám, působí proto i na kmeny rezistentní k cefalosporinům 1. generace (Ferrari a Turnidge, 2003). Ve srovnání s předešlou skupinou antibiotik jsou dobře účinné proti H. influenzae, Moraxella catarrhalis, meningokokům, gonokokům a některým kmenům Enterobacter spp. Do této skupiny cefalosporinů náleží i cefamyciny, které navíc účinkují proti Bacteroides fragilis (Mascaretti, 2003). Cefalosporiny 3. generace Cefalosporiny

3.

generace

nejsou

vnímavé

k většině

cefalosporináz

(enzymům

inaktivujícím cefalosporinová antibiotika). Ve srovnání s předešlými generacemi mají široké spektrum antimikrobiálního účinku. Mají nižší účinek proti grampozitivním kokům a naopak lépe působí na enterobakterie, P. aeruginosa, Haemophilus spp. a Neisseria spp. produkující cefalosporinázy (Mascaretti, 2003). Cefalosporiny 4. generace Cefalosporiny 4. generace jsou zaváděny do terapie až v poslední době. Mají sníženou afinitu

a vysokou stabilitu k β-laktamázám 1. třídy. Jsou tedy účinné na grampozitivní

bakterie, na enterobakterie a P. aeruginosa, které produkují tyto β-laktamázy. Nepůsobí na enterokoky a anaerobní bakterie. Počítá se s nimi v léčbě závažných smíšených infekcí (Ferrari a Turnidge, 2003).

6

Tabulka 1 Rozdělení, charakteristika a spektrum antimikrobiálního účinku penicilinů (vypracováno podle: Ferrari a Turnidge, 2003; Mascaretti, 2003) KATEGORIE

CHARAKTERISTIKA

ANTIBIOTIKA

CITLIVÉ BAKTERIE

přírodní

úzké spektrum účinku, citlivé

penicilin G

S. aureus, streptokoky,

peniciliny

k β−laktamázám, acidolabilní

penicilin V

N. gonorrhoeae, N. meningitidis,

prokain penicilin

P. multocida, anaeroby

antistafylokokové

úzké spektrum účinku,

methicilin

S. aureus produkující penicilinázu,

peniciliny

rezistentní k β-laktamázám,

nafcilin

jiné stafylokoky, streptokoky,

acidolabilní

isoxazolyl peniciliny

gonokoky, meningokoky

cloxacilin dicloxacilin flucloxacilin oxacilin

aminopeniciliny

citlivé k účinku β−laktamáz,

ampicilin

spektrum účinku shodné s

používají se spolu s inhibitory

amoxicilin

přírodními peniciliny, aktivnější

β−laktamáz

bacampicilin

proti enterokokům, gramnegativním

ciclacilin

bakteriím (salmonelám, shigelám, E. coli, P. mirabilis, H. influenzae)

protipseudo-

citlivé k β-laktamázám

monádové

stafylokoků, stabilní k

tikarcilin

anaeroby (B. fragilis)

peniciliny

β-laktamázám enterobakterií

indanylkarbenicilin

streptokoky, enterokoky,

a P. aeruginosa

karboxypeniciliny

ureidopeniciliny piperacilin azlocilin mezlocilin

7

Enterobacteriaceae, P. aeruginosa

Neisseria spp.

Tabulka 2 Přehled cefalosporinů, jejich vlastnosti a spektrum antimikrobiálního účinku (vypracováno podle: Ferrari a Turnidge, 2003; Mascaretti, 2003)

GENERACE

CHARAKTERISTIKA A

ANTIBIOTIKUM

SPEKTRUM ÚČINKU cefalosporiny

citlivé k β-laktamázám, účinné

cefadroxil, cefazolin

1. generace

na grampozitivní bakterie - S. aureus citlivému

cefalexin, cefaloridin,

k methicilinu, aerobní i anaerobní

cefalothin, cefapirin

streptokoky, na gramnegativní bakterie

Cefradin

cefalosporiny

odolné účinku β-laktamáz, mají shodné spektrum

cefaclor, cefamandol

2. generace

s cefalosporiny 1. generace, vykazují vyšší

cefonicid, ceforanid

antimikrobiální účinek proti H. influenzae,

cefuroxim, cefproxil

M. catarrhalis, meningokokům, gonokokům,

Loracarbef

Enterobacter spp. a anaerobům

cefamyciny (cefmetazol, cefotetan, cefoxitin)

cefalosporiny

rezistentní k cefalosporinázám, široké spektrum

cefdinir, cefditoren

3. generace

účinku, menší účinek na grampozitivní koky,

cefixim, cefoperazon,

lépe působí proti enterobakteriím a P. aeruginosa,

cefotaxim, cefpodoxim,

H. influenzae a neisseriím

ceftazidim, ceftibuten, ceftizoxim, ceftriaxon

cefalosporiny

snížená afinita a vysoká stabilita k β-laktamázám

Cefepim

4. generace

1. třídy, účinné na grampozitivní bakterie,

Cefpirom

enterobakterie a P. aeruginosa, použití k léčbě závažných smíšených infekcí

8

3.2.3 Monobaktamy Jediným klinicky užívaným monobaktamem je aztreonam. V jeho molekule jsou na monocyklickém

jádře připojeny různé řetězce kyselin, které tato antibiotika modifikují.

Monobaktamy se vážou primárně na PBP gramnegativních aerobů včetně P. aeruginosa. Nejsou hydrolyzovány většinou β-laktamáz a neindukují jejich produkci. Působí na zástupce čeledi Enterobacteriaceae včetně rodů Enterobacter a Serratia; jsou účinné také na neisserie a hemofily. Mnoho bakterií jako na příklad Acinetobacter spp., Burkholderia cepacia a Stenotrophomonas maptophilia jsou k jejich účinku rezistentní. Nepoužívají se k léčbě infekcí vyvolaných grampozitivními koky a anaeroby (Ferrari a Turnidge, 2003).

3.2.4 Karbapenemy Ve své struktuře se karbapenemy liší od jiných β-laktamů hydroxylethylovým postranním řetězcem v poloze trans v pozici 6 a absencí atomů síry a kyslíku v bicyklickém jádře. Karbapenemy v sobě spojují účinek penicilinů a širokospektrých cefalosporinů, pokrývají témeř celé spektrum bakterií. Výborně účinkují na aerobní grampozitivní bakterie, na 90% kmenů čeledi Enterobacteriaceae a jsou to nejvhodnější β-laktamová antibiotika proti anaerobům. Mají vysokou afinitu k PBP. Nepodléhají hydrolýze většinou β-laktamáz včetně širokospektrých, ale k β-laktamázám S. maltophilia a některých kmenům B. fragilis nejsou stabilní (Ferrari a Turnidge, 2003). Některé účinkují také jako inhibitory těchto enzymů (Finch a kol., 2003). Prvním klinicky užívaným karbapenemem byl imipenem. Využítí samotného imipenemu se ukázalo neúčelné, protože je v ledvinách odbouráván. Imipenem se proto kombinuje s cilastinem, který chrání imipenem před jeho odbouráváním. Dalšími zástupci karbapenemů je meropenem a ertapenem (Ferrari a Turnidge, 2003). 3.2.5 Inhibitory β-laktamáz Tyto látky mají podobnou strukturu jako β-laktamová antibiotika, liší se od nich absencí antibakteriálního účinku; jejich strukturní vzorce jsou uvedeny na obrázku 3. Podávají se v preparátech spolu s β-laktamovými antibiotiky. Nejpoužívanějším inhibitorem je kyselina klavulanová, do této skupiny látek řadíme i sulbaktam a tazobaktam. Fungují jako efektivní inhibitory bakteriálních β-laktamáz, na které se vážou za vzniku ireverzibilních komplexů. Touto vazbou se sami inaktivují a zároveň dojde ke ztrátě hydrolytického účinku β-laktamáz. Mohou tak ochránit peniciliny před jejich inaktivací (Finch a kol., 2003). Nejčastější kombinace inhibitorů s β-laktamy včetně názvů používaných preparátů obsahuje Tabulka 3. 9

Kyselina klavulanová Kyselina klavulanová je produkovaná plísní Streptomyces clavuligerus. Působí ve spojení s různými peniciliny a cefalosporiny. Používá se při léčbě infekcí vyvolaných bakteriemi produkujícími β-laktamázy, především stafylokoky, klebsielami a jinými enterobakteriemi, H. influenzae. M. catarrhalis, N. gonorrhoeae a B.

fragilis. Induktivní β-laktamázy

enterobakterií ale nejsou působením kyseliny klavulanové inhibovány (více v kapitole 6.3) (Finch a kol., 2003). Sulbaktam Sulbaktam

je

semisyntetický

sulfon

kyseliny

6-deaminopenicilanové

se

slabou

antimikrobiální aktivitou. Funguje jako efektivní inhibitor určitých β-laktamáz S. aureus, enterobakterií, H. influenzae, M. catarrhalis, Neisseria spp. a Legionella spp. Působí i na některé anaeroby a Mycobacterium spp. Podobně jako kyselina klavulanová nemá schopnost inhibovat induktivní β-laktamázy enterobakterů, citrobakterů, indolpozitivních proteů a pseudomonád. Samotný sulbaktam je účinný proti

N. gonorrhoeae, N. meningitidis a

některým acinetobakterům (Ferrari a Turnidge, 2003). Tazobaktam Tazobaktam je sulfonový derivát kyseliny penicilanové, je strukturně příbuzný sulbaktamu. Inhibuje β-laktamázy stafylokoků, dále bakteriálních druhů H. influenzae, N. gonorrhoeae, E. coli a B. fragilis. Dobře působí i na acinetobaktery, citrobaktery, protey, prevotely a morganely produkující β-laktamázy 1. třídy. Enterobacter spp., Pseudomonas spp. a klebsiely jsou k tazobaktamu citlivé (Ferrari a Turnidge, 2003).

Tabulka 3 Kombinace inhibitorů β-laktamáz s β-laktamovými antibitotiky (upraveno podle práce: Ferrari a Turnidge, 2003) β−LAKTAM β−

INHIBITOR

NÁZEV PREPARÁTU

ampicilin

+

sulbaktam

Unasyn

tikarcilin

+

kyselina klavulanová

Timentin

amoxicilin

+

kyselina klavulanová

Augmentin

piperacilin

+

tazobaktam

Zosyn

10

Obrázek 2 Strukturní vzorce β-laktamových antibiotik (převzato z práce: Ferrari a Turnidge, 2003) a) peniciliny

b) cefalosporiny

c) monobaktamy

d) karbapenemy

Obrázek 3 Inhibitory β-laktamáz (převzato z práce: Finch a kol., 2003) a) kyselina klavulanová

b) sulbaktam

11

c) tazobaktam

4. STANOVENÍ CITLIVOSTI BAKTERIÍ K ANTIBIOTIKŮM Zjištění citlivosti dané bakterie k antimikrobiálním látkám je jednou z hlavních funkcí klinických mikrobiologických laboratoří. Tyto testy se obvykle neprovádí u infekcí způsobených mikroorganismy, které jsou vysoce citlivé na určité antibiotikum, a u kterých nebyla rezistence dosud zaznamenána. U některých mikroorganismů lze předvídat jejich citlivost a empirická terapie při léčbě jimi způsobených infekcí je stále užívaná. Citlivost k antibiotikům se testuje nejčastěji u bakterií, o nichž se předpokládá možnost rezistence k běžně užívaným antibiotikům. Stanovení citlivosti na antibiotika je také důležité v epidemiologických studiích rezistence a při vývoji nových antibiotik (NCCLS, 2002). Metodika, interpretace získaných výsledků citlivosti bakterií k antimikrobiálním látkám a v neposlední řadě standardizace interpretačních kritérií se řídí určitými pravidly. Jednou z organizací vyvíjející normy pro testování je NCCLS (US National Committee for Clinical and Laboratory Standards), jedná se o mezinárodní, neziskovou, vzdělávací organizaci, která podporuje rozvoj a užívání dobrovolných schválených standardů a směrnic ve zdravotní péči (NCCLS, 2002). Do současné doby nebyla vypracována žádná jednotná mezinárodní standardizace těchto metod (Ferrari a Turnidge, 2003). Přední uznávanou organizací však zůstává NCCLS; standardizace testování citlivosti bakterií k antimikrobiálním látkám jsou popsány v metodologických listech této organizace.

4.1 Výběr antibiotika pro stanovení citlivosti Při výběru antibiotika pro stanovení citlivosti příslušných mikroorganismů musí brát laboratoř zřetel na druh mikroba, který způsobuje infekci, na lokalizaci infekce (mozkomíšní mok, krev, moč,…), druh pacienta a zdravotnické zařízení, ve kterém je tento pacient léčen. Výběr antibiotika by měl minimalizovat možnost selekce multirezistentních kmenů vzniklých z důvodu užívání širokospektrých antibiotik (NCCLS, 2002). Pro testování se obvykle vybírá jeden zástupce z dané skupiny antimikrobiálních látek (Ferrari a Turnidge, 2003).

4.2 Výběr půdy, příprava inokula a podmínky inkubace Testování citlivosti k antibiotikům se provádí na půdách, které obsahují dostatek živných látek nezbytných pro přiměřený růst vyšetřované bakterie a malé nebo žádné množství inhibitorů antibiotik. Při výběru kultivační půdy se bere zřetel na druh mikroba. MuellerHinton (MH) agar nebo bujón jsou standardní půdy pro vyšetření citlivosti gramnegativních střevních tyček, stafylokoků, enterokoků, Pseudomonas aeruginosa a ostatních rychle 12

rostoucích nenáročných bakterií. MH agar s 5% ovčí krve (KMHA) se používá pro náročnější bakterie (na příklad pneumokoky, streptokoky, meningokoky). Bakterie se speciálními růstovými nároky vyžadují speciální kultivační půdy (Urbášková, 1997). Na příslušné půdy či do příslušného bujónu se očkuje suspenze vyšetřované bakteriální kultury. Stáří, koncentrace a způsob přípravy inokula významným způsobem ovlivňuje výsledky vyšetření citlivosti. Inokulum se připravuje z kultury staré maximálně 24 hodin a izolované na neselektivní půdě. V rutinní praxi se používá nepřímá metoda měření zákalu vytvořeného buňkami v tekutém prostředí, který do jisté míry odpovídá jejich koncentraci. Vztah mezi zákalem a počtem buněk závisí na druhu bakterie, morfologii a na stáří kultury. Zákal lze měřit opticky nebo porovnáním ze standardem McFarlanda, nejčastěji se používá zákalový standard 0,5-1 McFarlanda (Urbášková, 1997). Naočkované půdy se inkubují v termostatu při 36 oC, zajištění příslušné atmosféry po dobu 24 hodin, anaeroby je nutno kultivovat 24-72 hodin. Po příslušné době inkubace se hodnotí výsledek testu (Urbášková, 1997).

4.3 Interpretační kategorie Výsledkem testu citlivosti bakterií k antibiotikům jsou hodnoty MIC nebo velikost zóny inhibice růstu. Forma výsledku závisí na druhu použité metody. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) antimikrobiální látky je nejnižší množství antibiotika, které inhibuje viditelný růst. MIC se vyjadřuje v µg/ml nebo mg/l. Hodnota MIC však není hodnotou absolutní. Skutečná MIC leží někde mezi nejnižší koncentrací antibiotika, která inhibuje růst bakterie (tj. hodnota MIC, kterou odečteme) a vedlejší nižší testovanou koncentrací antibiotika. Na příklad při odečtení hodnoty MIC=16 mg/l leží pravdivá hodnota MIC mezi 16 a 8 mg/l. Druhým výsledkem je velikost zóny inhibice růstu, která se měří kolem disků s příslušnou koncentrací antibiotika (NCCLS, 2002). Minimální baktericidní koncentrace (MBC) odpovídá nejnižší naměřené koncentraci antibiotika in vitro, která usmrtí exponovanou bakteriální kulturu v průběhu 24 hod. Průkaz spolehlivosti baktericidního účinku spočívá v následné kultivaci na agarových půdách, kde nemají vyrůst žádné kolonie bakterií. U antibiotik se silným baktericidním účinkem jsou rozdíly mezi MIC a MBC malé (Ferrari a Turnidge, 2003). Hodnoty MIC a velikost inhibiční zóny kolem disků se poté porovnávají s hraničními hodnotami pro citlivé kmeny neboli break-pointy a na jejich základě se vyšetřovaný

13

bakteriální izolát zařadí do jedné ze tří kategorií - citlivý, středně citlivý nebo rezistentní. Hodnoty break-pointů, podle kterých se testovaný mikrob označí za citlivý, jsou vytvořeny na základě koncentrace antibiotika dostupné v tělních tekutinách při použití maximálních možných terapeutických dávek. Bakterie je k testovanému antibiotiku citlivá, je-li zjištěná hodnota MIC o více než jedno ředění menší vhledem k break-pointům navrženým pro citlivé kmeny, popřípadě je-li průměr inhibiční zóny dvakrát a vícekrát větší než break-pointy vyvinuté pro diskové difuzní testy (Ferrari a Turnidge, 2003). Citlivost daného testovaného izolátu znamená, že s vysokou pravděpodobností bude jím způsobená infekce vyléčena, jestliže bude antibiotikum aplikováno v příslušné koncentraci dosažitelné v místě infekce (v séru, v tkáni). Tato cílová koncentrace nezávisí pouze na farmakokinetických vlastnostech antibiotika, ale také na jeho doporučené dávce, která se v jednotlivých zemích liší. Kategorie středně

citlivý

(intermediátní)

zamezuje

chybám

v

interpretaci,

kdy

rezistentní

mikroorganismus by byl označen za citlivý a naopak. Kategorie rezistentní značí, že infekce nebude daným antibiotikem vyléčena, neboť při běžném dávkování bude dosažitelná koncentrace antibiotika v místě infekce nižší než hodnota MIC vyšetřovaného mikroba (NCCLS, 2002). Break-pointy pro diskový difuzní test bývají odvozeny z break-pointů pro vyhodnocování MIC, tyto hodnoty tedy mezi spolu vzájemně korelují. Jejich vztah lze vyjádřit pomocí lineární regresní přímky (Ferrari a Turnidge, 2003).

4.4 Metody pro vyšetření citlivosti mikrobů k antibiotikům 4.4.1 Diluční metody Diluční metody se používají k určení minimální koncentrace antibiotika potřebného k inhibici růstu vyšetřovaného mikroba. Vyšetření se provádí na agarových nebo v bujónových půdách, které obsahují zvolené koncentrace antibiotik, obvykle ředěné v dvojnásobné geometrické řadě. Do půd se očkuje standardní inokulum testovaného mikroba. Po příslušné době inkubace se odečítá minimální inhibiční koncentrace (MIC). Kvalita výsledků závisí na přesném dodržení metody a ověřuje se systémem kontrol (Urbášková, 1997). Diluční metody jsou flexibilní, standardní médium může být nahrazeno jiným médiem k vyšetření kultivačně náročnějších mikroorganismů. Poskytuje kvantitativní výsledky a zařazuje mikroorganismy do kategorií (citlivé, středně citlivé nebo rezistentní) (Ferrari a Turnidge, 2003). Kmeny s MIC daného antibiotika shodnou nebo nižší než je hraniční koncentrace pro citlivé kmeny se označí jako citlivé k tomuto antibiotiku (Urbášková, 1997).

14

Diluční metody jsou preferovány pro vyšetření izolátů z krve, likvoru a jiných normálně sterilních tělních tekutin, kdy má stupeň kvantitativní citlivosti vliv na výběr antibiotika a jeho množství použité v léčbě. Tyto metody také slouží k vyhledávání neobvyklé rezistence. Diluční metody zahrnují agarovou a bujónovou diluční metodu (Urbášková, 1997).

4.4.1.1 Agarová diluční metoda Minimální inhibiční koncentrace se hodnotí na agarových půdách, které obsahují zvolené koncentrace antibiotika. Obvykle se připravuje 12-15 koncentrací jednoho antibiotika ředěného dvojnásobně geometrickou řadou. Na půdy se očkuje standardní inokulum vyšetřovaných bakterií a po příslušné době inkubace se odečítá nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibuje růst neboli MIC. Získaná hodnota se porovnává s hraničními koncentracemi pro citlivé kmeny. Kmeny s MIC daného antibiotika shodnou nebo nižší než je hraniční koncentrace pro citlivé kmeny se označí jako citlivé k tomuto antibiotiku (Urbášková, 1997). Výhody a nevýhody agarové diluční metody Agarová diluční metoda je vysoce standardizovanou referenční metodou užívanou převážně v Evropě, lze ji užít k hodnocení přesnosti ostatních metod. Pomocí této metody máme možnost vyšetřit citlivost velkého souboru kmenů. Je spolehlivá k hodnocení účinnosti nových antibiotik. Ve srovnání s diluční mikrometodou spolehlivěji odhaluje kontaminaci kmenů a lépe detekuje heterorezistenci. Metoda je ovšem pracná a ekonomicky náročná, proto není praktická pro vyšetření citlivosti malého množství kmenů (Ferrari a Turnidge, 2003).

4.4.1.2 Bujónové diluční metody Vyšetření citlivosti pomocí těchto metod se provádí nejčastěji v MH bujónu s upravenou koncentrací vápníku a hořčíku. Tyto metody zahrnují diluční makrometodu a diluční mikrometodu (Ferrari a Turnidge, 2003). Diluční makrometoda Diluční makrometoda (zkumavková) se provádí ve 13 zkumavkách o výšce 100 milimetrů, které obsahují kultivační médium. Do těchto zkumavek se aplikuje 1 ml různých koncentrací antibiotik a poté se přidá 1 ml inokula. Připraví se také zkumavka obsahující pouze inokulum, která slouží pro kontrolu kvality růstu. Po příslušné době inkubace se odečítá MIC.

15

Nárůst či inhibice růstu v jednotlivých zkumavkách s danou koncentrací antibiotika se porovnává se zkumavkou pro kontrolu růstu (NCCLS, 2002). Je to vysoce standardizovaná metoda používaná především pro výzkumné účely nebo při testování citlivosti dané bakterie pouze k jednomu antibiotiku. Z důvodu její vysoké pracnosti se v rutinním testování v klinických laboratořích nepoužívá (Ferrari a Turnidge, 2003). Diluční mikrometoda Při této metodě se používá pouze malé množství tekutého média rozplněného v jamkách plastikové mikrotitrační destičky obvykle po 0.05 až 0.1 ml. Minimální inhibiční koncentrace se hodnotí v jamkách mikrotitrační destičky (obvykle s 96 jamkami), která obsahuje zvolené koncentrace antibiotika v bujónu. Obvykle se připravuje 8 koncentrací jednoho antibiotika. Na jedné destičce je možné vyšetřit MIC jednoho izolátu k 12 různým antibiotikům. Destičky s příslušnými koncentracemi antibiotika potřebné pro mikrodiluční metodu lze připravit přímo v laboratoři nebo získat od komerčních výrobců. Do jamek se očkuje standardní inokulum vyšetřovaných bakterií. Po inkubaci se destičky umístí na tmavou podložku. Růst vyšetřovaného kmene se projevuje jako zákal nebo sediment na dně jamky. Růst v jamkách s antibiotikem se porovnává s růstem v kontrolní jamce. Odečte se koncentrace, která zřetelně inhibuje růst (MIC) a porovná se s hraničními hodnotami pro citlivé kmeny (Urbášková, 1997). Výhody a nevýhody diluční mikrometody Diluční mikrometoda je snadná a časově nenáročná na rozdíl od diluční makrometody. Koncentrace inokula neovlivňuje výsledek tak významně jako u diskové difuzní metody nebo Etestu. Nevýhodou tohoto testu je stabilní sestava a koncentrace antibiotik v komerčně vyráběných destičkách, která často nevyhovuje potřebám v laboratoři. Metoda má také malou schopnost detekce rezistentní subpopulace některých bakterií nebo rezistence způsobené některými novými mechanismy. Touto metodou se obtížně rozeznává kontaminace a nelze ji použít pro kmeny, které v tekutém prostředí autolyzují (Urbášková, 1997).

4.4.2 Disková difuzní metoda Disková difuzní metoda umožňuje zařadit testovaný bakteriální izolát do kvalitativní kategorie (citlivý nebo rezistentní). Při pečlivém provedení a přísném dodržení postupu se výsledky získané touto metodou vysoce shodují s výsledky dilučních metod. Citlivost nebo rezistenci stanovíme podle toho, zda vyšetřovaná bakterie na agarové půdě vytvoří či 16

nevytvoří příslušnou zónu inhibice růstu kolem disků s určitou koncentrací antibiotika po předepsané době inkubace. Průměr zóny inhibice se u jednotlivých antibiotik liší v závislosti na rychlosti jejich difuze z disku a je v obráceném poměru k jejich minimální inhibiční koncentraci (Ferrari a Turnidge, 2003). Vyšetření provádíme na MH agaru, některé bakterie vyžadují půdy obohacené. Inokulum se aplikuje roztěrem pomocí sterilního tampónu nebo přelitím agaru. Na takto naočkované půdy se kladou antimikrobiální disky, na plotnu o průměru 90 mm lze obvykle položit 5-6 disků. Disky se rozmístí do kruhu, přičemž vzdálenosti mezi středy disků a vzdálenost disků od kraje plotny musí být přibližně 25 mm (Urbášková, 1997). Po inkubaci se měří průměr inhibičních zón. Velmi jemný nárůst na okrajích zón se ignoruje. Přítomnost drobných kolonií uvnitř inhibiční zóny se hodnotí jako rezistence. Průměr zóny inhibice se porovnává s referenčními (hraničními) hodnotami pro citlivé kmeny. Vytvoří-li vyšetřovaný izolát inhibiční zónu o stejném nebo větším průměru než je hraniční hodnota, pokládá se za citlivý k danému antibiotiku. Vytvoření inhibiční zóny o menším průměru se považuje za rezistenci (Urbášková, 1997). Výhody a nevýhody diskové difuzní metody Metoda se pro svou snadnost a jednoduchost používá v rutinní praxi. Nevyžaduje speciální přístrojové vybavení a náklady ve srovnání s jinými metodami jsou nižší. Metoda vyhovuje většině klinických požadavků na vyšetření citlivosti. Nelze ji ale použít pro mikroby s nízkou rychlostí růstu, se speciálními kultivačními nároky a pro anaeroby. Výsledky jsou významně ovlivněny koncentrací inokula. Kvalitativní výsledek nepostačuje pro výběr antibiotika a jeho dávek k léčbě některých infekcí (sepse, endokarditidis, meningitidis) (Urbášková, 1997).

4.4.3 Etest Etest je metoda pro kvantitativní vyšetření citlivosti, která kombinuje principy diskové difuzní a diluční metody. Pro vysoký stupeň shody s výsledky MIC získanými referenční agarovou diluční metodou je Etest vhodný k vyšetření MIC antimikrobiálních látek u řady mikrobů včetně náročných bakterií a anaerobů. Etest je inertní plastikový proužek, který na své jedné straně obsahuje exponenciální gradient koncentrací stabilizované antimikrobiální látky v tuhém stavu. Na druhé straně proužku je vyznačen kód antibiotika a kontinuální stupnice, obvykle odpovídá rozmezí 15 ředění dvojnásobně geometrickou řadou. Stupnice slouží k odečítání MIC. Na povrch agaru, naočkovaného inokulem testovaného mikroba, se

17

přiloží Etest stranou, která obsahuje antimikrobiální látku. Po inkubaci se vytvoří kolem proužku elipsa inhibovaného růstu. Minimální inhibiční koncentrace se odečítá v místě, kde elipsa přetíná okraj proužku. Vzhledem k tomu, že výsledky MIC získané Etestem se většinou shodují s výsledky získanými agarovou diluční metodou, používají se k jejich interpretaci stejné hraniční koncentrace (Urbášková, 1997). Výhody a nevýhody Etestu Pro jednoduchost provedení a možnost stanovení MIC jednotlivého antibiotika se metoda osvědčila v rutinní praxi jako doplnění nebo upřesnění výsledků získaných diskovou difuzní metodou. Ve srovnání s bujónovou diluční metodou Etest spolehlivěji odhaluje kontaminaci kmenů a lépe detekuje heterorezistenci. Nevýhodou je vysoká cena a skutečnost, že jsou výsledky vysoce ovlivněny koncentrací inokula (Urbášková, 1997).

5. REZISTENCE BAKTERIÍ K ANTIBIOTIKŮM Rezistenci bakterie k antimikrobiálnímu přípravku lze definovat jako schopnost bakteriální populace přežít účinek inhibiční koncentrace příslušného antibiotika. V současné době je bakteriální rezistence jedním z nejdůležitějších problémů při léčbě antibiotiky (Kolář a kol., 2002). Rozlišujeme dva základní typy rezistence. Bakteriální rezistence může být přirozená (primární) nebo získaná (sekundární). Přirozená rezistence je dána druhem bakterie a jejími přirozenými vlastnostmi. Odpovídá geneticky podmíněné necitlivosti bakterií na dané antibiotikum bez ohledu na předchozí kontakt s tímto antibiotikem. Primárně rezistentní bakterie neprodělaly žádnou genetickou změnu, jsou odolné z toho důvodu, že pro dané antibiotikum nenesou zásahové místo. Přirozená vícenásobná rezistence se také může vyskytovat u bakterií žijících v prostředí s mikroorganismy (ve vodě, v půdě), které přirozeně produkují antimikrobiální látky a jsou tedy vystavovány jejich účinku (Ferrari a Turnidge, 2003). Získaná rezistence vzniká až v průběhu antimikrobiální terapie nebo následkem předchozího podávání antibiotika. Antibiotikum ničí citlivé buňky v bakteriální populaci, ale může dojít k selekci buněk rezistentních. V této souvislosti se tedy mluví o tzv. selekčním tlaku antibiotik. Rychlost rozvoje sekundární rezistence závisí na frekvenci mutací a na množství bakterií s určitým stupněm rezistence (Ferrari a Turnidge, 2003).

18

5.1 Genetická podstata získané rezistence Získaná rezistence chromozomální vzniká jako následek jedné či více mutací na bakteriálním chromozomu. Všechna antibiotika mají svá cílová zásahová místa, jsou to často proteiny s důležitou funkcí pro růst buňky. Tyto proteiny jsou kódovány buněčnými geny. Interakce mezi antibiotikem a zásahovým místem je specifická a změna jen jedné báze genu může toto místo pozměnit natolik, že se antibiotikum na něj nenaváže, nemůže tak působit na bakteriální buňku a ta se stane k antibiotiku rezistentní (Ferrari a Turnidge, 2003). Extrachromozomální

rezistence

spočívá

v převzetí

genetického

materiálu

od

rezistentních bakteriálních buněk. Tento typ rezistence se nejčastěji šíří přenosem genů umístěných na plazmidech prostřednictvím konjugace, která má ze všech způsobů přenosu genů (konjugace, transdukce a transformace) pro rezistenci největší význam (Kolář a kol., 2002). Za určitých okolností může dojít i k mutaci genů podmiňujících rezistenci, která vede k zesílení rezistence nebo ke vzniku rezistence k jinému antibiotiku. Příkladem je mutace genů blaTEM kódujících β-laktamázu TEM. Tato mutace byla objevena v době, kdy se začaly ve

větší

míře

používat

cefalosporiny

3.

generace

k léčbě

infekcí

způsobených

gramnegativními bakteriemi. Tato antibiotika jsou primárně odolná β-laktamázám, ale mutacemi blaTEM genů vzniká nová forma β-laktamázy TEM, která chrání bakterie účinku cefalosporinových antibiotik 3. generace (Ferrari a Turnidge, 2003).

5.2 Obecné mechanismy bakteriální rezistence Získaná antimikrobiální rezistence má svůj původ v biochemických procesech, které jsou kódované bakteriálními geny (Ferrari a Turnidge, 2003). Nejdůležitější mechanismy bakteriální rezistence u jednotlivých skupin antibiotik jsou následující:


enzymatická inaktivace antibiotika modifikací jeho struktury




modifikace cílových molekul pro antibiotikum




omezení přístupu k zásahovému místu




aktivní vypuzování antibiotika

5.3 Prevence vzniku a šíření bakteriální rezistence Prevenci vzniku a šíření rezistence bakterií k antimikrobiálním látkám je nutné vnímat ve dvou základních rovinách, a to jako prevenci získání genetické informace vedoucí k rezistenci 19

a prevenci šíření rezistentních bakteriálních kmenů. Získání nových genů prostřednictvím plazmidů probíhá pravděpodobně kontinuálně, ale na nízké úrovni, která pro klinickou praxi není významná. K hlavní příčině, která umožňuje bakteriím s novou genetickou informací přežít a pomnožit se, je právě aplikace antibiotik. Při každé aplikaci antibiotika dochází k usmrcení citlivé bakteriální populace a s tím souvisejícímu pomnožení rezistentní bakteriální mikroflóry. Hlavní součástí prevence je tedy racionální aplikace antimikrobiálních látek. Prevence šíření rezistentních bakteriálních kmenů znamená prevenci šíření z jedné osoby na druhou a ve zdravotnických institucích

je nejdůležitější součástí prevence

nosokomiálních nákaz. Hlavním nástrojem je přísné dodržování základních hygienických režimů včetně izolace pacientů s prokázaným výskytem nebezpečných multirezistentních bakterií (Kolář a kol., 2002). Základní možnosti prevence a vzniku šíření bakteriální rezistence jsou znázorněny na Obrázku 4. Dalším důležitým zdrojem nebezpečí šíření rezistentních bakteriálních kmenů je aplikace antibiotik pro podporu růstu zvířat (růstových stimulátorů). Užívání antibiotik v krmivech je spojeno jak s růstem rezistence bakteriálních druhů, které kontaminují potraviny a následně infikují jejich konzumenta (převážně salmonely a kampylobaktery), tak s přenosem determinant rezistence k lidským patogenům, na příklad enterokokům. Tato skutečnost je zarážející, neboť aplikace růstových stimulátorů je drahá a často zbytečná (Ferrari a Turnidge, 2003).

Obrázek 4 Prevence vzniku a šíření antimikrobiální rezistence (převzato z práce: Kolář a kol., 2002)

20

6. REZISTENCE BAKTERIÍ K β-LAKTAMOVÝM ANTIBIOTIKŮM β-laktamy patří mezi nejběžněji užívaná antibiotika. Jednou z prvních objevených antimikrobiálních látek byl právě penicilin. Od zahájení jeho užívání k léčbě bakteriálních infekcí je neustále vyvíjeno mnoho nových β-laktamových antibiotik, proto není překvapující, že rezistence bakterií k těmto látkám je běžným a

nadále se rozvíjejícím problémem.

Rezistence je nejčastěji způsobena přítomností β-laktamáz nebo v menší míře také mutacemi PBP, které snižují afinitu k β-laktamovým antibiotikům. Necitlivost k β-laktamům může také vzniknout následkem snížené propustnosti antibiotika přes buněčnou stěnu nebo jejich aktivním vypuzováním za účasti pump (Fluit a kol., 2001).

6.1 Rezistence zprostředkovaná PBP Tento mechanismus rezistence je preferován grampozitivními bakteriemi, ale vyskytují se i gramnegativní bakterie s takto získanou rezistencí. Takto zprostředkovaná rezistence má u bakterií několik forem. Zahrnuje nadprodukci PBP, získaní cizí PBP s nízkou afinitou, rekombinaci citlivých PBP s rezistentními variantami a bodové mutace genů kódujících PBP, které snižují jejich afinitu k β-laktamům (Ferrari a Turnidge, 2003).

Nadprodukce PBP Nadprodukce PBP jako mechanismus rezistence se vyskytuje ojediněle. Citlivost nebo rezistence dané bakterie závisí na poměru počtu molekul β-laktamu k počtu zásahových míst. Vysoký počet zásahových molekul může za určitých okolností vyústit ve vznik rezistence. Nadprodukce PBP má za následek rezistenci E. coli k imipenemu. U tohoto mikroba je PBP3 produkován zhruba ve 2000 kopiích (Ferrari a Turnidge, 2003).

Získání cizí PBP s nízkou afinitou V roce 1961, po zahájení používání methicilinu proti

stafylokokovým infekcím, byly

izolovány kmeny rezistentní k tomuto antibiotiku. Tyto rezistentní kmeny Staphylococcus aureus se zkráceně označují MRSA (z angl. methicilin-resistant Staphylococcus aureus). Kmeny MRSA jsou jedny z nejdůležitějších celosvětově rozšířených patogenů způsobujících nosokomiální infekce (Mascaretti, 2003).

21

U MRSA byla prokázána existence genů mec. Strukturní gen mecA kóduje protein PBP2a, mecI a mecR1 jsou regulační oblasti řídíci transkripci mecA. PBP2a má nízkou afinitu k βlaktamům, vykazuje transglykosylační a současně transpeptidační aktivitu. Může tedy zajišťovat všechny funkce, které zajišťují PBP vlastní druhu S. aureus. Tyto PBP mají za následek rezistenci ke všem β-laktamům (Mascaretti, 2003). Původ genu mecA není zcela objasněn. Homologní geny byly objeveny u Staphylococcus sciuri, primitivního stafylokoka izolovaného z hlodavců a jiných nižších savců (Ferrari a Turnidge, 2003). Rekombinace genů pro citlivé PBP s rezistentními variantami Tento mechanismus je omezen na druhy schopné transformace nebo přijetí volné DNA z prostředí. Přirozená transformace byla popsána u N. gonorrhoeae a N. meningitidis. Tyto bakteriální druhy získaly části genů kódující rezistentní PBP z komensálních druhů neisserií rezistentních k penicilinu (Ferrari a Turnidge, 2003).

Bodové mutace genů kódujících PBP Bodové mutace genů pbp kódujících proteiny vázající penicilin mají za následek syntézu PBP se sníženou afinitou k β-laktamům. Tímto mechanismem dochází ke vzniku rezistence k ampicilinu a cefalosporinům u H. influenzae. U tohoto rezistentního mikroba nastala mutace genu ftsI kódujícího transpeptidázu PBP3A a PBP3B (Ferrari a Turnidge, 2003).

6.2 Omezení přístupu antibiotika k zásahovému místu a jeho aktivní vypuzování Všechny gramnegativní bakterie mají vnější membránu, kterou musí antibiotikum překonat, než se

dostane k cytoplazmatické membráně. K průniku různých látek včetně

antibiotik do bakteriální buňky slouží poriny. Redukce množství porinů může vést ke vzniku rezistence k určitým antibiotikům. Příkladem takto vzniklé rezistence je necitlivost některých kmenů P. aeruginosa k imipenemu. Klinickým problémem při léčbě pseudomonádových infekcí je také rezistence k imipenemu zprostředkovaná jeho aktivním vypuzováním prostřednictvím pump lokalizovaných v cytoplazmatické membráně (Ferrari a Turnidge, 2003). 6.3 Rezistence zprostředkovaná β-laktamázami Produkce β-laktamáz je nejběžnějším mechanismem rezistence k β-laktamům vyskytujícím se převážně u gramnegativních bakterií. β-laktamázy jsou skupina enzymů s určitými 22

podobnostmi ve struktuře. Jejich účinek spočívá v interakci s β-laktamovým antibiotikem a jeho následné hydrolýze (Ferrari a Turnidge, 2003). První β-laktamáza TEM-1 byla popsána v roce 1965 u E. coli, brzy po zahájení užívání penicilinu v klinické praxi (Livermore, 1995). V současné době rozlišujeme více než 340 typů různých β-laktamáz (Finch a kol., 2003). Geny kódující β-laktamázy se nachází na bakteriálním chromozomu nebo na přenosných elementech

(Mascaretti,

2003).

Mnoho

gramnegativních

bakterií

má

přirozené

chromozomálně kódované β-laktamázy. Předpokládá se, že se tyto enzymy vyvinuly z PBP, s nimiž vykazují určitou sekvenční homologii. Pravděpodobně vznikly následkem selekčního tlaku půdních organismů nacházejících se volně v prostředí a produkujících β-laktamy (Bradford, 2001). Přítomnost genů na plazmidech a transpozonech umožňuje jejich přenos mezi různými bakteriemi (Mascaretti, 2003). β-laktamázy mohou být produkovány konstitutivně či induktivně. Při konstitutivní produkci vytváří bakterie tyto enzymy nezávisle na přítomnosti či nepřítomnosti antibiotika uvnitř nebo vně buňky. Induktivní β-laktamázy jsou produkovány pouze v případě, že v okolí nebo uvnitř bakteriální buňky je přítomno β-laktamové antibiotikum (Livermore, 1995). Rozlišujeme dva prostory, do kterých mohou být β-laktamázy vylučovány. Gramnegativní bakterie produkují tyto enzymy do periplazmatického prostoru. Naopak u grampozitivních bakterií jsou vylučovány vně buňky (Ferrari a Turnidge, 2003).

6.3.1 Nomenklatura β-laktamáz Nomenklatura β-laktamáz se neřídí žádnými racionálními pravidly. Tyto enzymy jsou obvykle označovány zkratkami, které se skládají se ze tří nebo čtyř písmen. Názvy zkratek vycházejí ze substrátu, který dané β-laktamázy hydrolyzují, na příklad β-laktamáza CARB obdržela tuto zkratku na základě své aktivity ke karbenicilinu nebo β-laktamázu OXA podle schopnosti hydrolyzovat oxacilin. Názvy enzymů také mohou odrážet jejich biochemickou aktivitu. Jméno β-laktamázy může být také vytvořen podle genů, které ji kódují, mezi takto pojmenované enzymy patří β-laktamáza AmpC kódovaná genem ampC. Zkratky jiných enzymů vycházejí

z názvu bakterie, která tento enzym produkuje. Do skupiny takto

pojmenovaných enzymů můžeme zařadit β-laktamázu PSE produkovanou pseudomonádami. Jedna z nejznámějších β-laktamáz TEM byla pojmenována podle pacienta, mladé ženy Temoniéry, ze kterého byl kmen produkující tento enzym izolován. β-laktamázy jsou také

23

pojmenovány podle států (OHIO) či nemocnic (MIR - Miriam Hospital), ve kterých byly nalezeny, podle vědců, kteří je objevili (HMS - Hartus, Matthew, Sykes) (Mascaretti, 2003).

6.3.2 Spektrum účinku Jednotlivé β-laktamázy mají schopnost hydrolyzovat různé skupiny β-laktamových antibiotik, některé i dokonce širší skupinu těchto látek. Na základě substrátové specifity rozlišujeme

penicilinázy,

které

hydrolyzují

peniciliny,

cefalosporinázy

preferující

cefalosporiny různých generací, karbapenemázy, jejichž substrátem je karbapenem a v neposlední řadě také monobaktamázy hydrolyzující monobaktam. V posledních desetiletích se začínají stále častěji objevovat kmeny, které produkují širokospektré β-laktamázy. Jsou však izolovány i bakteriální kmeny s produkcí β-laktamáz rezistentních k účinku inhibitorů β-laktamáz (Mascaretti, 2003).

Širokospektré β-laktamázy Širokospektré β-laktamázy vznikají následkem jednobodových mutací v genových sekvencích. Jsou schopné rozkládat širokospektrá β-laktamová antibiotika jako cefalosporiny vyšších generací (cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, cefepim a cefpirom) a monobaktamy. Zkráceně se označují ESBL (z angl. extended-spectrum β-lactamases) a v současné době je jim věnována velká pozornost, neboť komplikují léčbu bakteriálních infekcí. Zvýšená aktivita těchto enzymů k širokospektrým cefalosporinům má však za následek snížení citlivosti k inhibitorům β-laktamáz. Širokospektré β-laktamázy nejsou aktivní k cefamycinům a většina kmenů s ESBL fenotypem je citlivá k cefoxitinu a cefotetanu (Bradford, 2001). Selekční tlak a nadměrné užívání nových β-laktamových antibiotik má za následek vznik nových variant β-laktamáz. Dnes rozlišujeme více než 150 druhů ESBL. Většina ESBL vznikla mutací genů kódujících β-laktamázy TEM-1 a SHV-1. Jsou celosvětově rozšířené a nachází se ve vysokém procentu především u klinických izolátů E. coli, K. pneumoniae; z nefermentujících gramnegativních bakterií především u P. aeruginosa (Bradford, 2001).

β-laktamázy rezistentní k účinku inhibitorů Ačkoliv β-laktamázy rezistentní k účinku inhibitorů nepatří mezi ESBL, často se o nich mluví v souvislosti s těmito enzymy, neboť jde převážně o deriváty β-laktamáz typu TEM. Zkráceně se označují IRT (z angl. inhibitor-resistant TEM β-lactamases) (Bradford, 2001). První β-laktamáza rezistentní ke kyselině klavulanové byla získána v roce 1992 ve Francii 24

a současně také ve Velké Británii (Blazquez a kol., 1993). Analýza nukleotidových sekvencí ukázala, že se jedná o varianty β-laktamáz TEM-1 a TEM-2. Dnes rozlišujeme přinejmenším 23 derivátů TEM β-laktamáz a nejméně jeden derivát β-laktamázy SHV, které vykazují sníženou citlivost k jednomu nebo několika inhibitorům (Mascaretti, 2003).

6.3.3 Mechanismus katalytického účinku Působení β-laktamáz spočívá v interakci s β-laktamovým antibiotikem. Interakce má za následek hydrolýzu kritického místa β-laktamového kruhu. Schéma hydrolýzy β-laktamového antibiotika účinkem β-laktamázy popisuje Obrázek 5. Rychlost i efektivnost připojení βlaktamázy k danému antibiotiku a rychlost hydrolýzy vzniklého komplexu závisí na afinitě βlaktamázy k antibiotiku a účinnosti následné hydrolýzy (Ferrari a Turnidge, 2003). Na základě mechanismu katalytického působení rozlišujeme dva typy β-laktamáz. První skupinu tvoří β-laktamázy s reaktivním serinovým zbytkem lokalizovaném v aktivním místě tohoto enzymu. Druhou skupinu tvoří β-laktamázy, které ke své funkci vyžadují přítomnost těžkého kovu, nejčastěji Zn2+, spolu se zbytky histidinu a cysteinu (Kolář a kol., 2002). Srovnání mechanismů reakce zmíněných dvou typů β-laktamáz popisuje Obrázek 6.

β-laktamázy s reaktivním serinovým zbytkem Mezi β-laktamázy s reaktivním serinovým zbytkem patří většina známých β-laktamáz. Enzymy se nejdříve vážou nekovalentní vazbou k antibiotiku za vzniku nekovalentního komplexu. β-laktamový kruh je poté napadán první hydroxylovou skupinou serinu (Ser70) lokalizovanou v aktivním místě, ta působí jako nukleofil v acylační reakci a vytváří tak kovalentně vázaný ester. Hydrolýzou esteru molekulou vody, která je nutným nukleofilem v deacylačním kroku, nakonec dojde k uvolnění aktivního enzymu a vzniku inaktivní antimikrobiální látky (Walsh, 2003). Obdobný mechanismus se uplatňuje při interakci PBP s β-laktamy. Hlavní rozdíl mezi PBP a β-laktamázami je v míře deacylace, intermediát PBP s β-laktamovým antibiotikem je méně náchylný k nukleofilnímu ataku molekulou vody, vzniká tak trvalá kovalentní vazba, která má za následek inaktivaci PBP (Mascaretti, 2003).

β-laktamázy vyžadující přítomnost zinku Na rozdíl od předchozí skupiny enzymů, které otevírají β-laktamový kruh díky intermediátu acyl-enzym tvořenému β-laktamem s navázaným enzymem, zinek u této skupiny

25

β-laktamáz aktivuje molekulu vody a katalyzuje její připojení k β-laktamovému kruhu (více v kapitole 6.3.5.2). Tyto enzymy mají schopnost inaktivovat karbapenemy jako imipenem a meropenem a patří tedy převážně mezi karbapenemázy (Walsh, 2003).

Obrázek 5 Hydrolýza β-laktamu účinkem β-laktamázy (převzato z práce: Finch a kol., 2003)

Obrázek 6 Srovnání mechanismů účinku dvou typů β-laktamáz (převzato z práce: Walsh, 2003)

6.3.4 Klasifikace β-laktamáz β-laktamázy představují heterogenní skupinu enzymů. Klasifikační schémata jsou navržena na základě hydrolytického spektra enzymů, citlivosti k inhibitorům, umístění jejich genů (na plazmidu či chromozomu), genových či aminokyselinových sekvencí (Bush a kol., 1995).

26

6.3.4.1 Historie klasifikačních schémat První klasifikace rozlišující penicilinázy a cefalosporinázy byla navržena již v roce 1968 Sawaiem a kol. Další klasifikační schéma bylo vypracováno Jackem a Richmondem v roce 1970 a následně v roce 1973 rozšířeno Richmondem a Sykesem. Tímto schématem byly všechny do té doby známé β-laktamázy gramnegativních bakterií rozčleněny do pěti tříd na základě své substrátové aktivity. Schéma bylo v roce 1976 rozšířeno Sykesem a Matthewem a kladlo důraz na plazmidem kódované β-laktamázy. Tito autoři popsali i dělení podle izoelektrického bodu. Mitsuhashi a Inoue navrhli v roce 1981 novější klasifikační schéma. Vytvořené skupiny penicilináz a cefalosporináz rozšiřují o novou skupinu β-laktamáz hydrolyzujících cefuroxim. Reorganizaci ve třídění β-laktamáz navrhl v roce 1989 Bush, jeho systém byl znovu upraven a v roce 1995 publikován pod názvem Bush-Jacoby-Madeirosovo funkčně klasifikační schéma. Převratem ve členění β-laktamáz je klasifikace podle Amblera zakládající se na analýze aminokyselinových sekvencí β-laktamáz. V současné době se používají poslední dvě zmíněná klasifikační schémata (Bush a kol., 1995).

6.3.4.2 Bush-Jacoby-Madeirosovo funkčně klasifikační schéma Bush-Jacoby-Madeirosova klasifikace se pokouší o korelaci rozdělení enzymů na základě substrátové specifity včetně citlivosti k inhibitorům a jejich molekulární struktury. βlaktamázy dělí do 4 skupin označených arabskými číslicemi 1 až 4, skupina 2 je dále dělena na jednotlivé podskupiny značené malými písmeny (2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e a 2f). Zmíněné čtyři skupiny Bush-Jacoby-Madeirosovy klasifikace jsou následující (Bush a kol., 1995; Kolář a kol., 2002): Skupina 1 obsahuje cefalosporinázy, které nejsou inhibovány kyselinou klavulanovou. Jsou kódovány chromozomálně. Hlavními producenty jsou enterobakterie a P. aeruginosa. Skupina 2 je největší, zahrnuje plazmidem kódované penicilinázy a cefalosporinázy, které jsou citlivé k inhibitorům β-laktamáz. Skupinu 3 obsahuje metalo-β-laktamázy, které hydrolyzují peniciliny, cefalosporiny a karbapenemy a jsou slabě inhibovány témeř všemi klasickými β-laktamovými inhibitory kromě EDTA a p-chlormerkuribenzoátu (pCMB). Skupinu 4 tvoří málo četné enzymy (penicilinázy), které nejsou inhibovány kyselinou klavulanovou a jsou produkovány některými druhy Bulkholderia cepacia

27

6.3.4.3 Amblerova klasifikace Výše popsaná fenotypová klasifikace odhaluje problém, že bodové mutace mohou vysoce změnit substrátovou specifitu a citlivost β-laktamáz k inhibitorům, což vede ke změně začlenění enzymu do skupiny. Častěji se proto β-laktamázy klasifikují na základě analýzy jejich aminokyselinových sekvencí. Klasifikace je stabilní, odráží v sobě příbuznost enzymů a nemůže být narušena mutacemi genů. β-laktamázy se tímto systémem člení do 4 hlavních skupin označených písmeny A až D. Třídy A, C a D zahrnují evolučně odlišné skupiny enzymů účinkujících pomocí serinu a třídu B tvoří metaloenzymy neboli β-laktamázy vyžadující k reakci těžký kov (Bush a kol.,1995). Srovnání Amblerovy a Bush-JacobyMadeirosovy klasifikace je obsaženo v Tabulce 4.

Tabulka 4 Klasifikace β-laktamáz (upraveno podle: Ferrari a Turnidge, 2003) Bush-Jacoby-Madeirosovo schéma

Hlavní

Amblerovo schéma

Klasifikační kritéria

podskupiny

Skupina 1 - cefalosporinázy

C

Převážně chromozomálně kódované, rezistentní ke všem β-laktamům kromě karbapenemů, nejsou inhibovány kyselinou klavulanovou

Skupina 2 - penicilinázy

2a

A

Stafylokokové penicilinázy

(citlivé ke kyselině

2b

A

β-laktamázy s úzkým spektrem účinku:

klavulanové)

TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be

A

β-laktamázy se širokým spektrem TEM-3 - ??, SHV-2 - ??

2br

A

β-laktamázy TEM rezistentní k inhibitorům (IRT)

Skupina 3 - metalo-β-laktamázy

Skupina 4

2c

A

β-laktamázy hydrolyzující karbapenem

2e

A

Cefalosporinázy inhibované k. klavulanovou

2f

A

Karbapenemázy inhibované k. klavulanovou

2d

D

Hydrolyzují oxacilin (OXA)

3a

B

Karbapenemázy vyžadující zinek

3b

B

3c

B neklasifikovány

28

Různorodé enzymy, nesekvencovány

Z tabulky 4 je patrné, že Amblerovo schéma a Bush-Jacoby-Madeirosova klasifikace spolu navzájem korelují. Třída A odpovídá skupině 2, třída B koreluje se skupinou 3, třída C se skupinou 1, enzymy skupiny 4 nebyly zatím sekvencovány. Výjimku tvoří skupina 2d, která zahrnuje několik enzymů skupiny A aktinomycet a všechny enzymy třídy D gramnegativních bakterií. Není však jisté, zda se budou tato schémata i nadále shodovat, jestliže bude sekvencováno více genů kódujících β-laktamázy (Bush a kol., 1995).

6.3.5 Klasifikace β-laktamáz podle Amblera 6.3.5.1 Třída A β-laktamázy této třídy jsou nejčastěji se vyskytující β-laktamázy grampozitivních i gramnegativních bakterií a nejrozsáhlejší z hlediska druhové početnosti (Ferrari a Turnidge, 2003). Jsou kódovány převážně geny lokalizovanými na plazmidech (kromě chromozomálně kódovaných β-laktamáz druhů Klebsiella spp., Proteus vulgaris a Bacteroides spp.) (Kolář a kol., 2002). Amblerova třída A koreluje se skupinou 2, s vyjímkou podskupiny 2d, do které náleží β-laktamázy třídy D (Livermore, 1995). Nejrozšířenějšími a co do typů nejpočetnějšími β-laktamázami vůbec jsou β-laktamázy TEM, dalšími často produkovanými β-laktamázami jsou SHV. β-laktamázy TEM si získaly značnou pozornost, neboť mutací genů kódující tyto enzymy vznikají stále nové varianty, které vykazují vlastnosti širokospektrých β-laktamáz. Širokospektré β-laktamázy jsou produkovány převážně kmeny E. coli a Klebsiella pneumoniae, ale byly detekovány i u kmenů Enterobacter aerogenes, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus rettgeri a salmonel, dále u P. aeruginosa, H. influenzae a N. gonorrhoeae (Ferrari a Turnidge, 2003).

Spektrum účinku Preferovanými substráty β-laktamáz třídy A jsou

peniciliny, mohou hydrolyzovat i

cefalosporiny. Kmeny produkující ESBL hydrolyzují i širokospektré cefalosporiny a jsou citlivé k inhibitorům. V této třídě nalézáme i β-laktamázy rezistentní k inhibitorům, tato vlastnost má za následek snížení citlivosti k cefalosporinům (Ferrari, Turnidge, 2003).

Mechanismus účinku Klíčovým místem pro reakci je aminokyselinový zbytek Ser70, za jeho účasti vytváří βlaktamázy se substráty komplexy, serin tedy funguje v nukleofilní acylaci. Dalšími důležitými

29

oblastmi jsou Lys73, který má funkci akceptoru protonu v acylačním kroku reakce, Glu166 se podílí na deacylaci (Mascaretti, 2003).

6.3.5.1.1 Rozdělení β-laktamáz třídy A Třída A je

velmi rozmanitou a obsáhlou skupinou β-laktamáz. Mezi nejčastěji

produkované β-laktamázy náleží enzymy TEM, SHV, CTX-M, PER, K-1 a mnoho dalších. Zmíněné enzymy jsou produkovány gramnegativními bakteriemi. Z grampozitivním bakterií jsou rozšířené kmeny S. aureus produkující penicilinázy. Podrobnější výčet β-laktamáz třídy A včetně β-laktamáz ostatních tří tříd vytvořili Bush a kol.ve své práci z roku 1995. a) β-laktamázy typu TEM β-laktamázy typu TEM s úzkým spektrem účinku β-laktamáza

TEM-1

je

první

popsanou

plazmidem

kódovanou

β-laktamázou

gramnegativních bakterií. V roce 1965 byl tento enzym detekován u kmene E. coli v řeckých Aténách. Tento rezistentní mikrob byl izolován z hemokultury pacientky Temoniéry, odtud tedy pochází i její název. TEM-1 je kódována genem blaTEM-1 lokalizovaném na transpozonu Tn3. Umístění genu blaTEM-1 na mobilních genetických elementech umožňuje jeho snadné šíření mezi různými bakteriálními druhy. Z tohoto důvodu je dnes tento enzym produkován různými druhy čeledi Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, H. influenzae a N. gonorrhoeae. Tato β-laktamáza byla detekována u více než 90% kmenů E. coli rezistentních k ampicilinu. Je zodpovědná za vzrůstající rezistenci bakterií k ampicilinu a penicilinu. TEM-2 je prvním derivátem TEM-1. Ačkoliv vznikla substitucí jedné aminokyseliny, nemá vzhledem k původní β-laktamáze změněnou substrátovou specifitu (Bradford, 2001).

β-laktamázy typu TEM se širokým spektrem účinku Od roku 1980, kdy se začala ve velké míře používat širokospektrá β-laktamová antibiotika a inhibitory β-laktamáz, jsou geny kódující TEM-1 vystavovány silnému selekčnímu tlaku (Bradford, 2001). Bylo popsáno okolo 100 derivátů β-laktamázy TEM-1, některé jsou rezistentní k inhibitorům, ale většinou se jedná o širokospektré β-laktamázy (Mascaretti, 2003). Byly objeveny 4 aminokyselinové zbytky, jejichž substitucí mohou vzniknout širokospektré β-laktamázy. Vznik fenotypu charakteristického pro ESBL je podporován substitucí glutamátu za lysin v pozici 104, argininu za serin v poloze 164, glycinu za serin v 30

poloze 238 a glutamátu za lysin v pozici 240. Obecně je substituce v pozici 238 nejběžnější mutací dávající vznik ESBL. Kombinace substitucí jednotlivých aminokyselinových zbytků umožňuje vznik ESBL, které jsou schopné hydrolyzovat specifické cefalosporiny 3. generace jako ceftazidim a cefotaxim (Bradford, 2001). První širokospektrá β-laktamáza TEM byla detekována v 80. letech minulého století a pojmenována TEM-3 (Sougakoff a kol., 1988).

β-laktamázy typu TEM rezistentní k účinku inhibitorů β-laktamáz (IRT) Enzymy této skupiny nacházíme převážně u klinických izolátů E. coli, dále u kmenů K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis a Citrobacter freundii. Tyto IRT jsou rezistentní k inhibici kyselinou klavulanovou a sulbaktamem, ale zároveň ke kombinaci β-laktamu s inhibitorem β-laktamázy (převážně k následujícím kombinacím: amoxicilin-k. klavulanová, tikarcilin-k. klavulanová, ampicilin-sulbaktam). Bakterie produkující IRT jsou citlivé k tazobaktamu a ke kombinaci piperacilin-tazobaktam (Bradford, 2001). Současně s analýzou nukleotidových sekvencí genů kódujících tyto enzymy byly popsány aminokyselinové zbytky nezbytné ke vzniku IRT fenotypu. U β-laktamáz rezistentních k inhibitorům nacházíme změny v Met69, Arg244, Arg275 a Asn276. Tyto sekvence jsou odlišné od sekvencí typických pro ESBL (Bradford, 2001). Byla však objevena β-laktamáza TEM-50 s aminokyselinovými zbytky charakteristickými pro ESBL i IRT. To dokazuje, že nově vznikající β-laktamázy mohou zároveň sdílet vlastnosti charakteristické pro širokospektré β-laktamázy i β-laktamázy rezistentní k inhibitorům (Sirot a kol., 1997).

b) β-laktamázy typu SHV Tato skupina zahrnuje β-laktamázu SHV-1 a více než 23 jejich variant. Jedná se o enzymy kódované

geny blaSHV lokalizovanými na přenosných plazmidech. Název SHV pochází

z angl. „sulfhydryl variable“, neboť tyto enzymy interagují s p-chlormerkuribenzoátem (pCMB), který se váže merkaptoskupinou (SH skupinou). Tato interakce je pro SHV βlaktamázy typická, ostatní plazmidem kódované β-laktamázy typu TEM, OXA a PSE jsou k této látce rezistentní (Mascaretti, 2003). β-laktamázy SHV byly poprvé detekovány u kmenů K. pneumoniae a poté u E. coli. Z důvodu lokalizace genů blaSHV na plazmidech jsou dnes hojně produkovány mnoha bakteriálními druhy čeledi Enterobacteriaceae i P. aeruginosa. Citrobacter diversus,

31

Morganella morganii a K. oxytoca produkující β-laktamázy SHV patří mezi důležité původce nosokomiálních infekcí (Mascaretti, 2003).

β-laktamáza SHV s úzkým spektrem účinku SHV-1 je β-laktamáza s úzkým spektrem účinku, vykazuje hydrolytickou aktivitu proti penicilinům a cefalosporinům 1. generace. Je zajímavé, že u izolátů K. pneumoniae je gen kódující tento enzym lokalizován na chromozomu, zatímco E. coli nese gen blaSHV-1 na plazmidu (Mascaretti, 2003). Soudí se, že i K. pneumoniae může nést gen na přenosných elementech, tento předpoklad však nebyl zatím prokázán (Bradford, 2001). Širokospektré β-laktamázy typu SHV a β-laktamáza SHV rezistentní k inhibitorům V roce 1983 Knothe a kol. detekovali první širokospektrou β-laktamázu u klinického izolátu K. pneumoniae a S. marcescens. Tento enzym je derivátem SHV-1 a byl pojmenován SHV-2. Z původní β-laktamázy vznikl substitucí jedné aminokyseliny, glycin v pozici 238 byl nahrazen serinem (Mascaretti, 2003). V roce 1999 byla popsána širokospektrá β-laktamáza SHV u P. aeruginosa, což dokazuje, že geny blaSHV se mohou šířit mezi všemi gramnegativními bakteriemi (Naas a kol., 1999). Většina mutantů SHV-1 vykazuje fenotyp typický pro ESBL. SHV-10 je doposud jedinou známou β-laktamázou SHV typu rezistentní k inhibitorům β-laktamáz. Předpokládá se, že tento enzym vznikl mutací β-laktamázy SHV-5 (Bradford, 2001).

c) Širokospektré β-laktamázy non-TEM a non-SHV typu β-laktamázy CTX-M Kromě širokospektrých β-laktamáz typů SHV a TEM byl v 90. letech 20. století objeven nový typ ESBL. Tyto plazmidy kódované β-laktamázy byly pojmenovány CTX-M, prvním známým enzymem tohoto typu byla β-laktamáza CTX-M-1 (MEN-1) (Dutour a kol., 2001). Do současnosti bylo popsáno přibližně 20 typů CTX-M. Na rozdíl od širokospektrých βlaktamáz TEM a SHV mají β-laktamázy CTX-M schopnost hydrolyzovat cefotaxim lépe než ceftazidim. Jsou navíc lépe inhibovány tazobaktamem než kyselinou klavulanovou (Ferrari a Turnidge, 2003).

32

β-laktamázy CTX-M nacházíme především u E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Citrobacter spp. a Enterobacter spp. Kmeny podílející se na šíření CTX-M byly izolovány z mnoha částí světa, ale většinou pochází z východní Evropy, Jižní Ameriky a Japonska (Ferrari a Turnidge, 2003). CTX-M nejsou příbuzné β-laktamázám TEM a SHV, s těmito enzymy vykazují nízkou shodu v nukleotidových sekvencích. Byla objevena vysoká sekvenční homologie s chromozomálními β-laktamázami AmpC Kluyvera ascorbata (Klu-1 a Klu-2) (Bradford, 2001). β-laktamázy PER PER-1 je β-laktamáza kódovaná genem umístěným na plazmidu. Byla poprvé popsaná u kmene P. aeruginosa získaného z pacienta v Turecku. β-laktamáza PER-1 je v Turecku široce rozšířená, je prokázána u 60% kmenů A. baumannii rezistentních k ceftazidimu. PER-2 vykazuje 86% sekvenční homologii s PER-1. Tato β-laktamáza byla nalezena v Argentině u izolátu S. enterica serovar Typhimurium (Bradford, 2001).

β-laktamázy příbuzné PER-1 β-laktamázy PER-1 vykazují 40 až 50%

shodu v nukleotidových sekvencích s β-

laktamázami VEB-1 (poprvé nalezena u E. coli ve Vietnamu), CME-1 (izolovaná z Chryseobacterium meningosepticum) a TLA-1 (detekována u E. coli v Mexiku). Způsobují rezistenci k širokospektrým cefalosporinům, převážně k ceftazidimu a nejsou citlivé k účinku aztreonamu. VEB-1 byla první širokospektrou β-laktamázou nalezenou uvnitř integronu (Bradford, 2001; Ferrari a Turnidge, 2003). Širokospektré β-laktamázy SFO-1, GES-1 a BES-1 SFO-1 je neobvyklá β-laktamáza příbuzná β-laktamáze třídy A produkované kmeny Serratia fonticola. Je kódovaná geny umístěnými na plazmidu. GES-1 je další neobvyklou širokospektrou β-laktamázou; na rozdíl od SFO-1 není blízce příbuzná žádné plazmidem kódované β-laktamáze (Bradford, 2001). BES-1 byla získána z klinického izolátu Serratia marcescens a pojmenována podle země, ve které byla nalezena (z angl. Brazil extended spectrum) (Bonnet a kol., 2000).

33

d) β-laktamáza K-1 K-1 je typickou β-laktamázou kmenů K.

oxytoca. Gen kódující tuto β-laktamázu je

lokalizován na chromozomu. Rezistence k β-laktamům obvykle vzniká následkem hyperprodukce této β-laktamázy. Hyperproducenti jsou citliví ke všem inhibitorům a ceftazidimu a rezistentní ke všem penicilinům, cefuroximu, cefotaximu, ceftriaxonu a aztreonamu (Livermore, 1995).

e) β-laktamázy rezistentní k účinku karbapenemů Ačkoliv karbapenemy zůstávají k účinku většiny β-laktamáz třídy A rezistentní, bylo nalezeno několik enzymů schopných jejich hydrolýzy. Karbapenemáza Sme-1, produkována kmeny Serratia marcescens, chromozomální β-laktamáza NMC-A, detekována u Enterobacter cloaceae, dále IMI-1 a KPC-1 patří mezi nejčastější karbapenemázy (Bush a kol., 1995). Tyto β-laktamázy jsou detekovány u bakteriálních kmenů v Severní Americe v oblastech, kde jsou v nadbytečné míře používány karbapenemy (Ferrari a Turnidge, 2003).

f) β-laktamázy grampozitivních bakterií Nejdůležitějším grampozitivním patogenem, který produkcí β-laktamáz způsobuje problémy při léčbě jím způsobené infekce, je S. aureus. V době, kdy se začal užívat benzylpenicilin, bylo pouze 5% izolátů S. aureus rezistentních k tomuto antibiotiku. Lokalizace genů rezistence na plazmidech a selekční tlak antibiotik během několika desetiletí způsobil, že je dnes 80 až 90% kmenů S. aureus a koagulázanegativních stafylokoků rezistentních k benzylpenicilinu (Livermore, 1995). Mezi nejrozšířenější penicilinázy této skupiny patří plazmidem kódovaná β-laktamáza PC1 (Bush a kol., 1995).

6.3.5.2 Třída B Geny kódující β-laktamázy třídy B jsou lokalizované převážně na chromozomu, mohou být produkovány konstitutivně nebo induktivně (Ferrari a Turnidge, 2003). Byla popsána βlaktamáza IMP-1 kódovaná genem blaIMP-1 lokalizovaném na plazmidu. Její produkce byla prokázána u celosvětově rozšířených nosokomiálních patogenů jako P. aeruginosa, dále S. marcescens i jiných zástupců čeledi Enterobacteriaceae. Nebezpečí těchto patogenních bakterií spočívá v rapidním šíření genů blaIMP prostřednictvím plazmidů nebo integronů. První

34

β-laktamáza třídy B byla objevena u relativně neškodné bakterie Bacillus cereus a identifikována před více než 39 lety (Mascaretti, 2003). Mezi hlavní producenty řadíme Bacteroides fragilis, Aeromonas hydrophila a Aeromonas veronii, S. maltophilia, S. marcescens, P. aeruginosa, K. pneumoniae, Chryseobacterium spp., a další bakteriální druhy (Mascaretti, 2003). β-laktamázy kmenů B. cereus, S. maltophilia, A. hydrophila a A. jandaei jsou produkovány induktivně (Ferrari a Turnidge, 2003).

Spektrum účinku Během několika posledních let si získaly vysokou pozornost díky své schopnosti účinkovat jako karbapenemázy (enzymy hydrolyzující karbapenemy) a utilizovat kyselinu klavulanovou a jiné inhibitory β-laktamáz (tazobaktam a sulbaktam) (Mascaretti, 2003). Výborně hydrolyzují i peniciliny a cefalosporiny včetně cefamycinů. Monobaktamy nejsou jejich účinkem hydrolyzovány a nepůsobí ani jako inhibitory (Ferrari a Turnidge, 2003).

Mechanismus účinku β-laktamázy této třídy jsou označovány jako metalo-β-laktamázy, neboť vyžadují zinek nebo jiný těžký kov. Jejich molekula má pro kovy dvě vazebná místa. Rozlišujeme metalo-βlaktamázy monozinkové, které potřebují pouze jednu molekulu zinku a dizinkové vyžadující molekuly dvě. Přesný průběh reakce obou typů metaloenzymů není zatím vyřešen. Srovnání mechanismu účinku dvou zmíněných typů β-laktamáz je na Obrázku 7. Při působení monozinkových metalo-β β-laktamáz se molekula vody spojuje se zinkem (Zn1) a vzniká hydroxid, který působí jako nukleofil. Tento nukleofil napadá uhlíkový atom karbonylové skupiny β-laktamového kruhu. Kyslík karbonylové skupiny interaguje se Zn1 a polarizuje karbonylovou vazbu. Aminokyselinový zbytek monozinkové β-laktamázy Asp90 se váže na vodík hydroxidu zinku a přijímá proton. Asp90 může v této formě protonovat dusíkový atom β-laktamového kruhu, což způsobí rozbití tohoto kruhu. Nejdůležitějším rozdílem mezi dvěma zmíněnými typy metalo-β-laktamáz je protonace dusíku β-laktamového kruhu, která je pro monozinkové β-laktamázy nezbytná, dizinkové metalo-β β-laktamázy však tuto protonaci k hydrolýze antibiotika nevyžadují. Koordinací kyslíku karbonylové skupiny k atomu zinku (Zn1) a dusíku β-laktamového kruhu k druhému atomu zinku (Zn2) dojde k polarizaci vazeb v molekule substrátu (β-laktamového

35

antibiotika). Zn1 vázaný ve formě hydroxidu působí, stejně jako u monozinkových βlaktamáz, jako nukleofil. Napadení substátu hydroxidem zinku vede ke stabilizaci komplexu účinkem Zn1 a aminokyselinového zbytku Asn193. Dusík rozbitého β-laktamového kruhu se poté vyskytuje ve formě aniontu a je stabilizován druhým atomem zinku Zn2 (Mascaretti, 2003). Obrázek 7 Mechanismy reakce metalo-β β-laktamáz (převzato z práce: Mascaretti, 2003) a) monozinkové metalo-β β-laktamázy

b) dizinkové metalo-β β-laktamázy

36

6.3.5.2.1 Rozdělení metalo-β β-laktamáz Metaloenzymy se člení do skupin B1, B2 a B3. β-laktamázy těchto 3 skupin včetně mikroorganismů, které je produkují, shrnuje Tabulka 5. Skupina B1 zahrnuje většinu β-laktamáz třídy B. Jsou to enzymy se širokým spektrem účinku produkované mnoha bakteriemi zahrnujícími na příklad rody Bacillus, Bacteroides, Serratia a Pseudomonas. β-laktamázy skupiny B2 mají schopnost hydrolyzovat pouze karbapenemy, patří mezi monozinkové enzymy, vazba druhého zinku způsobuje nekompetitivní inhibici. Hlavními producenty těchto enzymů jsou aeromonády, S. fonticola a B. cepacia. β-laktamázy skupiny B3 mají úzké spektrum účinku a jsou aktivní převážně proti cefalosporinům. Do této skupiny náleží metaloenzym L1 produkovaný kmeny S. maltophilia. Tento enzym se liší od ostatních metalo-β-laktamáz svojí strukturou, většina β-laktamáz třídy B jsou monomery, zatímco L1 je tetramer. V současné době význam S. maltophilia stále roste, neboť tento nosokomiální patogen ohrožuje imunokomprimované osoby, pacienty s cistickou fibrózou a rakovinou. Schopnost této bakterie odolávat účinku β-laktamů je způsobena převážně produkcí dvou induktivních, chromozomálně kódovaných β-laktamáz, metaloenzymem L1 a β-laktamázou L2, která náležící do třídy A a rozkládá ty cefalosporiny a monobaktamy, které účinku L1 unikají (Mascaretti, 2003).

Tabulka 6 β−laktamázy β− třídy B (vytvořeno podle práce: Mascaretti, 2003) Skupina

β−laktamáza β−

Produkující bakterie

B1

BcII

Bacillus cereus

CcrA (CfiA)

Bacteroides fragilis

BlaB

Chryseobacterium meningosepticum

IND-1

Chryseobacterium indologenes

IMP-1

Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens

VIM-1

Pseudomonas aeruginosa

Cpha, CphA2, ImiS

Aeromonas spp.

Shf-I

Serratia fonticola

L1

Stenotrophomonas maltophilia

GOB-1

Chryseobacterium meningosepticum

FEZ-1

Legionella gormanii

THIN-1

Janthinobacterium lividum

B2 B3

37

6.3.5.3 Třída C β-laktamázy třídy C jsou po β-laktamázách třídy A druhé nejběžnější. Jsou kódovány geny lokalizovanými na chromozomu, byly popsány i geny pro β-laktamázy na konjugativních plazmidech. Tato skupina enzymů je produkována většinou gramnegativních bakterií (Ferrari a Turnidge, 2003).

Spektrum účinku β-laktamázy třídy C hydrolyzují cefalosporiny účinněji než peniciliny. Na rozdíl od třídy A mají větší aktivní místa, která jim umožní vazbu objemných cefalosporinů 3. generace. Tato konfirmační flexibilita a její vliv na sousední uspořádání usnadňuje hydrolýzu vytvořeného komplexu, který je přístupnější ataku molekulou vody. Většina β-laktamáz třídy C je rezistentní k inhibitorům (Ferrari a Turnidge, 2003).

Mechanismus účinku Mechanismus působení těchto enzymů je dobře prostudován a podobá se účinku enzymů skupiny A. V prvním kroku napadá aminokyselinový zbytek Ser64 karbonylový uhlík a otevírá tak β-laktamový kruh za vzniku intermediátu tvořeného enzymem a β-laktamem. Ve druhém kroku je tento intermediát hydrolyzován. Studie prokázaly, že aktivace molekuly vody je umožněna aminokyselinovým zbytkem Tyr150 (Mascaretti, 2003).

6.3.5.3.1 Rozdělení β-laktamáz třídy C a) Chromozomálně kódované β-laktamázy Chromozomálně kódované varianty těchto enzymů jsou důležité u klinických izolátů Enterobacter aerogenes, S. marcescens, Citrobacter freundii, M. morganii a P. aeruginosa. Hydrolyzují β-laktamová antibiotika včetně cefamycinů a širokospektrých cefalosporinů. Jsou kódovány geny ampC, exprese těchto genů je regulovaná (Ferrari a Turnidge, 2003).

Regulace exprese genu ampC u E.coli Exprese genu ampC je regulována geny ampG, ampD a ampR. Průběh exprese genu ampC schematicky znázorňuje Obrázek 8 a je podrobně vysvětlen v následujících odstavcích.

38

Gen ampG kóduje transmembránový protein AmpG, který transportuje fragmenty peptidoglykanu vzniklé destrukcí buněčné stěny, ke které došlo následkem navázání βlaktamu na PBP. Protein AmpG přenáší disacharilový tripeptid GlcNAc-anhydroMurNAc. Po vstupu do cytoplazmy je tento tripeptid rozpoznáván proteinem AmpR (Walsh, 2003). AmpR je kódován genem ampR, funguje jako represor vzhledem k interakci s UDPMurNAc pentapeptidy, což jsou prekurzory molekul peptidoglykanu. V této formě není AmpR schopný aktivovat ampC a ve skutečnosti slouží jako represor genu ampR. V případě vysoké koncentrace produktů rozpadu buněčné stěny (GlcNAc-anhydroMurNAc tripeptidu) jsou vytlačeny UDP-MurNAc pentapeptidy z vazby s AmpR, což má za následek přeměnu AmpR na aktivátor transkripce genu ampC (Ferrari a Turnidge, 2003). Posledním proteinem podílejícím se na regulaci exprese ampC je protein AmpD kódovaný genem ampD, funguje jako amidáza a nachází se v cytoplazmě buňky. Štěpí GlcNAcanhydroMurNAc tripeptidy a tudíž funguje

jako negativní regulátor, který snižuje

koncentraci těchto tripeptidů. Při vysoké koncentraci disacharilových tripeptidů vzniklých destrukcí peptidoglykanu následkem účinku molekuly β-laktamu, nemohou být všechny tyto molekuly štěpeny proteiny AmpD, unikají jejich účinku, vážou se na protein AmpR a touto vazbou ho aktivují k expresi genu ampC (Walsch, 2003).

Vzrůst exprese genu ampC Induktivní vzrůst exprese genu ampC je vyvolán některými β-laktamy, které způsobují uvolnění vhodného množství anhydro-MurNAc tripeptidu z peptidoglykanu. Určitá hladina tohoto tripeptidu znemožní znovuvyužití proteinu AmpD. Za této indukce je β-laktamáza produkována tak dlouho, dokud se antibiotikum vyskytuje v prostředí. Konstitutivní vysoká produkce AmpC je většinou důsledek mutací genu ampD. Za těchto okolností se v cytoplazmě vyskytuje konstitutivně vysoká hladina tripeptidu anhydroMurNAc a protein AmpR tak slouží jako konstitutivní aktivátor transkripce genu ampC. Konstitutivní produkce může mít také svůj původ v deleci genu ampR, ale v tomto případě je β-laktamáza produkována jen v malém množství (Ferrari a Turnidge, 2003).

b) β-laktamázy kódované plazmidy Současný výzkum je zaměřen na studium genu ampC nacházejícím se na přenosných plazmidech. Plazmidem kódované β-laktamázy třídy C byly objeveny u mnoha gramnegativních bakterií ve všech částech světa. Klebsiella pneumoniae, Enterobacter 39

aerogenes, Salmonella spp. (serovary Seftenberg a Enteritidis), E. coli, P. mirabilis, M. morganii a K. oxytoca

jsou hlavními hostitelskými druhy, které přechovávají tyto β-

laktamázy (Ferrari a Turnidge, 2003). Stručný výčet plazmidy kódovaných β-laktamáz včetně jejich nejčastějších bakteriálních producentů obsahuje Tabulka 6.

Tabulka 6 Rozdělení β−laktamáz β− třídy C kódovaných plazmidovými geny (vytvořeno podle práce: Ferrari a Turnidge, 2003) Skupina 1.

Charakteristika

β−laktamáza β−

příbuzné chromozomální β−laktamáze

BIL-1

AmpC Citrobacter freundii

CMY-1 LAT-1, LAT-2

2.

3.

příbuzné chromozomální cefalosporináze

MIR-1

AmpC bakteriálního druhu Enterobacter cloaceae

ACT-1

příbuzné chromozomální β−laktamáze AmpC

CMY-1

Pseudomonas aeruginosa

FOX-1 MOX-1

4.

plazmidem kódované enzymy, které jsou ve vztahu s CMY-1

Obrázek 7 Regulace exprese genu ampC u E. coli (převzato z práce: Walsh, 2003)

40

6.3.5.4 Třída D Tato třída byla navržena na základě analýzy sekvencí aminokyselin. Koreluje se skupinou 2d v Bush-Jacoby-Madeirosově klasifikaci. β-laktamázy této třídy jsou produkovány enterobakteriemi a P.

aeruginosa. Jejich geny se nachází na mobilních genetických

elementech (Ferrari a Turnidge, 2003). Rozlišujeme několik typů enzymů této třídy: OXA-1 až OXA-45, AmpS , LCR-1; stále nové β-laktamázy jsou i nadále popisovány (Mascaretti, 2003). Skupina β-laktamáz OXA typu byla původně vytvořena na základě fenotypového projevu než podle genotypu těchto enzymů, proto nacházíme pouze 20% sekvenční homologii mezi jednotlivými členy (Bradford, 2001).

Spektrum účinku Nomenklatura β-laktamáz této třídy se zakládá převážně na schopnosti těchto enzymů hydrolyzovat oxacilin. Bakterie produkující β-laktamázy této třídy D jsou rezistentní k aminopenicilinům a ureidopenicilinům. β-laktamázy OXA mají vysokou hydrolytickou aktivitu ke cloxacilinu a methicilinu. Jsou slabě inhibovány kyselinou klavulanovou nebo sulfony (tazobaktamem a sulbaktamem); karbapenemy jsou k jejich účinku stabilní (Mascaretti, 2003).

Mechanismus účinku Mechanismus hydrolýzy molekuly β-laktamu se pravděpodobně liší od způsobu účinku βlaktamáz tříd A a C. Podobně jako enzymy tříd A a C i β-laktamázy třídy D vyžadují nukleofil pro acylační krok reakce, v jejich případě se uplatňuje aminokyselinový zbytek Ser67. Na rozdíl od těchto dvou tříd však molekuly β-laktamáz třídy D neobsahují žádné aminokyselinové zbytky nutné k deacylaci (Mascaretti, 2003).

6.3.5.4.1 Rozdělení β-laktamáz třídy D a) β-laktamázy typu OXA s úzkým spektrem účinku Nejběžnějším enzymem třídy D je β-laktamáza OXA-1, je produkována zástupci čeledi Enterobacteriaceae. Vykazuje nízkou afinitu k penicilinům (Ferrari a Turnidge, 2003). βlaktamáza OXA-10 má ve srovnání s OXA-1 schopnost hydrolyzovat širší spektrum βlaktamových antibiotik. Bakteriální kmeny produkující tento enzym jsou vysoce rezistentní

41

k cefoperazonu (Mascaretti, 2003). Hyperprodukce β-laktamázy OXA-10 má za následek malé snížení citlivosti k aztreonamu, cefotaximu a ceftriaxonu (Livermore, 1995).

b) β-laktamázy typu OXA se širokým spektrem účinku Zatímco většina ESBL je produkována bakteriálními druhy Klebsiella pneumoniae, E. coli a jinými enterobakteriemi, širokospektré β-laktamázy OXA typu jsou typické zejména pro Pseudomonas aeruginosa (Mascaretti, 2003). Většina širokospektrých β-laktamáz třídy D je deriváty OXA-10. Tyto širokospektré βlaktamázy obsahují ve své struktuře jednu nebo dvě substituce aminokyselin. Bylo prokázáno, že ke vznik fenotypu charakteristického pro širokospektré β-laktamázy dochází substitucí asparaginu za serin v pozici 73 nebo asparaginu za glycin v pozici 157. Mezi mutanty OXA10 patří na příklad β-laktamázy OXA-11, -14, -16, a –17 (Bradford, 2001). β-laktamáza OXA-21 byla popsána u kmenů Acinetobacter baumannii, je prvním enzymem nalezeným původně u této bakterie. Acinetobacter baumannii může produkovat dvě další β-laktamázy, z tohoto důvodu zatím není jasné, zda OXA-21 patří mezi širokospektré β-laktamázy nebo enzymy s úzkým spektrem substrátů (Bradford, 2001).

c) Nově popsané β-laktamázy s úzkým spektrem účinku Tato skupina β-laktamáz OXA typu zahrnuje OXA-20, -22, -24, -25, -26, -27 a OXA-30 a několik dalších enzymů (Bradford, 2001). β-laktamázy OXA-25, -26, a -27 byly popsány v roce 2000 u Acinetobacter spp.; jedná se o enzymy schopné hydrolyzovat karbapenemy. Mnohé z těchto enzymů byly původně nalezeny u bakteriálních izolátu z Turecka a Francie (Afzal-Shah a kol., 2000).

7. METODY PRŮKAZU β-LAKTAMÁZ Detekce enzymů modifikujících antibiotikum se v klinických laboratořích omezuje na průkaz β-laktamáz. Je možné detekovat produkci β-laktamáz (fenotyp) nebo prokazovat geny kódující příslušné β-laktamázy (genotyp). Fenotypové testy jsou běžně užívány v rutinní praxi a zahrnují tzv. přímé testy a testy na průkaz širokospektrých β-laktamáz (Ferrari a Turnidge, 2003).

42

7.1 Testy založené na přímém průkazu β-laktamáz Pozitivní výsledek získaný při přímých testech prokazuje, že testovaný bakteriální izolát je producentem β-laktamázy. Negativní reakce ovšem neposkytuje jednoznačný závěr, neboť rezistence k β-laktamům může být způsobená jiným mechanismem než produkcí β-laktamáz. Tyto metody jsou velmi rychlé, výsledek je možné získat během 1 až 60 minut. Mohou poskytovat klinicky důležitou informaci dříve než jsou dostupné výsledky diluční mikrometody. Používají se pro průkaz β-laktamáz u izolátů Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, stafylokoků a jsou jedinými spolehlivými testy pro průkaz β-laktamáz Enterococcus spp. Tyto testy se nepoužívají u enterobakterií a Pseudomonas aeruginosa, neboť témeř každý zástupce této skupiny produkuje rozličné βlaktamázy, které způsobují různou citlivost k různým β-laktamům. Rozlišujeme 3 typy testů pro přímou detekci β-laktamáz, a to chromogenní, jodometrické a acidimetrické. Testy jsou založeny na průkazu

hydrolýzy antibiotika, která nastává

v případě přítomnosti β-laktamázy. Pozitivní reakce se projeví jako barevná změna. Testují se bakteriální izoláty vykultivované na neselektivním médiu (Ferrari a Turnidge, 2003).

7.1.1 Chromogenní metody Pro průkaz β-laktamáz chromogenními metodami se užívá chromogenních cefalosporinů, mezi které řadíme nitrocefin, PADAC a CENTA; strukturní vzorce těchto látek jsou znázorněny na Obrázku 9. Při hydrolýze jejich β-laktamového kruhu účinkem β-laktamázy produkované testovaným mikrobem prodělávají barevnou změnu (Finch a kol., 2003).

Nitrocefin Nitrocefin je světle žlutá látka, její hydrolýza účinkem β-laktamázy způsobí posun elektronů v molekule, který má za následek vznik tmavě červeného produktu obvykle do 30 minut. Nitrocefin je možné použít ve formě roztoku nebo jako komerčně dodávané disky a proužky napuštěné touto látkou, vyšetřovaná bakterie se testuje rozetřením přímo na tento disk (Ferrari a Turnidge, 2003). Tento test je vysoce citlivý ke většině β-laktamáz, ale není 100% specifický, existuje zde nebezpečí falešně pozitivních a negativních výsledků. Sérum má schopnost vyvolat

falešně pozitivní reakci (Ferrari a Turnidge, 2003), naopak falešně

negativní reakce mohou nastat u kmenů H. influenzae produkujících β-laktamázu ROB-1. Tyto problémy jsou však minimální, neboť tato β-laktamáza je produkována ojediněle 43

(Livermore, 1995). Z důvodu falešné pozitivity se neužívá u izolátů Staphylococcus saprophyticus (Mascaretti, 2003). Nitrocefin lze také použít pro průkaz β-laktamáz gramnegativních anaerobních bakterií kromě skupiny Bacteroides fragilis, která je známým producentem různých β-laktamáz (Ferrari a Turnidge, 2003). Většina bakterií vytváří β-laktamázy konstitutivně, některé stafylokoky mohou však produkovat induktivní β-laktamázy. Detekovatelné množství těchto enzymů vytváří až po vystavení účinku β-laktamového antibiotika. Testy se tedy provádí na bakteriích, které rostly v přítomnosti neinhibiční koncentrace β-laktamu (na příklad 0.25 µg cefoxitinu na ml) v bujonu nebo na agarové plotně. Můžeme také testovat kolonie vyrostlé kolem disku s 1 µg oxacilinu (Ferrari a Turnidge, 2003).

PADAC Při reakci β-laktamázy s touto purpurovou látkou se uvolňuje z její molekuly 3'-pyridinová skupina, což má za následek ztrátu purpurové barvy (Mascaretti, 2003).

CENTA V roce 2001 Bebrone a kol. prokázali, že CENTA je hydrolyzována β-laktamázami všech skupin kromě metaloenzymů Aeromonas hydrophila. Autor poukazuje, že tato látka nemá využití v rutinní praxi, neboť k detekci se nemohou využívat kmeny vyrostlé na agarovém kultivačním médiu. Je užitečná v kinetických studiích, pro detekci β-laktamáz v surových extraktech a při chromatografických reakcích.

Obrázek 9 Strukturní vzorce chromogenních cefalosporinů (převzato z práce: Finch a kol., 2003)

44

7.1.2 Acidimetrické a jodometrické testy K detekci přítomnosti kyseliny penicilinové, která vzniká hydrolýzou penicilinu účinkem β-laktamázy, se používají kolorimetrické indikátory (Ferrari a Turnidge, 2003). Substrátem při acidimetrických reakcích je penicilin s navázaným citrátem a k detekci reakce se užívá červený fenolový indikátor. Vzrůst pH v přítomnosti kyseliny penicilinové způsobí barevnou změnu z červené na žlutou. Při jodometrické metodě se používá penicilin s navázaným fosfátem a komplex škrobu s jódem. V přítomnosti penicilinové kyseliny dochází k redukci jódu na jodid a k jeho uvolnění z komplexu se škrobem, což má za následek odbarvení. Negativní reakce je charakteristická modrofialovou barvou (Ferrari a Turnidge, 2003). Tyto testy jsou levnější než test s nitrocefinem, ale častěji dávají falešně pozitivní výsledky; na příklad při nespecifické reakci jódu s bakteriálními proteiny. Při acidimetrických testech jsou falešně pozitivní výsledky způsobeny hustým inokulem nebo destilovanou vodou používanou pro navlhčování stripů, která bývá trochu kyselá (Livermore, 1995). Nepřesnost těchto testů včetně metod chromogenních nastává v případě špatného uchovávání reagencií, neboť může dojít k degradaci penicilinu a falešně pozitivním výsledkům. Ačkoliv acidimetrické a jodometrické testy jsou citlivé, z důvodu malých zkušeností se k detekci β-laktamáz v běžné praxi nepoužívají (Ferrari a Turnidge, 2003). 7.1.3 Kontrola kvality testů založených na přímém průkazu β-laktamáz Možné problémy při přímých testech pro průkaz β-laktamáz ukazují na důležitost provádění paralelních kontrol se známými producenty β-laktamáz a s kmeny, které tyto enzymy neprodukují (Livermore, 1995). Kmeny Staphylococcus aureus doporučené NCCLS pro kontrolu kvality diskového difuzního a dilučního testu se mohou užít také pro kontrolu kvality při β-laktamázovém testu. Kmen S. aureus ATCC 25923 je používán jako negativní kontrola, neboť není producentem β-laktamázy a kmen S. aureus ATCC 29213 se užívá jako pozitivní kontrola (Ferrari a Turnidge, 2003).

7.2 Metody založené na průkazu ESBL fenotypu Stále rostoucí produkce širokospektrých β-laktamáz (ESBL) bakteriálními druhy čeledi Enterobacteriaceae nutí odborníky vyvíjet metody pro jejich rutinní průkaz v klinických izolátech (Bradford, 2001). Metody detekce širokospektrých β-laktamáz mohou být založeny na průkazu fenotypu. Při podezření, že určitý kmen produkuje ESBL se doporučuje

45

kombinovat více těchto metod. Žádná z metod zakládající se na hodnocení fenotypu není 100% citlivá a specifická. V případě pozitivního výsledku lze přítomnost širokospektré βlaktamázy pouze předpokládat. K jejímu definitivnímu průkazu jsou zapotřebí metody odhalující změny v aminokyselinách, neboť některé mutace jsou pro určité ESBL charakteristické (Ferrari a Turnidge, 2003). Je-li prokázána produkce širokospektré βlaktamázy, označí se daný izolát za rezistentní ke všem penicilinům, cefalosporinům a aztreonamu (NCCLS, 2002). Velký problém při průkazu ESBL nastává v případě, že testovaná bakterie produkuje βlaktamázu AmpC nebo dokonce oba typy enzymů (AmpC a současně ESBL). Bakterie produkující AmpC může být nesprávně označena za producenta ESBL. Naopak vytváří-li testovaný izolát AmpC i ESBL, může být produkce širokospektré β-laktamázy maskována produkcí AmpC. Přítomnost ESBL nemusí být také prokázána, má-li bakteriální izolát následkem mutace změněnou propustnost porinů nebo produkuje-li β-laktamázy TEM a SHV se sníženou afinitou k β-laktamovým antibiotikům (Sanguinetti a kol., 2003). Tento problém byl potvrzen výzkumem prováděným v Evropě, ve kterém bylo zjištěno, že 37% mikroorganismů je chybně označováno za citlivé k širokospektrým cefalosporinům (Lucet a kol., 1999). Přítomnost širokospektré β-laktamázy je možné prokázat na základě hodnot MIC, z mnoha důvodů se doporučuje doplňovat tyto metody

testy, které jsou založené na průkazu

synergického účinku β-laktamázy a inhibitoru.

7.2.1 Podezření na produkci ESBL podle hodnot MIC a průměru inhibičních zón Vyhledávací (screeningové) testy na průkaz produkce ESBL se zakládají na interpretaci hodnot MIC získaných z dilučních metod a výsledků měření průměru inhibičních zón při diskovém difuzním testu. Detekce širokospektré β-lakamázy může být složitá, protože v mnoha případech nedosahují hodnoty MIC hodnot break-pointů užívaných při rutinním testování citlivosti, podle kterých by byla daná bakterie označena za rezistentní (Sanguinetti a kol., 2003).

Z tohoto důvodu vyvinula NCCLS nové hraniční hodnoty MIC a hodnoty

průměru inhibičních zón pro aztreonam, cefoxitin, cefpodoxim, ceftazidim a ceftriaxon, tyto testy lze tedy užít jako testy konfirmační. Kmeny produkující ESBL mohou vykazovat vysokou rezistenci ke zmíněným antibiotikům. Na základě speciálně vyvinutých break-pointů je možné zachytit produkci širokospektré β-laktamázy u E. coli, K. oxytoca a K. pneumoniae (NCCLS, 2002). Ačkoliv NCCLS stanovuje tyto hodnoty pouze pro zmíněné tři druhy 46

bakterií, teoreticky by se na jejich základě daly detekovat i jiné druhy produkující ESBL (Ferrari a Turnidge, 2003). Nedostatkem však zůstává, že NCCLS vyvinula pouze break-pointy pro průkaz ESBL, ale hodnoty pro zachycení izolátů produkujících β-laktamázu AmpC zatím nestanovila (Ferrari a Turnidge, 2003). 7.2.2 Průkaz synergie s inhibitorem β-laktamázy Prostřednictvím těchto testů je možné velmi dobře odlišit bakterie, které produkují induktivní β-laktamázy AmpC od těch, které vylučují širokospektré β-laktamázy. Na rozdíl od AmpC je většina širokospektrých β-laktamáz inhibována kyselinou klavulanovou a jinými inhibitory. Rozlišujeme několik typů těchto metod, všechny jsou však založeny na průkazu synergického účinku mezi inhibitorem β-laktamázy a cefalosporiny 3.generace (obvykle ceftazidimem, cefotaximem, cefpodoximem, ceftriaxonem) a aztreonamem. Nějčastěji užívaným inhibitorem β-laktamáz je v těchto testech kyselina klavulanová. Při hodnocení se srovnává zvýšená aktivita v přítomnosti β-laktamového antibiotika spolu s inhibitorem β-laktamáz a aktivita v případě, je-li antibiotikum testováno samotné. Podstatou testu je inhibice širokospektré β-laktamázy kyselinou klavulanovou, což má za následek snížení hladiny rezistence k cefalosporinu (Bradford, 2001). Testy mají několik variant, jsou založeny na diskovém difuzním testu, bujónové diluční mikrometodě, trojrozměrném testu a Etestu. 7.2.2.1 Diskový difuzní test s inhibitorem β-laktamázy Jedním z prvních testů pro průkaz širokospektrých β-laktamáz byl test vypracovaný Jarlierem a kol. v roce 1988 a je známý pod názvem double-disk synergy test (DDS test). Inokulum testovaného mikroba se nanese na MH agar. Do středu misky se umístí disk obsahující kombinaci kyseliny klavulanové s amoxicilinem a disk s cefalosporinem 3. generace (nejčastěji s ceftazidimem) se umístí 30 mm od prvního disku. Kyselina klavulanová difunduje agarem a inhibuje β-laktamázu v okolí disku s cefalosporinem. V pozitivním případě dochází k typickému rozšíření inhibiční zóny kolem disku s cefalosporinem směrem k disku s kombinací amoxicilinu a kyseliny klavulanové. Pozitivní výsledek testu je dobře viditelný na Obrázku 10. Thomson a Senders (1992) prokázali, že citlivost testu vzroste, sníží-li se vzdálenost mezi disky na 20 mm. 47

Kromě ceftazidimu se v těchto testech začal užívat také cefpodoxim. V současné době jsou disky pro DDS test vyráběny komerčně několika společnostmi (Becton Dickinson, MAST a Oxoid) (Carter a kol., 2000). Disky s ceftazidimem a cefpodoximem nebo s jejich kombinací s kyselinou klavulanovou jsou nejvhodnější (Gheldre a kol., 2003). Jacoby a Han vyvinuly v roce 1996 DDS test, ve kterém se používá disk s 20 µg sulbaktamu a cefalosporinu 3. generace. Vzrůst inhibiční zóny okolo disku obsahujícího kombinaci sulbaktamu a cefalosporinu

o 5 mm ve srovnání s diskem se samotným

cefalosporinem je považován za pozitivní výsledek.

Obrázek 10 Pozitivní výsledek DDS testu (převzato z práce: Bradford, 2001)

AMC = amoxicilin v kombinaci s kyselinou klavulanovou (disk umístěný vlevo) CAZ = ceftazidim (disk umístěný vpravo)

7.2.2.2 Etest pro průkaz ESBL V tomto testu se užívají komerčně vyráběné proužky, které jsou napuštěny na jednom konci gradientem ceftazidimu a na konci druhém gradientem ceftazidimu v kombinaci s kyselinou klavulanovou (obvykle 4 µg/ml). Pozitivní výsledek testu nastává v případě snížení MIC ceftazidimu v přítomnosti kyseliny klavulanové o 3 ředění ve srovnání s MIC ceftazidimu samotného. Etest je citlivější než DDS test, ve srovnání s ním je ale nákladnější. Tato metoda je vhodná

pro praktické využití, ale někdy obtížná na vyhodnocení v případě, že MIC

ceftazidimu je nízká, protože kyselina klavulanová difunduje z jedné strany proužku ke straně obsahující ceftazidim samotný (Bradford, 2001). Srovnání těchto dvou možných výsledků testu popisuje obrázek 11. Nevýhoda Etestu spočívá také v jeho neschopnosti rozlišit hyperproducenty chromozomální β-laktamázy K1 izolátů K. oxytoca od izolátů produkujících

48

ESBL. I přes tyto nedostatky se doporučuje používat Etest k rutinnímu testování klinických izolátů (Leverstein-van Hall a kol., 2002).

Obrázek 11 Etest pro průkaz širokospektrých β-laktamáz (převzato: Bradford, 2001)

A)

B)

V obou případech je levá strana proužku napuštěna ceftazidimem v kombinaci s kyselinou klavulanovou (TZL), pravá strana obsahuje gradient ceftazidimu (TZ). Obrázek A znázorňuje zřetelně pozitivní výsledek testu. Na obrázku B je vidět výsledek testu, který je obtížný na vyhodnocení, neboť kyselina klavulanová difunduje agarem z levé strany proužku ke straně pravé obsahující samotný ceftazidim.

7.2.2.3 Trojrozměrný test Trojrozměrný test k průkazu širokospektrých β-laktamáz byl vyvinut Thomsonem a Sandersem. Inokulum testované bakterie se aplikuje na MH agar, část agaru se vyřízne, čímž vznikne jamka, do které se napipetuje inokulum. Antibiotické disky se umístí na povrch agaru ve vzdálenosti 3 mm od této jamky. Nesouvislost kruhové zóny inhibice kolem disků je považována za pozitivní výsledek. Je dostatečně citlivý, ale pracný a technicky náročnější než jiné metody. Výhodou trojrozměrného testu je, že poskytuje zároveň informaci o citlivosti k antibiotikům i produkci širokospektré β-laktamázy (Thomson a Sanders, 1992).

49

7.2.2.4 Automatizované testy na průkaz ESBL V Evropě jsou dostupné 3 automatizované systémy schopné prokázat produkci širokospektré β-laktamázy, a to systémy Vitek 1, Vitek 2 a novější mikrobiologický automatizovaný systém Phoenix. Tyto systémy využívají komerčně vyráběné stripy, které se inokulují a příslušnou dobu inkubují. Umožňují automatizovanou identifikaci bakterií a testování jejich citlivosti k antimikrobiálním látkám, výsledky jsou vyhodnocovány speciálně vyvinutými softwarovými programy (Leverstein-van Hall a kol., 2002). Testy jsou opět založeny na srovnání zóny redukovaného růstu bakterie způsobeného inhibicí cefalosporinem 3. generace v kombinaci s klavulanovou kyselinou a zóny vzniklé inhibicí samotným cefalosporinem. Získané výsledky jsou analyzovány softwarovým programem, který k výsledkům poskytuje komentáře a doporučení dalších testů. Jednou z důležitých funkcí tohoto systému je odhalení nesouladu mezi identifikací organismu a citlivostí vyšetřeného izolátu k antimikrobiálním látkám. Hodnocení je založeno na srovnávání různých fenotypů a hodnot MIC, které jsou pro počítačové vyhodnocování získávány převážně z publikované literatury a různých výzkumů (Leverstein-van Hall a kol., 2002). Leverstein-van Hall a kol. publikovali v roce 2002 výsledky svého výzkumu, ve kterém srovnávali schopnosti 3 zmíněných automatizovaných testů a Etestu zachytit producenty ESBL. Bylo prokázáno, že Etest a systém Vitek 1 nesprávně označují izoláty K. oxytoca produkující β-laktamázu K1 za producenty širokospektré β-laktamázy. Systémy Phoenix a Vitek 2 v naprosté většině případů při odlišení těchto izolátů neselhaly. Phoenix byl vyhodnocen jako nejlepší systém schopný detekovat produkci ESBL s vysokou citlivostí a specifitou. 7.3 Molekulárně-biologické metody průkazu β-laktamáz Metody založené na průkazu fenotypu mohou pouze prokázat přítomnost β-laktamázy, přesné určení specifické β-laktamázy je komplikovanější. Běžné identifikační metody širokospektrých β-laktamáz zahrnují určení biochemických a biofyzikálních vlastností těchto enzymů, to znamená analýzu jejich substrátové specifity a určení izoelektrického bodu. Tyto metody vyžadují různé stupně purifikace proteinů a navíc metoda založená na průkazu izoelektrického bodu selhává u některých nově popsaných širokospektrých β-laktamáz TEM, SHV, CTX-M i OXA typu, které mohou mít hodnoty izoelektrického bodu shodné. Nejspolehlivější metodou je přímé sekvencování 50

DNA, které se stalo tzv. „zlatým

standardem“ pro analýzu genů kódujících nové typy β-laktamáz. Nespornou nevýhodou této metody jsou vysoké náklady a časová náročnost. Mohou nastat i technické problémy v případě, že vyšetřovaný izolát nese 2 geny pro různé β-laktamázy, které se liší pouze malým počtem nukleotidů. Z těchto důvodu se tato metoda v klinických laboratořích nepoužívá (M’Zahli a kol., 1998). Nejrůznější molekulárně-biologické techniky, které nacházejí uplatnění v rutinní klinické praxi, využívají k identifikaci β-laktamáz DNA sondy; častěji jsou ale založeny na PCR (Fluit a kol., 2001). Hlavní kroky PCR zahrnují denaturaci DNA, připojení primerů a jejich elongaci termostabilní DNA polymerázou. Při metodách PCR se používají oligonukleotidové primery specifické pro různé geny kódující určité β-laktamázy. Tyto primery je možné vybrat podle specifických sekvencí různých β-laktamáz, dostupných ve veřejných databázích (na příklad Genbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) (Bradford, 2001). Amlifikované úseky DNA jsou obvykle detekovány elektroforézou na agarovém gelu. Odlišným přístupem v detekci produktů PCR je využití immunoassay (Curran a kol., 1996).

7.3.1 Metody hybridizace za využití DNA sond DNA sondy se používají převážně k průkazu genů kódujících β-laktamázy TEM-1, OXA-1, SHV-1 a AmpC, které se řadí mezi enzymy s úzkým spektrem účinku (Fluit a kol., 2001). První molekulárně-biologická metoda využívající DNA sondy pro rozlišení β-laktamáz TEM-1 a TEM-2 byla vyvinuta Oullettem a kol. v roce 1988. Pro vizualizaci výsledného produktu reakce je možné označit DNA sondy radioizotopy nebo biotinem. Důležitou vlastností těchto sond, která ovlivňuje výsledky, je jejich délka. Při použití krátkých sond vzroste riziko špatné identifikace, je-li u odlišných organismů přítomna stejná sekvence v nepříbuzných genech. Naopak delší sondy často postrádají specifitu a mohou hybridizovat s příbuznými sekvencemi různých genů (Fluit a kol., 2001)

7.3.2 PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism) Tato metoda je založena na analýze konformačního polymorfismu jednořetězcových vláken. Má vysoké uplatnění při detekci základních mutací na specifických místech genů blaSHV. Podstatou metody je vytvoření amplikonu o velikosti 475 pb prostřednictvím PCR za využití oligonukleotidových primerů homologních k sekvencím genů blaSHV. V následujících krocích je tento amplikon naštěpen restrikčním enzymem PstI. Vzniklé fragmenty nukleové kyseliny jsou denaturovány na jednořetězcové úseky a podrobeny elektroforéze na 20% 51

polyakrylovém gelu (M’Zahli a kol., 1998). Metoda vychází ze skutečnosti, že molekula jednořetězcové DNA má sekundární strukturu, která je určena nukleotidovou sekvencí, vlastnostmi pufru a teplotou (Fluit a kol., 2001). Jednobodové mutace mění konformaci denaturovaných vláken a tudíž dochází ke změně jejich elektroforetické pohyblivosti. Odlišná pozice jednořetězcových fragmentů na polyakrylovém gelu tedy odráží odlišnost v sekvenci (Heritage a kol., 1999). Je to vysoce citlivá metoda pro odhalování jednonukleotidových změn jednořetězcové DNA. Nespornou výhodou je také její jednoduchost a vysoký stupeň specifity (Mazura a kol., 2001). M’Zahli a kol. prokázali, že technika PCR-SSCP může být použita i u těch kmenů, které nesou více než jeden typ genu blaSHV. Má rovněž schopnost detekovat nové, do té doby nepopsané, β-laktamázy SHV typu. Chanawong a kol. ve své práci ale upozorňují, že některé varianty je obtížné od ostatních β-laktamáz SHV odlišit. Další nevýhodou je relativně nákladné přístrojové vybavení, které není v diagnostických laboratořích běžně dostupné (Chanawong a kol., 2000). Technika PCR-SSCP má schopnost detekovat jakoukoli bodovou mutaci v jakékoli krátké sekvenci DNA. Je možné ji použít i pro průkaz genů kódujích jiné β-laktamázy a genů podmiňujících rezistenci k jiným antibiotikům (Heritage a kol., 1999). Technika SSCP se také využívá k identifikaci β-laktamáz TEM rezistentních nejčastěji ke kyselině klavulanové a k vyhledávání nových typů β-laktamáz rezistentních k inhibitorům (Speldooren a kol., 1998).

7.3.3 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) V případě, že nějaká mutace vnáší do genu, nebo odstraňuje z genu rozpoznávací místo pro pro určitý restrikční enzym, je možno k její detekci použít metodu polymorfismů délek restrikčních fragmentů. Tato technika je založena na specifické vlastnosti enzymů, restrikčních endonukleáz, štěpit dvouřetězcovou DNA na určitých, sekvenčně totožných, místech. Tato místa v molekule mají nejčastěji charakter 4-6 nukleotidových palidromů. Výsledkem této základní hybridizační techniky jsou detekovatelné změny v délce DNA fragmentů (Mazura a kol., 2001). Rozdílná délka fragmentů vytvořených určitým restrikčním enzymem v sobě odráží bodové mutace strukturních genů (Bradford, 2001). Tato metoda je běžně používána k identifikaci β-laktamáz typů TEM i SHV. Při průkazu βlaktamáz SHV se používá restrikční enzym NheI, který má schopnost odhalit nukleotidové změny G na A, které se projeví jako substituce glycinu za serin v pozici 238; mutace v této pozici je typická pro mnoho širokospektrých β-laktamáz SHV typu. Dalším často používaným 52

restrikčním enzymem je endonukleáza DdeI, která odhaluje mutaci genů blaSHV v pozici 35. Metodou PCR-RFLP nelze určit přesný typ širokospektré SHV β-laktamázy a některé mutace nemohou být komerčně dodávanými endonukleázami odhaleny (Chanawong a kol., 2000). Tato technika může být aplikována pro průkaz derivátů β-laktamázy OXA-10, ale opět touto metodou nelze určit přesný typ enzymu. Problém identifikace oxacilináz spočívá v heterogenitě jednotlivých typů těchto enzymů (Bert a kol., 2002). Chanawong a kol. publikovali v roce 2000 studii, ve které identifikovali β-laktamázy SHV prostřednictvím metod PCR-SSCP a PCR-RFLP. Ve výzkumu byly použity různé restriktázy k detekci 12 mutací v 11 oblastech genů blaSHV. Bylo prokázáno, že kombinované použití obou metod poskytuje vedle přímého sekvencování nejcitlivější techniku k identifikaci širokospektrých β-laktamáz tohoto typu.

7.3.4 RSI-PCR (restriction site insertion) Velmi jednoduchou a rychlou technikou vyvinutou k detekci jednobodových mutací je metoda založená na inserci restrikčních míst. Prostřednictvím RSI-PCR lze identifikovat známé mutace genů blaSHV a odlišit jednotlivé varianty těchto genů, které nemohou být rozpoznány jinými technikami. Chanawong a kol. (2001) prokázali, že při kombinaci PCRRFLP a RSI-PCR může být rychle a spolehlivě rozlišeno až 27 variant β-laktamáz SHV. K tvorbě míst charakteristických pro určité restriktázy se používají speciálně navržené primery. Používané primery detekují mutace, které mají za následek substituci aminokyselin v pozicích 8, 179, 205, 238 a 240. Při amplifikaci vytváří primery nová restrikční místa, která jsou poté štěpena specifickými restrikčními endonukleázami. Působením těchto restriktáz vznikají fragmenty určitých délek, které jsou odlišeny elektroforézou. Amplifikované sekvence genů blaSHV nesoucí mutace nebudou svými endonukleázami štěpeny. Vyjímku tvoří primer pro detekci substituce v pozici 205. Tento primer byl navržen tak, aby deletoval restrikční místo specifické pro endonukleázu PstI, toto místo se nachází v blízkosti nukleotidů kódujících aminokyseliny v pozici 208 a 209. Restrikční místo pro PstI je přítomné ve všech genech blaSHV. Primery budou tvořit amplikon, který bude naštěpen restriktázou PstI pouze v případě, je-li tvořen geny, které nesou mutaci v místě pro tuto restriktázu PstI. RSI-PCR je flexibilní metoda, při které je možné vytvářet či odstraňovat restrikční místa. Vyžaduje pouze základní přístrojové vybavení, termocycler a zařízení pro elektroforézu. Její

53

nevýhodou je možnost detekovat mutace pouze v sekvencích, kde příslušné typy primerů vytváří restrikční místa (Chanawong a kol., 2001).

7.3.5 LCR (ligase chain reaction) Ligázová řetězová reakce je amplifikační technikou, která je používána pro množení fragmentů nukleové kyseliny prostřednictvím termostabilní DNA ligázy. Schéma této techniky je totožné s PCR, odlišuje se používáním 2 párů primerů. První pár primerů je navržen tak, aby nasedal do bezprostřední blízkosti cílových oblastí templátu prvního řetězce, druhý pár je komplementární k cílovým sekvencím opačného řetězce (Mazura a kol., 2001). Oproti některým typům PCR má ligázou řízená amplifikace schopnost detekovat jednonukleotidové změny. To je umožněno specifickou úpravou primerů na 5'-konci tak, že v jejich 3'-koncové pozici je programována predikovaná mutace. Výsledkem změny v jednom nukleotidu je porucha hybridizace a přerušení ligázové řetězové reakce (Mazura a kol., 2001). Oligonukleotidy se změněnými bázemi nemohou amplifikovat a budou odlišeny od ostatních sekvencí. Oligonukleotidové produkty jednoho genu mohou sloužit jako substrát pro další cyklus, proto se signál zesiluje exponenciálně jako u PCR amplifikace (Kim a Lee, 2000). Ligázová řetězová reakce slouží k průkazu β-laktamáz typu SHV. Při této technice jsou cílové sekvence DNA denaturovány v termocycleru při 94 oC a po snížení teploty na 65 oC nastává ligace prostřednictvím 4 typů primerů značených biotinem, který umožňuje konečnou vizualizaci amplifikovaných produktů. V následujících krocích je aplikována termostabilní ligáza, která spojuje pouze ty primery, které jsou komplementární k cílovým sekvencím. Používají se primery, které mají schopnost detekovat následující substituce: Gln za Leu v pozici 35, Leu za Arg v pozici 205, Ser za Gly v pozici 238 a Lys za Glu v pozici 240. Právě schopnost detekovat mutaci v pozici 238 je velkou výhodou této metody, neboť mutace v této pozici je pro širokospektré β-laktamázy SHV typická (Kim a Lee, 2000).

7.3.6 Real-time PCR a MCMD (melting curve mutation detection) K průkazu β-laktamáz SHV byla vyvinuta nová metoda založená na detekci mutace prostřednictvím analýzy křivky tání, která využívá real-time PCR k vizualizaci množství amplifikované DNA. Při této technice se používají dvě speciálně navržené oligonukleotidové sondy značené fluorescenčními látkami. Mutace jsou detekovány za využití energetické změny fluorescenční resonance (FRET). Podle intenzity flourescence je možné zjistit množství amplifikované DNA sekvence. Jednobodové mutace mohou být 54

detekovány

v případě, že jedna ze sond funguje jako krátká detekční sonda. Přítomnost bodové mutace v cílové sekvenci DNA znemožní připojení sondy a způsobí charakteristické snížení teploty tání, které je detekováno a zaznamenáno ve formě křivky. Má vysokou schopnost detekovat mutace v pozicích 179, 238 a 240. Její nespornou výhodou je, že nevyžaduje postamplifikační manipulace jako restrikci nebo detekci amlifikačních produktů elektroforézou. To snižuje možnost kontaminace konečného produktu a množství chyb potenciálně vznikajících při jednotlivých krocích PCR s postamplifikačními úpravami. Metoda je velmi citlivá, specifická a navíc velmi snadná a rychlá; výsledky jsou dostupné do 1 hodiny. Podobně jako PCR-RFLP ale nemá schopnost přesně určit typ produkované β-laktamázy SHV, tyto enzymy může pouze rozdělit do dvou skupin, a to na SHV, které nepatří mezi ESBL (SHV-1 a SHV-11) a širokospektré βlaktamázy SHV. Další nevýhodou je drahé přístrojové vybavení (LightCycler). Ale díky svým nesporným přednostem se pravděpodobně stane metodou užívanou v rutinní diagnostice (Randegger a Hächler, 2001).

55

8. DISKUSE β-laktamová antibiotika patří mezi nejpoužívanější a nejméně toxické antimikrobiální látky. Není tedy překvapující, že díky vysoké spotřebě těchto léčiv vzniká velmi snadno rezistence. Problematika rezistence bakterií k β-laktamovým antibiotikům vyvolaná produkcí β-laktamáz je velmi obsáhlým tématem. V odborné literatuře a převážně v odborných časopisech zabývajících se rezistencí bakterií a antimikrobiální léčbou (zejména časopis Antimicrobial Agents and Chemotherapy) je jedním z aktuálních problémů, kterému se dnes věnuje vysoká pozornost. Samo členění β-laktamových antibiotik penicilinů a cefalosporinů nebývá jednotné. Tak například v nejnovějších monografii autorů Finch a kol. (2003) jsou cefalosporiny na rozdíl od klasického členění děleny na 6 skupin podle spektra účinku. Do budoucnosti lze očekávat, že systém členění β-laktamových antibiotik bude odrážet vedle spektra účinku i jejich rezistenci k různým typům β-laktamáz. V oblasti metod testování citlivosti bakterií k antimikrobiálním látkám zůstává nedořešená jejich standardizace. Do současnosti nebyla provedena mezinárodní standardizace metodik a přijata obecně platná kritérii pro interpretaci výsledků citlivosti. Určitým všeobecně uznávaným standardem jsou směrnice vydávané NCCLS. Metodiky této organizace jsou používány v mikrobiologických laboratořích mnoha zemí a jejich dodržení je vyžadováno při publikaci výsledků ve vědeckých časopisech. Nejběžnějším mechanismem rezistence bakterií k β-laktamovým antibiotikům je rezistence zprostředkovaná produkcí β-laktamáz. Jak je v této práci zmíněno, do roku 2003 bylo popsáno okolo 340 různých typů β-laktamáz a to není rozhodně číslo konečné, což je potvrzeno skutečností, že v odborné literatuře staré zhruba 10 let je toto číslo poloviční. Z důvodu vysokého počtu druhů těchto enzymů je nutné je nějakým způsobem rozčlenit. Klasifikace β-laktamáz je složitým a obsáhlým tématem. Klasifikační schémata, která členila β-laktamázy na základě spektra jejich účinku selhala s objevem novějších typů širokospektrých β-laktamáz. V současnosti se při klasifikaci stále častěji využívají metody molekulární biologie. Je zajímavé, že tento způsob klasifikace dobře koreluje se schématy členícími β-laktamázy na základě fenotypových vlastností. Mnoho genů kódujících βlaktamázy se zatím nepodařilo sekvencovat, tak je otázkou, zda bude shoda mezi těmito schématy i nadále zachována. Nedílnou součástí problému rezistence je vývoj rychlých a levných diagnostických metod 56

pro průkaz rezistentních kmenů v bakteriální populaci. Metody zakládající se na průkazu fenotypových vlastností β-laktamáz často selhávají při průkazu širokospektrých β-laktamáz. Vývoj spolehlivých metod k odlišení těchto enzymů a zajištění jejich standardizace je proto stálým požadavkem klinické mikrobiologie. V tomto směru jsou metody molekulární biologie považovány za nejspolehlivější, jejich zavedení do rutinních laboratoří by mohlo napomoci identifikaci β-laktamáz a tím i racionální volbě antibiotické terapie.

57

9. ZÁVĚR Vědecké poznatky během posledních desetiletí přispěly značným způsobem k pochopení základních biologických procesů antimikrobiální rezistence a jejího vlivu na člověka, zvířata a prostředí. Získané znalosti nám dávají příležitost tyto procesy ovlivnit. Vědci, kteří se zabývají výzkumem rezistence si jsou vědomi celosvětového problému šíření rezistence a hledají jeho řešení ve vývoji nových antimikrobiálních látek a dezinfekčních prostředků. Cílem boje proti rezistenci bakterií k antimikrobiálním látkám je vyvinutí nových strategií, jak zamezit a odstranit kolonizaci a infekci pacientů, zabránit přenosu infekcí vyvolaných rezistentními klony bakterií. Novějším přístupem v otázce zamezení šíření rezistence je terapie bakteriofágy, aktivní a pasivní imunizace a také užívání probiotik. Na šíření rezistence v bakteriální populaci má svůj podíl také užívání antibiotik ve veterinární oblasti k terapii a profylaxi bakteriálních infekcí. Samostatnou kapitolou je použití antimikrobiálních látek jako růstových stimulátorů. Je však nutné zdůraznit, že aplikace růstových stimulátorů je v mnoha zemích již zakázána. Při nadměrné aplikaci antibiotik dochází u zvířat k selekci rezistentních klonů bakterií, které mohou kontaminovat živočišné produkty, prostředí, potraviny a následně člověka. Determinanty rezistence se tak mohou touto cestou přenést k lidským patogenům. Ve své diplomové práci bych se chtěla věnovat této problematice podrobněji a zaměřit se na monitorováním frekvence výskytu β-laktamáz u bakterií izolovaných z potravního řetězce člověka.

58

10. SEZNAM LITERATURY Ambler, R. P. (1980): The structure of β-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. B. 289: 321-331. Afzal-Shah, M., Woodford, N., Livermoore, D. M. (2001): Characterization of OXA-25, OXA-26, and OXA-27, molecular class D β-lactamases associated with carbapenem resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 583-588. Bebrone, C., Moali, C., Mahy, F., Ravil, S., Docquier, J. D., Rossolini, G.M., Fastez, J., Pratt, R.F., Frère, J.M., Galleni, M. (2001): CENTA as a chromogenic substrate for studying β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1868-1871.

Bert, F., Branger, C., Lambert-Zechovsky, N. (2002): Identification of PSE and OXA ßlactamase genes in Pseudomonas aeruginosa using PCR–restriction fragment length polymorphism. J. Antimicrob. Chemother. 50: 11-18.

Blazquez, J., Baquero, M. R., Canton, R., Alos, I., Blaquero, F. (1993): Characterization of a new TEM-type β-lactamase resistant to clavulanate, sulbactam, and tazobactam in a clinical isolate of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 37: 2056-2063.

Bonnet, R., Sampaio, J. L. M, Chanal, C., Sirot, D., Champs, C. D., Viallard, J. L., Labia, R., Sirot, J. (2000): A novel class A extended-spectrum β-lactamase (BES-1) in Serratia marcescens isolated in Brazil. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 3061-3068. Bradford, P. A. (2001): Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin. Microb. Rev. 14: 933-951. Bush, K. (1989): Characterization od β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 33: 259276.

59

Bush, K., Jacoby, G. A., Medeiros, A. A. (1995): A functional classification scheme for βlactamase and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1211-1233.

Carter, M. W., Oakton, K. J., Warner, M., Livermore, D. M. (2000): Detection of extended-spectrum β-lactamases in Klebsiellae with the Oxoid combination disk method . J. Clin. Microb. 38: 4228-4232.

Curran, R., Talbot, D. C. S., Towner, K. J. (1996): A rapid immunoassay method for the direct detection of PCR products: application to detection of TEM β-lactamase genes. J. Med. Microbiol. 45:76-78. Dutour, C., Bonnet, R., Marchandin, H., Boyer, M., Chanal, C., Sirot, D., Sirot, J. (2001): CTX-M-1, CTX-M-3, and CTX-M-14 ß-lactamases from Enterobacteriaceae isolated in France. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1730-1736. Ferrari, M. J., Turnidge, J. D. Section V. Antibacterial agents and suspectibility test methods, 1037-1196. In: Manual of clinical microbiology Vol. 1. Editor Murray, P. R., Baron, E. J., Jorgensen, J. H., Pfaller, M. A., Yolken, R. H., ASM Press Washington, D.C., 2003, 1212 p.

Finch, R. G., Greenwood, D., Norrby, S. R., Whitley, R. J. (2003): Antibiotics and chemotherapeuty. Anti-infective agents and their use in therapy. Vol. 8. Churchill Livingstone, 964 p.

Fluit, A. C., Visser, M. R., Schmitz, F. J. (2001): Molecular detection of antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 14: 836-871.

De Gheldre, Y., Avesani, V., Berhin, C., Delmée, M., Glupczynski, Y. (2003): Evaluation of Oxoid combination discs for detection of extended-spectrum β-lactamases. J. Antimicrob. Chemother. 52: 591-597.

Heritage, J., M’Zahli, F. H., Gascoyne-Binzi, D., Hawkey, P. M. (1999): Evolution and spread of SHV extended-spectrum ß-lactamases in Gram-negative bacteria. J. Antimicrob. Chemother. 44: 309-318. 60

Chanawong, A., M’Zahli, F. H., Heritage, J., Lulitanond, A., Hawkey, P. M. (2000): Characterization of extended- spectrum β-lactamases of the SHV family using a combination of PCR-single strain conformation polymorphism (PCR-SSCP) and PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). FEMS Microb. Lett. 184: 85-89.

Chanawong, A., M’Zahli, F. H., Heritage, J., Lulitanond, A., Hawkey, P. M. (2001): Discrimination of SHV β-lactamase genes by restriction site insertion-PCR. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2110-2114. Jack, G. W., Richmond, M. H. (1970): A comparative study od eight distinct β-lactamases synthetised by gram-negative bacteria. J. Gen. Microb. 61: 43-61. Jacoby, G. A., Han, P. (1996): Detection of extended spectrum β-lactamases in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. J. Clin. Microb. 34: 908-911. Jarlier, V., Nicolas, M., Fournier, G., Philippon, A. (1988): Extended broad-spectrum βlactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and suspectibility pattern. Rev. Infect. Dis. 10: 867-878. Kim, J., Lee, H. J. (2000): Rapid discriminatory detection of genes coding for SHV βlactamases by ligase chain reaction. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1860-1864.

Kolář, M., Látal, T., Čermák, P. (2002): Klinicko-mikrobiologické podklady racionální antibiotické léčby. Nakladatelství Trios, Praha. 110 s.

Leverstein-van Hall, M., Fluit, A. C., Paauw, A., Box, A. T. A., Brisse, S., Verhoef, J. (2002): Evaluation of the Etest ESBL and the BD Phoenix, VITEK 1, and VITEK 2 automated instruments for detection of extended-spectrum β-lactamases in multiresistant Escherichia coli and Klebsiella spp. J. Clin. Microb. 40: 3703-3711. Livermore, D. M. (1995): β-lactamases in laboratory and clinical resistence. Clin. Microb. Rev. 8: 557-584.

Lucet, J. C., Decré, D., Fichelle, A., Joly-Guillou, M. L., Pernet, M., Deblangy, C., Kosmann, M. J., Régnier, B. (1999): Control of prolonged outbreak of extended-spectrum 61

β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in a university hospital. Clin. Infect. Dis. 20: 1411-1418.

Mascaretti, O. A. (2003): Bacteria versus antimicrobial agents an integrated aproach. ASM Press Washington, D.C, 393 p.

Mazura, I., Michalová, K, Brdička, R., Mácha J. (2001): Speciální metody molekulární biologie. Univerzita Karlova v Praze. Nakladatelství Karolinum. 101 s.

Mitsuhashi, S., Inoue, M. (1981): Mechanism of resistance to beta-lactam abtibiotics, p. 4156. In S. Mitsuhashi (ed.), Beta-lactam antibiotics. Springer-Verlag, New York.

M’Zali, F. H., Heritage, J., Gascoyne-Binzi, Snelling, A. M., Hawkey, P. M. (1998): PCR single strand conformational polymorphism can be used to detect the gene encoding SHV-7 extended-spectrum beta-lactamase and to identify different SHV genes within the same strain. J. Antimicrob. Chemother. 41: 123-125.

M’Zahli, F. H., Chanawong, A., Kerr, K. G., Birkenhead, D., Hawkey, P. M. (2000): Detection of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the MAST DD test, the double disc and the Etest ESBL. J. Antimicrob. Chemother. 45: 881-885.

Naas, T., Philippon, L., Poirel, L., Ronco, E., Nordmann, P. (1999): An SHV-derived extended-spectrum β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1281-1284.

NCCLS. 2002. Performance standards for antimicrobial disk and dilution suspectibility tests for bacteria isolated from animals, approved standard-second edition. NCCLS document MA, Vol. 19 No. 11. Edited by NCCLS, Wayne, Pensylvania 2002, 85 p.

Oullette, M., Paul, G. C., Philippon, A. M., Roy, P. H. (1988): Oligonucleotide probes (TEM-1, OXA-1) versus isoelectric focusing in β-lactamase characterization of 114 resistant strains. Antimicrob. Agents Chemother. 32: 397-399.

62

Randegger, C. C., Hächler, H. (2001): Real-time PCR and melting curve analysis for reliable and rapid detection of SHV extended-spectrum β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1730-1736.

Richmond, M. H., Sykes, R. B. (1973): The structure of Gramnegative bacteria and their possible physiological role. Adv. Microb. Physiol. 9: 31-88.

Sanguinetti., M., Posteraro, B., Spanu, T., Ciccaglione, D., Romano, L., Fiori, B., Nicolleti, G., Zanneti, S., Fadda, G. (2003): Characterization of clinical isolates of Enterobacteriaceae from Italy by the BD Phoenix extended-spectrum β-lactamase detection method. J. Clin. Microb. 41: 1463-1468.

Sawai, T., Kanno, M., Tsukamoto, K. (1982): Drug resistance of enteric bacteria. XIV. Comparison

of

β-lactamases

in

gram-negative

rod

bacteria

resistant

to

α-

aminobenzylpenicillin. Jpn. J. Microbiol. 12: 423-434.

Sirot, D., Recule, C., Chaibi, E. B., Bret, L., Croize, J., Chanal-Claris, C., Labia, R., Sirot, J. (1997): A complex mutant of TEM-1 β-lactamase with mutations encountered in both IRT-4 and extended-spectrum TEM-15, produced by an Escherichia coli clinical isolate. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1322-1325. Sougakoff, W., Goussard, S., Courvalin, P. (1988): The TEM-3 β-lactamase, with hydrolyzes broad-spectrum cefalosporins, is derived from the TEM-2 penicillinase by two amino acid substitutions. FEMS Microbiol. Lett. 56: 343-348.

Speldooren,V., Heym, B., Labia, R., Nicolas-Chanoine, M. H. (1998): Discriminatory detection of inhibitor-resistant β-lactamases in Escherichia coli by single-strand conformation polymorphism-PCR. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 879-884. Sykes, R. B., Richmond, M. H. (1976): The β-lactamases of gram-negative bacteria and their role in resistance to β-lactam antibiotics. J. Antimicrob. Chemother. 2: 115-157.

63

Thomson, K. S., Sanders, C. C. (1992): Detection of extended-spectrum beta-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the double-disk and threedimensional tests. Antimicrob. Agents Chemother. 36: 1877-1882.

Urbášková, P. (1997): Rezistence bakterií k antibiotikům-vybrané metody. Nakladatelství Trios, Praha.

Walsh, Ch. Antibiotics-Action, origin, resistence. ASM Press Washington, D.C. 2003, 335 p.

64

OBSAH

seznam zkratek 1.

ÚVOD

1

2.

CÍL PRÁCE

2

3.

β-LAKTAMOVÁ ANTIBIOTIKA

3

3.1 Mechanismus účinku β-laktamových antibiotik 3.2 Rozdělení β-laktamových antibiotik

3 4 4 9 9 9

3.2.1 3.2.3 3.2.4 3.2.5

Peniciliny Monobaktamy Karbapenemy Inhibitory β-laktamáz

4.

STANOVENÍ CITLIVOSTI BAKTERIÍ K ANTIBIOTIKŮM

12

4.1 4.2 4.3 4.4

Výběr antibiotika pro stanovení citlivosti Výběr půdy, příprava inokula a podmínky inkubace Interpretační kategorie Metody pro vyšetření citlivosti mikrobů k antibiotikům 4.4.1 Diluční metody 4.4.1.1 Agarová diluční metoda 4.4.1.2 Bujónové diluční metody 4.4.2 Disková difuzní metoda 4.4.3 Etest

12 12 12 14 14 15 15 16 17

5.

REZISTENCE BAKTERIÍ K ANTIBIOTIKŮM

18

5.1 Genetická podstata získané rezistence 5.2 Obecné mechanismy získané rezistence 5.3 Prevence vzniku a šíření bakteriální rezistence

6.

REZISTENCE K β-LAKTAMOVÝM ANTIBIOTIKŮM

6.1 Rezistence zprostředkovaná PBP 6.2 Omezení přístupu antibiotika k zásahovému místu a jeho aktivní vypuzování 6.3 Rezistence zprostředkovaná β-laktamázami 6.3.1 Nomenklatura β-laktamáz 6.3.2 Spektrum účinku β-laktamáz 6.3.3 Mechanismus katalytického působení 6.3.4 Klasifikace β-laktamáz 6.3.4.1 Historie klasifikačních schémat 6.3.4.2 Bush-Jacoby-Madeirosovo funkčně klasifikační schéma 6.3.4.3 Amblerova klasifikace 6.3.5 Klasifikace β-laktamáz podle Amblera 6.3.5.1 β-laktamázy třídy A 6.3.5.2 β-laktamázy třídy B 6.3.5.3 β-laktamázy třídy C 6.3.5.4 β-laktamázy třídy D

65

19 19 19

21 21 22 22 23 24 26 26 27 27 28 29 29 34 38 41

7.

METODY PRŮKAZU β-LAKTAMÁZ

42

7.1 Testy založené na přímém průkazu β-laktamáz 7.1.1 Chromogenní metody 7.1.2 Acidimetrické a jodometrické metody 7.1.3 Kontrola kvality testů založených na přímém průkazu β-laktamáz

43 43 45 45

7.2 Metody založené na průkazu ESBL fenotypu 7.2.1 Podezření na produkci ESBL podle hodnot MIC a průměru inhibičních zón 7.2.2 Průkaz synergie s inhibitorem β-laktamázy 7.2.2.1 Diskový difuzní test s inhibitorem β-laktamázy 7.2.2.2 Etest pro průkaz ESBL 7.2.2.3 Trojrozměrný test 7.2.2.4 Automatizované testy na průkaz ESBL

45 46 47 47 48 49 50

7.3 Molekulárně-biologické metody průkazu β-laktamáz 7.3.1 Metody hybridizace za využití DNA sond 7.3.2 PCR-SSCR 7.3.3 PCR-RFLP 7.3.4 RSI-PCR 7.3.5 LCR 7.3.6 Real-time PCR a MCMD

50 51 51 52 53 54 54

8.

DISKUSE

56

9.

ZÁVĚR

58

10. SEZNAM LITERATURY

59

66