UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd
Diagnostika virové hepatitidy B v sérologické a molekulárně biologické laboratoři Bakalářská práce
Vedoucí bakalářské práce: PharmDr. Barbora Voxová Školitel externista: Mgr. Linda Matoušová
Hradec Králové, 2014
Petr Vagner
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“
datum
podpis
Poděkování: Rád bych touto cestou poděkoval PharmDr. Barboře Voxové z Katedry biologických a lékařských věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy a Ústavu klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Hradec Králové za vedení bakalářské práce a Mgr. Lindě Matoušové ze Sérologické laboratoře Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze za odborné vedení, dohled, trpělivost a pečlivost v průběhu tvorby této práce. Děkuji také MUDr. Miluši Kreidlové a Bc. Veronice Žďárské ze Sérologické laboratoře Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze za cenné rady během celého studia. Další dík náleží kolegyním ze Sérologické laboratoře Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze za ochotu pomoci během celé doby studia. Mnohokrát děkuji přítelkyni, rodině i přátelům za velkou podporu během studia.
SOUHRN
Autor: Petr Vagner
Název: Diagnostika virové hepatitidy B v sérologické a molekulárně biologické laboratoři Studijní obor: Zdravotní laborant, kombinovaná forma
Cíl práce: Náhled do diagnostiky virové hepatitidy B se zaměřením na vyšetření sérologických markerů hepatitidy B a vyšetření DNA viru hepatitidy B. Materiál a metody: V Sérologické laboratoři Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky (ÚLBLD) ve Všeobecné fakultní nemocnici (VFN) v období od 1. 1. 2011 do 31. 12. 2013 bylo provedeno 77 900 vyšetření metodou chemiluminiscenční imunoanalýzy systémem ARCHITECT a enzymové imunoanalýzy systémem AxSYM pro detekci protilátek a antigenů viru hepatitidy B nebo molekulárně biologickými metodami pro detekci DNA viru hepatitidy B, určení jeho genotypu, lékové rezistence a pre-core mutace. Výsledky: Ze 77 900 vyšetření HBV v laboratoři za stanovené období let 2011 – 2013 bylo provedeno 92,90% sérologických a
7,10% molekulárně biologických
vyšetření. Z vyšetření sérologických markerů HBV byla nejvyšší četnost vyšetření HBsAg (24 033 vyšetření) a anti-HBs (16 588 vyšetření). Z 16 588 vyšetření anti-HBs zaslalo nejvíce požadavků na vyšetření Centrum preventivní péče VFN, 4 665 vyšetření anti-HBs za stanovené období, z toho 3 254 průvodních listů s diagnózou Zdravotní prohlídka zaměstnanců. Z molekulárně biologických vyšetření HBV byla nejvyšší četnost vyšetření HBV DNA (5085 vyšetření) a určení HBV genotypu (262). Z určených genotypů HBV v daném období byly detekovány genotypy A (50,00%), B (7,57%), C (7,98%), D (33,19%), E (0,42%), F (0,42%) a genotyp H (0,42%). Závěry: Ze získaných dat vyplývá, že se v nemocnici dodržuje povinná kontrola protilátek proti HBsAg. Výsledky určení genotypu HBV byly srovnány s geografickým popisem a rozdíl byl objasněn.
ABSTRACT
Author: Petr Vagner
Title: Diagnosis of viral hepatitis B in the serologic and molecular biology laboratory Field of study: Medical laboratory technician, combined type of study
The aim of the study: The insight to the diagnosis of viral hepatitis B, with a focus on the examination of antibodies and antigens of Hepatitis B virus. Material and Methods: From 1st January 2011 to 31st December 2013 the serological laboratory of the Institute of Medical Biochemistry and Laboratory Medicine (ÚLBLD) in General University Hospital in Prague (VFN) 77,900 examinations were carried out by chemiluminescent immunoassay system ARCHITECT and system enzyme immunoassay AxSYM, which is used for detection of antibodies and antigens of the virus hepatitis B or detection of molecular biological methods for the detection of hepatitis B virus DNA, the determination of its genotype, drug resistance and pre-core mutations. Results: In total 92.90% of mentioned examinations were serological examinations and 7.10% molecular biological examinations. The examinations of serological markers of HBV were with the highest frequency of HBsAg testing (24, 033 tests) and 16 588 anti-HBs tests, the majority of requests was sent by The Center of Preventive Care (VFN), on the whole 4665 examinations of anti-HBs, from which 3,254 were indicated as health examinations of employees. From HBV molecular biological examinations the highest frequency had HBV DNA test (5,085) and determining the genotype of HBV (262). From the determined genotypes of HBV in a given period genotypes A (50.00%), B (7.57%), C (7.98%), D (33.19%), E (0.42%) F (0.42%) and H (0.42%) were detected. Conclusion: The obtained data confirm that the hospital follows mandatory inspection of antibodies against HBsAg. The results of the determination of HBV genotype were compared with a geographical description and the differences were explained.
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ALT
alaninaminotransferáza
Anti-HBc
protilátka proti dřeňovému (core) antigenu viru hepatitidy B
Anti-HBc IgM
protilátka proti dřeňovému (core) antigenu viru hepatitidy B třídy IgM
Anti-HBe
protilátka proti e antigenu viru hepatitidy B
Anti-HBs
protilátka proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B
CMIA
chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích
DNA
deoxyribonukleová kyselina
dNTP
deoxynukleotid trifosfát
ELFO
elektroforéza
HAV
hepatitida A virus
HBcAg
dřeňový (core) antigen viru hepatitidy B
HBeAg
e antigen virové hepatitidy B
HBsAg
povrchový antigen viru hepatitidy B (Australský antigen)
HBV
hepatitida B virus
HCC
hepatocelulární karcinom
HDV
hepatitida D virus
IU
mezinárodní jednotky
MEIA
enzymová imunoanalýza na mikročásticích
mRNA
messengerová RNA
NK
nukleová kyselina
ORF
otevřený čtecí rámeček
PCR
polymerázová řetězcová reakce
real-time PCR
PCR v reálném čase
rHBsAg
rekombinantní HBsAg
RLU
relativní světelné jednotky
RNA
ribonukleová kyselina
SZÚ
Státní zdravotní ústav
ÚLBLD
Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky
VFN
Všeobecná fakultní nemocnice
VHB
virová hepatitida B
Z100
diagnóza zdravotní prohlídka zaměstnanců
OBSAH 1
ÚVOD................................................................................................................... 8 1.1
2
ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE ................................................................... 8
TEORETICKÁ ČÁST............................................................................................ 9 2.1
CHARAKTERISTIKA VIROVÉ HEPATITIDY B ............................................. 9
2.1.1
AKUTNÍ HEPATITIDA B ......................................................................... 9
2.1.2
CHRONICKÁ HEPATITIDA B ............................................................... 10
2.1.3
VAKCINACE PROTI HEPATITIDĚ B.................................................... 12
2.1.4
LÉČBA VIROVÉ HEPATITIDY B .......................................................... 13
2.2
VIRUS HEPATITIDY B ................................................................................ 14
2.2.1
REPLIKACE HBV ................................................................................. 14
2.2.2
GENOM VIRU HEPATITIDY B ............................................................. 14
2.2.3
SÉROLOGICKÉ MARKERY HEPATITIDY B........................................ 15
2.3
DIAGNOSTIKA VIROVÉ HEPATITIDY B .................................................... 18
2.3.1
2.3.1.1
DETEKCE A VÝZNAM HBsAg ....................................................... 19
2.3.1.2
DETEKCE A VÝZNAM anti–HBs.................................................... 19
2.3.1.3
DETEKCE OSTATNÍCH SEROLOGICKÝCH MARKERŮ VHB ..... 20
2.3.2
3
DETEKCE A VÝZNAM VIROVÝCH MARKERŮ HEPATITIDY B.......... 18
DETEKCE HBV DNA ............................................................................ 21
2.3.2.1
IDENTIFIKACE GENOTYPU HBV ................................................. 21
2.3.2.2
LÉKOVÁ REZISTENCE ................................................................. 23
2.3.1.3
PRECORE MUTANTA ................................................................... 23
PRAKTICKÁ ČÁST ............................................................................................ 24 3.1
STANOVENÍ TITRU anti-HBs ..................................................................... 24
3.2
STANOVENÍ HBV VIRÉMIE........................................................................ 24
3.3
URČENÍ GENOTYPU HBV ......................................................................... 25
4
VÝSLEDKY ........................................................................................................ 27
5
DISKUZE ........................................................................................................... 33
6
ZÁVĚR ............................................................................................................... 35
SEZNAM OBRÁZKŮ, GRAFŮ A TABULEK ............................................................. 36 POUŽITÁ LITERATURA........................................................................................... 37
1
ÚVOD Tato bakalářská práce zahrnuje problematiku virové hepatitidy B. V teoretické
části je popisován virus způsobující tuto infekci, klinické projevy onemocnění, cesty přenosu, možnosti terapie a shrnuta laboratorní diagnostika. V praktické části se práce
blíže
zaměřuje
na
specifickou
laboratorní
diagnostiku
souvisíjící
s onemocněním virovou hepatitidou B a statistické zpracování dat za období tří let získaných v Sérologické laboratoři Ústavu lékařské biologie a laboratorní diagnostiky ve Všeobecné fakultní nemocnici v Praze, kde pracuji.
1.1
ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Podstatou bakalářské práce je bližší seznámení s virovou hepatitidou B, virem
způsobujícím toto onemocnění a jeho diagnostikou v sérologické a molekulárně biologické laboratoři. Praktická část se zabývá diagnostikou sérologických markerů virové hepatitidy B, tedy protilátek a antigenů, a dále diagnostikou pomocí molekulárně biologických metod.
8
2
TEORETICKÁ ČÁST Následující kapitoly se teoreticky zabývají tématy jako jsou charakteristika
virové hepatitidy B, struktura, specifické vlastnosti a znaky viru hepatitidy B a jeho laboratorní diagnostika.
2.1
CHARAKTERISTIKA VIROVÉ HEPATITIDY B Virová hepatitida B (VHB) je infekční onemocnění, při kterém jsou napadeny
jaterní buňky a které způsobuje akutní či chronické onemocnění jater. VHB patří mezi nejzávažnější choroby postihující velkou část světové populace. Na celé planetě je infikováno cca 350 – 400 milionů lidí (Ehrmann, 2010). Více než 90% dospělých osob infikovaných virem hepatitidy B (HBV) se z infekce zotaví. Přesto asi 600 tisíc lidí ročně zemře na následky akutní nebo chronické formy hepatitidy B (World Health Organization, 2013). Česká republika se řadí mezi státy, kde je poměrně nízký výskyt pozitivních nálezů VHB. Za tento stav vděčíme vysoké úrovni prevence proti VHB (Ehrmann, 2010). HBV může mimo tělo hostitele přežít po dobu nejméně sedmi dnů. Po tuto dobu může virus infikovat osobu, která s ním přijde do kontaktu a není očkovaná vakcínou proti HBV. Inkubační doba HBV je cca. 75 dní (World Health Organization, 2013).
2.1.1 AKUTNÍ HEPATITIDA B Většina pacientů s akutní formou hepatitidy B nemá žádné příznaky. V některých případech však může dojít k zežloutnutí pokožky a očního bělma, pak hovoříme o žloutence (icterus). Mezi další příznaky patří tmavá moč, velká únava, nevolnost, zvracení a bolesti břicha. Tyto příznaky mohou trvat až několik týdnů
(World Health Organization, 2013). Státní zdravotní ústav (SZÚ) na svých internetových stránkách uvádí počet hlášených případů akutní VHB v letech 2004 - 2013 v České republice. Na následujícím grafu č. 1 jsou tato data graficky zpracována. Z grafu vyplývá postupný pokles výskytu akutní VHB (SZÚ, 2014).
9
Graf 1
Hlášený výskyt akutní hepatitidy B v ČR v letech 2004 – 2013, absolutně (Epidata SZÚ, cit. 2014-04-23)
2.1.2 CHRONICKÁ HEPATITIDA B Chronická virová infekce je způsobena imunotolerancí HBV. Buď vůbec nedochází k imunitní reakci na přítomnost HBV, nebo je imunitní reakce velmi slabá (Šperl, 2005). Na světě trpí touto formou jaterní infekce HBV více než 240 miliónů lidí. U těchto pacientů se vyskytuje poškození hepatocytů, které později vede k cirhóze jater nebo hepatocelulárnímu karcinomu (World Health Organization, 2013). Samotný VHB není pro jaterní buňky cytopatogenní. Replikace viru v hepatocytu buňku přímo nepoškozuje. Virus, respektive HBV povrchový antigen (HBsAg) a HBV core antigen (HBcAg), na membráně infikované buňky spouští odpověď imunitního systému, který hepatocyt nakonec zničí (Šperl, 2005). Po histologické stránce dochází při infekci VHB v hepatocytech ke změnám, které jsou charakteristické pro HBV a liší se od projevů ostatních virů. „Objevuje se ´matnicový´ vzhled cytoplazmy hepatocytů. Ta je homogenního vzhledu, jemně granulovaná a světlejší než v okolních virem nepostižených buňkách“ (Mančák, Mančíková, 2004). 10
O chronické formě HBV infekce mluvíme v případě, kdy trvá déle než 6 měsíců a vyznačuje se dlouhotrvajícím pozitivním nálezem HBs antigenu nebo kdy pozitivita HBs antigenu v krvi pacienta přetrvává déle než 6 měsíců (Ehrmann, 2010). Chronickou formu VHB bychom mohli rozdělit na jednotlivé fáze, které se liší hlavně přítomností e antigenu VHB (HBeAg). Jedná se o chronickou VHB ve fázi replikační – HBeAg pozitivní, chronickou VHB ve fázi replikační – HBeAg negativní a chronickou VHB – inaktivní nosičství. Tyto fáze jsou uvedeny v následující tabulce č. 1, spolu s akutní VHB, postinfekčním a postvakcinačním stavem. Tabulka informuje o sérologických a molekulárně biologických nálezech v průběhu infekce (Ehrmann, 2010).
Tabulka 1
Typické sérologické a molekulárně genetické nálezy jednotlivých stádií přirozeného vývoje infekce HBV (Ehrmann, 2010)
Stadium infekce VHB
HBsAg
anti-HBs
HBeAg
anti-HBe
IgG IgM anti-HBc anti-HBc + + + +/-
HBV DNA + +
akutní VHB chronická VHB ve fázi replikační HBeAg pozitivní chronická VHB ve fázi replikační HBeAg negativní chronická VHB inaktivní nosičství postinfekční protilátky postvakcinační protilátky
+ +
-
+ +
-
+
-
-
+/-
+
+/-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
+ +
-
+ -
+ -
-
-
Choroba se častěji vyskytuje v rozvojových státech s vysokým přírůstkem počtu obyvatelstva. V těchto lokalitách se obyvatelé často nakazí HBV už jako děti přímo od matky nebo od osob v jejich okolí (Husa, 2005). Přitom pravděpodobnost, že se infekce HBV stane chronickou, závisí na věku, v němž se člověk nakazí. U dětí mladších šesti let, které se nakazí HBV, je pravděpodobnost rozvoje chronické hepatitidy B velmi vysoká (World Health Organization, 2013). V rozvinutých státech, kde je prevence proti přenosu HBV na vyšší úrovni, ať jde o očkování rizikových skupin nebo důraz na vyšetření dárců krve, dochází k nákaze HBV spíše v dospělém věku. V těchto oblastech bývá stále častěji příčinou přenosu infekce sexuální styk a přenos infikovanou jehlou narkomanů (Husa, 2005).
11
2.1.3 VAKCINACE PROTI HEPATITIDĚ B Hlavní prevencí proti VHB je vakcinace neboli očkování. Kromě vakcinace proti VHB existuje z vakcín proti virovým hepatitidám očkování proti hepatitidě A (HAV). Vakcína proti HBV vytváří sekundárně rezistenci i proti hepatitidě D (HDV), která může vzniknout jen během VHB (Marek, 2010). Po celém světě od roku 1982 byla použita více než miliarda dávek vakcíny. V mnoha zemích, kde 8 – 15% dětí trpělo chronickou formou HBV infekce, se díky vakcinaci snížilo množství infikovaných dětí na méně než 1% (World Health Organization, 2013). V roce 1982 se objevila první komerčně vyráběná vakcína proti HBV, která byla zcela bezpečná. V roce 2001 bylo v České republice zavedeno doočkování proti VHB všech dětí starých 12 let a očkování mladších dětí, které doposud nebyly očkovány. U dětí mladších dvou let byla používána monovalentní vakcína, kterou nahradila v roce 2006 kombinovaná šestivalentní vakcína Infanrix Hexa. Dnes je v České republice vakcinace zavedena od stáří tří až jedenácti měsíců. V případě novorozenců, jejichž matky jsou HBsAg pozitivní, se vakcinace zahajuje do 24 hodin po porodu (Vakciny.net, 2014). Kromě vakcinace mohou být podány hyperimunní imunoglobuliny proti HBV. Tyto prostředky v obraně proti HBV se aplikují např. novorozencům, u jejichž matek byla diagnostikována chronická infekce HBV. Dále jsou tyto imunoglobuliny podávány u pacientů, kteří právě prodělali transplantaci jater z důvodu jaterní cirhózy zapříčiněné chronickou VHB (Souček, 2005). V následující tabulce č. 2 jsou uvedené komerčně vyráběné a distribuované vakcíny a imunoglobuliny proti VHB (Marek, 2010).
Tabulka 2
Komerčně dostupné vakcíny a imunoglobuliny proti VHB (Marek, 2010)
Druh
Obchodní název
Výrobce
vakcína proti HBV
Engerix B Fendrix HB Vax Pro
Glaxo Smith Kline Glaxo Smith Kline Merck sharp dohme
imunoglobulin proti HBV
Pasteurised Human Antihepatitis B Imunoglobulin
Instituto Grifols
kombinovaná vakcína
Twinrix
Glaxo Smith Kline
proti HAV a HBV
Ambirix
Glaxo Smith Kline
12
Dávkování vakcinační látky se liší. Děti jsou za normálních okolností první dávkou očkovány ve 3. až 11. měsíci po porodu, jde většinou o kombinovanou dětskou vakcínu. Počet dávek je 3+1. Časové rozmezí mezi základními dávkami je 1 až 2 měsíce, interval posilující dávky pak 6 až 10 měsíců (ve druhém roce života). Nadále může docházet k přeočkování vakcínou proti HBV na základě hladiny protilátek proti povrchovému antigenu HBV (anti-HBs) v séru, např. u osob pracujících ve zvýšeném riziku nákazy HBV (Vakciny.net, 2014). Očkování by mělo vyvolat tvorbu dostatečného množství ochranných protilátek proti HBV infekci, tedy anti-HBs, které vydrží u zdravé očkované osoby nejméně 20 let, někdy i doživotně (World Health Organization, 2013).
2.1.4 LÉČBA VIROVÉ HEPATITIDY B Žádná specifická léčba akutní VHB není. Péče o pacienta se zaměřuje hlavně na správnou nutriční rovnováhu. Důležité je zachování dostatečného množství tekutin v organizmu, které jsou vylučovány během zvracení a průjmu (World Health Organization, 2013). Léčba chronické formy HBV infekce je možná. Nasazení léčebných prostředků je závislé na hladině HBV DNA v krvi a množství alaninaminotransferázy (ALT). Léčba se doporučuje, jestliže je hladina HBV DNA >2000 IU/ml séra (plazmy). Důležitým ukazatelem pro nasazení léčby je také jaterní biopsie, kde jsou při chronické VHB detekovány zánětlivé nekrotické procesy nebo fibróza jater. Indikace léčebných prostředků u HBeAg pozitivní i HBeAg negativní chronické VHB je stejná (Ehrmann, 2010). V průběhu léčby chronické HBV infekce se pacientům podávají antivirotika a interferon. Léčba zpomaluje průběh cirhózy jater a snižuje možnost výskytu hepatocelulárního karcinomu (HCC). Pacientům s cirhózou je možno pomoci transplantací jater. HCC je bohužel ve většině případů fatální (World Health Organization, 2013).
13
2.2
VIRUS HEPATITIDY B HBV
je
jedním
z nejmenších
obalených
virů
čeledi
Hepadnaviridae
obsahujících jako genetický materiál deoxyribonukleovou kyselinu (DNA). HBV je sférická částice o velikosti asi 42 nm. Kompletní virová částice se také nazývá Daneova částice. HBV způsobuje akutní a chronické infekce (Glebe, 2013). HBV je jediný DNA virus, který způsobuje hepatitidu. Všechny ostatní viry způsobující hepatitidu patří mezi viry obsahující ribonukleovou kyselinu (RNA). Virus HBV však není klasickým DNA virem. DNA viru se vytváří zpětným přepisem z RNA. Procesu se účastní reverzní transkriptáza. Nositelem dědičné informace jsou tedy obě nukleové kyseliny střídavě. Díky těmto procesům u HBV shledáváme vlastnosti obou skupin, ať jde o schopnost integrovat se do DNA hostitelské buňky, což jsou klasické schopnosti DNA virů, nebo klasické chování RNA virů, jako tvoření mnoha kopií při replikaci nebo velká proměnlivost. Unikátní vlastnosti cyklu dávají HBV velkou schopnost přetrvávat v infikovaných buňkách mnohdy i doživotně. Díky této specifičnosti se shledávají jisté podobnosti s retroviry (Beneš, 2009).
2.2.1 REPLIKACE HBV Replikace viru je poměrně složitý proces, který je mezi DNA viry jedinečný (Lukáš, 2007). Proces replikace HBV začíná vniknutím virové DNA do jádra infikované buňky. Do vlákna DNA se doplní potřebné a chybějící báze pro vznik kruhové DNA. Až po této úpravě je virová kruhová DNA začleněna do genomu jaterní buňky. Po integrování DNA do hepatocytu následuje transkripce na RNA, vycestování RNA do cytoplazmy a proteosyntéza (Beneš, 2009).
2.2.2 GENOM VIRU HEPATITIDY B Velikost genomu hepatitidy B je charakterizována takto: „Struktura DNA je dvouvláknová a cirkulární s jednovláknovým úsekem, který obsahuje 600 – 2100 nukleotidů. Celkem se genom HBV skládá z 3 200 bází.“ (Husa, 2005) Genom HBV je tvořen čtyřmi geny. Tyto geny, které jsou schematicky znázorněné na obrázku č. 1, kódují HBV proteiny (Beneš, 2009).
14
Obrázek 1
Organizace genomu HBV (upraveno podle http://www.answers.com/topic/hepatitis-b )
Na obrázku č. 1 je modrou barvou znázorněn gen P. Tento gen kóduje DNA polymerázu. Gen S je znázorněn zelenou barvou. Kóduje HBsAg. Geny pre S1 a pre S2, jsou oblastmi genu S, které kódují protein zajišťující adhezi viru na receptory jaterních buněk. Dalšími geny jsou gen C, ten kóduje HBeAg a HBcAg, zvýrazněn je barvou růžovou a žlutou barvu má na obrázku gen X, který kóduje protein s regulační funkcí. Tento protein je aktivátorem pochodů nezbytných k replikaci viru (Beneš, 2009). Zmíněné geny vytvářejí kódující úseky bez stopkodónů, tzv. otevřené čtecí rámečky (ORF). Tyto ORF se nacházejí na minus DNA vláknu. Toto DNA vlákno je kompletní a kóduje messengerovou RNA (mRNA), připravenou pro tvorbu proteinů HBs, HBc, HBe a X. Plus vlákno DNA bývá inkompletní s fixovaným 5´ koncem a variabilním 3´ koncem (Stránský, 2001).
2.2.3 SÉROLOGICKÉ MARKERY HEPATITIDY B Mezi strukturní součásti HBV řadíme antigeny, které jsou nezbytné pro správnou funkci viru. Jedním z hlavních antigenů je HBsAg, tzv. Australský antigen. Ten je zakotvený na povrchu viru třemi podjednotkami, malou, střední a velkou. HBsAg je nezbytný pro vstup viru do hepatocytu (Lukáš, 2007).
15
Během infekce HBV je HBsAg produkován virem jako první. Objevuje se 1 až 10 týdnů po prvním kontaktu organizmu s virem, což je asi 2 až 8 týdnů před projevem prvních klinických příznaků. HBsAg má dvě hlavní funkce. Slouží viru jako prostředník při navázaní na jaterní buňku a je cílem navázání neutralizačních protilátek (ABBOTT Diagnostics Division, 2011). Jako další strukturální antigen je HBcAg, Core antigen. Protein, o kterém by se dalo říci, že obsahuje dvoušroubovici HBV DNA. Na nukleové kyselině se vyskytuje HBV DNA polymeráza. Jde o nezbytný enzym účastnící se replikace vlákna DNA viru. Při replikaci HBV je z napadeného hepatocytu vylučován HBeAg. Jde o o protein, který nemá strukturní funkci, ale je diagnosticky důležitý. HBeAg je jakýmsi fragmentem HBcAg, což znamená, že jsou kódovány stejným genem (Lukáš, 2007). Na obrázku č. 2 je schematicky zobrazena stavba virové částice HBV.
Obrázek 2
Virus HBV (upraveno podle http://www.answers.com/topic/hepatitis-b)
Mezi sérologické markery, kromě již zmíněných antigenů HBsAg a HBeAg, patří i protilátky, které se v organizmu vytvářejí na podnět přítomnosti antigenů HBV. Běží o protilátky proti povrchovému antigenu (anti-HBs), protilátky proti core antigenu (anti-HBc) a protilátky proti e antigenu (anti-HBe) (Lukáš, 2007). Na ze
následujícím
obrázku
sérologického pohledu.
Je
č.
3
je
znázorněna
znázorněn závislost
průběh výše
titru
akutní
VHB
jednotlivých
detekovaných sérologických markerů na čase od expozice virem až po vyléčení VHB.
16
Obrázek 3
Grafické znázornění průběhu akutní VHB (upraveno podle http://www.remedia.cz/Okruhy-temat/Mikrobiologie-ainfekcni-choroby/Lecba-chronicke-hepatitidy-B/8-1c-an.magarticle.aspx)
Na dalším obrázku č. 4 je znázorněna chronická forma VHB, kdy se detekovaná hladina HBsAg nesnižuje a pacient se stává chronickým nositelem pozitivního HBsAg.
Obrázek 4
Grafické znázornění průběhu chronické VHB (upraveno podle http://www.remedia.cz/Okruhy-temat/Mikrobiologie-ainfekcni-choroby/Lecba-chronicke-hepatitidy-B/8-1c-an.magarticle.aspx) 17
2.3
DIAGNOSTIKA VIROVÉ HEPATITIDY B Základními parametry v diagnostice VHB je vyšetření sérologických markerů
HBV a stanovení virémie, tedy koncentrace HBV DNA v krvi. Přesto že molekulárně biologické metody jsou modernější, důležitost a četnost použití detekce sérologických markerů HBV v laboratoři neklesla, také díky nižší ceně, rychlosti a dostupnosti vyšetření (Špičák, 2007). Je třeba uvést i legislativní postavení vyšetření sérologických markerů VHB, hlavně protilátek anti-HBs, HBsAg a anti-HBc. V příloze č. 4 k vyhlášce č. 422/2008 Sb., jsou uvedeny požadavky na laboratorní vyšetření dárců s výjimkou dárců reprodukčních buněk. V případě HBV jde o vyšetření HBsAg a anti-HBc. (Ministerstvo zdravotnictví, 2008). V paragrafu 7, vyhlášky č. 306/2012 Sb., je popsána nutnost provedení vyšetření základních markerů HBV při hospitalizaci drogově závislého pacienta (Ministerstvo zdravotnictví, 2012).
2.3.1 DETEKCE A VÝZNAM VIROVÝCH MARKERŮ HEPATITIDY B K detekci virových markerů VHB se v naší laboratoři využívá imunochemický analyzátor Systém ARCHITECT PLUS i4000SR od firmy ABBOTT, který je zobrazen na následujícím obrázku č. 5. Tento analyzátor je plně automatizovaný, detekuje antigeny a protilátky na základě principu chemiluminiscenční imunoanalýzy na mikročásticích (CMIA) (ABBOTT Diagnostics Division, 2012).
Obrázek 5
Systém ARCHITECT PLUS i4000SR (upraveno podle http://www.medwrench.com/?equipment.view/equipmentNo/6647/Abbot t-Diagnostics/ARCHITECT-i4000SR/) 18
V roce 2013 přestala být podporována firmou ABBOTT diagnostika na systému AxSYM. Tento analyzátor pracoval na principu enzymové imunoanalýzy na mikročásticích (MEIA) a také umožňoval vyšetření vzorků na sérologické markery HBV (ABBOTT, 2012).
2.3.1.1
DETEKCE A VÝZNAM HBsAg
Pozitivní laboratorní nález HBsAg je hlavním důkazem výskytu HBV v organizmu. Jak již bylo zmíněno, setrvávání HBsAg déle než půl roku znamená chronickou formu onemocnění VHB (Špičák, 2007). Diagnostika HBsAg v systému ARCHITECT je kvalitativní jednokroková imunoanalýza, kdy vzorek tvoří reakční směs s paramagnetickými mikročásticemi, které jsou potažené protilátkami anti-HBs, spolu s konjugátem anti-HBs a akridiniem. HBsAg obsažený ve vzorku se váže na anti-HBs vázaný na mikročásticích. Akridinium v reakční směsi, které řadíme mezi luminofory, v této reakci slouží jako značka. Ta je po reakci s roztoky Pre-trigger a Trigger, což jsou roztoky peroxidu vodíku a hydroxydu sodného, uvedena do nestabilní formy v excitovaném stavu. Při návratu do stabilní formy se energie uvolňuje jako svícení. Výsledná reakce je měřena v relativních světelných jednotkách (RLU). Zda HBsAg ve vzorku je, či není, se určuje porovnáním s hodnotou cut-off. Hodnota cut-off je zjištěna na základě kalibrace, kterou je nutno provést při každém zavedení nového reagenčního setu (ABBOTT Diagnostics Division, 2011).
2.3.1.2
DETEKCE A VÝZNAM anti–HBs
K detekci anti-HBs je využíván již zmíněný systém ARCHITECT, který se používá ke kvantitativnímu stanovení tohoto parametru, tedy ke zjištění koncentrace v lidském séru nebo v plazmě (ABBOTT Diagnostics Division, 2012). Anti-HBs je protilátka, která má neutralizační funkci. Tato protilátka se váže na podjednotku HBsAg, která je ukotvena na povrchu virionu a tím inhibuje vstup HBV do hepatocytu (Lukáš, 2007).
19
Stanovení hladiny anti-HBs se využívá při monitoringu účinnosti očkování a stavu po léčbě u jedinců infikovaných HBV. Zvýšení hladiny protilátek proti HBsAg a snížení hladiny tohoto antigenu dokazuje efektivní léčbu a odeznění onemocnění. V případě pozitivního nálezu anti-HBs u pacientů neočkovaných proti HBV a bez příznaků onemocnění tento nález svědčí o předchozím kontaktu s HBV (ABBOTT Diagnostics Division, 2012).
2.3.1.3
DETEKCE OSTATNÍCH SEROLOGICKÝCH MARKERŮ VHB
HBcAg je protein, který je detekovatelný jen v období replikace virové nukleové kyseliny (NK). Sérologický průkaz u tohoto antigenu není možný, protože HBcAg se v séru nevyskytuje. Tento antigen je detekovatelný pouze na membráně infikovaného hepatocytu speciálními imunohistochemickými metodami (Lukáš, 2007). Diagnostika HBeAg se využívá jako pomocný a doplňkový test při detekci VHB a monitoringu průběhu tohoto onemocnění (ABBOTT Diagnostics Division, 2012). Pokud je pozitivní sérologický nález HBeAg, lze očekávat pozitivní nález HBcAg v jaterní tkáni (Lukáš, 2007). Kvalitativní detekce přítomnosti protilátek anti-HBe se provádí hlavně jako doplňkové vyšetření pro potvrzení virové infekce a pro monitoring průběhu VHB. Metoda je založena na stejném principu jako stanovení ostatních sérologické markery HBV (ABBOTT Diagnostics Division, 2012). Detekcí protilátek anti-HBc, známých také jako protilátek proti core antigenu, se potvrzuje probíhající nebo již proběhnuvší infekce VHB. Metoda ARCHITECT Anti-HBc může být také kromě tohoto využití používána jako screeningové vyšetření vzorků krve a plazmy při předtransfúzním nebo předtransplantačním vytřením, se snahou zamezit přenosu VHB. Jde o kvalitativní detekci opět využívající princip CMIA. (ABBOTT Diagnostics Division, 2013). Posledním sérologickým markerem VHB je protilátka třídy IgM proti core antigenu HBV (anti-HBc IgM). Jde o kvalitativní detekci a využívá se pro stanovení akutní nebo nedávno proběhnuvší virové infekce (ABBOTT Diagnostics Division, 2013).
20
2.3.2 DETEKCE HBV DNA Detekce HBV DNA je jednou z metodik diagnostiky VHB. Spolu s vyšetřením jaterních enzymů a sérologických markerů, patří mezi metody hodnotící průběh a účinnost léčby infekce HBV. Kvantifikace DNA HBV se však považuje za nejpřesnější metodu pro měření replikace viru. Spojitosti mezi hladinou HBV DNA a markery HBV nejsou stále zcela vyjasněné. Kvantita DNA HBV se nejčastěji stanovuje metodou polymerázové řetězcové reakce (PCR), tedy amplifikací NK (Roche Diagnostics, 2012). Principem PCR je: „Enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích“ (Bartůňková, 2011). Pro průběh PCR je nezbytná schopnost denaturace dvouvláknové DNA vysokou teplotou a renaturace při následném ochlazení. Během renaturace je nutné dodržet komplementaritu bazí (Bartůňková, 2011). K určení kvantity HBV DNA j v laboratoři, kde pracuji, využíván test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, dále jen Test COBAS. Test COBAS k detekci využívá PCR v reálném čase (real-time PCR) (Roche Diagnostics, 2012). Real-time PCR je založena na principu klasické PCR. Odlišnost tohoto typu PCR je v měření během exponenciální fáze. Po každém cyklu PCR dochází k měření amplifikovaného produktu na základě fluorescenčního záření. Fluorescenční detekce je umožněna díky fluorescenčním sondám či barvám. Pomocí kalibrační křivky vytvořené danými standardy se vypočítá výsledná kvantifikace DNA (Holubec, 2004).
2.3.2.1
IDENTIFIKACE GENOTYPU HBV
HBV se rozděluje na základě odlišností sekvence genomu na 8 různých genotypů, které se označují A až H. Jednotlivé genotypy se liší v geografickém výskytu, což je znázorněno na obrázku č. 6. Každý genotyp určuje mírně odlišné vlastnosti viru. Např. odpověď na léčbu interferonem alfa je u genotypu A a B lepší než u genotypu C a D (Špičák, 2007). K diagnostice HBV genotypu se na našem pracovišti využívá test INNO-LiPA HBV genotyp, který je schopný detekovat HBV genotyp A až H (Innogenetics, 2012).
21
Obrázek 6
Geografický výskyt genotypů HBV (upraveno podle: http://www.intechopen.com/books/practical-management-of-chronicviral-hepatitis/genomic-heterogeneity-of-hepatitis-viruses-a-e-role-inclinical-implications-and-treatment )
V roce 2008 byl publikován odborný článek Prevalence of HBV genotypes in Central and Eastern Europe v Journal of Medical Virology, kde byly uvedeny výsledky prevalence HBV genotypu ve střední a východní Evropě. Ze států sousedících s Českou republikou je uváděn výskyt genotypů HBV v Německu a v Polsku. Publikovaná data jsou uvedena v následující tabulce č. 3 (Deterding et al., 2008).
Tabulka 3
Prevalence HBV genotypů u vybraných sousedních států ČR (Deterding et al., 2008)
Genotyp HBV Německo Polsko
A 43 190
B
C 2 0
D 7 0
E
78 47
F 1 0
22
G 1 2
H 0 0
0 5
2.3.2.2
LÉKOVÁ REZISTENCE
Léčba chronické VHB je zaměřena na dosažení trvalého potlačení replikace HBV. K léčbě se používají léky jako interferon-alfa, peginterferon alfa-2, lamivudin, entecavir a další. Mutace v genomu HBV a HBV genotyp sám o sobě může ovlivnit účinek léku a odpověď na jeho podání. To má vliv na průběh onemocnění. Jde například
o
mutace
vyvolávající
rezistenci
na
účinky
lamivudinu,
mutace
L180M+M204V/I a A181T genu pro HBV polymerázu. Mutace v genu HBV DNA mohou být způsobené dlouhodobou léčbou. Míra získané rezistence se liší (Quest diagnostics, 2012). Léková rezistence se vyšetřuje z lidského séra či plazmy. K detekci se využívá INNO - LiPA HBV DR v2, což je in vitro hybridizační test. Test je schopný detekovat mutace nebo polymorfizmus v kodonech 80, 173, 180, 181, 184, 194, 202, 204, 236 a 250 genu HBV polymerázy. Princip metody je podobný jako u detekce HBV genotypu, který je uveden v praktické části práce. Po izolaci čisté DNA však dochází jen k jedné amplifikaci. Následuje hybridizace na proužku. K hodnocení nám napomáhají interpretační tabulka dodávaná spolu s reagenciemi a literární údaje o souvislostech zjištěných mutací a rezistencí na antivirotika (Innogenetics, 2011).
2.3.1.3
PRECORE MUTANTA
Během replikace viru se může vytvořit mutace v precore oblasti genu kódujícího tvorbu HBeAg. Tato mutace zapříčiní komplikace během onemocnění a obtíže během léčby. Precore mutace způsobuje rychlejší průběh chronické formy VHB vedoucí k cirhóze jater a hepatocelulárnímu karcinomu. Tato mutace dále způsobuje malou citlivost HBV na účinky interferonu. Vyskytuje se pouze u HBeAg negativní formy chronické VHB (infekce.cz, 2009). Pro vyšetření precore mutace se v naší laboratoři využívá test INNO-LiPA HBV PreCore. Jde o in vitro reverzní hybridizaci. Jako materiál pro vyšetření se využívá plazma či sérum. Test je schopný identifikovat pre-core oblast HBV v kodonu 28 a nukleotidový polymorfizmus nt1762 a nt1764. Princip metody je opět velmi podobný testu INNO-LiPA HBV genotyp (Innogenetics, 2012).
23
3
PRAKTICKÁ ČÁST V následujících kapitolách jsou popsány metody patřící mezi nejdůležitější
vyšetření HBV. Z diagnostiky sérologických markerů byla vybrána detekce anti-HBs, jako kontrola tvorby protilátek po vakcinaci. Z molekulárně biologických metod se práce zaměřuje na stanovení virémie HBV a následné určení HBV genotypu.
3.1
STANOVENÍ TITRU anti-HBs K vyšetření anti-HBs, jak již bylo zmíněno v teoretické části práce, se používá
metoda CMIA. Touto metodou se vyšetřují protilátky proti HBsAg v séru či plazmě vyšetřovaného pacienta. Sérum nebo plazma se získávají centrifugací krve pacienta. Centrifugace probíhá za rychlosti 3 000 ot./min po dobu 10 minut. Tekutá složka se po stočení odseparuje od sedimentovaných krevních částic a sérum či plazma jsou připraveny pro vyšetření sérologickými metodami. Kvantitativní stanovení anti-HBs probíhá dvoukrokovou chemiluminiscenční imunoanalýzou. V prvním kroku reakce dochází ke smíchání vyšetřovaného vzorku s paramagnetickými mikročásticemi, potaženými rekombinantním HBsAg (rHBsAg). Na rHBsAg navázaný na mikročásticích se naváže anti-HBs přítomný ve vzorku. Následuje promytí promývacím roztokem a druhý krok reakce. Během reakce se k reaktantům přidá konjugát rHBsAg s akridiniem. Po dalším promytí se přidávají do reakční směsi roztoky Pre-trigger a Trigger. Po chemiluminiscenční reakci jsou výsledky
měřeny
v RLU.
Naměřený
signál
optickým
detektorem
systému
ARCHITECT je přímo úměrný množství protilátek anti-HBs. Ke zjištění koncentrace anti-HBs využívá software metodu kalibrační křivky. Koncentrace anti-HBs se uvádí v mezinárodních jednotkách (IU) na mililitr, respektive mIU/ml (ABBOTT Diagnostics Division, 2012).
3.2
STANOVENÍ HBV VIRÉMIE Stanovení HBV virémie je metoda, díky které lze monitorovat replikaci viru a
pozorovat tak průběh a účinnost léčby VHB. Jak jsem již uvedl, ke kvantifikaci HBV DNA se využívá test COBAS. Jde o test, který dosahuje vysoké citlivosti při určení kvantity HBV DNA. Jako vyšetřovaný materiál se používá sérum či plazma. Test COBAS se skládá ze dvou fází. První fáze 24
je
izolace
HBV
DNA.
Druhou
fází
je
PCR
amplifikace
hledané
DNA
a detekce oligonukleotidové sondy, která je rozštěpena a dvojitě značena. Proces přípravy vzorku, PCR amplifikace i detekce cílové HBV DNA je automatizovaný. Ke stanovení kvantity HBV DNA se využívá kvantifikační standard (Roche Diagnostics, 2012).
3.3
URČENÍ GENOTYPU HBV Určení genotypu HBV je důležité pro zvolení správného léčebného postupu
u infikovaného pacienta HBV. Identifikaci genotypu musí vždy předcházet stanovení HBV DNA virémie. Vyšetření lze provádět pouze u vzorků s virémií vyšší než 20 IU/ml. V opačném případě nemá smysl toto vyšetření provádět, protože kvantita vyšetřované NK ve vzorku je pro metodu určení genotypu HBV příliš nízká. I u hodnot mírně vyšších než 20 IU/ml je jisté riziko, že určení genotypu HBV z nedostatku DNA nebude možno provést. V takových případech se do výsledku uvádí pojem neurčeno. Pro samotné určení genotypu HBV je nutné provést izolaci vyšetřované DNA ze vzorku pacienta, tedy z plazmy či séra. Pro izolaci DNA naše laboratoř využívá izolační kit Chemagic Viral DNA/RNA od firmy ELIZABETH PHARMACON. Princip izolace pomocí tohoto kitu je založen na přítomnosti magnetických částic. Tyto částice se přidávají do směsi, kterou tvoří 10µl proteázy, 4µl Poly (A) RNA, 200µl lyzačního pufru a 200µl vzorku. Do této reagenční směsi se po inkubaci přidá 30µl magnetických částic a 600µl vazebného pufru. Následuje několikrát se opakující proces separace v magnetickém separátoru a následné promytí promývacím pufrem. Po přidání elučního roztoku, inkubaci a separaci vzniká eluát s čistou virovou DNA (Elizabeth pharmacon, 2007). K identifikaci genotypu HBV se používá Test INNO-LiPA, který má dva kroky. Po již uvedené izolaci následuje amplifikace čisté DNA ve dvou kolech metodou PCR s použitím biotinylovaných PCR primerů. Během prvního kola dochází k denaturaci vysokou teplotou DNA šroubovice a následnému annealingu, nasedání oligonukleotidových
primerů
specificky
komplementárních
k cílové
oblasti
v přítomnosti deoxynukleotid trifosfátu (dNTP) a termostabilní DNA polymerázy. Tato část reakce probíhá za teploty 45°C. Během tohoto procesu, vznikne přesná kopie šablony DNA. Reakci tvoří 40 cyklů. Pokud množství produktu první amplifikace není 25
dostačující, je třeba druhé kolo PCR amplifikace. Přibližné množství amplifikované DNA ověříme metodou elektroforézy (ELFO) na agarázovém gelu. Princip druhého kola PCR je totožný s prvním kolem s následujícími rozdíly. DNA je nahrazena amplifikovaným produktem z prvního kola PCR. Primery se používají biotinylované nested primery a proces je tvořen jen 35 cykly. Množství amplifikované DNA opět ověříme metodou ELFO. Následuje hybridizace na proužcích, na kterých dochází k reakci otevřeného čtecího rámečku HBsAg, který hybridizuje s oligonukleotidovou sondou fixovanou na proužku. Nenahybridizovaná DNA se z proužku vymyje promývacím roztokem. K proužku se přidá streptavidin značený alkalickou fosfatázou a následuje inkubace. Pozitivní reakce se zobrazí jako fialová až hnědá sraženina v místě linie na hybridizačním proužku, což je zobrazeno na obrázku č. 7 (Innogenetics, 2012).
Obrázek 7
Stripy s pozitivními liniemi jednotlivých genotypů (upraveno podle: http://www.fujirebio-europe.com/products-services/productbrowser/inno-lipa-hbv-genotyping )
26
4
VÝSLEDKY V období 1. 1. 2011 - 31. 12. 2013 bylo v sérologické laboratoři přijato 35 684
průvodních listů k materiálům, u kterých bylo požadováno 77 900 vyšetření tykajících se HBV. Podklady potřebné pro zpracování praktické části této bakalářské práce byly exportovány z laboratorního informačního systému OpenLIMS od firmy Stapro s. r. o., který ve Všeobecné fakultní nemocnici (VFN) využíváme. Stažená data byla nadále zpracovávána v programu Microsoft Excel 2010. V následující tabulce č. 4 je uvedena četnost všech vyšetření sérologických markerů a metod molekulárně biologické diagnostiky HBV v daném období.
Tabulka 4
Četnost všech vyšetření HBV za období let 2011 - 2013
HBV diagnostiky HBsAg anti-HBs HBeAg anti-HBe anti-HBc anti-HBc IgM HBV DNA HBV genotyp Pre-core mutanta HBV lék. rezist. Celkem vyšetření
2011 9 517 5 534 2 193 2 375 6 168 1 782 1 661 75 18 33 29 356
2012 7 240 5 466 2 006 1 905 4 395 1 578 1 659 87 32 39 24 407
27
2013 2011 - 2013 7 276 24 033 5 588 16 588 1 551 5 750 1 854 6 134 4 380 14 943 1 565 4 925 1 765 5 085 100 262 23 73 35 107 24 137 77 900
Na grafu č. 2 je znázorněna četnost vyšetření HBV v procentuálním zastoupení z celkového množství všech vyšetření HBV za období let 2011 - 2013.
Graf 2
Četnost vyšetření HBV v procentech za období let 2011 - 2013
Graf 3
Zastoupení sérologických a molekulárně biologických vyšetření HBV z celkového množství vyšetření
28
Na grafu č. 3 je zobrazen poměr množství sérologických a molekulárně biologických vyšetření v procentech. Z celkového množství 77 900 vyšetření HBV za období uvedených tří let bylo požadováno 16 588 vyšetření anti-HBs. V tabulce č. 5 jsou uvedeny počty vyšetření anti-HBs v jednotlivých letech.
Tabulka 5
Počet vyšetření anti-HBs v období 2011 - 2013
Období Počet vyšetření anti-HBs
2011-2013 16 588
2011 5 534
2012 5 466
2013 5 588
Graf 4 Počet vyšetření anti-HBs zadané klinikami VFN, zadávajících >500 vyšetření za období let 2011 – 2013
V grafu č. 4 jsou znázorněny počty vyšetření anti-HBs zadané klinikami VFN za období let 2011 – 2013. Do grafu byly vybrány pouze kliniky zadávající více než 500 vyšetření za stanovené období. V tabulce č. 6 jsou tyto kliniky uvedeny s četností vyšetření v procentech z celého počtu vyšetření anti-HBs. Ze 4 665 vyšetření anti-HBs zadaných Centrem preventivní péče (CPP) bylo za stanovené období 371 vyšetření (8,0%) negativních nebo s hodnotou <10mIU/ml. 29
Tabulka 6
Množství vyšetření uváděné v % celkového počtu vyšetřených anti-HBs za období let 2011 - 2013 Množství vyšetření uváděné v % 28,1% 11,8% 10,7% 7,9% 7,8% 7,3% 4,3% 4,1%
Klinika VFN CENTR. PREV. PÉČE - závodní lékař I. INTERNÍ KLINIKA INTERNÍ ODDĚLENÍ STRAHOV KLINIKA NEFROLOGIE II. INTERNÍ KLINIKA IV. INTERNÍ KLINIKA ODDĚLENÍ LÉČBY ZÁVISLOSTI KARDIOVASKULÁRNÍ CHIR.
Na grafu č. 5 je uvedena četnost diagnóz uvedených na průvodkách přijatých z CPP v období let 2011 – 2013. Z diagnóz jsou v grafu uvedeny 4 diagnózy s největší četností. Patří mezi ně: Z100 - Zdravotní prohlídka zaměstnanců, Z008 Jiná celková vyšetření (prohlídky), Z021 - Vyšetření před přijetím do zaměstnání, Z246 - Potřeba imunizace proti virové hepatitidě.
Graf 5
Četnost diagnóz uvedených na průvodkách přijatých z CPP v období let 2011 – 2013
30
Z celkového množství vyšetření v období let 2011 – 2013 byla stanovena virémie u 5 085 vzorků. Na grafu č. 6 je znázorněn počet exportovaných výsledků HBV DNA v jednotlivých letech. Z celkového počtu vyšetření HBV DNA, 5 085 vyšetření bylo za období let 2011 až 2013 detekováno 47,6% negativních, 34,0% pozitivních a 18,4% výsledků, kde hodnota byla uvedena jako <20, což znamená, že výsledek je pozitivní, avšak hodnota kvantity je pod mezí pro kvantitativní rozlišení metody.
Množství výsledků vyšetření HBV DNA v letech 2011, 2012 a 2013
Graf 6
Z celkového množství přijatých žádanek za období let 2011 až 2013 bylo vyšetřeno 262 vzorků na genotyp HBV. U 239 vzorků byl genotyp HBV určen. U 23 pacientů bylo do výsledku napsáno „neurčeno“. Důvodem byla nízká virémie, která v těchto vzorcích byla pod mezí detekce metody. Potřebná data byla exportována a zpracována stejným způsobem jak již bylo zmíněno u dat vyšetření anti-HBs. V následující tabulce č. 7 je zpracována četnost vyšetření HBV genotypu v letech 2011 až 2013 pro jednotlivé roky.
Tabulka 7
Četnost vyšetření HBV genotyp
Období Počet určených genotypů HBV
2011 - 2013 262 31
2011
2012 75
87
2013 100
V grafu č. 7 jsou znázorněné početní zastoupení jednotlivých genotypů, které byly v naší laboratoři určeny za období let 2011 – 2013. Nutno zmínit, že do grafu nebylo započítáno 23 případů, kdy bylo do výsledku zapsáno – neurčeno.
Graf 7
Početní zastoupení jednotlivých genotypů HBV z celkového počtu vyšetření v období let 2011 - 2013
V tabulce č. 8 je uvedeno procentuální zastoupení jednotlivých genotypů detekovaných v laboratoři v časovém rozmezí let 2011 až 2013.
Tabulka 8
Procentuální zastoupení identifikovaných genotypů HBV za období let 2011 - 2013
Genotyp HBV Četnost určených genotypů HBV v %
A
B
C
D
E
F
H
50,0%
7,6%
8,0%
33,2%
0,4%
0,4%
0,4%
32
5
DISKUZE Za období od 1. 1. 2011 do 31. 12. 2013 bylo na našem pracovišti provedeno
77 900 vyšetření HBV. Z tohoto počtu je 92,9% vyšetření sérologických markerů HBV a 7,1% vyšetření HBV molekulárně biologickými technikami. Z grafu č. 2 vyplývá, že ze všech vyšetření v rozmezí tří let je 31,0% vyšetření HBsAg, 21,3% vyšetření anti-HBs, 19,2% vyšetření anti-HBc a 21,6% vyšetření ostatních sérologických markerů, mezi které řadíme HBeAg, anti-HBe a anti-HBc IgM. Molekulárně biologických vyšetření HBV bylo provedeno znatelně méně. Důvodem jsou rozdílné indikace toho kterého typu vyšetření. Mnohem častěji je zapotřebí zjistit některé ze sérologických markerů HBV. Nesmíme však opomenout i mnohem vyšší cenu molekulárně biologických vyšetření HBV oproti metodám sérologických markerů HBV. Z celkového množství vyšetření bylo 6,5% stanovení kvantity HBV DNA, 0,3% určení HBV genotypu a 0,2% ostatních molekulárně biologických HBV vyšetření, tedy vyšetření HBV lékové rezistence a pre-core mutanty. Ze získaných dat bylo potvrzeno, že zdravotnickému personálu je v rámci preventivní prohlídky pravidelně kontrolována hladina protilátek proti HBsAg. Z grafu č. 4 je vyplývá, že nejvíce vyšetření anti-HBs se v sérologické laboratoři provádí na žádost CPP, tedy závodních lékařů. Na průvodním listu, doprovázejícím materiál, je vždy uvedena diagnóza. Z 16 588 vyšetření anti-HBs za období let 2011 až 2013 je uváděna diagnóza Z100, tedy diagnóza zdravotní prohlídka zaměstnanců, u 3 486 vyšetření anti-HBs, což je 21,0% z celkového množství provedených vyšetření
anti-HBs.
To
dokazuje,
že
zdravotnický
personál
VFN
dochází
na pravidelné prohlídky a je v rámci prevence jednou za dva roky testován na aktuální hladinu anti-HBs v krvi. Minimální hladina anti-HBs uznávaná lékařem preventivní péče je 10 mIU/ml. V případě, že zaměstnanec nemá dostatečný titr protilátek proti HBs antigenu, což bylo stanoveno u 8,0% vzorků zaslaných z CCP, je nutné přeočkování vakcínou proti VHB. Jak
již
bylo
zmíněno
v teoretické
části,
jednotlivé
genotypy
se
liší geografickým výskytem, viz obr. č. 6. V Evropě se vyskytuje genotyp A, D a G (Špičák, 2007). Námi zjištěné výsledky ale tyto literární prameny podporují jen částečně. Z grafu č. 7 vyplývá, že nejvyšší četnost detekovaných genotypů je opravdu u genotypu A (50,0%) a genotypu D (33,2%). Genotyp G, který by se měl podle
Špičáka
(2007)
v Evropě
vyskytovat, 33
však
vůbec
v naší
laboratoři
za období let 2011 až 2013 detekován nebyl. Naopak byly určeny genotypy C (8,0%) a B (7,6%), které se geograficky vyskytují hlavně v Asii. Dále byly po jednom detekovány genotypy E (0,4%), F (0,4%) a H (0,4%), které též nepatří podle Špičáka (2007) mezi genotypy HBV klasicky se vyskytující v Evropě. Podobné výsledky, jaké jsme získali z dat sérologické laboratoře VFN Praha, byly publikovány v roce 2008 v Journal of Medical Virology v článku Prevalence of HBV genotypes in Central and Eastern Europe. V této publikaci byla popsána prevalence HBV genotypů v sousedních státech České republiky, konkrétně v Německu a Polsku. Z tabulky č. 3 vyplývá, že v Německu byla nejvyšší četnost genotypu D a následně genotypu A. Byly však určeny i genotypy B, C, E a F. Genotyp G zde nebyl detekován. V Polsku byla nejvyšší četnost genotypu A. Genotyp G zde též nebyl určen. Nesrovnalosti mezi popisem v publikaci Špičáka (2007) a našimi výsledky jsou pravděpodobně způsobené migrací vyšetřovaných osob po celém světě, tedy i migrací viru.
34
6
ZÁVĚR Cílem práce byl náhled do diagnostiky virové hepatitidy B se zaměřením
na vyšetření sérologických markerů hepatitidy B a vyšetření DNA viru hepatitidy B, což
bylo
objasněno
v teoretické
části.
V praktické
části
se
práce
ze všech sérologických markerů HBV zaměřila hlavně na vyšetření anti-HBs. U vyšetření anti-HBs byla prezentována četnost tohoto vyšetření zadaného jednotlivými klinikami VFN. Cílem prezentace bylo objasnit úlohu stanovení hladiny anti-HBs v prevenci zdravotnických zaměstnanců. Z molekulárně biologických metod byla vybrána kvantifikace HBV DNA jako monitoring úspěšnosti léčby a určení HBV genotypu, což je vyšetření nezbytné ke zvolení správné léčby u HBV pozitivních pacientů. U tohoto vyšetření byly prezentovány genotypy HBV detekované v Sérologické laboratoři ÚLBLD VFN Praha za stanovené období. Tyto výsledky byly srovnány s popisem geografického výskytu jednotlivých genotypů. Rozdíly byly objasněny.
35
SEZNAM OBRÁZKŮ, GRAFŮ A TABULEK Obrázek 1
Organizace genomu HBV.…………………………………………………15
Obrázek 2
Virus HBV.……………………………………….………………………..…16
Obrázek 3
Grafické znázornění průběhu akutní VHB…………………...…………..17
Obrázek 4
Grafické znázornění průběhu chronické VHB...…………………….…...17
Obrázek 5
Systém ARCHITECT PLUS i4000SR…………………………….………18
Obrázek 6
Geografický výskyt genotypů HBV………………………………………..22
Obrázek 7
Stripy s pozitivními liniemi jednotlivých genotypů…………………….…26
Graf 1
Hlášený výskyt akutní hepatitidy B v ČR v letech 2004 – 2013, absolutně (Epidata SZÚ, cit. 2014-04-23) …………….………...………10
Graf 2
Četnost vyšetření HBV v procentech za období let 2011 – 2013…..…28
Graf 3
Zastoupení sérologických a molekulárně biologických vyšetření HBV z celkového množství vyšetření…………………………..………...28
Graf 4
Počet vyšetření anti-HBs zadané klinikami VFN, zadávajících >500 vyšetření za období let 2011 – 2013………..……...29
Graf 5
Četnost diagnóz uvedených na průvodkách přijatých z CPP v období let 2011 – 2013………………………………..……………...….30
Graf 6
Množství výsledku vyšetření HBV DNA v letech 2011, 2012 a 2013....31
Graf 7
Početní zastoupení jednotlivých genotypů HBV z celkového počtu vyšetření v období let 2011 - 2014…………………..……………………32
Tabulka 1
Typické sérologické a molekulárně genetické nálezy jednotlivých stádií přirozeného vývoje infekce HBV……………….…………..………11
Tabulka 2
Komerčně dostupné vakcíny a imunoglobuliny proti VHB……………..12
Tabulka 3
Prevalence HBV genotypů u vybraných sousedních států ČR…..…....22
Tabulka 4
Četnost všech vyšetření HBV za období let 2011 – 2013……………...27
Tabulka 5
Počet vyšetření anti-HBs v období 2011 až 2013……………..………..29
Tabulka 6
Množství vyšetření uváděné v % celkového počtu vyšetřených anti-HBs za období let 2011 – 2013………………………………………30
Tabulka 7
Četnost vyšetření HBV genotypu….………………………….…………. 31
Tabulka 8
Procentuální zastoupení identifikovaných genotypů HBV za období let 2011 – 2013…………………………………………………32 36
POUŽITÁ LITERATURA
ABBOTT Diagnostics Division: Příbalový leták ARCHITECT Anti-HBc, srpen 2013, B8L447
G3-9398/R06
ABBOTT Diagnostics Division: Příbalový leták ARCHITECT Anti-HBc IgM, listopad 2013, B6C337
G3-9496/R07
ABBOTT Diagnostics Division: Příbalový leták ARCHITECT Anti-HBe, září 2012, B6C347
G2-9603/R04
ABBOTT Diagnostics Division: Příbalový leták ARCHITECT Anti-HBs, duben 2012, G2-4017/R09 B7C187.
ABBOTT Diagnostics Division: Příbalový leták ARCHITECT HBeAg, září 2012, G2-9592/R06 B6C327
ABBOTT Diagnostics Division: Příbalový leták ARCHITECT HBsAg, listopad 2011, G2-3965/R03 B2G227. ABBOTT Diagnostics Division: Příbalový leták AxSYM CORE, červen 2012,B7A417 G2-4086/R12.
BARTŮŇKOVÁ, J.: Vyšetřovací metody v imunologii, 2., přepracované a doplněné vydání; Grada Publishing, Praha 2011, s. 84, ISBN 978-80-247-3533-7
BENEŠ, J.: INFEKČNÍ LÉKAŘSTVÍ, 1. vydání; Galén, Praha 2009, s. 169, 171, ISBN 978-80-7262-644-1.
DETERDING, K. et al.: Prevalence of HBV genotypes in Central and Eastern Europe, Journal of Medical Virology, 2008, 80:1707-1711, [ online ], [ cit. 21-04-2014], čerpáno z: http://onlinelibrary.wiley.com.ezproxy.is.cuni.cz/doi/10.1002/jmv.21294/pdf
37
EHRMANN, J.: HEPATOLOGIE, 1. vydání; Grada Publishing, Praha 2010, s. 233 – 236, ISBN 978-80-247-3118-6
ELIZABETH PHARMACON spol. s r. o., Příbalový leták Chemagic Viral DNA/RNA Kit, 2007, 02-01-193-6A-2007
GLEBE D., BREMER C.M.: The Molecular Virologi of Hepatitis B in: Seminars in liver disease; Giessen, 2013, s. 103 – 112, DOI: 10.1055/s-0033-1345717
HOLUBEC, L.: KOLOREKTÁLNÍ KACINOM Současné možnosti diagnostiky a léčby, 1. vydání; Grada Publishing, Praha 2004, s. 74, ISBN 80-247-0636-9
HUSA, P.: VIROVÉ HEPATITIDY, 1. vydání; Galén, Praha 2005, s. 26 – 39, ISBN 80-7262-304-4.
INFEKCE.CZ, Diagnostika a léčba chronické hepatitidy B, duben 2009, [ online ], [ cit. 07-04-2014], čerpáno z: http://www.infekce.cz/DoporVHB09.htm INNOGENETICS: Příbalový leták INNO-LiPA HBV Genotyping, říjen 2012, INX50251 25976 v12
INNOGENETICS: Příbalový leták INNO-LiPA HBV Multi-RD, září 2011, INX38790 28101 v1 INNOGENETICS: Příbalový leták INNO-LiPa HBV PreCore, červen 2012, 24993 v9
LUKÁŠ, K.: GASTROENTEROLOGIE A HEPATOLOGIE Učebnice, 1. vydání; Grada Publishing, Praha 2007, s. 203-205, ISBN 978-80.247-1787-6
MANČÁK, J., MANČÁKOVÁ J.: PATOLOGIE; Grada Publishing, Praha 2004, dotisk 2011, s. 250, ISBN 80-247-0785-3
38
MAREK, J., FARMAKOTERAPIE VNITŘNÍCH NEMOCÍ, 4., ZCELA PŘEPRACOVANÉ A DOPLNĚNÉ VYDÁNÍ, 4. vydání; Grada Publishing, Praha 2010, s. 213, ISBN 978-80-247-2639-7 MINISTERSTVO ZDRAVOTNICTVÍ: Paragraf 7, vyhláška č. 306/2012 Sb., ze dne 12. Září 2012, o podmínkách předcházení vzniku a šíření infekčních onemocnění a o hygienických požadavcích na provoz zdravotnických zařízení a ústavů sociální péče, s. 3957 MINISTERSTVO ZDRAVOTNICTVÍ: Příloha č. 4 k vyhlášce č. 422/2008 Sb., ze dne 28. Listopadu 2008, o stanovení bližších požadavků pro zjištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání a buněk určených k použití u člověka, s. 6962
Quest diagnostics: Hepatitis B Virus Drug Resistance, Genotype, and BCP/Precore Mutations, 2012, [ online ], [ cit. 26-03-2014], dostupné z: https://www.questdiagnostics.com/testcenter/testguide.action?dc=TS_HBV_Genotyp e_BCP_Precore ROCHE Diagnostics, Příbalový leták COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, version 2.0, květen 2012, Doc Rev. 8.0 05549191001-07
SOUČEK, M.: VNITŘNÍ LÉKAŘSTVÍ PRO STOMATOLOGY; Grada Publishing, a.s., Praha 2005, s. 355, ISBN 80-247-1367-5
STRÁNSKÝ, J.: Virová hepatitida B a její klinický význam; Grada Publishing, spol. s.r.o., Praha 2001, s. 18, ISBN 80-247-0243-6.
SZÚ. Vybrané infekční nemoci v ČR v letech 2004 – 2013 – absolutně: Hlášený výskyt vybraných infekčních nemocí v České republice v Epidatu v letech 2004-2014 - absolutně - předběžná data [online]. [cit. 2014-03-23]. Dostupné z: http://www.szu.cz/publikace/data/vybrane-infekcni-nemoci-v-cr-v-letech-2003-2012absolutne
39
ŠPERL, J.: Léčba chronické hepatitidy B, [ online ], [ cit. 2014-03-13 ], Dostupné z: http://www.remedia.cz/Clanky/Farmakoterapie/Lecba-chronicke-hepatitidy-B/6-Lan.magarticle.aspx
ŠPIČÁK, J., Novinky v gastroenterologii a hepatologii, 1. vydání; Grada Publishing, Praha 2007, s. 274 - 276, ISBN: 978-80-247-6769-7
Vakciny.net, OČKOVÁNÍ proti virové hepatitidě typu B, aktualizováno 16. 3. 2014, [ online ], [ cit. 2014-03-26 ], Dostupné z: http://www.vakciny.net/pravidelne_ockovani/HBV.htm
World Health organization, Hepatitis B, Updated July 2013, [online], [cit. 2013-12-13], Dostupné z: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/
40
