Diagnostika a léčba DMP

Diagnostika a léčba DMP Viktor Kožich Martin Hřebíček Ústav dědičných metabolických poruch 1.LF UK a VFN Praha

n=800

Patofyziologie metabolitů u DMP

substrát <1500 Da

vedl.produkt >1500 Da produkt

1

2

3

Kategorie DMP-příklady Malá molekula

Komplexní molekula

Hromadění substrátu

•Aminoacidopatie •Hyperamonemie •Org.acidurie

•Lysosomální nemoci

Chybění produktu

•Glykogenosy •Poruchy BOX MK •Poruchy synthesy kreatinu

•CDG syndromy •Generalisované peroxisomální nemoci

Otázky ke zkoušce Vyšetřovací metody u DMP.  Novorozenecký a selektivní screening v ČR  Léčba DMP malých molekul-principy a příklady  Léčba DMP komplexních molekulprincipy a příklady. 

Osnova  Diagnostika obecně  Novorozenecký screening  Selektivní screening  Léčba

Proč je třeba znát diagnosu? Vysvětlení klinických příznaků  Omezení úzkosti a nejistoty  Prevence zbytečných dalších vyšetření  Prevence dalších komplikací  Zahájení léčby  Stanovení rizika pro příbuzné probanda 

Diagnostika ≈ verifikace hypothes

pacient

http://farm1.static.flickr.com/21/100467846_832c312de1_o.gif

Diagnostika DMP je genetické testování

Genetiké testování Selektivní screening

Celopopulační screening

Screening

To screen= prosévat  Screening= identifikace osob se zvýšeným rizikem nemoci  Diagnosa se ověřuje jinými nezávislými metodami 

zdraví

falešné nálezy

pacienti

Úrovně diagnostiky

Úspěšná diagnostika DMP

+ Vědoucí lékař(ka)

3.bp.blogspot.com/.../s320/physicianatdesk.jpg

Dostupný laboratorní test

Osnova 

Diagnostika obecně

 Novorozenecký

screening Selektivní screening  Léčba 

Genetické testování Selektivní screening


Novorozenecký screening

Novorozenecký screening 

Aktivní vyhledávání nemocí v celé populaci, presymptomatická diagnostika



Sensu stricto- laboratorní analysa suchých krevních skvrn



Zakladatel-Prof. Robert Guthrie 1916-1995

JMG Wilson and G Jungner: Principles and Practice of Screening for Disease, WHO 1968

Klasická kritéria pro screening    

     

Nemoc je důležitá a častá Latentní fáze, kdy je nemoc bezpříznaková Průběh nemoci a mechanismy jsou známé Spolehlivý test Test je populací akceptovatelný Hledání pacientů musí být kontinuální proces Přijatelná léčba Podmínky pro diagnostiku a léčbu Konsensus o tom, kdo má být léčen Náklady dg a léčby musí být ekonomicky vyvážené v systému zdravotní péče

Jak se rozhodnout, které nemoci se mají screenovat?

Prospěch versus riziko

USA: prospěch postiženého dítěte a znalost diagnosy

Evropa: poškození rodin u falešně pozitivních nálezů nebo nemocí s nejasnou prognosou/léčbou

Newborn Screening: Toward a Uniform Screening Panel and System

Michael S. Watson, PhD, Marie Y. Mann, MD, MPH, Michele A. Lloyd-Puryear, MD, PhD, Piero Rinaldo, MD, PhD, and R. Rodney Howell, MD, editors Genet Med 2006:8(5,Supplement):1S–11S The Maternal and Child Health Bureau commissioned the American College of Medical Genetics to outline a process for the standardization of outcomes and guidelines for state newborn screening programs and to define responsibilities for collecting and evaluating outcome data, including a recommended uniform panel of conditions to include in state newborn screening programs. The expert panel identified 29 conditions for which screening should be mandated. An additional 25 conditions were identified because they are part of the differential diagnosis of a condition in the core panel, they are clinically significant and revealed with screening technology but lack an efficacious treatment, or they represent incidental findings for which there is potential clinical significance. The process of identification is described, and recommendations are provided.

Frekvence

Časné klinické projevy

Závažnost nemoci

Prospěch léčby-pacient

Prospěch léčby-rodina

Prevence úmrtí

Max. 700 bodů

Sensitivita a specifita testu Vlastnosti testu

Max. 700 bodů

Existence léčby

Cena léčby Účinnost léčby

Potvrzení diagnosy

Akutní léčba

Jednoduchost léčby

Max. 700 bodů

Max. 2100 bodů

81 nemocí

1 29 nemocí

2 25 nemocí

http://www.bioethics.gov/images/new_born_screening.gif

NS USA-2009

29

31 31

45 34

44

31

33 54

45

47 51

50

50

49

31

52

4 9

13

24

33 31

45

41

52 50

32

41

51

30 37

48

29

31

53 48

29

45

49

51

32 46

32

35

50

44

46

35

35

40

41

31 36

52 48

DC

Evropa 0-29 nemocí

Screenované nemoci ČR 10/2009 ~1:2 900 Kumulativně 1:1 200 ~1:4 000

~1:4 000

Jak správně odebírat

správné sušení 3 hod, ne přímé teplo, pokoj.T, bez kontaktu

denní odesílání vzorků !!!!!!! http://cms.ich.ucl.ac.uk/website/imagebank/images/Neonatal_appendix.gif

Proč je důležitý správný odběr?

Tandemový hmotnostní spektrometr (MS/MS)

Pacienti s DMP Nemoc

PKU/HPA

Selektivní screening (odhad/rok/ ČR)

Pilotní studie ÚDMP (20012008, n=98 039)

Celá ČR 2010 Celá ČR 2011 (n= 117 705) (n= 108 673)

(15-20)

15

18

19

MCAD deficit

0-1

2

10

3

LCHAD deficit

0-1

3

0

2

GA I

0-1

0

2

0

leucinosa

0-1

0

1

0

VLCAD

0-1

0

0

1

Ostatní (IVA,

0-1

0

0

0

15-25

20

31

25

CPTI, CACT, CPTII)

Celkem

Informace pro rodiče

www.novorozeneckyscreening.cz

Osnova Diagnostika obecně  Novorozenecký screening 

 Selektivní  Léčba

screening

Genetické testování Selektivní screening


Selektivní screening

Klinický výběr pacientů je klíčovou komponentou selektivního screeningu

Klinický obraz DMP-věk

http://www.hrr.co.uk/acatalog/crocodile_toddler.jpg http://www.co.shasta.ca.us/html/DSS/images/FosterParentingAdopt/infant.jpg

http://markandrich.googlepages.com/Old-woman.jpg/Old-woman-full.jpg

Klinický obraz DMP-orgány

http://universe-review.ca/I10-82-organs.jpg

Klinický obraz-multisystémovost

http://www.istockphoto.com/file_thumbview_approve/5982111/2/istockphoto_5982111-human-internal-organs.jpg

Základní situace s dif dg. DMP 

Malé molekuly  akutně

nemocný novorozenec  (opakovaná) ataka dlouhotrvajícího bezvědomí  neprospívání kojence  těžší PMR/epilepsie/tonusové změny 

Velké molekuly  progredující

postižení CNS a svalstva  dysmorfie obličeje  organomegalie (játra, slezina, srdce)

Signály možnosti DMP    

Rodinná anamnesa: konsanguinita, podobný průběh nemoci u příbuzných, neobjasněné úmrtí příbuzných Onemocnění považované původně za běžné neodpovídá na standardní léčbu Multisystémové onemocnění Průběh nemoci ovlivněný zevními faktory/potravou 

katabolismus  hladovění  příjem proteinů nebo cukrů (galaktosa, fruktosa)



Nevysvětlitelné laboratorní odchylky při běžných vyšetřeních Podklad y- Dr.D.Behulová

Potrava a DMP malých (Sub)akutní toxicita molekul  mléko (laktosa)-hepatopathie 

sacharosa/fruktosa/sorbitol- hepatopathie a hypoglykemie  bílkovinná strava- zvracení, letargie, koma (poruchy cyklu močoviny, organické acidurie)  MCT oleje- porucha srdečního rytmu (poruchy betaoxidace MK)

Hladovění a DMP  ketotická hypoglykemie u glykogenos  hypoglykemie se sníženou tvorbou ketolátek (poruchy beta-oxidace MK)  metabolické koma (MAc nebo hypermamonemie) při katabolismu/hladovění

Potrava a DMP malých (Sub)akutní toxicita molekul  mléko (laktosa)-hepatopathie 

sacharosa/fruktosa/sorbitol- hepatopathie a hypoglykemie  bílkovinná strava- zvracení, letargie, koma (poruchy cyklu močoviny, organické acidurie)  MCT oleje- porucha srdečního rytmu (poruchy betaoxidace MK)

Hladovění a DMP  ketotická hypoglykemie u glykogenos  hypoglykemie se sníženou tvorbou ketolátek (poruchy beta-oxidace MK)  metabolické koma (MAc nebo hypermamonemie) při katabolismu/hladovění

Indicie DMP při běžných laboratorních vyšetřeních moči a likvoru

Vyšetření moči  Abnormální

zápach  Abnormální zbarvení  Krystalurie  pH moči  Ketolátky  Kyselina močová  Myoglobin

Vyšetření likvoru – Glukosa – Celková bílkovina – Laktát


Jeden metabolit

Profil metabolitů= metabolomika

http://www.surlalunefairytales.com/illustrations/cinderella/images/hall_cinderella.jpg

http://2.bp.blogspot.com/_lgBf1VCDEQw/Sh2EGB6e8BI/AAAAAAAAF50/tjLEnCQeU8o/s400/Popelka.jpg

http://ustl1.univ-lille1.fr/chimie/html/Enseignement/ATE_web/chrom/Tswett_final.jpg

HPTLC- oligosacharidy v moči

Foto Dr.Ledvinová

Deficit a L- iduronidasy

Foto Dr.Ledvinová

(excretion of dermatan sulphate/DS and heparan sulphate/HS )

AMA- citrulinemie pacient

kontrola

Komplexní směsi-obtížná detekce

http://www.surlalunefairytales.com/illustrations/cinderella/images/hall_cinderella.jpg http://2.bp.blogspot.com/_ndSioEQ29iM/THGz8dhNaKI/AAAAAAAACwI/mbO0743ibKQ/s1600/Kym+Hepworth,+mixed+beads.jpg

50

12,2 9

150

3,5 7

200 0,0

0,0 2,5

2,5 5,0

5,0

350

250

100 10,0

7,5 10,0 12,5

18,4 0

15,0

15,0

17,8 0

14,8 0

12,5

14,8 1

13,8 0

18,3 9

13,7 2

14,0 0 14,7 0

12,0 8

10,6 3

150

14,9 6

14,7 0

7,5

13,8 1

75

11,5 1

10,3 6

7,7 7

100

13,4 7

12,2 8

6,6 1 7,2 1

125

13,7 2

12,0 8

300

10,6 4

6,6 4

25

6,6 3

5,8 6

Volta ge [mV]

5,5 4

200

5,9 3

5,0 7

3,2 6

50

4,2 4

Volta ge [mV]

GC: methylmalonová aciduria 175

17,5 20,0 Time [min.]

17,5 20,0 Time [min.]

50

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5

100

18,4 0

15,0

15,0

17,8 0

14,7 0

12,5

14,8 0

10,0

13,8 1

7,5

13,4 7

300

10,6 4

5,0

12,0 8

6,6 3

2,5

5,9 3

14,8 8

13,7 6

5,9 4

18,4 7

13,8 5

12,2 8

5,1 2

150

14,9 6

200

5,0 7

0,0

4,2 4

100

3,2 9

18,6 9

12,3 3

14,7 4

6,6 7

10,6 8

Volta ge [mV] 200

13,7 2

12,2 9

150

3,5 7

Volta ge [mV]

GC: deficit MCAD 250

50

17,5 20,0 Time [min.]

350

250

17,5 20,0 Time [min.]

Hmotnostní spektrometrie

1. rozměr MS LC GC

www.nature.com/.../v2/n2/fig_tab/nrd1011_F5.html

Fragmentace

http://www.ch.cam.ac.uk/staff/pics/es1.jpg

Sensitivita Alkaptonurie: 1-5 g homogentisátu /d  Cystinurie: 1-5 g cystinu /d 

Moč-litry



PKU: 0.1 g Phe /l krve 0.2 – 1 ml séra



MCAD: C8 acylcarnitin 0.0001 g / l krve NS terč 0.003 ml krve

In vivo měření metabolitů Před léčbou

Deficit kreatinu v mozku (MRS)

Po léčbě

Vyšetřování metabolitů u DMP      

Specializované testy Obvykle nedostupné v rutinních laboratořích Většinou profilové analysy Většinou chromatografické techniky, potřebné je nákladné vybavení Metody pracné, řada „in-house“ testů Komplexita interpretace (např. organické kyseliny), nutná specializace


Enzymová aktivita Účinnost transporteru

Množství enzymu ? Lze použít ELISU?

Principy enzymologického vyšetření •separace substrátu a produktu •kvantifikace přírůstku či úbytku

*

substrát

produkt

změněný kofaktor •kvantifikace přírůstku či úbytku kofaktor

*

Stanovení enzymů u DMP 

Obvykle nutné buňky  Leukocyty,

fibroblasty  Tkáně plodu a obalů plodu 



Techniky fluorimetrické a radiometrické (event. fotometrické), velký rozmach MS/MS Měřený parametr:  úbytek

substrátu nebo tvorba produktu  změny kofaktoru

Typické výsledky enzymologie 

Postižení homozygoti jasně deficitní



Heterozygoti: překryv



Zdraví homozygoti: obvykle negausovské rozdělení aktivity v populaci

Selektivní screening Analysa DNA/RNA

http://openwetware.org/images/6/61/DNA_sequencing.JPG

Next generation sequencing 





Sekvenování exomu je dostupné (1% z 3GB) Ceny klesají (cíl 1000 USD za genom) Analysa dat je největší úskalí

Next generation sequencing?

?

Nejistota o fenotypových dopadech pozorovaných alelických variant

Úspěšná diagnostika DMP

+ vědoucí lékař/ka

dostupný laboratorní test 3.bp.blogspot.com/.../s320/physicianatdesk.jpg

http://unitedcaremedical.com/pharmacy_tech.gif

Osnova Diagnostika obecně  Novorozenecký screening  Selektivní screening 

 Léčba

Léčba DMP substrát

produkt

Léčba primárního defektu substrát

2

1 enzym transportér

produkt

Transplantace buněk a orgánů

Genové manipulace Enzymové manipulace

Genové manipulace 

Náhrada genu 







Ovlivnění exprese genů  



ADA deaminasa- léčba v 90.letech Inserční mutagenesa se vznikem leukemie u části pacientů Hledají se bezpečné virové vektory Malé molekuly (PBA, VPA…) Glukosa u pofyrií (exprese HO 1)

Oprava mutace  

Pročtení se předčasným stopkodonem Antisense oligo pro poruchy sestřihu

Léčba zaměřená na enzym 

Substituce normálním enzymem    



Parenterální podávání Transport do cílového Imunitní odpověd-protilátky Cena a výroba

Stabilizace mutantního enzymu  



Přirozené ligandy- kofaktory Umělé ligandy-malé molekuly (farmakologické chaperony) Slibný přístup k léčbě

Erlandsen H and Stevens RC, The Structural Basis of Phenylketonuria. Mol Genet Metab. 1999 Oct; 68(2):103-125.

Enzyme supplementation therapy

Enzymová substituční terapie 

Užití u nemocí (LSD)-rutinní i v testování         



M.Gaucher (glukocerebrosidasa) M.Fabry (alfa galaktosidasa A) M.Pompe (kyselá alfa glukosidasa) MPS I (alfa iduronidasa) MPS II (alfa iduronátsulfatasa) MPS VI (arylsulfatasa B) M.Niemann-Pick B (kyselá sfingomyelinasa) MPS IVA Wollmanova nemoc (kyselá lipasa)

Výroba rekombinantních enzymů Genzyme, TKT, Biomarin, Shire, Inotech….

ERT u Gaucherovy nemoci 



Hromadění glukosylceramidu převážně v buňkách odvozených od makrofágů (Gaucherovy buňky) Léčba: endocytosa zprostředkovaná receptorem 

 



manosový receptor (makrofágy, endothelie, játra) není transport do mozku glukocerebrosidasa ošetřená exoglykosidasami (odstranění M-6-P)

Enzym isolovaný z lidské placenty X recombinantní enzym (CHO cells) X recombinantní enzym v mrkvi

Přirozené kofaktory  

Většina vitaminů= prekursory kofaktorů Příklady použití    





BH4 u PKU Pyridoxin u deficitu CBA a OAT Riboflavin u deficitu ETF-DH Vit.B12 u cblA a cblB Ubichinon u defektů respiračního řetězce Mo-kofaktor in kombinovaného deficitu XO/SO

http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/8/89/Coenzyme.GIF

Farmakologické chaperony

Gregersen N J Inherit Metab Dis (2006) 29:456–470

Farmakologické chaperony Slibná oblast výzkumu  Často kompetitivní inhibitory enzymů  Efektivita t.č. většinou nízká  M.Fabry, Gaucher - klinické zkoušky 

High-throughput screening (HTS) malých molekul  



Knihovny–stovky tisíc látek Knihovny schválených a běžně užívaných léků – např. NINDS Assay 





Interakce s proteinem: fluorescence, absorbance, křivky tavení Funkční důsledky: enzymová aktivita, biologická assay

Automatizace, miniaturizace http://bccg.burnham.org/HTS/HTSInstrumentation.aspx

Léčba primárního defektu substrát

2

1 enzym transportér

produkt

Transplantace buněk a orgánů

Genové manipulace Enzymové manipulace

Transplantace

http://2.bp.blogspot.com/_uqBx13aymCE/TA9EBoLq_bI/AAAAAAAAB3w/aJ7yI-gU43o/s1600/Allogenic.gif

Přenos hematopoetických kmenových bb    

Zdroj: kostní dřeň, pupečník Výhoda: přechod hematoencefalickou bariérou Nevýhoda: vysoká mortalita Lysosomální nemoci 







Mucopolysacharidosa I- dobrá responsivita MPS III – není zpomalení progese u neurologických obtíží Krabbeho nemoc-slibné výsledky u časně diagnostikovaných pacientů (novoroz.screening New York)

Peroxisomální nemoci 

X-ALD

http://www.sflorg.com/sciencenews/images/imscn 060807_01_01.jpg

Přežívání u cerebrální formy X-ALD po přenosu hematopoetických kmenových bb

Expert Review of Neurotherapeutics 2008, Vol. 8, No. 9, Pages 1367-1379

Transplantace orgánů 

Transplantace jater/hepetocytů   



Transplantace ledvin  





Cystinosa Hyperoxalurie I M.Fabry

Kombinovaná transplantace jater a ledvin  



GSD Poruchy cyklu močoviny Organické acidurie

Organické acidurie (zvl.MMA) Hyperoxalurie I

Transplantace srdce 

M.Fabry http://www.coldtruth.com/wp-content/uploads/2009/10/human-organ2.jpg

Léčba ovlivněním metabol.dráhy 1

potrava 2

toxický prekursor toxický vedl. produkt

substrát

produkt

4

netoxický produkt 3

PAH

PKU

http://www.chemie.fu-berlin.de/chemistry/bio/aminoacid/gif/phe.gif

Děti cca 400 mg Phe/d Dospělí 800-1200 mg Phe/d


potrava 2


substrát

produkt

4


Substrát-redukující léčba Farmakologická modulace reakcí nad enzymovým blokem  Příklady 

Nitison u tyrosinemie I a alkaptonurie  Miglustat u LSD  Metronidazol u propionové acidemie  LNAA u PKU-kompetice o transportér 

Léčba alkaptonurie a tyrosinemie I nitison (NTBC)

http://www.natuurlijkerwijs.com/english/b4f4ca00.gif

Substrát-redukující léčba u M.Gaucher   



J. Clin. Invest. 103(4): 497-505 (1999) THE LANCET • Vol 355 • April 29, 2000 .

Miglustat (OGT 918, SC-48334, Nbutyldeoxynojirimycin) Orálně aktivní aminocukr Inhibuje syntasu glukosylceramidu a synthesu glykosfingolipidů Střední koncentrace GM1 gangliosidu klesla o 38.5% po12 měsících léčby (p < 0.05)


potrava 2


substrát

produkt

4


Snížení toxicity hromaděných substrátů 

Méně toxické konjugáty 



Rozpustnější komplexy 



Isovalerová acidemia-glycin

Cysteamin

Fyzikálně chemické vlivy (moč) Alkalinizace  Zvýšený přívod tekutin 

Glycin u isovalerové acidemie

http://img.medscape.com/fullsize/migrated/455/705/smj455705.fig1.gif


potrava 2


substrát

produkt

4


Dodání chybějícího produktu 

Přímo produkt blokované reakce 

  



Obohacování směsi AMK (Tyr u PKU) Glukosa u GSD Biotin u deficitu biotinidasy BH4 u defektů v synthese a recyklaci BH4

Distální obejití bloku    



Glukosa u poruch beta-oxidace MCT oleje u poruch beta.oxidace dlouhých MK Uridin u orotové acidurie Obohacování směsi AMK (Cys u deficitu CBS) Hemarginát u AIP

Léčba biotinem

MCT a mitochondrie  



MCT oleje Transport nezávislý na karnitinových transporterech Použití u defektů CARN a VLCAD

Léčba nespecifická systémová 1

Eliminace toxinů Hemodialysa Hemadsorption (výměnná transfuse) (peritoneální dialysa)

2 Obecná léčba Energie Hydratace Léčba infekce Atd.

Léčba poruchy cyklu močoviny

CVVHD = continuous venovenous hemodiafiltration; HD = hemodiafiltration. Clay A S , Hainline B E Chest 2007;132:1368-1378

©2007 by American College of Chest Physicians

Dědičné metabolické poruchy substrát obvykle AR, GR

klinicky variabilní

obvykle enzym

produkt

Diagnostika a léčba DMP

Recommend Documents