DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta, adalah karya saya sendiri, dengan bimbingan para Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2009
Mujiatun NRP. B251064084
ABSTRACT MUJIATUN. Detection of Avian Influenza Virus in Day Old Chick (DOC) Transported in Soekarno Hatta Airport. Under direction of RETNO D. SOEJOEDONO and SRI MURTINI. The aims of this research was detecting and isolating AIV in DOC. Samples were taken from DOC which transported through Soekarno Hatta Airport Quarantine Station. The detect disease method with convenience sampling methods was used with the estimation of prevalence at about 0.9%. The total samples were 346 DOC. There were 58 pooled samples of tracheas and lungs, which collected from 6 DOC per pooled. Afterwards, sera and egg yolks were individually collected. Sera were tested with haemagglutinin inhibition (HI) test. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) assays were performed to the pooled tracheas and lungs. This RT-PCR were carried out to prove the presence of Influenza virus A using a pair of matrix primers (F-MatrikAI; R-Matrik-AI). The samples which were positively AIV detected by RT-PCR assays using matrix primers were tested using H5 primers (F-H5-AI; R-H5-AI). The RT-PCR assays were also generated to the egg yolks. These assays were performed to confirm the absence of AIV in the DOC which were negatively detected by RT-PCR assays. In this detection, three pairs of matrix primers were used (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI), (M-Flu 1; M-Flu 2) and (FAI; RAI). The detected matrix protein of AIV in those samples were tested with H5 primers (FH5; RH5) and (HA-1444; H5-1735R). Geometric mean titer (GMT) of the samples were 11.7 while mean titer of the positive AIV were 32. It also identified that 6 of 58 samples were positively detected by AIV matrix primers but negative by H5 primers. Third teen samples negatively detected by matrix primers, 8 samples were positively identified in egg yolks by RT-PCR assays. Influenza virus A were positively identified in those 8 samples using matrix primers (M-Flu 1; M-Flu 2), while 3 of 13 samples were positively detected using different matrix primers (FAI; RAI) and one of them positive by H5 primers (FH5; RH5). The differences between RT-PCR results, it can cause difference of genetic sequences and also resulted from the different target of primer annealing. Also, this research was verifying the possibility of AIV to be transmitted vertically to the DOC. This verification were concluded from the high concentration of AIV detected in egg yolk compared with AIV concentration in tracheas and lungs. Key words: day old chick, influenza A, avian influenza virus, matrix, H5, primer
RINGKASAN MUJIATUN. Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta. Di bawah bimbingan RETNO D. SOEJOEDONO dan SRI MURTINI. Perpindahan hewan dari suatu daerah/negara ke daerah/negara lain berpotensi menyebarkan penyakit. Salah satu penyakit penting yang bersifat transboundary animal diseases adalah Avian Influenza (AI). Day Old Chick (DOC) diduga berpotensi terinfeksi dan menyebarkan Virus Avian Influenza (VAI) kepada unggas lain melalui importasi dari negara lain dan transportasi dari Jawa ke pulau lain di Indonesia. Peraturan pemerintah yang mengatur pengendalian penyakit AI dituangkan dalam Peraturan Dirjen Peternakan nomor: 46/PD.640/F/08.05. Peraturan tersebut menyatakan bahwa lalu lintas anak ayam umur 1 hari (DOC), anak itik umur 1 hari (DOD), telur dan pakan ternak dari daerah tertular ke daerah bebas dapat diizinkan dengan persyaratan tertentu. Peraturan ini dibuat dengan pertimbangan untuk memenuhi kebutuhan konsumen di daerah bebas yang tidak memiliki peternakan pembibitan karena sentra industri peternakan unggas sebagian besar terletak di Pulau Jawa yang merupakan daerah tertular. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini dilakukan dengan menggunakan pendekatan metode Detect Diseases. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengisolasi adanya infeksi virus AI pada DOC yang berpotensi menyebarkan virus dari satu daerah/negara ke daerah/negara yang lain. Deteksi keberadaan virus AI dilakukan dengan reverse transcriptase-polymerase chains reaction (RT-PCR). Pengujian untuk pooling sampel organ paru-paru dan trakhea digunakan primer matrik: F-matrik-AI; Rmatrik-AI dan H5: F-H5-AI; R-H5-AI (Lee et.al 2001). Setelah diketahui proporsi sampel DOC positif AI, kemudian dilakukan konfirmasi untuk meyakinkan bahwa sampel yang negatif pada organ trakhea dan paru-paru dengan primer Lee et al. (2001) benar-benar negatif. Pengujian dilakukan pada organ kuning telur secara individu dengan 3 jenis primer matrik yaitu: F-Matrik-AI; R-Matrik-AI (Lee et al. 2001), M-Flu 1; M-Flu 2 (Trani et al. 2006) dan FAI; RAI (Lee & Suarez 2004) dilanjutkan dengan 2 jenis primer H5 yaitu FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) dan HA-1444; H5-1735R (WHO 2002). Beberapa sampel positif pada pooling organ trakhea dan paru-paru dilakukan penelusuran pada kuning telur secara individu menggunakan primer matrik: FAI; RAI dan H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004). Penelusuran dilakukan untuk mengetahui sumber penularan virus AI pada DOC. Sampel-sampel yang menunjukkan hasil positif AI dilakukan inokulasi pada telur ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) untuk mendapatkan isolat virus AI dari DOC. Sebanyak 346 sampel DOC dan 172 serum diperoleh dari DOC hidup yang dikirim ke luar pulau jawa (antar area). Trakhea dan paru-paru dikumpulkan dalam pooling, setiap pooling terdiri dari 6 organ DOC dan diperoleh sejumlah 58 pooling. Pooling berdasarkan perusahan produsen/importir dan tanggal menetas. Serum diuji dengan metode penghambatan haemaglutinasi atau haemaglutinasi inhibition (HI) tes mengikuti standar OIE (2005). Supernatan suspensi organ dan kuning telur diekstraksi dengan TRIzol-LS (Invitrogen).
Pengujian RT-PCR menggunakan enzim Superscript TM One-Step RT-PCR with Platimum ® Taq (Invitrogen Cat. No. 10928-034) dengan total reaksi 25 µl yang mengandung 12.5 µl 2x Reaction Mix, 3 µl RNA, 0.5 µl RT/Platinum® Taq Mix, 0.5 µl (0.2 µM) primer forward, 0.5 µl (0.2 µM) primer reverse dan 17 ddH2O. Formulasi reaksi RT-PCR ini berlaku untuk semua jenis primer. Proses amplifikasi menggunakan mesin Thermal Cycle Sprint Hybaid dan Gene Amp®. Masing-masing reaksi dianalisis dengan menggunakan elektroforesis 135 volt selama 35 menit (Mupid-x Japan) dan elektroforesis 100 volt, 400 mA selama 60 menit (Owl Model OSP-300) dengan konsentrasi agar rose 1.5 % (Invitrogen) dengan pewarnaan ethidium bromida (Sigma), DNA marker 100 bp (Invitrogen dan Fermentas) dan 50 bp (Invitrogen) selanjutnya hasil dibaca dengan UV transilluminator. Sampel-sampel yang menunjukkan hasil dubius, positif lemah dan positif dilakukan inokulasi pada TAB-SPF mengikuti standar OIE (2005). Uji korelasi Spearman digunakan untuk melihat korelasi antara maternal antibodi dengan keberadaan virus AI pada sampel. Rataan titer maternal antibodi pada sampel adalah 23.5 (11.7). Uji korelasi Spearman antara titer maternal antibodi dengan primer matrik tidak signifikan pada α = 0.05 artinya keberadaan virus Influenza A pada DOC tidak dipengaruhi oleh adanya maternal antibodi. Penelitian ini juga menunjukkan rataan titer antibodi AI dari sampel positif virus dengan uji RT-PCR sebesar 25 (32). Rataan titer dari masing-masing sampel tesebut belum cukup untuk memproteksi unggas terhadap infeksi dan eksresi (shedding) virus AI. Sejumlah 58 pooling sampel yang diuji terdapat 6 sampel yang menunjukkan positif Influenza A dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-MatrikAI) tetapi negatif pada pengujian dengan primer H5 (F-H5-AI; R-H5-A1). Jika diasumsikan bahwa dalam 1 pooling organ terdapat sekurang-kurangnya 1 sampel organ DOC mengandung virus Influenza A maka dapat dihitung angka prevalensi. Total sampel 346, sebanyak 6 sampel positif Influenza A (1.73%). Sampel antar area 174, sebanyak 3 sampel positif Influenza A (1.72%). Berdasarkan daerah asal dapat diperoleh angka prevalensi untuk Cianjur yang menunjukkan 1 sampel positif dari 48 sampel DOC (2.08%), Subang 1 sampel positif dari 66 sampel DOC (1.51%) dan Tangerang 1 sampel positif dari 42 sampel DOC (2.38%), sementara itu untuk sampel dari Bogor dan Sukabumi negatif terhadap AI. Sampel kadaver DOC impor dari USA menunjukkan prevalensi virus Influenza A sebesar 3 sampel positif dari 172 sampel kadaver DOC (1.74%). Penelusuran pengujian RT-PCR pada organ kuning telur dengan 3 macam primer, dilakukan pada 13 sampel negatif AI pada paru-paru dan trakhea yang telah diuji dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI). Kuning telur diuji menggunakan primer matrix (M-Flu 1; M-Flu 2) menunjukkan 8 sampel positif dan primer matrik (FAI; RAI) menunjukkan 3 sampel positif. Hasil positif berbeda-beda pada setiap pasangan primer, hal ini dapat terjadi karena perbedaan gen penyusun dari masing-masing virus dan perbedaan target annealing dari masing-masing primer. Satu sampel positif matrik dengan primer matrik (FAI; RAI) menunjukkan positif H5 dengan primer H5 (FH5; RH5). Konfirmasi pengujian dilakukan pada sampel positif. Hasil pengujian menunjukkan bahwa sampel yang positif dengan primer matrik (F-Matrik-AI; RMatrik-AI) ketika dikonfirmasi dengan pasangan primer matrik (FAI; RAI) dan H5 (FH5; RH5) menunjukkan hasil yang tetap positif. Berdasarkan penelitian ini
ditemukan bahwa DOC mengandung virus AI subtipe H5, namun tidak menutup kemungkinan adanya subtipe virus Influenza A lain. Hasil inokulasi pada telur ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) dari sampel kuning telur yang menunjukkan hasil positif AI dengan metode RT-PCR diperoleh isolat virus Avian Influenza. Penelusuran untuk mengetahui pola penularan AI dilakukan pengujian RTPCR pada sampel positif dan negatif pada organ paru-paru dan trakhea menggunakan pasangan primer marik dan H5 dari Lee & Suarez (2004). Virus Avian Influenza negatif pada organ trakhea dan paru-paru DOC dengan RT-PCR, tetapi setelah dilakukan penelusuran pada sampel kuning telur menunjukkan hasil yang dubius, positif lemah dan positif (37,5%). Sampel-sampel yang menunjukkan positif pada pooling organ trakhea dan paru-paru tetap menunjukkan hasil yang positif (62,5%). Pooling sampel trakhea dan paru-paru positif matrik setelah diinokulasikan pada TAB-SPF menunjukkan hasil negatif (100%). Sebanyak 100% sampel kuning telur yang positif RT-PCR dengan primer matrik dan H5 menunjukkan hasil positif setelah dilakukan inokulasi pada TAB-SPF. Hasil inokulasi TAB-SPF pada pooling organ paru-paru dan trakhea negatif karena jumlah virus dalam organ tersebut masih sedikit sehingga belum mencapai 1 EID50 (jumlah virus minimal untuk dapat tumbuh pada TAB). Virus AI pada kuning telur dapat tumbuh pada TAB-SPF karena jumlahnya lebih banyak dari 1 EID50. Penelitian ini menunjukkan adanya fenomena bahwa virus Avian Influenza dapat ditularkan secara vertikal. Kata kunci: day old chick, influenza A, virus avian influenza, matriks, H5, primer.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2009 Hak cipta ini dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apapun tanpa seizin IPB.
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Tesis Nama Mahasiswa Nomor Pokok
: Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta : Mujiatun : B 251064084
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Retno D Soejoedono MS Ketua
Dr. drh. Sri Murtini, MSi Anggota
Diketahui Ketua Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
Dr. drh. Denny Widaya Lukman, MSi.
Tanggal Ujian : 19 Januari 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS.
Tanggal Lulus :
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. drh. Ekowati Handaryani, MSi
