DETEKSI DAN KARAKTERISASI TURNIP MOSAIC VIRUS PENYEBAB PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN CAISIN (Brassica campestris L. spp. chinensis)1) (Detection and Characterization of a Turnip Mosaic Virus Causing Mosaic Disease on Caisin (Brassica campestris L. spp. chinensis)1) Firdaus, SP., M.Si Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Aceh E- mail :
[email protected] ABSTRACT A mosaic disease is becoming very common on caisin (Brassica campestris L. spp. chinensis) in Bogor, West Java. Study to identify the causal agent was conducted in Cikabayan screen house and Virology Laboratory of Department of Plant Pests and diseases from June 2003 to August 2004. A virus was isolated from caisin plants showing mosaic symptoms and further investigation to identity and characterize of the virus was conducted involving several methods, i.e. I-ELISA, RT-PCR, EM, Host range, and transmission studies. Plant samples from Cinangneng, Bogor reacted positively with TuMV polyclonal antisera. RT-PCR using a specific pair of primer for TuMV was successfully amplified a 800 bp DNA fragment from plant samples. Electron microscopy of leaf dips from plant samples revealed flexuous particle of 11-12 nm wide and 700-780 nm length. The host range of the virus includes plant species belongs to the family Brassicaceae, Chenopodiaceae, and Solanaceae in which the virus induces necrotic local lesion, and mosaic symptoms. Two aphid species, Myzus persicae and Aphis craccivora, was able to transmit the virus. Based on the above characters, the virus was identified as TuMV. Key words : Turnip mosaic virus, I-ELISA, RT-PCR, Brassicaceae
PENDAHULUAN Caisin (Brassica campestris L. spp. chinensis) merupakan salah satu jenis sayuran dari suku kubis-kubisan (Brassicaceae). Sayuran ini banyak diusahakan oleh petani karena mempunyai nilai ekonomi yang cukup baik. Namun demikian, dalam budidaya tanaman ini banyak mendapat kendala terutama gangguan hama dan penyakit. Seperti misalnya, hasil survei yang dilakukan oleh peneliti pada bulan Mei 2008 di Desa Cinangneng, Kecamatan Darmaga, Kabupaten Bogor, dan Desa Cipanas, Kecamatan Cipanas, Kabupaten Cianjur, Provinsi Jawa Barat menemukan banyak tanaman caisin (50% dari populasi yang diamati) menunjukan gejala mosaik, blister, malformasi atau kerdil. Gejala mosaik yang disertai berbagai gejala lainnya mungkin disebabkan oleh virus, karena beberapa jenis virus telah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman kubis-kubisan seperti: cucumber
mosaic virus
(CMV), cauliflower mosaic virus (CaMV), turnip yellow mosaic virus (TYMV) dan turnip mosaic virus (TuMV) (Sako, 1981). Uji pendahuluan yang telah dilakukan dengan enzyme-
2 linked immunosorbent assay (ELISA) terhadap sampel tanaman sakit mengarahkan pada dugaan bahwa TuMV berasosiasi dengan penyakit ini.
TuMV telah banyak dilaporkan
menginfeksi tanaman caisin di negara-negara subtropis (Green and Deng 1985; Jenner and Walsh 1996; Oshima et al. 1996), tetapi laporan detail mengenai TuMV isolat caisin di Indonesia belum tersedia. TuMV termasuk genus Potyvirus dalam famili Potyviridae yang mempunyai anggota paling banyak diantara virus-virus tumbuhan (Green and Deng 1985; Shukla et al. 1994; Shi et al. 1996; Lehmann et al. 1997; Stavolone et al. 1998). Potyvirus mempunyai partikel berbentuk batang lentur berukuran 15-20 x 720 nm dan mengandung genom monopartit berupa RNA untai tunggal yang terdiri dari 9830 nukleotida (Nicolas and Laliberte 1992). Kerugian produksi caisin akibat penyakit mosaik di masa yang akan datang diharapkan dapat diatasi bila identitas virus penyebabnya diketahui dan metode deteksinya tersedia.
Deteksi secara tepat dan cepat merupakan prasyarat keberhasilan usaha
pengendalian penyakit tanaman oleh virus. Dewasa ini, metode deteksi dan identifikasi virus yang umum digunakan antara lain uji serologi, pengamatan bentuk partikel dengan mikroskop elektron, teknik molekuler, dan kajian bioekologi (Shukla et al. 1994). Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus penyebab penyakit mosaik pada tanaman caisin melalui berbagai metode seperti serologi, PCR, mikroskop elektron, kajian kisaran inang, penularan dengan serangga vektor.
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan mulai Juni 2008 sampai Agustus 2009 di Rumah Kasa Cikabayan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Metode Pengumpulan Tanaman Sampel dari Lapangan Sampel daun caisin dari tanaman bergejala mosaik dikoleksi dari lahan petani di Desa Cinangneng, Kecamatan Darmaga, Kabupaten Bogor, dan Desa Cipanas, Kecamatan Cipanas, Kabupaten Cianjur, Provinsi Jawa Barat. Sebagian dari sampel daun tersebut disimpan di deep freezer pada suhu –80o C dan sebagian lagi dikering-awetkan dengan CaCl3 pada suhu 4o C sebelum digunakan sebagai bahan penelitian.
3
Uji Serologi Untuk mendeteksi adanya virus pada sampel daun caisin yang telah dikoleksi dilakukan uji serologi dengan indirect-ELISA (I-ELISA) mengikuti metode Stobbs and Shuttuck (1989). Pada penelitian ini digunakan antiserum terhadap pepper mild mottle virus (PMMV), cucumber mosaic virus (CMV), potato virus Y (PVY), tomato mosaic virus (ToMV) dan turnip mosaic virus (TuMV). Daun caisin sampel dilumatkan dalam bufer ekstrak [3,3 g general extract powder (Agdia.Inc) dan 2 g Tween-20 dilarutkan dalam 100 ml aquadest] dengan perbandingan 1:10 (b/v). Nilai absorbansi dibaca dengan menggunakan ELISA-reader pada panjang gelombang A405 nm (BioRad, USA) 45 menit setelah penambahan substrat.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Terhadap beberapa sampel yang bereaksi dalam uji ELISA dilakukan deteksi lebih lanjut dengan RT-PCR. RNA total diekstraksi dari sekitar 0,1 g daun caisin sumber virus dengan metode standar (Sambrook et al. 1989). RNA total hasil ekstraksi disuspensikan dalam 10 µl aquabidest. Reaksi RT dilakukan dengan menambah 10 pmol oligo-dT, 2 U reverse transcriptase (Gibco-BRL), bufer reaksi (20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KCl, 200 mM dNTP, 2,5 mM MgCl2 ) dan aquades sampai volume 25 µl pada tabung mikro yang telah mengandung 5 µl RNA total. Reaksi diawali dengan inkubasi pada suhu 940 C selama 5 menit untuk denaturasi, kemudian dilanjutkan pada 37 o C selama 1 jam untuk sintesa cDNA. PCR dilakukan dalam volume 50 µl dengan menambahkan 10 pmol primer dan 2 U Taq polymerase (Gibco-BRL) ke dalam hasil reaksi RT. Siklus PCR dilakukan sebagai berikut: satu siklus untuk denaturasi inisiasi pada 95 o C selama 5 menit; 30 siklus untuk denaturasi pada 940 C selama 30 detik, anneling pada 50o C selama 30 detik, dan ekstensi 72o C selama 1 menit; dan satu siklus untuk ekstensi akhir pada 72 o C selama 5 menit. Primer (TuMV8573F: 5’AGC TCC CTA GCA CAA GAA GG3’ dan TuMV-9385R: 5’TCG AGC TAA GCA CAT GTC GG3’) didesain berdasarkan sikuen nukleotida genom TuMV (Nicolas and Laliberte 1992; Oshima et al. 1996). Hasil amplikasi PCR dengan pasangan primer ini diperkirakan sekitar 800 bp. Produk PCR (sekitar 10-15 µl ) diseparasi dengan elektroforesis pada 1,2% agarose dalam 0,5x bufer TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8,0). Gel distaining dengan etidium bromida dan divisualisasi dengan UV transilluminator (Sambrook et al. 1989).
4 Isolasi Virus Sampel daun yang terbukti terinfeksi TuMV dengan uji ELISA ditularkan secara mekanik ke beberapa tanaman indikator termasuk Chenopodium amaranticolor dimana virus menginduksi lesio lokal nekrotik. Isolasi virus dilakukan dengan penularan lesio tunggal (single-lesion tranfer) pada C. amaranticolor sebanyak tiga kali berturut-turut. Lesio tunggal pada penularan terakhir diinokulasikan ke tanaman caisin berumur dua minggu setelah semai. Daun-daun caisin yang tumbuh kemudian (sekitar duapuluh hari setelah inokulasi) dipanen dan disimpan pada suhu –80o C sebagai sumber virus untuk penelitian selanjutnya.
Pengamatan Morfologi Partikel Virus Morfologi partikel virus diamati dibawah mikroskop elektron (JEOL 1010) di Laboratorium Terpadu, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Leaf-dip dari daun caisin terinfeksi difiksasi dengan 2% glutaraldehyde lalu distain negatif dengan 2% sodium phosphotungstate (PTA) pH 7,0.
Kajian Kisaran Inang Virus Isolat virus diinokulasi secara mekanik ke beberapa spesies tanaman yang termasuk dalam famili Brassicaceaea, Chenopodiaceae, Solanaseae, dan Cucurbitaceae (Tabel 1). Inokulum disiapkan dengan menggerus daun caisin sumber virus dalam 0,01 M bufer fosfat pH 7,0 (1:10 b/v). Inokulasi dilakukan pada dua daun dari masing- masing tanaman uji. Pengamatan munculnya gejala dilakukan setiap hari untuk menentukan masa inkubasi dan tipe gejala. Verifikasi infeksi dilakukan dengan ELISA.
HASIL DAN PEMBAHASAN Gejala Penyakit pada Tanaman Caisin di Lapangan Tanaman caisin sakit yang diamati di lapangan memperlihatkan gejala yang bervariasi.
Beberapa tanaman hanya meperlihatkan mosaik ringan,
tetapi kebanyakan
tanaman sakit memperlihatkan gejala mosaik berat hijau kekuningan pada daun disertai gejala vein clearing, melepuh (blister), dan perubahan bentuk atau malformasi. Tanaman yang terserang umumnya terhambat pertumbuhannya sehingga tampak kerdil (Gambar 1).
5
A
B
C
D
Gambar 1 Variasi gejala pada tanaman caisin terinfeksi TuMV; mosaik ringan disertai vein clearing (A), melepuh (B), malformasi (C), dan kerdil (D, kanan) Deteksi TuMV dengan I-ELISA Hasil I-ELISA terhadap beberapa daun caisin sampel dari Cinangneng dan Cipanas (Gambar 2) memperlihatkan bahwa semua sampel yang diuji bereaksi positif terhadap antiserum TuMV. Empat dari sampel tersebut yaitu CN1, CN2, CP2, dan CP3 juga bereaksi positif terhadap antiserum ToMV. Sebaliknya dengan menggunakan antiserum CMV, PVY, dan PMMV semua sampel bereaksi negatif.
Dari hasil pengujian tersebut, tampaknya
penyakit mosaik pada tanaman caisin di daerah Cinangneng maupun di Cipanas dominan disebabkan oleh infeksi TuMV, walaupun beberapa diantaranya merupakan infeksi campuran dengan ToMV. Sako (1981) telah melaporkan bahwa selain TuMV, CMV dan CaMV juga dapat menginfeksi caisin. Beberapa peneliti sebelumnya telah berhasil mendeteksi TuMV dengan uji serologi, seperti: Stobbs and Shuttuck (1989) berhasil mendeteksi TuMV dengan ELISA pada tanaman rutabaga (Brassica napus ssp. rapifera) di Southern Ontario, Canada. Selanjutnya di Taiwan, Green and Deng (1985) melakukan identifikasi TuMV yang diisolasi dari tanaman Chinese cabbage (B. campestris subsp. pekinensis L.) dan tanaman lobak (Raphanus sativus L.) melalui teknik double antibody sandwich-ELISA. Sementara Jenner and Walsh (1996) dapat mendeteksi TuMV isolat Eropa yang berasal dari tanaman oilseed rape (B. napus var. oleifera) dengan cara I- ELISA di Campania (Stavolone et al. 1998).
6
TuMV
CMV
ToMV
PVY
PMMV
Nilai Absorbansi A405nm
3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 GEB K(-) CN1 CN2 CN3 CN4 CN5 CN6 CN7 CP1 CP2 CP3 CP4 CP5 CP6
Tanaman Sampel
Gambar 2 Nilai absorban hasil uji ELISA pada A405 nm terhadap sampel daun caisin dengan antiserum TuMV, CMV, ToMV, PVY, dan PMMV. CN = sampel daun caisin sakit dari Cinangneng; CP = sampel daun caisin sakit dari Cipanas; K(-) = daun caisin sehat sebagai kontrol negatif; GEB = bufer ekstrak Deteksi TuMV dengan RT-PCR RT-PCR dengan primer yang didesain spesifik untuk deteksi TuMV (Nicolas and Laliberte 1992; Oshima et al. 1996) berhasil mengamplifikasi genom virus isolat Cinangneng dan Cipanas (Gambar 3). Berdasarkan perbandingan dengan pita-pita pada DNA marker maka produk RT-PCR tersebut diestimasi sekitar 800 bp. Produk RT-PCR tersebut sesuai dengan yang diharapkan bila menggunakan primer TuMV-8573F dan TuMV-9385R (Nicolas and Laliberte 1992; Oshima et al. 1996). Pada percobaan ini, tidak ditemukan adanya pita pada sampel tanaman caisin sehat, menandakan kespesifikan primer yang digunakan. Satu dari enam isolat virus (Cipanas 3) tidak berhasil diamplifikasi dengan RT-PCR. Hal ini mungkin disebabkan oleh kegagalan dalam ekstraksi RNA total mengingat RNA adalah bahan yang sangat rentan terhadap Rnase.
Isolasi Virus Untuk keperluan karakterisasi, isolasi virus berhasil dilakukan melalui penularan lesio tunggal pada C. amaranticolor dari beberapa daun caisin yang diketahui terinfeksi tunggal TuMV pada uji serologi. Pada inang tersebut, virus membentuk lesio nekrotik berdiameter sekitar 1 - 2 mm berwarna coklat. Setiap isolat virus dapat menginduksi gejala yang sama
7 dengan gejala infeksi alami di lapang (Gambar 1). Isolat tersebut diberi kode CN (untuk Cinangneng) dan CP (untuk Cipanas) sesuai dengan tempat virus tersebut diperoleh.
M 1
2
3
4
5
6
7
800bp
Gambar 3 Hasil elektroforesis gel agaros produk RT-PCR isolat- isolat TuMV dari daerah Cinangneng dan Cipanas menggunakan pasangan primer TuMV-8573F dan TuMV-9385R. M = 1 Kb DNA marker; 1 = virus isolat Cipanas 1; 2 = daun caisin sehat sebagai kontrol negatif; 3 dan 4 = virus isolat Cipanas 2 dan 3; 5,6,7 = virus isolat Cinangneng 1, 2 dan 3.
Morfologi Partikel Virus Berdasarkan pengamatan menggunakan mikroskop elektron, partikel virus penyebab penyakit mosaik pada tanaman caisin yang teramati berbentuk batang lentur dengan dimeter sekitar 11-12 nm dan panjang 700 – 780 nm (Gambar 4). Berdasarkan publikasi yang ada, virus tanaman yang mempunyai ciri morfologi semacam ini termasuk genus Potyvirus, family Potyviridae (Hari 1995; Murphy et al. 1995). Ukuran partikel virus tersebut sesuai dengan ukuran partikel TuMV hasil penelitian Ping (1987) yang melaporkan bahwa partikel TuMV berbentuk batang lentur berukuran 700 – 800 nm x 11 – 12 nm. Beberapa peneliti lain melaporkan bahwa ukuran partikel TuMV adalah 680 – 754 nm (Tomlinson 1970), 720 x 15 – 20 nm (Nicolas and Laliberte 1992), 700 – 800 nm x 12 – 13 nm (Sako 1981).
8
Gambar 4
Partikel TuMV (V) yang berasosiasi dengan penyakit mosaik pada tanaman caisin di daerah Cinangneng. Bar : 200 nm Kajian Kisaran Inang
Isolat virus dari Cinangneng (CN-5) berhasil ditularkan secara mekanik pada beberapa spesies/kultivar tanaman (Tabel 1). Isolat virus tersebut dapat menginfeksi 17 jenis tanaman dari 20 tanaman yang diuji dengan gejala yang bervariasi dan masa inkubasi antara 5 – 14 hari. Isolat virus tersebut menginduksi gejala sistemik pada semua spesies/kultivar tanaman uji dari famili Brassicaceae, sedangkan pada tanaman dari famili Chenopodiaceae dan Solanaceae menginduksi lesio lokal nekrotik. Tanaman dari famili Cucurbitaceae dan sebagian tanaman dari famili Solanaceae tampaknya tidak menjadi inang virus tersebut. Pada ketiga jenis tanaman tersebut (Nicotiana glutinosa, Capsicum annuum dan Cucumis sativus) gejala tidak muncul sampai satu bulan pengamatan dan verifikasi dengan ELISA tidak menunjukkan adanya infeksi laten. Hasil kajian kisaran inang virus ini sesuai dengan hasil penelitian Stobbs dan Shattuck (1989) bahwa kisaran inang TuMV cukup luas terutama spesies-spesies yang termasuk famili Brassicaceae.
Tabel 1 Famili
Nilai absorbansi hasil ELISA pada (A405 nm ) , masa inkubasi dan tipe gejala pada berbagai spesies tanaman uji hasil penularan virus isolat Cinangneng (CN ) Species
Nilai Absorbansi A405 nm
M asa Inkubasi (hari)
Tipe Gejala
9 Brassicaceae
Kontrol negatif (Caisin sehat) Raphanus sativus - cv. Red chine (radish) - cv Ten-an kohshin (chinese radish) - cv. Tokinashi (Japanese radish) - cv Awashinbansai (Japanese radish) - cv. Hohryoh (Japanese radish) Brassica oleracea var gogylodes - cv. Sunbird (kohlrabi) B. oleracea var capitata - cv. Shikidori (cabbage) - cv. Haruhikari (cabbage) B. oleracea var gemmifera - cv. Family Seven (baby cabbage) B. oleracea var acephala - cv. Aojiroyoh kale (kale) B. oleracea var capitat - cv. Shoshyu (cabbage) B. oleracea var bottytis - cv Greenface (broccoli) B. oleracea var amplexicaulis - cv. M usoh (Chinese cabbage) B. oleracea var botrytis - cv Suow crown (cauliflower) B. rapa (turnip)
0.322
- na
-
0.893 (+) 0.856 (+) 1.353 (+) 1.086 (+) 0.766 (+)
7-10 9-10 9-10 8-10 9-11
m, mf m, mf, kd m, mf m m
1.223 (+)
8-12
vc
1.482 (+) 1.931 (+)
9-12 9-11
vc, vc
0.915 (+)
8-10
vc
1.254 (+)
7-11
vc,
0.926 (+)
9-12
vc
0.895 (+)
9-14
vc
1.528 (+)
6-9
m, bls
0.831 (+) 1.750 (+)
7-10 5-7
m m
Chenopodiaceae
Chenopodium amaranticolor
0.650 (+)
8-12
lln
Solanaceae
Nicotiana tabacum, N. glutinosa, Capsicum annuum Cucumis sativus
0.675 (+) 0.423 (-) 0.342 (-) 0.406 (-)
7-10 - na - na - na
lln - tb - tb - tb
Cucurbitacea
Keterangan: m = mosaik, mf = malformasi, kd = kerdil, vc = veinclearing, bls = blister, lln = lesio lokal nekrotik, tb = tidak bergejala , deteksi dengan I-ELISA memberikan hasil positif (+) atau negatif (-), na = tidak bergejala sampai akhir pengamatan
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan. Melalui I-ELISA dan RT-PCR terbukti bahwa penyakit mosaik pada tanaman caisin berasosiasi dengan TuMV.
TuMV isolat caisin mempunyai partikel
berbentuk batang lentur dengan diameter sekitar 11 nm dan panjang 700 – 780 nm, mempunyai kisaran inang cukup luas terutama spesies-spesies dari famili Brassicaceae, dan dapat ditularkan oleh dua spesies kutudaun. M. persicae lebih efektif sebagai vektor TuMV dibandingkan A. craccivora. Saran. Untuk lebih memahami karakteristik TuMV, masih perlu dilakukan penelitian lanjutan meliputi: (1) Pemetaan sebaran TuMV di Indonesia, dan (2) Analisis hubungan kekerabatan antar strain TuMV isolat Indonesia dengan isolat TuMV negara lain.
10
DAFTAR PUSTAKA Green SK, Deng TC. 1985. Turnip mosaic virus strain in cruciferous hosts in Taiwan. Plant Dis 69: 28-31 Hari V. 1995. The Potyviridae. In: Singh RP, Singh S, Kohmoto K (eds) Pathogenesis and Host Specificity in Plant Disease III: Viruses and Viroids. Pergamon & Oxford. pp: 118 Jenner CE, Walsh JA. 1996. Pathotypic variation in turnip mosaic virus with special reference to European isolates. Plant Pathology 45: 848-856 Lehmann P, Petrzik K, Jenner C, Greendland A, Spak J et al. 1997. Necleotide and amino acid variation in the coat protein coding region of turnip mosaic virus isolates and possible involment in the interaction with the brassica resistance gen TuRBO1. Physiol Mol Plant Pathol 51: 195-208 Murphy FA, Fauquet CM, Bishop DHL, Ghabrial SA, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA, Summers MD. 1995. Virus taxonomy: Six report of the international committee on taxonomy of viruses. Arch Virol Suppl 10: 348-357 Nicolas O, Laliberte JF. 1992. The complete nucleotide sequence of turnip mosaic potyvirus RNA. J Gen Virol 73: 2785-2793 Nishi Y. 1963. Studies on transmission of plant viruses by aphids. (In Japanese with English summary). Bull. Kyushu Agric. Exp. Stn. 8:351-408 Oshima K, Tanaka M, Sako N. 1996. The complete nucleotide sequence of turnip mosaic virus RNA Japanese strain. Arch Virol 141: 1991-1997 Ping LX. 1987. Identification of a virus isolat from infected crucifers in Thailand. Report ARC Training Sako N. 1981. Virus diseases of Chinese cabbage in Japan. Proceeding of the First International Symposium on Chinese Cabbage. AVRDC Taiwan. 489 pp. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Moleculer Cloning: A Laboratory Manua l. Ed ke-2. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Shi N, Chen J, Wilson TNA, Macfarlane SA, Antoniw JF, Adams MJ. 1996. Single-strand conformation polymorphism analysis of RT-PCR products of UK isolates of barley yellow mosaic virus. Virus Res 44: 1-9 Shukla DD, Ward CW, Brunt AA. 1994. The Potyviridae. CAB International, Wallingford, UK Stavolone L, Alioto D, Ragozzino A, Laliberte JF. 1998. Variability among turnip mosaic potyvirus isolates. Phytopathology 88: 1200-1204 Stobbs LW, Shattuck VI. 1989. Turnip mosaic virus strain in Southern Ontario, Canada. Plant Dis 73: 208-212 Tomlinson JA. 1970. Turnip mosaic virus. Descriptions of Plant Viruses No. 8. Commonw Mycol Inst/Assv oc Appl Biol, Kew Surrey, England
