J Kedokter Trisakti
Januari-April 2002, Vol.21 No.1
Deteksi butirilkolinesterase varian C5+ dengan elektroforesis poliakrilamid Elly Herwana*, Franciscus D. Suyatna**, Rianto Setiabudy** *
**
Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
ABSTRACT Butyrylcholinesterase (BChE) is an enzyme which involved in the metabolism of succinylcholine. Alteration in enzyme activity influenced the duration of action of succynilcholine. The objective of this study is to find out the distribution of C5+ variant of BChE and its relation to the increase of enzyme activity. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was used to detect C5+ variant of BChE. The measurement of butyrylcholinesterase activity was also done in this study. The study was done on 246 individuals from Javanese ethnic residing in Jakarta. Variant C5+ was characterized by PAGE developed by Laemmli, and BChE activity determined by the methods developed by Kallow. PAGE identified 54 individuals (22%) with C5+ and 192 individuals (78%) with C5-. The distribution of BChE activity using benzoylcholine as substrate, ranged between 450 u/l – 1380 u/l, 19 individuals (7,7%) had low enzyme activity. Related to C5+ variant, it was found that the mean enzyme activity of C5+ was slightly higher than that of C5-. The average level activity of BChE ( ± SD) of C5+ variant and C5were 987,77 u/l ± 205,59 and 942,76 u/l ± 168,69 respectively. Statistical analysis using t-test showed that the difference was not statistically significant. Key words: Butyrylcholinesterase, PAGE, C5+ variant
ABSTRAK Butirilkolinesterase (BChE) merupakan enzim yang berperan dalam metabolisme suksinilkolin. Perubahan aktivitas enzim mempengaruhi lama kerja suksinilkolin. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan data distribusi fenotip BChE varian C5+ dan hubungannya dengan peningkatan aktivitas enzim. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) digunakan untuk mendeteksi BChE varian C5+. Penelitian ini dilakukan pada 246 individu suku bangsa Jawa yang tinggal di Jakarta. PAGE dilakukan menurut metode Laemmli, dan pengukuran aktivitas BChE dilakukan menggunakan substrat benzoilkolin menurut metode Kallow. Hasil PAGE menunjukkan 54 individu (22%) dari 246 sampel adalah varian C5+, dan 192 individu (78%) adalah C5-. Hasil pengukuran aktivitas BChE bervariasi antara 450-1360 u/l, sebanyak 19 individu (7,7%) menunjukkan aktivitas di bawah nilai normal. Dikaitkan dengan varian C5+ dan C5-, aktivitas enzim pada varian C5+ tampak lebih tinggi dari C5-. Rata-rata aktivitas BChE ± SD pada C5+ dan C5- adalah 987,77 ± 205,59 u/l dan 942,76 ± 168,69 u/l. Analisis statistik dengan uji-t tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna antara aktivitas BChE pada varian C5+ dan C5-. Kata kunci : Butirilkolinesterase, PAGE, varian C5+
PENDAHULUAN Sejak tahun 1951 suksinilkolin telah digunakan sebagai pelemas otot. Pada penggunaannya sebagai ajuvan pada anestesi umum, suksinilkolin memberikan efek paralisis otot yang kuat, dengan
masa pemulihan yang cepat, dan efek samping yang sedikit/ringan. Setelah obat ini banyak digunakan timbul masalah karena pada beberapa pasien dijumpai pemanjangan efek suksinilkolin yang 1
Herwana, Suyatna, Setiabudy
disertai dengan efek henti nafas yang lebih lama. Kallow dkk.(1,2,3) menemukan bahwa kelainan ini berkaitan dengan aktivitas enzim butirilkolinesterase. Butirilkolinesterase (BChE) merupakan enzim dalam serum yang berperanan dalam metabolisme suksinilkolin.(3,4) Pada pemberian suksisnilkolin secara intravena, dalam waktu satu menit maka 90% obat telah dimetabolisme oleh enzim BChE menjadi suksinilmonokolin dan kolin yang inaktif.(4) Dengan demikian kadar suksinilkolin yang mencapai reseptor motor endplate pada membran sel otot kadarnya jauh lebih rendah dari dosis pemberian obat. Hal ini menyebabkan suksinilkolin mempunyai mula kerja obat (onset of action) dan masa kerja obat (duration of action) yang sangat singkat. Jika terjadi perubahan aktivitas enzim BChE, maka hal ini akan sangat mempengaruhi masa kerja dari suksinilkolin. Bilamana terdapat gangguan afinitas suksinilkolin dengan BChE, metabolisme obat akan dihambat. Selanjutnya reseptor menerima kelebihan dosis yang sangat besar sehingga efek henti nafas yang pada keadaan normal hanya berlangsung antara 1-6 menit akan berlangsung lebih lama.(3,4) Sebaliknya bilamana terdapat peningkatan aktivitas BChE maka efek suksinilkolin akan berlangsung lebih singkat. Ada beberapa metode pemeriksaan yang dapat digunakan untuk mengukur aktivitas enzim BChE dan mengidentifikasi variasi genetik BChE. Protein enzim BChE dapat diidentifikasi melalui pemeriksaan elektroforesis yang akan memberikan gambaran berupa pita-pita protein. (5,6) Pada penelitian ini akan dilakukan identifikasi BChE varian C5 dengan pemeriksaan elektroforesis poliakrilamid (Polyacrylamide gel electrophoresis = PAGE). Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi distribusi fenotip BChe varian C5+ dengan menggunakan pemeriksaan elektroforesis poliakrilamid pada suatu populasi suku Jawa yang tinggal di Jakarta. BAHAN DAN CARA Subyek Penelitian ini dilakukan pada 246 sampel darah 2
Butirilkolinesterase varian C5+
yang diperoleh dari donor darah sukarela pria dan wanita di PMI DKI Jaya. Kriteria pengikutsertaan subyek adalah pria/wanita dewasa sehat yang datang sebagai donor darah sukarela di PMI DKI Jaya, suku Jawa, dan tidak minum obat apapun minimal 1 minggu sebelum melakukan donor darah. Bahan Dari tiap subyek diambil 5 ml darah vena, darah dicampur dengan 2 tetes Heparin (Leo) 1250 unit/ml, dan disentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Plasma dipisahkan dan disimpan pada suhu -20°C hingga saat pengukuran. Pengukuran aktivitas BChE Aktivitas BChE diukur berdasarkan nilai absorbans pada spektrofotometer (Perkin Elmer) dari campuran 1,25 ml buffer fosfat (0,355 M, pH 7,4), 0,75 ml substrat benzoilkolin (2.10-4 M), dan 1 ml plasma (0,3 ml plasma diencerkan dalam 10 ml buffer fosfat). Pemeriksaan elektroforesis gel akrilamid Pemeriksaan PAGE dilakukan menurut metode Laemmli,(7) tanpa SDS (sodium dodecyl sulfate) dan merkapto etanol. Gel pemisah dibuat dari 5 ml larutan akrilamid 30%, 3,3 ml larutan Tris HCl 2 M, dan 8,2 ml H2O, 40 µl ammonium persulfat 10%, dan 10 µl temed. Gel sampel dibuat dari 0,5 ml larutan akrilamid 30 %, 0,6 ml tris HCl 0,5 M, 3,9 ml H2O, 10 µl ammonium persulfat 10%, dan 2,5 µl temed. Larutan bufer elektroforesis dibuat dari 3,03 g Tris HCl, 14,4 g glisin, ditambahkan H2O hingga l. Larutan buffer sampel dibuat dari 12 ml larutan Tris HCl 0,5 M. 10 g sukrosa, 0,5 ml bromfenol biru 0,2%, dan H2O hingga 50 ml. Untuk setiap sampel yang diperiksa, dibuat campuran 15 ul buffer sampel dan 3 ul plasma, lalu dipipetkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis dijalankan dengan aliran listrik 70 mA selama 4 jam pada suhu ruang. Untuk pewarna digunakan larutan Fast red. Gel poliakrilamid dilepaskan dari cetakannya dan direndam di dalam larutan Fast red pada suhu ruang hingga terbentuk gambaran pita-pita protein yang berwarna kemerahan pada gel. Dari gambaran pita protein yang terbentuk pada gel dapat diidentifikasi varian C5.
J Kedokter Trisakti
Vol.21 No.1
Penentuan fenotip BChE varian C5 secara PAGE C5- : memberikan gambaran 4 pita protein pada gel poliakrilamid C5+ : memberikan gambaran 5 pita protein pada gel poliakrilamid Analisis statistik Dilakukan analisis statistik dengan uji t (t-test) untuk menguji perbedaan rata-rata aktivitas BChE antara varian C5+ dan C5-. HASIL PENELITIAN 1.
Aktivitas BChE Hasil pengukuran aktivitas BChE dengan substrat benzoilkolin pada 246 sampel menunjukkan aktivitas antara 450 – 1380 u/l. Nilai normal untuk aktivitas BChE dengan substrat benzoilkolin adalah antara 690 – 1560 u/l. Sebanyak 227 individu (92,3 %) menunjukkan aktivitas BChE normal dan 19 individu (7,7 %) dengan aktivitas BChE di bawah nilai normal.
2.
Elektroforesis gel poliakrilamid Butirilkolinesterase varian C5+ diidentifikasi dari gambaran pita protein yang terbentuk pada media elektroforesis. Dengan menggunakan substrat alfa naftil asetat dan pewarna fast red protein BChE tampak sebagai pita- pita protein yang berwarna merah. Dari seluruh sampel yang diperiksa terdapat minimal 4 pita protein dan diidentifikasi sebagai varian C5-, dan sampel yang memberikan gambaran 5 pita protein diidentifikasi sebagai varian C5+. (Lihat Gambar 1). Hasil pemeriksaan elektroforesis gel poliakrilamid pada 246 sampel menunjukkan 54 individu (22 %) dengan varian C5+, dan 192 individu (78 %) adalah C5-. Pengukuran aktivitas BChE dengan substrat benzoilkolin, didapatkan nilai rata-rata aktivitas BChE pada varian C5+ lebih tinggi daripada C5-. Nilai rata-rata aktivitas BChE (± SD) pada varian C5+ adalah 987,77 u/l ± 205,59 dan untuk C5- adalah 942,76 u/l ± 168,69. Analisis statistik dengan uji-t (t-test) menunjukkan tidak ada perbedaan yang bermakna antara aktivitas BChE pada varian C5+ dan C5(p>0,05).
Gambar 1. Hasil elektroforesis gel poliakrilamid 3
Herwana, Suyatna, Setiabudy
PEMBAHASAN Analisis kelainan genetik enzim BChE telah dilakukan di banyak negara, tetapi data untuk populasi Indonesia belum ada. Beberapa fenotip variasi genetik BChE telah berhasil diidentifikasi. Kallow dkk.(1,2,3) yang pertama kali mengamati hal ini dan mengidentifikasi varian atipik yang berkaitan aktivitas BChE yang rendah. Untuk mendeteksi varian atipik ini Kallow (1,2) menggunakan uji inhibitor dengan dibukain. Harris dan Whittaker(8) menggunakan natrium fluorida sebagai inhibitor dan mengidentifikasi varian resisten fluorida. Liddell(9) menemukan varian S (Silent) dengan aktivitas enzim yang sangat rendah. Bartels dkk.(10,11,12) menemukan varian J, varian K, dan varian H yang secara kuantitatif menunjukkan penurunan aktivitas enzim akibat perubahan dalam sintesis atau stabilitasnya sehingga terjadi penurunan jumlah molekul enzim dalam plasma. Hampir semua variasi genetik tersebut di atas berkaitan dengan aktivitas BChE yang lebih rendah, dan varian-varian tersebut dapat dideteksi melalui uji inhibitor dengan dibukain, natrium fluorida, propranolol, atau Ro2-0683 (dimetil karbamat 2 hidroksi-5 fenilbenzil-trimetilamonium bromida).(1,2,8,13,14) Fenotip BChE varian C5+ merupakan varian fenotip BChE yang berbeda dari varian yang lain. Varian C5+ tidak dapat dideteksi dengan uji inhibitor dan hanya dapat dideteksi melalui pemeriksaan elektroforesis.(5) Ada 2 macam pemeriksaan elektroforesis yang dapat digunakan untuk mendeteksi protein butirilkolinesterase yaitu elektroforesis agar (Agarose electrophoresis) dan elektroforesis poliakrilamid.(5,6) Simpson(15) telah membandingkan pemeriksaan eletroforesis agar dengan elektroforesis poliakrilamid untuk mengidentifikasi fenotip C5+ pada populasi Kaukasus, Indian, dan Eskimo. Hasilnya menunjukkan bahwa pemeriksaan elektroforesis poliakrilamid 25% lebih sensitif daripada elektroforesis agar. Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan elektroforesis poliakrilamid menurut metode Laemmli(7) dengan substrat alfa naftil asetat dan pewarna fast red. Pada varian C5- memperlihatkan 4 pita protein yang dinamakan C1, C2, C3, dan C4, sementara pada varian C5+ terdapat pita protein 4
Butirilkolinesterase varian C5+
tambahan yang dinamakan pita protein C5.(5,6,16) Pada awalnya diduga varian C5+ ini ditentukan oleh lokus genetik dari kromosom yang berbeda dengan enzim BChE.(4) Lokus genetik yang mengkode enzim BChE ada pada pada kromosom 3, sementara untuk varian C5+ semula diduga berasal dari kromosom 16. Dengan demikian diperkirakan ada 2 lokus genetik untuk BChE yaitu lokus E1 pada kromosom 3 yang menentukan fenotip BChE dan lokus E2 pada kromosom 16 yang menentukan varian C5+. Masson dkk.(17) membuktikan bahwa hanya ada satu gen untuk BChE yaitu lokus E1 pada kromosom 3, keberadaan lokus E2 untuk BChE tidak terbukti. Pita protein C5, kemungkinan merupakan gabungan dari protein BChE dengan protein lain yang belum teridentifikasi. Lokus E2 mungkin spesifik untuk protein yang belum diketahui ini.(17) Hasil pemeriksaan elektroforesis poliakrilamid pada 246 subyek dalam penelitian ini menghasilkan 54 subyek (22%) dengan varian C5+ dan 192 subyek (78%) adalah C5-. Pada populasi Kaukasus frekuensi varian C5+ berkisar antara 8-10%.(17) Harris dkk.(6) mendapatkan frekuensi varian C5+ yang lebih rendah pada populasi Inggris yaitu 5%, dan pada populasi Tristan da Cunha didapatkan 17 %. Hasil penelitian ini juga mendapatkan bahwa aktivitas BChE rata-rata pada varian C5+ lebih tinggi daripada aktivitas enzim pada C5-. Tetapi pada uji stasistik didapatkan perbedaaan tidak bermakna. Beberapa peneliti juga mendapatkan aktivitas BChE yang lebih tinggi untuk varian C5+, tetapi uji statistiknya menunjukkan perbedaan yang bermakna. Hal ini mungkin disebabkan karena hasil penelitian ini menunjukkan variasi aktivitas BChE yang terlalu besar. Banyak faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas BChE, seperti penyakit hati, malnutrisi, karsinoma, obat-obatan, atau penggunaan insektisida organofosfat.(4,18) Penelitian Harris dkk.(6) membandingkan aktivitas BChE, fenotip BChE, dan varian C5 pada 248 sampel dari populasi Inggris dan 213 sampel dari populasi Tristan da Cunha. Hasilnya menunjukkan bahwa pada populasi Inggris didapatkan 9 fenotip BChE heterozigot normal atipik dan 13 varian C5+ (5%) yang seluruhnya berasal dari fenotip BChE
J Kedokter Trisakti
normal. Sedangkan pada populasi Tristan da Cunha tidak dijumpai variasi genetik fenotip BChE tetapi frekuensi varian C5+ didapatkan lebih tinggi yaitu 36 sampel (17%). Subjek penelitian Harris dkk.(6) mencakup jumlah pria dan wanita yang seimbang dari berbagai kelompok usia (0-4 tahun hingga 8589 tahun). Tidak ditemukan perbedaan bermakna dalam frekuensi varian C5+ antara pria dan wanita maupun antara kelompok usia yang berbeda. Pada penelitian ini didapatkan frekuensi varian C5+ juga cukup tinggi yaitu 22%. Penelitian yang dilakukan sebelumnya pada sampel yang sama tidak menemukan variasi genetik fenotip BChE pada suku Jawa.(19,20) Pada penelitian ini tidak dapat dianalisis perbedaan frekuensi varian C5+ pada pria dan wanita atau pengaruh usia, karena sampel penelitian ini diambil dari donor darah sukarela di PMI yang hampir seluruhnya adalah pria dewasa.
Vol.21 No.1
5.
6.
7.
8.
9. 10.
KESIMPULAN 11.
Pemeriksaan elektroforesis yang telah dilakukan pada 246 sampel dari suatu populasi suku Jawa di Jakarta mengidentifikasi 54 individu (22%) adalah varian C5+ dan 192 individu (78%) adalah C5-. Aktivitas BChE rata-rata pada varian C5+ didapatkan lebih tinggi daripada aktivitas enzim rata-rata pada subyek dengan C5-. Tidak terdapat perbedaan bermakna antara aktivitas BChE pada varian C5+ dan C5-. Daftar Pustaka 1.
2.
3.
4.
Kallow W, Lindsay HA. A comparation of optical and manometric methods for the assay of human serum cholinesterase. Canad J Biochem 1955; 33:568-74. Kallow W, Staron N. On distribution and inheritance of atypical forms of human serum cholinesterase as indicated by dibucaine numbers. Canad J Biochem 1957; 35:1305-21. Kallow W, Gunn DR. The relation between dose of succynilcholine and duration of apnea in man. J Pharm Exp Ther 1957; 120:203-14. Lockridge O. Genetic variants of human serum butyrylcholinesterase influence the metabolism of the muscle relaxant succinylcholine . In: Kallow W, editor. Pharmacogenetics of drug metabolism.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
New York:P ergamon Press; 1992.p.15-47. Harris H, Hopkinson DA, Robson EB. Twodimentional electrophoresis of pseudocholinesterase components in normal human serum. Nature 1962; 196:1296-8. Harris H, Hopkinson DA, Robson EB, Whittaker M. Genetical studies on a new variant of serum cholinesterase detected by electrophoresis. Ann Hum Genet 1963; 26:359-82. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227:680-5. Harris H, Whittaker M. Differential inhibition of human serum cholinesterase with fluoride recognation of two phenotypes. Nature 1961; 191:496-8. Liddell J. A ‘silent’ pseudocholinesterase gene. Nature 1962; 193:561-2. Bartels CF, James K, La Du BN. DNA mutation associated with human butyrylcholinesterase Jvariant. Am J Hum Genet 1992; 1104-14. Bartels CF, Jensen FS, Lockridge O, van der Speck AF, Rubinstein HM, Lubrano T et al. DNA mutation associated with the human butyrylcholinesterase K-variant and its linkage to the atypical variant mutation and polymorphicsites. Am J Hum Genet 1992; 50:1086-103. Jensen FS, Bartels CF, La Du BN. Structural basis of the butyrylcholinesterase H-variant segregatin in two Danish families. Pharmacogenetics 1992; 2:234-40. Prester L, Simeon V. Kinetics of the inhibition of human serum cholinesterase phenotypes with the dimetylcarbamate of (2-hydroxy-5-phenylbenzyl)trimetylammonium bromide (Ro-0683). Biochem Pharmacol 1991;42:2313-6. Whittaker M, Britten JJ, Wicks RJ. Inhibition of plasma cholinesterase variants by propranolol. Br J Anaesth 1981; 53:511-6. Simpson NE. Polyacrylamide electrophoresis used for the detection of C5+ cholinesterase in Canadians Caucasians Indians and Eskimos. Am J Hum Genet 1972; 24:317-20. Ashton GC, Simpson NE. C5 types of serum cholinesterase in a Brazilian population. Am J Hum Genet 1966; 18(5):438-47. Masson. P, Chatonnet A, Lockridge O. Evidence for a single butyrylcholinesterase gene in
5
Herwana, Suyatna, Setiabudy
individuals carrying the C5 plasma cholinesterase variant (CHE2). FEBS Lett. 1990; 262:115-8. 18. La Du BN. Overview of pharmacogenetics. In: Kallow W, editor. Pharmacogenetics of drug metabolism. New York:Pergamon Press;1992. p112. 19. Herwana E, Suyatna FD, Setiabudy R. Distribusi
6
Butirilkolinesterase varian C5+
aktivitas butirilkolinesterase pada suatu populasi suku Jawa di Jakarta. J Kedokter Trisakti 2001; 20:42-8. 20. Suyatna FD, Setiabudy R, Herwana E, Tjandra O. Butyrylcholinesterase and C5+ variant in a Javanese ethnic group in Indonesia. Int J Clin Pharm Ther 2000; 38:339-44.
