přehledné články
Degradace alergenů členovců v prostředí člověka The allergen degradation in human environment JAN HUBERT1,2, RADEK KLUBAL1
2
1 Medicínské centrum Praha Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha
SOUHRN Část alergenů produkovaných v trávicím traktu synantropních členovců se dostává do prostředí člověka v exkrementech. Tyto alergeny po defekaci nejsou závislé na velikosti a kolísání populace členovců, perzistují v prostředí nezávisle a vstupují do respirabilní frakce. Z hlediska deratizačních ošetření vyhubení škodlivých členovců sice zastaví produkci dalších alergenů, avšak bez sanitačního zásahu nevede k eliminaci alergenů již vyprodukovaných. Z tohoto důvodu je stabilita alergenů v prostředí člověka jedním z významných faktorů ovlivňující expozici senzitivních jedinců. V tomto přehledu shrnujeme poznatky o stabilitě alergenů prachových roztočů a švábů, tj. Der f 1, Der p 2, Der p 2, Bla g 1 a Bla g 2. Pokusy sledující rozklad těchto alergenů byly prováděny: (i) jednak v kontrolovaných laboratorních podmínkách (konstantní teplota, nebo vlhkost); (ii) v lidských domácnostech a pracovním prostředí. U těchto alergenů bylo prokázáno, že jsou velmi perzistentní a mohou přetrvat v prostředí člověka delší dobu než jeden rok. Bylo prokázáno, že stabilita alergenů Bla g 1 a Bla g 2 je odlišná, Bla g 1 je více perzistentní. Degradaci alergenů ovlivňují fyzikální podmínky a společenstva dekompozitorů, což jsou mikroskopické houby nebo bakterie. Dosud chybí údaje o změnách reaktivity těchto alergenů v průběhu jejich degradace. Vzhledem k vysoké stabilitě alergenů lze doporučit součinnost dezinsekčního a sanitačního zásahu pro eliminaci alergenů u senzitivních pacientů. Klíčová slova: alergeny, roztoči, švábi, degradace, Der f 1, Der p 2, Der p 2, Bla g 1, Bla g 2
SUMAMARY The allergens of synanthropic arthropods are either associated to their bodies or to the feces. The faces associated allergens are produced by the cells of digestive tract and entrance inside the feces to the human environment. The feces associated allergens are independent on the population size and pest fluctuation after defecation and persist in the environment independently to their producers. After defecation, the allergens entrance to the respirable fraction in the infested homes or working environment. The pest control without appropriate sanitation eliminates the arthropods and allergen production, but did not influence the already presented feces associated allergens in the environment of sensitive patients. The stability of feces associated allergen is a key factor influencing their hazards in the environment and the risk of exposure. The recent studies concern to the feces associated allergens of cockroaches and mites (i.e. Der f 1, Der p 2, Der p 2, Bla g 1 a Bla g 2) and their degradation are reviewed here. The experiments were done in laboratory conditions (controlled moisture and temperature) or in homes or working environment. The experiments revealed that the stability of allergens is longer than one year in the condition of human houses and working environment. There were observed differences in stability between Bla g 1 and Bla g 2. Bla g 1 is much more stable than Bla g 2. The microbial community in the feces is suggested as responsible for allergen degradation; however there are no available data describing the decomposers community and the changes during feces exposition. The changes of allergen reactivity to human sera after exposure have not been documented yet. Due to the high stability of feces associated allergens, the recommendation for sensitive parties is to do sanitation after pest elimination in their houses. Key words: allergen, mite, cockroach, Der f 1, Der p 2, Der p 2, Bla g 1, Bla g 2
Úvod Někteří členovci žijící v prostředí člověka produkují alergeny. Mezi významné producenty alergenů patří prachoví roztoči (např. Dermatophagoides pteronyssinus a D. fariane), skladištní roztoči (např. Lepidoglyphus destuctor a Tyrophagus putrescentiae) a švábi (Blattella germanica a Periplaneta americana) (1,2). Tito členovci obývají jednak domácnosti, případně pracovní
266
prostředí člověka, a někdy napadají skladované potraviny. Vzhledem k produkci alergenů nejsou tyto spolubydlící člověka vítaní hosté a je snaha výskyt těchto členovců kontrolovat, případně eliminovat napadení domácností a pracovního prostředí. V současné době existují metody chemické ochrany, které eliminují výskyt těchto členovců (3). Přesto existují případy, že po deratizačním zákroku, tj. většinou aplikaci chemických látek eliminující tyto
Alergie 4/2012
přehledné články členovce, nedošlo k zlepšení zdravotního stavu pacientů. Tuto situaci můžeme vysvětlovat dvojím způsobem: (i) deratizační zákrok nebyl účinný, nebo (ii) deratizační zásah eliminoval producenty alergenů, nedochází tak k další akumulaci alergenů, avšak alergeny v prostředí přetrvávají dále. Vzhledem k biologii skladištních škůdců se stává, že se v některých případech deratizační zásahy minou účinkem, což může způsobit snížení citlivosti členovců na použitý pesticid (rezistence), nebo nebyla pesticidy ošetřena všechna místa a zůstávají neošetřená ohniska, ze kterých probíhá zpětná kolonizace. Přetrvávání alergenů v prostředí souvisí s jejich stabilitou a sanitací, alergeny mohou být eliminovány úklidovými pracemi (4). Vzhledem k charakteru prostředí člověka mohou existovat místa, která nejsou adekvátně uklizena a kde alergeny zůstávají. V těchto případech záleží na jejich odolnosti vůči fyzikálním faktorům prostředí a účinku mikroorganismů, jejichž vlivem probíhá rozklad alergenů. V tomto přehledu se zaměříme právě na stabilitu alergenů a vliv abiotických podmínek na jejich rozklad. Několik experimentů prokázalo, že alergeny členovců jsou v prostředí člověka vysoce stabilní a mohou tak ohrožovat citlivé jedince i po eliminaci jejich producentů.
Přehled alergenů, pro které se stanovovala degradace Alergeny mohou být proteiny, které vzhledem ke své biochemické funkci jsou vázány na haemocel, svaly nebo trávicí trakt členovců. Alergeny asociované s trávicím traktem mají nejčastější funkci jako trávicí enzymy, tj. jsou produkované buňkami mesodea a pronikají do přijaté potravy, kde začínají trávicí procesy, na kterých participují. Mimo trávicí enzymy jsou s trávicím traktem asociované i jiné alergeny, např. skupina NPC2 proteinů (např. Der p 2, Der f 2), dále alergen švábů Bla g 1, které byly také prokázány v exkrementech (1,2). Vzhledem k jejich funkci jsou produkovány kontinuálně během života členovců, na rozdíl od alergenů, které jsou vázané na haemocel, nebo svaly členovců (např. paramyozin a tropomyozin). Po defekaci se tyto alergeny vyskytují nezávisle na jejich producentech, tj. členovci, kteří tyto alergeny produkovali a již nemusí být v prostředí člověka
přítomni, nebo detekováni, avšak jejich exkrementy s alergeny zůstávají. Provedené degradační studie vycházely právě z tohoto předpokladu, že rozdílná dynamika alergenů se projeví nejvíce u těch, které jsou vázané na trávicí trakt, a proto se vyskytují v exkrementech. Exkrementy jsou také považovány za hlavní zdroj alergenů a provedené degradační experimenty byly zaměřeny na tuto skupinu alergenů, tj. dosud byly studovány Der f 1, Der p 2, Der p 2, Bla g 1 a Bla g 2 (tabulka 1). Mimo tyto experimenty byla sledována závislost vnitřní rychlosti růstu populace roztoče Lepidoglyphus destructor a produkce alergenu Lep d 2 v obilí (5). Další experimenty sledovaly změnu enzymové aktivity v exkrementech Blattella germanica, ačkoliv žádný ze sledovaných enzymů nebyl dosud prokázán jako alergen. Byly sledovány aktivity proteáz, α-amyláz a celulázy pomocí chromogenních substrátů (6).
Metodické přístupy k degradaci alergenů Z medicinálního pohledu je degradace alergenů proces, kdy dochází ke změnám epitopů, takže tyto pozměněné molekuly již dále nemohou vázat IgE protilátky (7). Vzhledem k tomu lze pro sledování degradace aplikovat imunochemické metody, které využívají specifických protilátek proti alergenům. Problémem těchto analýz je, že monoklonální protilátky v ELISA testech se váží na jeden epitop. Dosud nebyla sledována reaktivita alergenů po delší expozici v prostředí s lidským IgE. Tato situace může být odlišná, než je vazba alergen – monoklonální protilátka. Dalším aspektem je možná role proteáz v alergické reakci, degradace aktivního místa enzymu může být jiná než degradace epitopů. Dosud také nebylo vyřešeno, zda degradace nevede k odhalování skrytých epitopů a tím k nárůstu reaktivity alergenu. Vzhledem k designu sledujícímu rozklad alergenů, experimenty zahrnují iniciální stadium, toto stadium představuje prach, který obsahuje alergeny. Následně jsou vzorky tohoto prachu exponovány. Alternativní přístup zahrnuje sběr exkrementů nebo frakce, které obsahují exkrementy, a ty jsou použity jako iniciální zdroj alergenů. V obou případech dochází ke zkreslení, ve vzorcích prachu mohou obsahovat již částečně degradované
Tab. 1: Přehled alergenů a design pokusů sledujících degradaci alergenů v prostředí člověka. Alergen
Původce
Zdroj
Podmínky
Sledovaný parametr
Autoři
Def 1
D. farinae
prach z matrací
dům, sklad, skleník
poločas rozpadu
Sidenius et al. (10)
Der p 1
D. farinae
prach koberce, matrace,
kontrolovaná teplota a vlhkost (5, 25 oC, 75% r.h.)
úbytek
Kort et al. (8)
Der p 1 Der p 2
D. pteronyssinus
prach z rohože
regrese
de-Boer et al. (7)
Bla g 1 Bla g 2
Blattella germanica
exkrementy
poločas rozpadu
Erban et al. (9)
Alergie 4/2012
elimnace roztočů maražením nebo lindanem, 15, 20, 25 oC, 33, 55, 75 % r.h. kontrolovaná teplota a vlhkost (15, 20, 25, 30, 35 oC, 53, 75, 85. 100% r.h.)
267
přehledné články alergeny. Nevýhodou použití exkrementů po defekaci je možné ovlivnění společenstva mikroorganizmů, které se na degradaci podílí. Měření enzymové aktivity v extraktech provedených z homogenátů exkrementů je limitováno metodicky. Toto měření selektivně neodlišuje mezi původem enzymů stejné biochemické funkce. Nelze odlišit, zda daná měřená aktivita je nepřímým odhadem koncentrace enzymu-alergenu, nebo zda tento enzym produkují mikroorganizmy.
Kontrolované podmínky byly testovány pro rozklad alergenu Der p 1 a Der p 2, kde se nepodařilo prokázat statisticky signifikantní vliv teploty, ve které byly alergeny exponovány, což bylo 5 a 25 °C, nebo 5, 15, 25 °C (7,8). Stejné výsledky ukázal i rozklad alergenu Bla g 1 v exkrementech švábů, kde po 9 měsících nedošlo k signifikantní změněně v koncentraci alergenu při teplotách v rozsahu 15 až 30 °C (9). Signifikantní pokles koncentrace Bla g 1 byl pozorován při jeho expozici v 35 °C (obrázek 1). Jiná situace byla v případě expozice alergenu Bla g 2, zde expozice nízké a vysoké konstantní teplotě, tj. 15, 30 a 35 °C způsobila po 9 měsících výrazný pokles koncentrace alergenu v exkrementech pod 10 % původní hodnoty. Expozice při teplotě 20 a 25 °C způsobila pokles na cca 40 a 60 % původní hodnoty (obrázek 2). Stejně jako vliv teploty, vliv vlhkosti byl rozdílný pro testované alergeny Bla g 1 a Bla g 2. Bla g 1 po 9 měsících expozice při vlhkostech 75 a 85 % (relativní vzdušná vlhkost) zůstal neovlivněn expozicí. K poklesu koncentrace tohoto alergenu došlo při expozici při 100% vlhkosti v exikátoru s destilovanou vodou, kde došlo k snížení na 10 % původní koncentrace a mírný pokles koncentrace byl i v prostředí při 53% vlhkosti, kde došlo k poklesu na
A
75 50 25 0 100
Degradace %
Degradace alergenů v kontrolovaných podmínkách (teplota, vlhkost)
100
B
75 50 25 0 100
C 75 50 25 0 kon- kontrolovaná kontrolovaná prostĜedí tro- teplota (°C) vlhkost (%) þlovČka la 15 20 25 30 35 A A WE 53 75 85 100
Obr. 2: Vliv expozice exkrementů po dobu 9 měsíců v různých kontrolovaných podmínkách na koncentraci alergenů rusa domácího (Blattella germanica) A − celkové proteiny B – Bla g 1 C – Bla g 2 Legenda: A – byt, WE – pracovní prostředí (pekárna).
85 % původní koncentrace. V případě Bla g 2 expozice exkrementů ve 100 % vzdušné vlhkosti vedla k totálnímu odbourání tohoto alergenu. Zatímco při expozici v ostatních kontrolovaných vlhkostech poklesla koncentrace alergenu na 45−60 % původní koncentrace (obrázek 1). Výsledky těchto experimentů ukazují, že při teplotách a vlhkostech typických v prostředí člověka jsou sledované alergeny více stálé než při „extrémních“ hodnotách vlhkosti a teploty (8,9).
Degradace alergenů v bytech a pracovním prostředí člověka
Obr. 1: Laboratorní kolonie rusa domácího
268
V domácnostech bylo zjištěno, že průměrná teplota (± směrodatná odchylka) je 20 ± 1,6 ºC, s minimem 16 °C, mediánem 20 °C a maximem 28 °C. Relativní vzdušná vlhkost dosahuje průměrné hodnoty 48 ± 9 %, minimum 26 %; medián 47 %; maximum 73 % (9). Tyto abiotické podmínky odpovídají situacím, kdy jsou alergeny členovců značně stabilní. Tomu odpovídají i měření stability alergenů roztočů, tj. po 47 měsících expozice v bytech, Der p 1 nevykazoval signifikantní
Alergie 4/2012
přehledné články
A
B
C
D
Obr. 3: Exkrementy rusa domácího (Blattella germanica) v různých fázích degradace zobrazené pomocí skenovacího mikroskopu. A – stav exkrementu těsně po defekaci, BC − exkrement degradovaný 168 dní při 15 °C, B − membrána exkrementu je porušena a exkrement je porostlý mikroskopickými houbami, šipky ukazují konidiofory, C – membrána exkrementu částečně porušena šipky, označují echinulátní konidie, D – exkrement degradovaný 168 dní při expozici v 30 °C, membrána exkrementu je porušena a šipky ukazují rostoucí konidie. Měřítka: A, D −100 μm; B, C − 10 μm.
úbytek (8). Sidenius et al. (10) odhadla poločas rozkladu alergenu Der f 1 v domácnostech – matracích na 10 let. Rozklad alergenů Blattella germanica po 9 měsících expozice ve dvou bytech a pekárně byl rozdílný v závislosti na typu alergenu, tj. Bla g 1 se nerozkládal (obrázek 1), zatímco Bla g 2 ubýval na 50–60 % původní koncentrace. Celková koncentrace proteinů klesala méně než koncentrace tohoto alergenu. Vliv mikroorganismů, které rostou v exkrementech, ukazují změny enzymatické aktivity v degradovaných exkrementech Blattella germanica po 9 měsících expozice v různých podmínkách. U většiny enzymů, které byly sledovány, došlo k poklesu aktivity, avšak nárůst proteolytické aktivity byl pozorován na substrátech SA3pNA a AAPpNA, tyto substráty identifikují enzymovou aktivitu podobnou chymotripsinu, elastáze. Přibližně dvojnásobný nárůst těchto aktiv byl zjištěn při expozici exkrementů ve vlhkosti 100 % (6).
Možné faktory ovlivňující degradaci alergenů Rozklad alergenů je degradace, hydrolýza proteinů, což je fyzikálně chemický proces, kterého se účastní mikroorganizmy a jejich trávicí enzymy (7). Exkrementy členovců obsahují celou řadu mikroorganizmů, které prochází jejich střevy a jsou metabolicky aktivní, dále
Alergie 4/2012
existuje celá řada koprofágních mikroorganizmů napadajících exkrementy po defekaci. Mikroorganizmy podílející se na degradaci exkrementů skladištních členovců nebyly dosud studovány ve vztahu k charakterizaci druhového spektra a jeho změn v průběhu degradací alergenů. Pomocí skenovacího mikroskopu byla provedena vizualizace mikroorganizmů na exkrementech rusa domácího (Blattella germanica) během expozice (viz obrázek 2). Tyto exkrementy byly porostlé mikroskopickými houbami, jejich aktivita poškozovala peritrofickou membránu na povrchu exkrementu (11). Lze předpokládat, že tyto houby produkují i řadu exo-enzymů, jež mohou degradovat alergeny.
Závěr 1) Alergeny členovců, které jsou obsaženy v jejich exkrementech, tj. např. Der f 1, Der p 2, Der p 2, Bla g 1 a Bla g 2. jsou v prostředí člověka vysoce stabilní. 2) Degradaci alergenů ovlivňují fyzikální podmínky a společenstva dekompozitorů, což jsou mikroskopické houby nebo bakterie. 3) Dosud chybí údaje o změnách reaktivity těchto alergenů v průběhu jejich degradace. 4) Vzhledem k vysoké stabilitě alergenů lze doporučit součinnost deratizačního a sanitačního zásahu, pro eliminaci alergenů u senzitivních pacientů.
269
přehledné články LITERATURA 1. Malkusová I, Panzner P, Gutová V, Hanzlíková J, Haschová M. Švábi − opomíjení původci alergií a astmatu. Alergie 2001, 3:186-190. 2. Kudlíková I, Klaudyová A, Hubert J, Přehled jednotlivých tříd alergenů u prachových a skladištních roztočů (Acari: Acaridida). Alergie 2005; 4: 281-290. 3. Hubert J, Stejskal V, Plachý J. Zhodnocení účinnosti 26 akaricidních biocidů na eliminaci prachového roztoče Dermatophagoides pteronyssinus. Alergie 2011; 2:114-127. 4. Gore JC, Schal C. Cockroach allergen biology and mitigation in the indoor environment. Annu Rev Entomol. 2007;52: 439-63. 5. Danielsen C, Hansen LS, Nachman G, Herling C. The influence of temperature and relative humidity on the development of Lepidoglyphus destructor (Acari: Glycyphagidae) and its production of allergens: a laboratory experiment. Exp Appl Acarol. 2004;32(3):151-170. 6. Erban T, Hubert J. Longterm persistence of proteolytic activities in frass of Blattella germanica increases its allergenic potential. Med Vet Entomol. 2011; 25(2):209-16. 7. de Boer R, van der Hoeven WA, Stapel SO. The decay of house dust mite allergens, Der p I and Der p II, under natural conditions. Clin Exp Allergy. 1995; 25(8):765-770. 8. Kort HS, Kniest FM. Four-year stability of Der p I in house dust under simulated domestic conditions in vitro. Allergy. 1994; 49(2):131-133.
270
9. Erban T, Stejskal V, Aulicky R, Krizkova-Kudlikova I, Nesvorna M, Hubert J. The influence of environmental temperature and humidity on temporal decomposition of cockroach allergens Bla g 1 and Bla g 2 in feces. J Med Entomol. 2010; 47(6):1062-1070. 10. Sidenius KE, Hallas TE, Stenderup J, Poulsen LK, Mosbech H Decay of house-dust mite allergen Der f 1 at indoor climatic conditions. Ann Allergy Asthma Immunol. 2002; 89(1):34-37. 11. Krizkova-Kudlikova I, Hubert J, Erban T, Klaudyova A, Aulicky R, Stejskal V. Degradation of cockroach allergen Bla g 2: Does the amount of the allergen increase after partial microbial degradation of faeces? In: Proceedings of the „9th International Working Conference on Stored Product Protection“, 15-18 October 2006, Sao Paulo, Brazil. Brazil, Campinas, Brazilian Post-harvest Association - ABRAPOS, 2006:1108-1113.
MUDr. Radek Klubal Medicínské centrum Praha Mezi Vodami 205 143 00 Praha 4 e-mail:
[email protected]
Alergie 4/2012
