FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2008 - 2009
De pathofysiologische impact van autoantilichamen bij LTβR knock-out muizen: bepaling van proteïnurie en andere orgaanschade.
Sigurd Delanghe
Promotor: Prof. Dr. Dirk Elewaut Begeleider: Dr. Jens Van Praet
Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2008 - 2009
De pathofysiologische impact van autoantilichamen bij LTβR knock-out muizen: bepaling van proteïnurie en andere orgaanschade.
Sigurd Delanghe
Promotor: Prof. Dr. Dirk Elewaut Begeleider: Dr. Jens Van Praet
Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
Voorwoord Eerst en vooral zou ik graag mijn promotor Prof. Dr. D. Elewaut willen bedanken om mij de kans te gunnen deel te nemen aan wetenschappelijk onderzoek. Het is een unieke en ook zeer leerrijke ervaring geweest die mij heel het proces van wetenschappelijk onderzoek al doende heeft geleerd. Door het harde werk was de voldoening op het einde trouwens veel groter. Ik ben mijn begeleider, Dr. Jens Van Praet, zeer erkentelijk omdat hij altijd klaar stond om mij bij te staan met advies en voor zijn hulp bij de soms ingewikkelde statistiek. Ik ben hem zeer dankbaar voor het zorgvuldig nalezen van al mijn teksten alsook voor zijn dubbel werk door bepaalde memory stick problemen. Onder de deskundige leiding van de laboranten van de dienst reumatologie mocht ik kennis maken met verschillende technieken zoals flow cytometry, RT-PCR, kleuren van coupes, isolatie van cellen… waarvoor ik ook hen graag zou bedanken. Ook de dierenverzorgsters die mijn dagen in het animalarium iets aangenamer maakten ben ik erkentelijk. Tevens zou ik graag Mevrouw Elke Lecoq (P8) bedanken voor haar hulp bij de urinaire eiwitelektroforese. Inge Vanassche, die ik altijd mocht storen voor vragen over “haar” antilichamen en die met mij de twee jaar durende rit op het MRB heeft uitgezeten, ben ik dankbaar voor de fijne momenten.
Mijn vriendin Evelien zou ik graag bedanken voor haar geduld als ik weer een avond moest afblazen wegens thesisverplichtingen en om mijn geklaag te aanhoren over muizen die weigerden te plassen.
Inhoudstafel Verklarende woordenlijst 1 2
Abstract ........................................................................................................................1 Inleiding .......................................................................................................................3 2.1 Lymfotoxines ......................................................................................................3 2.1.1 Functie van LTα1β2: rader in de regulatie van centrale tolerantie .........................5 2.1.2 Perifere effecten van de LTβ-receptor..................................................................7 2.2 Lupus ..................................................................................................................7 2.2.1 Lupus nefritis ......................................................................................................9 2.2.2 Hematologische veranderingen bij lupus ........................................................... 10 2.2.2.1 Anemie ...................................................................................................... 11 2.2.2.2 Thrombocytopenie ..................................................................................... 12 2.2.2.3 Leukopenie ................................................................................................ 13 2.3 Auto-immuun hepatitis ...................................................................................... 13 2.4 Bespreking van de verschillende muizenmodellen gebruikt in de studie ............ 15 2.4.1 C57BL/6 ........................................................................................................... 15 2.4.2 MRL ................................................................................................................. 16 2.4.3 MRL/Lpr ........................................................................................................... 16 2.4.4 Mechanisme van auto-immuniteit bij pristane-induced lupus ............................. 16 2.5 Doelstellingen van deze thesis ........................................................................... 17 3 Methodologie .............................................................................................................. 18 3.1 Muizen .............................................................................................................. 18 3.1.1 Pristane induced lupus en PBS-controle............................................................. 18 3.2 Urine analyse. ...................................................................................................18 3.2.1 Urineafname...................................................................................................... 18 3.2.2 Verwerking ....................................................................................................... 18 3.2.3 Bepaling van de proteïnurie ............................................................................... 19 3.2.4 Bepaling van het urinaire creatininegehalte ....................................................... 20 3.3 Urinaire elektroforese ........................................................................................ 20 3.4 Perifeer Bloed onderzoek .................................................................................. 21 3.5 Aspartaat amino transferase/ Alanine amino transferase .................................... 22 3.5.1 Activiteitsbepaling van alanine aminotransferase (ALT).................................... 23 3.5.2 Activiteitsbepaling van aspartaat amino transferase (AST) ................................ 23 3.6 Dataverwerking en statistiek .............................................................................. 23 4 Resultaten ................................................................................................................... 25 4.1 Perifeer Bloed Onderzoek ................................................................................. 25 4.1.1 Hemoglobine .....................................................................................................25 4.1.2 Leukocyten ....................................................................................................... 26 4.1.3 Thrombocyten ...................................................................................................26 4.2 AST/ALT .......................................................................................................... 27 4.3 Proteïnurie......................................................................................................... 29 4.3.1 Urinaire elektroforese ........................................................................................ 29 4.3.2 Vergelijking van proteïnurie tussen C57BL/6 muizen en LTΒR -/- muizen. ........ 31 4.3.2.1 Analyse op de leeftijd van 3 maanden ........................................................ 31 4.3.2.2 Analyse op de leeftijd van 6 maanden ........................................................ 33 4.3.3 Vergelijking van proteïnurie tussen MRL muizen en MRL/Lpr muizen. ............ 34 4.3.3.1 Vergelijking tussen de vrouwelijke muizen ................................................ 34 4.3.3.2 Vergelijking tussen de mannelijke muizen ................................................. 36
4.3.4 Vergelijking van proteïnurie tussen C57BL/6-pristane en C57BL/6-PBS muizen. 37 4.3.4.1 Vergelijking tussen de vrouwelijke muizen. ............................................... 37 4.3.4.2 Vergelijking tussen de mannelijke muizen ................................................. 39 5 Discussie ..................................................................................................................... 42 5.1 Perifeer Bloedonderzoek ................................................................................... 42 5.2 AST- en ALT activiteit ...................................................................................... 43 5.3 Proteïnurie......................................................................................................... 44 5.3.1 MRL en MRL/Lpr ............................................................................................. 44 5.3.2 C57BL/6-PBS en C57BL/6-pristane ..................................................................45 5.3.3 LTBR -/- en C57BL/6 ....................................................................................... 45 6 Referenties.................................................................................................................. 48
Verklarende woordenlijst Ǻ
= Ǻngstrom
AAA
= Anti -actine antilichaam
ACD
= Anemia of chronic disease
AIH
= Auto-immuun hepatitis
AIRE
= Auto-immune regulator
ALC
= Anti-liver cytosol
ALKM
= Anti-liver/ kidney microsome
ALT
= Alanine aminotransferase
ANA
= Anti-nucelaire antilichamen
AST
= Aspartaat aminotransferase
C3
= Complementfactor 3
CRP
= C-reactief proteïne
dsDNA
= Dubbelstrengig DNA
EPO
= Erythropoïetine
Fl
= Femtoliter (10-15 l)
Hb
= Hemoglobine
HLA
= Human leukocyte antigen
HVEM
= Herpes Virus Entry mediator
IFNα
= Interferon alpha
IL-6
= Interleukine 6
IL-12
= Interleukine 12
ITP
= Immune thrombocytopenische purpura
kDa
= kiloDalton
LDH
= Lactaatdehydrogenase
LIGHT
= LT-related inducible ligand that competes for glycoprotein D binding tot herpesvirus entry mediator on T-cells
LN
= Lupus nefritis
LT
= Lymfotoxine
LTBR -/-
= LTβ-receptor deficiënte muizen
MCV
= Mean Cellular Volume
MDH
= Malaatdehydrogenase
MHC
= Majeur histocompatibiliteitscomplex
NF-κB
= Nuclear factor – kappa B
NK
= Natural killer cel
NKT
= Natural killer T cel
RBC
= Rode bloedcel
SLE
= Systemische lupus erythematosus
SMA
= Anti-Smooth Muscle antilichaam
TCR
= T-cel receptor
TNF
= Tumor necrosis factor
TNFR1
= Tumor necrosis factor receptor 1
TNFR2
= Tumor necrosis factor receptor 2
1 Abstract De LTβ-receptor (LTβR) is, net als zijn liganden, een lid van de TNF superfamilie en kan een interactie aangaan met LIGHT en lymfotoxine α1β2 (LT α1β2). Lymfotoxine α1β2, een membraan gebonden associatie van LTα en LTβ, is voornamelijk gelokaliseerd op lymfocyten en NK cellen terwijl LTβR eerder op stromale en myeloïde cellen is gelegen. Hierdoor kan de lymfotoxinepathway worden gezien als een deel van een complex communicatiesysteem tussen lymfocyten enerzijds en parenchymale en stromale cellen anderzijds. Het is gekend dat LTα1β2 een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van lymfeknopen en de marginale zone van de milt. De laatste jaren is meer en meer duidelijk geworden dat lymfotoxine α1β2 een grote rol speelt bij de immunoregulatie en dit vooral door regulatie van negatieve selectie in de thymus.
Doelstelling: In deze thesis wordt getracht na te gaan welke fenotypische veranderingen de afwezigheid van de LTβ-receptor tot gevolg heeft op nefrologisch (proteïnurie), hematologisch en hepatologisch vlak. De bevindingen worden vergeleken met ziektemanifestaties van systemische lupus erythematosus (SLE) om te kijken of LTβR -/- muizen zouden kunnen fungeren als lupusmodel. Om onze methode van proteïnuriebepaling (ratio proteïne/creatinine op verdunde urine) te valideren, zullen onze geanalyseerde gegevens worden vergeleken met de literatuurgegevens omtrent de urinaire proteïne-excretie van de MRL/Lpr stam. Tenslotte wordt er ook onderzocht of een pristane-injectie bij C57BL/6 muizen aanleiding geeft tot nierschade.
Methodologie: Van LTβR -/- muizen werden hematologische parameters, leverenzymes en proteïnurie bepaald en vergeleken met C57BL/6 controlemuizen. Proteïnurie werd bepaald op een Cobas 6000 analyser en uitgedrukt door middel van urinaire proteïne/creatinine ratio. Bij de LTβR -/- muizen werd tevens een urinaire elektroforese uitgevoerd om de lokalisatie van de nierschade te achterhalen.
1
De C57BL/6 muizen werden op de leeftijd van 8 weken intraperitoneaal geïnjecteerd met pristane en werden gecontroleerd op aanwezigheid van proteïnurie.
Resultaten: Op hematologisch gebied vonden we significante afwijkingen bij de LTβR -/- muizen t.o.v. de controlestam C57BL/6 en werd er, net als bij SLE, thrombopenie vastgesteld. De overige hematologische parameters bleken niet overeen te komen met lupuskenmerken. Op nefrologisch gebied stelden we bij beide geslachten een sterk verhoogde excretie van urinaire proteïnen vast. Met behulp van de urinaire eiwitelektroforese kon worden afgeleid dat er zowel in de glomerulus als in de niertubuli pathologische veranderingen aanwezig waren. Bij de LTβR -/- muizen vonden we tevens een significant toegenomen activiteit van de leverenzymen AST en ALT in vergelijking met de controlegroep. Samen met de aanwezigheid van anti-Smooth Muscle antilichamen vonden we dus argumenten voor de aanwezigheid van auto-immuun hepatitis. Onze gegevens toonden aan dat afwezigheid van de LTβ-receptor gepaard gaat met duidelijke pathologische veranderingen in het organisme nl. thrombopenie, proteïnurie en leverschade. Enkel de proteïnurie en thrombopenie kwamen overeen met lupuskarakteristieken wat erop wijst dat de LTβR -/- muizen geen ideaal model zouden zijn voor SLE. Onze proteïnurie resultaten voor de MRL/Lpr stam kwamen perfect overeen met deze beschreven in de literatuur. Dit duidt aan dat de ratiobepaling van proteïne/creatinine op verdunde urine een accurate methode is voor proteïnuriebepaling bij muizen. Tenslotte werd aangetoond dat er, ondanks de aanwezigheid van auto-antilichamen, bij pristane-geïnjecteerde C57BL/6 muizen geen sprake was van nefrologische schade.
2
2 Inleiding Auto-immuniteit speelt een belangrijke rol in verschillende pathologieën. De laatste jaren wordt er meer en meer onderzoek verricht naar de manieren waarop het immuunsysteem erin slaagt vreemde organismen af te weren en lichaamseigen weefsels te negeren. Hieruit bleek dat o.a. lymfotoxines (LT) essentieel zijn voor deze regulatie.
2.1 Lymfotoxines Het immuunsysteem is een complex netwerk bestaande uit verschillende celtypes met elk hun specifieke functie. Om communicatie tussen deze cellen onderling mogelijk te maken, zijn er bepaalde boodschappermoleculen nodig: de zogenaamde cyto- en chemokines. Eén van de belangrijkste signaalmolecules in heel het immunologisch systeem is Tumor Necrosis Factor (TNF). Tegelijkertijd met de ontdekking van deze signaalmolecule werd een andere cytokine ontdekt, namelijk lymfotoxine α (LTα). Wegens zijn gelijkenis met TNF werd deze dan ook oorspronkelijk TNFβ genoemd. Later bleek echter dat, hoewel deze twee moleculen op elkaar gelijken, ze in het immuunsysteem wel degelijk zeer verschillende functies hebben.
Momenteel bestaat de TNF superfamilie uit ongeveer 20 ligand-receptorsystemen waaronder TNF, LIGHT en de lymfotoxines. De TNF-familie wordt gekenmerkt door een grote overlap wat betreft receptoren en liganden (figuur 1) wat zich uit in een nauwe genetische verbondenheid. Zo zijn de genen die coderen voor LTβ, TNF en LTα allemaal gelokaliseerd in het majeur histocompatibiliteits complex (MHC) op chromosoom 6 terwijl de genen voor de
receptoren
TNFR1
en
LTβR
gelokaliseerd
zijn
op
chromosoom
12.
De
lymfotoxinecomponent van deze familie zal verder worden uitgediept voor wat betreft communicatie en functie. LTα wordt enkel gesecreteerd en heeft een homotrimere structuur (LTα 3). LTα kan binden op zowel TNF-receptor 1 (TNFR1), TNF-receptor 2 (TNFR2) als HVEM maar de rol van deze signaalmolecule is tot op heden niet helemaal opgehelderd. Overexpressie van LTα induceert lokale inflammatie alsook de vorming van verschillende ectopische lymfoïde structuren. Verhoogde concentraties van LTα worden gevonden bij de ziekte van Crohn, T-cell leukemie en transplant afstotingsreacties (Gommerman en Browning, 2003). Naast de eerste basiscomponent, LTα, is er echter ook een andere belangrijke bouwsteen aanwezig, namelijk lymfotoxine β (LTβ). LTβ is een type 2 transmembraan proteïne zonder 3
signaalpeptide en is daardoor verankerd aan het celoppervlak. LTβ op zichzelf heeft geen functie. LTβ en LTα kunnen onderling echter een binding aangaan waardoor er twee heterotrimeren kunnen worden gevormd. Men onderscheidt LTα1β2 en LTα2β1. LTα2β1 bindt zowel op TNFR1, TNFR2 als op de LTβ-receptor (LTβR). Dit heterotrimeer bevindt zich op 2 % van de T-cellen en de fysiologische rol ervan is niet bekend (Ware, 2005). LTα1β2 is een membraangebonden heterotrimeer en bindt enkel op LTβR. LTα1β2 komt tot expressie op geactiveerde B - en T-lymfocyten en op NK-cellen. De LTβ-receptor daarentegen is afwezig op lymfocyten en bevindt zich eerder op stromale cellen of cellen van de myeloïde lijn. Omwille van deze segregatie op basis van celtype wordt LTα 1β2 dan ook aanzien als een communicatiesysteem tussen parenchymale en stromale cellen (Elewaut en Ware, 2007). Door de binding van LTα1β2 op de LTβ-receptor kunnen twee aparte signaalcascades geactiveerd worden. De eerste pathway leidt tot activatie van NF-κB1 (nuclear factor – kappa B) en resulteert in de kortstondige transcriptie van inflammatoire genen zoals bepaalde adhesiemolecules en chemokines. De tweede pathway leidt tot activatie van NF-κB2 en tot een meer langdurige transcriptie (uren) van genen die belangrijk zijn voor de ontwikkeling en het in stand houden van de architectuur van lymfoïde organen.
Figuur 1: Liganden en receptoren van het TNF/lymfotoxinesysteem. De interacties worden getoond door middel van pijlen. DcR3=Decoy receptor 3, BTLA=B and T lymphocyte attenuator (Ware, 2008).
4
Naast LTα1β2 kan ook LIGHT (LT-related inducible ligand that competes for glycoprotein D binding on herpesvirus entry mediator on T-cells) binden op de LTβ-receptor. Deze molecule komt tot expressie op T-cellen.
2.1.1 Functie van LTα1β2: rader in de regulatie van centrale tolerantie Het humaan immuunsysteem bestaat uit 2 componenten: het adaptieve immuunsysteem en het aangeboren immuunsysteem. Het adaptieve immuunsysteem heeft de mogelijkheid om zichzelf
aan
te
passen
aan
verschillende
pathogenen
en
werkt
o.a.
met
de
antilichaamproducerende B-lymfocyten en de T-lymfocyten die verantwoordelijk zijn voor de cellulaire immuniteit. De productie van de T-lymfocyten is complex en ontstaat in de centrale lymfoïde organen. Het belangrijkste orgaan voor de ontwikkeling van de T-lymfocyten is de thymus die bestaat uit twee duidelijk gecompartimenteerde delen: de cortex en de medulla. Deze worden elk afzonderlijk gekenmerkt door welbepaalde celtypes.
Vereenvoudigd kan men stellen dat er in het proces van T-celrijping twee grote delen bestaan: positieve selectie en negatieve selectie. De positieve selectie omvat een controle van de comptabiliteit tussen de T-cel receptor (TCR) en de eigen MHC-moleculen en vindt plaats in de cortex van de thymus. Slechts bij een geslaagde positieve selectie wordt aan de T-cel toegestaan om verder te differentiëren. Deze omvat een migratie van de thymocyt (de immature T-cel) naar de medulla van de thymus waar de negatieve selectie zal plaatsvinden. De negatieve selectie omvat de controle op binding tussen de TCR en eventuele autoantigenen. Men spreekt in deze context van de zogenaamde “Tissue restricted self-antigens”. Deze laatste worden tot expressie gebracht door de medullaire epitheelcellen van de thymus. Deze medullaire epitheelcellen bezitten de unieke mogelijkheid om antigenen tot expressie te brengen die normaal slechts op één orgaan aanwezig zijn.
De TCR op elke T-cel afzonderlijk wordt immers samengesteld op basis van een willekeurige genherschikking. Dit is nodig om de grote variatie aan pathogenen de baas te kunnen. Het gevaar in deze willekeurige herschikking schuilt erin dat de TCR zou kunnen binden met een auto-antigeen. Dit zijn antigenen die overal in het lichaam gesitueerd zijn en meestal eigen zijn aan bepaalde organen bijvoorbeeld lever, pancreas, speekselklier,... Indien er tegen deze auto-antigenen een specifiek T-cel repertoire zou ontwikkeld worden, kan dit aanleiding geven tot welbepaalde auto-immuunziekten. Indien de TCR bindt aan een auto-antigeen, gaat
5
de T-cel in apoptose. Juist in dit negatieve selectieproces speelt de LTβ-receptor een cruciale rol (Kyewski en Klein, 2006). Bij fenotypische beschrijvingen van LTβR -/- muizen bleken er verschillende kenmerken van auto-immuniteit aanwezig te zijn zoals lymfocytaire infiltraten in verschillende organen en auto-antilichaamproductie tegen lever, long, pancreas, speekselklieren en maag. De patronen van auto-antilichaamproductie hangen wel af van muis tot muis wat er op wijst dat er, in de afwezigheid van de LTβ-receptor, een verzameling ontstaat van autoreactieve lymfocyten die individueel verschillend is (Martins et al., 2008). Oorspronkelijk werd gedacht dat LTα1β2 verantwoordelijk was voor de expressie van de autoantigenen in de medullaire epitheelcellen door verhoogde expressie van de transcriptiefactor AIRE. Deze is in de medullaire epitheelcellen van de thymus verantwoordelijk voor de expressie van een groot deel (33%) van de weefselspecifieke antigenen (Chin et al., 2003). Aangezien er geen overlapping was tussen de transcriptieproducten van LTβR en van AIRE, werd deze hypothese verworpen (Martins et al., 2008) en (Boehm et al., 2003). Ook de piste van een LTβR-pathway afhankelijke expressie van weefselspecifieke antigenen onafhankelijk van AIRE (Chin et al., 2006) werd later ontkracht. Een mogelijke andere verklaring voor de auto-immuniteitsfenomenen bij LTβR-deficiënte muizen is de verstoring van de thymusarchitectuur. Bij LTβR-deficiënte muizen zag men ondermeer dat, bij de transcripten die verminderd waren ten opzichte van de controlemuizen, er heel wat waren die betrokken waren bij de epitheliale celpolarisatie, membraan compartimentalisatie en intercellulaire contactformatie zoals advilline, filagrin, Ncadherine,... Uit onderzoek van de LTβR-deficiënte thymi bleek dan ook het gehele medullaire epitheel structureel gewijzigd te zijn. Normaal is het medullaire thymusepitheel aaneengeschakeld in een complex driedimensioneel netwerk. Bij LTβR-deficiënte muizen verdwijnt deze driedimensionele structuur en klitten de medullaire thymusepitheelcellen bij elkaar (Martins et al., 2008). Tevens is ook het aantal medullaire epitheelcellen sterk verminderd bij LTβR-deficiënte muizen en werd er een verminderde export van mature thymocyten uit de thymus aangetoond (Boehm et al., 2003). Een hypothese is dus dat door de verstoorde architectuur ondermeer de interactie tussen de medullaire epitheelcellen en de thymocyten verstoord is waardoor de negatieve selectie minder efficiënt gebeurt. De LTβreceptor is ook betrokken bij de regulatie van de chemokines SLE en ELC die onder andere zorgen voor de thymocytenmigratie van de cortex naar de medulla. Deze secretie is volgens 6
sommigen betrokken bij de negatieve selectie in de thymus en zou een alternatief mechanisme kunnen zijn voor de regulatie van centrale tolerantie (Zhu et al., 2007).
2.1.2 Perifere effecten van de LTβ-receptor Een zeer belangrijke rol voor de LTβ-receptor is de betrokkenheid van deze signaalmolecule bij de bouw van de lymfoïde structuren zoals de milt en de lymfeknopen. Ook ectopische lymfoïde structuren (lymfoïde aggregaten op plaatsen van chronische inflammatie) hebben deze pathway nodig voor hun ontwikkeling. LTβR knock-out muizen bezitten dan ook geen lymfeknopen wat het hoge leukocytenaantal in hun bloed verklaart (Gommerman en Browning, 2003). De LTβ-receptor heeft een contradictorische rol in de centrale en de perifere immunologie. In de "periferie" werkt deze molecule immers pro-inflammatoir. Daardoor wordt ze dan ook als een belangrijk doelwit beschouwd in de strijd tegen auto-immuunziekten zoals o.a. reumatoïde artritis, multiple sclerose, diabetes type 1 en inflammatoire darmziekten. De werking van het LTBR-Ig fusie eiwit berust ondermeer op een verstoorde vorming van ectopische lymfoïde structuren alsook op de desintegratie van reticulaire stromale netwerken (Browning, 2008). Andere processen waarbij de LTβ-receptor betrokken is, zijn o.a de verdediging tegen bepaalde intracellulaire pathogenen onder meer tegen listeria en tuberculose en maturatie van NK en NKT cellen.
2.2 Lupus Systemische
lupus
erythematosus
(SLE)
is
een
multi-systeem,
auto-immune
bindweefselaandoening die wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van autoantilichamen. Deze aandoening is potentieel letaal en kan zich klinisch op verschillende manieren uiten. De prevalentie van SLE is wisselend: zo bedraagt in Noord-Europa de gemiddelde prevalentie 40/100.000 terwijl deze in de zwarte populatie kan oplopen tot meer dan 200 gevallen per 100.000 personen. De ziekte tast vooral vrouwen aan (vrouw:man ratio van 9:1) in hun late tienerjaren en in hun vroege veertiger jaren (D‟Cruz et al., 2007).
SLE heeft een belangrijke impact op de gemiddelde levensverwachting van de patiënten. Zo heeft een lupuspatiënt een mortaliteit die 3 tot 5 maal hoger ligt dan deze van de algemene
7
populatie. De belangrijkste doodsoorzaken zijn aantasting van de nieren, vasculitis en aandoeningen van cardiovasculaire aard. SLE kan zich op verschillende wijzen manifesteren. Zo wordt het bewegingsstelsel vaak aangetast door artritis, osteonecrose, serositis en myositis. Ook op hematologisch gebied heeft de ziekte belangrijke gevolgen. Een van de meest ernstige gevolgen van SLE is de nieraantasting die zeer gevarieerd kan zijn en één van de belangrijkste doodsoorzaken is (Rahman en Isenberg, 2008).
De diagnose van deze aandoening is, door de verschillende klinische uitingen, dan ook niet altijd zo eenvoudig. De diagnose is gebaseerd op 11 criteria waarvan tenminste 4 aanwezig moeten zijn voor men een patiënt kan diagnosticeren met SLE (Hochberg, 1997).
De pathogenese van SLE is nog niet volledig opgehelderd. De oorzakelijke theorieën heden ten dage omvatten zowel genetische, immunologische als externe factoren. De factoren gelinkt aan de pathogenese zijn dan ook zeer gevarieerd: zonlicht, farmaca, EBV-infectie, apoptose
abnormaliteiten,
abnormale
signaaltransductie
(toll-like
receptoren),
complementdeficiënties, gewijzigde interferonproductie, genmutaties van ondermeer CRP, amyloid P en van Fc-receptors en ook verscheidene omgevingsinvloeden (silica, pesticiden,..) (D‟Cruz et al., 2007). Bepaalde MHC-types (HLA-A1, -DR-3 en -B8) hebben een grotere kans op de ontwikkeling van SLE.
Net als het ontstaan van lupus bestaat er voor het ontstaan van de auto-antilichamen, die zo kenmerkend zijn voor lupus, nog geen eenduidig antwoord. Het is aangetoond dat personen met SLE een stoornis hebben in het verwerken van apoptotisch materiaal waardoor er een overmaat aan auto-antigenen in de bloedbaan terecht zou komen. Dit zou leiden tot overvloedige stimulatie van het immuunsysteem wat op zijn beurt dan weer kan leiden tot de productie van auto-antilichamen. De voornaamste oorzaak van de lichamelijke schade die SLE aanricht zijn de pathogene autoantilichamen met de daarbijhorende immuunreacties. De meest prevalente auto-antilichamen die men vindt bij SLE patiënten zijn anti-dsDNA antilichamen. Deze zijn zeer specifiek voor lupus (aanwezig bij 70% van de SLE patiënten) terwijl ze amper voorkomen in de normale populatie (0,5%). Naast de anti-dsDNA antilichamen zijn er echter ook verschillende andere auto-antilichamen aanwezig, zowel tegen nucleaire (anti-Ro/SSA, Anti-La/SSB, anti-Sm,…) als niet-nucleaire componenten (anti-C1q,...). 8
2.2.1 Lupus nefritis Lupus nefritis (LN) is één van de meest ernstige complicaties van SLE en gaat dan ook vaak gepaard met een slechte prognose. Om de diagnose van LN te kunnen stellen, moet er een persisterende proteïnurie aanwezig zijn groter dan 0.5 g per dag of de aanwezigheid van cellulaire cilinders (Balow, 2005). Bij aanvang van SLE heeft 30-50% van de patiënten LN; tot 60% van de patiënten ontwikkelen lupus nefritis in het ziekteverloop. De klinische presentatie kan variëren van subklinische lupus nefritis tot snel progressieve "cresentic glomerulonephritis". Proteïnurie wordt gezien in bijna alle patiënten met LN ( 4560% van de patiëntenpopulatie met LN ontwikkelt een nefrotisch syndroom). Microscopische hematurie is aanwezig bij 80% van de LN patiënten. Lupus nefritis heeft een ernstige impact op de nierfunctie met een daling van de nierfunctie bij 40-80% van de patiënten die bij 30% progressief is (Cameron, 1999). Aangezien lupus zowel de bloedvaten, de glomerulus als het tubulo-interstitium kan aantasten, kan lupus een zeer variabel spectrum van nierschade veroorzaken (Rajashekar et al., 2008).
De glomerulaire aantasting is het gevolg van een cascade van immuuncomplex depositie, complement activiteit en een inflammatoir antwoord. Momenteel worden de glomerulaire laesies op basis van een nierbiopsie ingedeeld in 6 categorieën: minimale mesangiale LN (I), mesangiale proliferatieve LN (II), focale lupus nefritis (III), diffuse segmentale (IV-a) of globale lupus nefritis (IV-b), membraneuze LN (V) en geavanceerde LN (VI). Tussen deze verschillende entiteiten kan er wel enige mate van overlap bestaan (Rajashekar et al., 2008). Naast de glomerulaire aantasting zijn er, zoals eerder aangehaald, ook andere vormen van renale
aantasting
bij
LN
zoals
tubulo-interstitiële
nefritis
en
vaataandoeningen.
Immuuncomplex gemedieerde tubulo-interstitiële nefritis wordt aangetroffen bij ongeveer 2/3 van de patiënten met glomerulaire aantasting en komt zelden geïsoleerd voor. Bij de renale vasculopathieën onderscheidt men vasculaire immuuncomplex deposities, necrotiserende thrombotische vasculitis en renale vasculitis.
Zoals eerder aangehaald is proteïnurie het belangrijkste kenmerk van lupus nefritis. Proteïnurie is een uiting van schade aan de glomerulaire capillairen en in mindere mate aan de tubuli. De hoeveelheid proteïnurie stijgt dan ook evenredig met de ernst van de renale aantasting. Onder normale omstandigheden laat het glomerulaire membraan geen eiwitten door met een moleculaire massa groter dan 68 kDa. Bij het voorkomen van glomerulaire 9
letsels is het optreden van proteïnurie dan ook een van de vroegste uitingen. Muizenserum heeft een eiwitspectrum dat erg goed lijkt op mensenserum (Brenneman en Rigby, 1968). Bij minimale letsels van het glomerulaire membraan treedt een selectieve proteïnurie op, waarbij voornamelijk albumine (68 kDa) en transferrine (80 kDa) in het glomerulair filtraat verschijnen. Bij het groter worden van deze letsels, wat ook resulteert in vergroting van de mean pore size van het glomerulaire membraan, wordt de selectiviteit van de proteïnurie geringer. Hierdoor neemt de proteïnurie toe en het urinair eiwitprofiel begint meer en meer op het serum eiwitprofiel te lijken.
Er zijn verschillende manieren om proteïnurie te bepalen. De gouden standaard is de 24-uurs collectie van urine. Deze kan bij knaagdieren om praktische redenen echter niet gebeuren. De urinaire proteïne/creatinine ratio wordt momenteel aanvaard als een eenvoudiger methode om de ernst van proteïnurie te bepalen. Deze numerieke verhouding is een accurate maat voor het aantal gram urinair eiwitverlies per dag. De urinaire creatinine-excretie betekent een constant “lek” van het stikstofmetabolisme. Creatinine wordt tegen een constant tempo gehydrolyseerd uit creatine en creatinefosfaat en via glomerulaire filtratie uit het lichaam verwijderd. Het is aangetoond dat de proteïne/creatinineverhouding goed bruikbaar is voor de bepaling van proteïnurie bij lupus nefritis (Leung et al., 2007).
LN wordt geïnitieerd door de glomerulaire depositie van immuuncomplexen. De renale antigenen waarop de antilichamen binden zijn deels gekend en omvatten o.a. α-actine, laminine en heparaansulfaat. Er dient opgemerkt te worden dat niet alle auto-antilichamen in SLE nefrotoxisch zijn. Tot op heden zijn auto-antilichamen met volgende specificiteit gelinkt aan LN: anti-dsDNA, anti-nucleosoom, anti-Ro/SSA, anti-Sm, anti-α-actine en anti-C1q (Rahman en Isenberg, 2008). De antilichamen zullen zorgen voor complement recrutering en activatie. De immuuncomplexen activeren ook direct de renale cellen tot productie van inflammatoire mediatoren. Deze zullen op hun beurt leiden tot de expressie van adhesiemoleculen met de aantrekking van leukocyten tot gevolg. Zowel B-cellen, T-cellen als dendritische cellen worden gerecruteerd naar de ontstoken nier.
2.2.2 Hematologische veranderingen bij lupus Het hematologische systeem wordt bij SLE ook getroffen. Deze uiting van SLE heeft een belangrijke impact en is dan ook opgenomen in de "revised criteria for SLE" van het American college of Rheumatology. Hematologische abnormaliteiten zijn relatief frequent in 10
patiënten met SLE. Zo ontwikkelen bijna alle SLE patiënten gedurende het verloop van hun aandoening een of andere hematologische manifestatie van de aandoening. Lymfopenie is de meest voorkomende hematologische uiting gevolgd door anemie (Giannouli et al., 2006). De aanwezigheid van actieve hematologische problemen is gerelateerd aan het voorkomen van nierziekten en aantasting van het centraal zenuwstelsel (Sultan et al., 2003).
2.2.2.1 Anemie De oorzaken van anemie bij SLE zijn zeer verscheiden. De meest voorkomende oorzaak van anemie bij SLE is de zogenaamde "anemia of chronic disease" (ACD). Naast ACD zijn ook ijzergebreksanemie,
auto-immuun
hemolytische
anemie,
anemie
door
chronische
nierinsufficiëntie en cyclophosphamide geïnduceerde myelotoxiciteit mogelijk. Er dient opgemerkt te worden dat er naast "anemia of chronic disease" tegelijkertijd ook andere pathofysiologische mechanismen kunnen zijn die anemie veroorzaken.
"Anemia of chronic disease" (ACD) is een milde tot middelmatige normocellulairehypochrome anemie en komt voor bij verschillende chronische aandoeningen waaronder ook SLE. De pathogenese van deze vorm van anemie staat nog niet vast maar waarschijnlijk spelen verschillende mechanismen een rol. Verschillende inflammatoire cytokines (IL-1, TNF-α, IFNα) leiden tot een verminderde EPO-secretie en een verminderd antwoord op EPO. Ook het ijzermetabolisme wordt beïnvloed. Bij lupus nefritis werd aangetoond dat CD4+ lymfocyten en macrofagen het renale interstitium infiltreren en door lokale loslating van cytokines de EPO-productie sterk verminderen. Ook anti-EPO antilichamen zouden een rol spelen bij de pathogenese van ACD bij SLE. Deze antilichamen zijn vaak gecorreleerd met ernstige gevallen van anemie en komen tevens meer voor bij patiënten met actieve SLE (Giannouli et al., 2006). Auto-immuun hemolytische anemie (AHA) is een immunologische oorzaak van anemie en komt voor bij 5 - 10% van de SLE patiënten. (Kokori et al., 2000). Deze vorm van anemie komt meer voor bij mannelijke SLE-patiënten en wordt herkend door de aanwezigheid van reticulocytose. AHA kan de enige manifestatie zijn van SLE maar kan de eigenlijke aandoening ook voorafgaan met enkele maanden tot zelfs jaren. AHA bij SLE-patiënten kan ook voorkomen in de context van het primaire antifosfolipidensyndroom. Twee derde van de SLE-patiënten heeft bij de aanvang van hun ziekte tevens hun eerste episode van hemolytische anemie. AHA is het resultaat van de binding van auto-antilichamen (zowel IgM als IgG) aan het oppervlak van erythrocyten. Door binding van deze antilichamen aan het 11
erythrocytenmembraan worden deze laatste het doelwit van fagocytose in het reticuloendotheliaal systeem. Deze vorm van anemie gaat over het algemeen gepaard met een gedaalde levensverwachting en met meer ernstige niet-hematologische ziektemanifestaties zoals aantasting van het centraal zenuwstelsel en van de nieren. De relatie tussen bepaalde auto-antilichamen en AHA staat nog niet helemaal vast. Zo zijn anti-dsDNA antilichamen in multivariante analyses niet geassocieerd met AHA, doch zijn ze meer frequent bij patiënten met matige tot ernstige AHA. De aanwezigheid van AHA is gelinkt aan andere manifestaties zoals thrombocytopenie, arteriële en veneuze tromboses en verhoogde activiteit van SLE. Ferriprieve anemie komt voor bij ongeveer 17% van de SLE-patiënten. Dit zijn echter alleen vrouwen van reproductieve leeftijd (Beyan et al., 2007). Auto-immuun anemieën zijn vaak ernstiger. Uit sommige case reports blijkt dat SLE zich ook kan manifesteren onder vorm van aplastische/hypoplastische anemie. Deze manifestatie is echter zeer zeldzaam bij SLE (Pavithran et al., 2002). Deze anemie is meestal normochroom en normocytisch waarbij hemolyse afwezig is. De diagnose wordt gesteld aan de hand van een sterk gereduceerd aantal RBC precursoren in het beenmerg (Keeling en Isenberg., 1993).
2.2.2.2 Thrombocytopenie Thrombocytopenie ten gevolge van de perifere immunologische destructie van plaatjes is frequent bij SLE-patiënten (7 - 30%) en in 15% van de pediatrische gevallen is het de eerste manifestatie van de ziekte. Ernstige thrombocytopenieën zijn echter zeldzamer (5%) (Sultan et al., 2003). Thrombocytopenie bij SLE patiënten kan zich manifesteren onder 3 grote vormen: een acute (vaak ernstige vorm), een chronische vorm (levert geen grote problemen) en de geïsoleerde vorm (kan soms tot 10 jaar voor de uiting van SLE gevonden worden). De hoofdoorzaak van thrombocytopenie bij SLE is te wijten aan anti-plaatjes antilichamen die eliminatie van de plaatjes in de milt induceren. Het voornaamste doelwit van deze antithrombocyten antilichamen is het IIb/IIIa antigen. Andere oorzaken van thrombocytopenie bij SLE
zijn
anti-fosfolipide
antilichamen,
thrombotische
microangiopathieën en
het
hemofagocytose syndroom. Al deze oorzaken worden gekenmerkt door een verhoogd aantal megakaryocyten in het beenmerg. Naast kwantitatieve afwijkingen werden er bij sommige patiënten ook kwalitatieve plaatjesafwijkingen gevonden zoals een verminderde aggregatie bij contact met collageen of een verminderde reactie op ADP of adrenaline (Keeling en Isenberg, 1993). SLE-patiënten met thrombocytopenie hebben een hogere incidentie van nieraantasting (Ziakas et al., 2005). 12
2.2.2.3 Leukopenie Leukopenie komt voor bij 18 - 50% van de patiënten met SLE gedurende het verloop van hun ziekte en is de meeste voorkomende hematologische stoornis bij SLE patiënten. De leukopenie kan te wijten zijn aan neutropenie, lymfopenie of een combinatie van beide. Neutropenie wordt aangetroffen bij 47% van de SLE-patiënten. Vaak is er een associatie met anti-cardiolipine antilichamen. Bij SLE-patiënten worden er soms antilichamen gevormd die specifiek gericht zijn tegen neutrofielen. Een andere mogelijke reden voor het optreden van neutropenie bij SLE patiënten is dat het serum van SLE-patiënten de neutrofielaggregatie zou bevorderen (Keeling en Isenberg, 1993). Lymfopenie heeft een prevalentie bij SLE-patiënten die varieert van 20% tot 80% en ongeveer 75% van de SLE-patiënten heeft lymfopenie op het moment van diagnose. De lymfopenie, waarbij zowel de B- als de T-cellen verminderd zijn, kan onafhankelijk optreden van de leukopenie. De pathogenese omvat o.a. lymfocytotoxische antilichamen en apoptose van lymfocyten. Circulerende lymfocytotoxische antilichamen zijn dan ook aangetoond bij 36 tot 90% van de SLE-patiënten. De titer van deze antilichamen correleert met lymfopenie. Deze antilichamen tegen lymfocyten zijn vooral "koude" reactieve IgM antilichamen en zouden vooral werken door opsonisatie en de promotie van fagocytose eerder dan direct cytotoxisch te zijn (Keeling en Isenberg, 1993).
2.3 Auto-immuun hepatitis Naar
aanleiding van de ontdekking van anti-Smooth Muscle antilichamen (SMA), die
gecorreleerd zijn aan het optreden van auto-immuun hepatitis, werden er bij dit onderzoek vergelijkingen uitgevoerd tussen C57BL/6 muizen en LTβR -/- muizen voor wat betreft AST/ALT-activiteiten in serum. Deze pathologie is slechts zelden geassocieerd met lupus.
Auto-immuun hepatitis (AIH) wordt algemeen gedefinieerd als een gegeneraliseerde chronische hepatitis van een onbekende oorzaak. De diagnose van AIH is gebaseerd op histologische abnormaliteiten, karakteristieke klinische en biochemische bevindingen en abnormale niveaus van serum globulines, onder meer auto-antilichamen. Om de diagnose te stellen, werd een scoresysteem ontwikkeld (Krawitt, 2006). Auto-immuun hepatitis komt meer voor bij vrouwen dan bij mannen (ratio 3:1) en komt wereldwijd bij zowel kinderen als volwassenen voor. In West-Europa wordt de prevalentie geschat tussen 50 en 200 gevallen /1.000.000 (Manns en Vogel, 2006).
13
De presentatie van deze aandoening is heterogeen en kan variëren van asymptomatisch tot fulminant leverfalen. Patiënten met ernstige of fulminante symptomen met icterus kunnen aminotransferase waarden hebben die zeer hoog kunnen oplopen. AIH wordt vaak vergezeld door andere auto-immuunaandoeningen zoals Hashimoto-thyroïditis, ulceratieve colitis, type 1 diabetes, reumatoïde artritis en coeliackie (Krawitt, 2006). AIH kan snel evolueren naar cirrose wat zich uit in een slechte prognose met 5- en 10 jaars-overleving van respectievelijk 50% en 10% (Manns en Vogel, 2006).
Auto-immuun hepatitis wordt momenteel ingedeeld in 2 groepen (AIH 1 en AIH2) op basis van de verschillende antilichamen die gevonden worden bij deze aandoening. Tot op heden is er weinig bewijs dat deze antilichamen mee betrokken zijn in de pathogenese van AIH. Type 1 AIH wordt het meest frequent gekarakteriseerd door anti-nucleaire antilichamen (ANA), anti- Smooth muscle antilichamen (SMA) en anti-actine antilichamen (AAA). De titers nodig voor de diagnose hangen af van het antilichaam en van de opsporingsmethode. Anti-SLA/LP is het meest specifieke antilichaam dat wordt gedetecteerd in type 1 AIH maar wordt slechts gevonden in 10-30% van de personen met AIH type 1. AIH type 2 wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van anti-liver/ kidney microsome-1 (ALKM-1) en anti-liver cytosol-1 (ALC-1) alleen of samen voorkomend. Vermits SMA geassocieerd worden met AIH type 1, zal vooral deze vorm besproken worden. (Krawitt, 2008). In AIH type 1 zijn ANA aanwezig bij 15% van de patiënten, geïsoleerde SMA zijn aanwezig bij 35% van de AIH type 1 patiënten en de gecombineerde aanwezigheid van ANA en SMA komt voor bij 60% van de AIH type 1 patiënten (Bogdanos et al., 2008). In het labo vallen de sterke stijgingen van de aminotransferase waarden op alsook de veralgemeende stijging van immunoglobulines (meer bepaald de IgG's) die 1,2 tot 3,0 zo hoog zijn als normaal. Bij de pediatrische vormen van AIH type 1 werd er ook een correlatie gevonden tussen de SMA titer en de AST waarden. SMA titers zouden dus samen met IgG gebruikt kunnen worden om de ziekte activiteit te bepalen. Bij volwassenen werd deze correlatie echter nog niet geobserveerd (Bogdanos et al., 2008). De pathogenese van AIH staat nog niet vast. Momenteel denkt men aan een samenspel tussen genetische en infectieuze factoren (vooral hepatitis virussen). Zo bleek uit genetische analyses van de HLA-componenten van AIH type 1 patiënten dat er een associatie bestaat van de aandoening met HLA-DR3 of HLA-DR4. Recente onderzoeken toonden aan dat defecten in de regulatoire T-cellen mee een rol zouden spelen in de pathogenese van AIH (Krawitt, 2006). 14
De histologische afwijkingen die gevonden worden bij auto-immuun hepatitis zijn dezelfde als deze bij chronische hepatitis. Alhoewel sommige veranderingen karakteristiek zijn voor AIH is geen enkele echt specifiek. AIH wordt gekarakteriseerd door een mononucleair cel infiltraat dat de eindplaat invadeert. Ook grote aantallen plasmacellen en eosinofielen worden aangetroffen. Fibrose, leidend tot distorsie van de hepatische lobulus, wordt gevonden bij alle patiënten met AIH, uitgezonderd bij de zeer milde vormen. Verdere ziekteprogressie kan leiden tot cirrose. De prevalentie van hepatocellulair carcinoom bij AIH patiënten is echter laag (Krawitt, 2006). De aanwezigheid van SMA op zichzelf is echter niet voldoende voor de diagnose (Manns en Vogel, 2006). De titers van de verschillende antilichamen wijzigen tijdens het verloop van de aandoening. SMA zijn gericht tegen componenten van het cytoskelet zoals actine, tubuline, vimentine, desmine en skeletin. Bij AIH werd er een welbepaalde specificiteit beschreven voor F-actine.
2.4 Bespreking van de verschillende muizenmodellen gebruikt in de studie 2.4.1 C57BL/6 C57BL/6 is de muizenstam waarop de LTβR knock-out mutatie werd uitgevoerd. Deze stam is de meest gebruikte inteeltstam en ontstaat door 20 opeenvolgende generaties van broer en zus met elkaar te laten paren. Deze stam is gemakkelijk genetisch modificeerbaar en laat een maximale expressie toe van de meeste mutaties. C57BL/6 muizen worden dan ook gebruikt in een groot aantal onderzoeksdomeinen. Op hematologisch gebied zijn deze muizen al goed bestudeerd. De gemiddelde hematologische waarden van deze muizen zijn reeds gekend. Bij 16 weken oude muizen schommelt het hemoglobinegehalte rond de 16,0 g/dl. De andere hematologische parameters verschillen licht tussen de geslachten. Zo vindt men bij 16 weken oude vrouwelijke muizen een plaatjesaantal van 1085 103 cellen/μL en een leukocyten gehalte van 2,67 103 cellen/μL . Bij de mannelijke muizen werden hogere waarden opgetekend met een thrombocytenaantal van 1310 103 cellen/μL en een leukocytenaantal van 3,10 103 cellen/μl. De ALT waarden van 16 weken oude muizen bedragen voor de mannelijke muizen gemiddeld 79 U/L en voor de vrouwelijke 40 U/L (jaxmice.jax.org). In vergelijking met andere muizenstammen kan men stellen dat C57BL/6 muizen gekenmerkt worden door een hoog aantal leukocyten en een laag aantal erythrocyten (www.harlan.com). De gemiddelde levensverwachting voor mannelijke C57BL/6 muizen bedraagt 29,3 maanden en voor vrouwelijke 26,5 maanden. 15
2.4.2 MRL MRL is de stam die als controle dient voor de MRL/Lpr stam. Deze muizensoort ontwikkelt ook auto-immuunsymptomen ondanks de afwezigheid van een mutatie in het Lpr-gen. Deze komen echter veel later tot uiting dan bij de MRL/Lpr muizen. Zo vindt men vanaf de leeftijd van 7 maanden sialoadenitis en pancreatitis alsook de aanwezigheid van antinucleaire antilichamen bij de meerderheid van de 10 maand oude muizen. De aanwezigheid van chronische glomerulonefritis is ook frequent bij deze muizen. De vrouwelijke muizen worden gemiddeld 73 weken oud; de mannelijke 93 weken.
2.4.3 MRL/Lpr Deze muizensoort draagt een mutatie in het Lpr-gen wat aanleiding geeft tot zeer manifeste auto-immuniteit. Kenmerken zijn onder meer een massieve lymphadenopathie, proliferatie van aberrante T cellen en artritis. Deze muizensoort is een model voor SLE en het Sjögren syndroom. Vanaf de leeftijd van 3 maanden ontstaan er enorme stijgingen van circulerende immuuncomplexen bij deze muizen wat leidt tot ernstige proliferatieve glomerulonefritis. De renale pathologie die zich manifesteert bij deze muizen kan als zeer ernstig beschouwd worden rond de 4 à 7 maanden. Antinucleaire antilichamen (inclusief anti-dsDNA) zijn aanwezig. De gemiddelde leeftijd van de MRL/Lpr muizen is dan ook opmerkelijk lager dan deze van hun respectievelijke controles: gemiddeld 22 weken voor de mannelijke en 17 weken voor de vrouwelijke muizen. De glomerulonefritis die ontstaat bij deze muizen is een immuuncomplex glomerulonefritis. De glomerulaire letsels omvatten proliferatie van zowel het endotheel als de mesangiale cellen en tevens ook van het basale membraan. Bij de ernstige laesies werd er ook tubulaire schade en castvorming aangetroffen. De proteïnurie heeft een incomplete penetrantie: zo heeft maar 50% van de vrouwelijke muizen een proteïnurie die 9 keer zo hoog is als deze van de controles.
2.4.4 Mechanisme van auto-immuniteit bij pristane-induced lupus Bij de injectie van pristane, een isoprenoïd alkaan, in het peritoneum zien we een SLE-achtig beeld ontstaan met zowel de vorming van auto-antilichamen als het ontstaan van een nefritis beeld. De pathway die leidt tot dit ziektebeeld is nog niet helemaal opgehelderd. Na de intraperitoneale injectie worden de pristanemoleculen bekleed met complementfactor C3. Deze trekt macrofagen aan die vervolgens de olie fagocyteren waardoor lipogranulomen ontstaan. De macrofagen in deze lipogranulomen secreteren o.a. grote hoeveelheden IL-6 en IL-12. Deze cytokines zouden verantwoordelijk zijn voor de auto-immuniteitsfenomenen die men ziet optreden bij deze muizen. Zo is de auto-antilichaamproductie (anti-dsDNA en 16
antichromatine antilichamen) van de pristane-behandelde muizen zeer dependent aan IL-6 (Shaheen et al., 1999). De productie van IL-12 bleek later cruciaal te zijn voor de ontwikkeling van pristane geïnduceerde lupus nefritis (Calvani et al., 2003) net zoals interferon type 1 (Nacionales et al., 2007).
2.5 Doelstellingen van deze thesis
Een
fenotypische
beschrijving
uitvoeren
van
de
eventuele
auto-immune
beschadigingen die optreden in de LTβ-receptor deficiënte muizenstam (LTβR -/muizen) met speciale aandacht voor het nierlijden.
Bepalen of de aanwezigheid van anti-Smooth Muscle antilichamen bij de LTβR -/muizen gecorreleerd is met leverpathologie.
Nagaan in welke mate de fenotypische kenmerken van deze muizenstam overeenkomen met systemische lupus erythematosus (SLE).
Valideren van de urinaire proteïne/creatinine ratio als accurate meetmethode voor proteïnurie bij onze muizen.
Bepalen van nierschade bij pristane-geïnjecteerde muizen.
17
3 Methodologie 3.1 Muizen Alle muizen werden aangekocht bij Harlan (Horst, Nederland). De muizen (uitgezonderd de MRL stam) werden gehouden in pathogeenvrije condities in het centraal animalarium op de campus van het UZ Gent. Met de aangekochte muizen werd er een kweekprogramma opgezet. De muizen in het animalarium werden regelmatig onderzocht op infecties met bepaalde pathogenen. De MRL muizen werden gehouden in het vivarium op de dienst reumatologie in het Medical Research Building op de campus van het UZ Gent. Toelating van het lokaal ethisch comité om dierexperimenten te verrichten werd aangevraagd en verkregen (dossiernummer ECD 08/01).
3.1.1 Pristane induced lupus en PBS-controle Vijf C57BL/6 mannetjes en vijf C57BL/6 vrouwtjes kregen een éénmalig intraperitoneale injectie met pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecaan, Sigma) op de leeftijd van 8 weken (Satoh et al., 1995). Hetzelfde aantal dieren kreeg een intraperitoneale injectie met PBS (Phosphate Buffered Saline) en deed dienst als negatieve controle. Vervolgens werden op geregelde tijdstippen urineafnames verricht.
3.2 Urine analyse. 3.2.1 Urineafname Van de verschillende muizenstammen werd er van elk proefdier afzonderlijk een urinemonster verzameld met behulp van een eppendorf microcup. De dieren werden hierbij bij de staart genomen, waarna er urine kon worden gecollecteerd. Elk eppendorfcupje werd vervolgens gemerkt met de identificatiegegevens van de muis en de datum van afname. De meeste stalen werden geanalyseerd op de dag van afname. Indien dit niet mogelijk bleek, werd de urine voor een korte periode gestockeerd in een koude kamer (4 ° C) of voor langere periodes in de diepvriezer (temperatuur van -20 ° C).
3.2.2 Verwerking Oorspronkelijk werd geopteerd voor het werken met dipsticks (Combur 12, Roche, Mannheim) voor de semi-kwantitatieve bepaling van proteïnurie. Wegens de kleine hoeveelheden urine die aanvankelijk konden worden gecollecteerd, ontstonden er echter problemen met aflezing en interpretatie van de resultaten. Tevens was de informatie die kon verzameld worden met deze sticks semi-kwantitatief waardoor er een beperkter statistisch 18
arsenaal aan testen mogelijk was (gezien de ordinale schaal). Wegens al de voorgenoemde redenen werd beslist om van de dipstickmethode af te stappen en over te schakelen naar gekwantificeerde bepaling van proteïnurie en urinair creatinine . Zoals al eerder aangehaald, is de verhouding urinair proteïnegehalte/urinair creatinine immers een goede manier voor het volgen van de nierfunctie bij onder andere lupus nefritis (Leung et al., 2007). Het urinaire creatininegehalte werd gebruikt als urinaire dilutieparameter in onze studie. Deze methode is ook bruikbaar bij muizen (Beynon en Hurst, 2004). De urinemonsters werden verwerkt in het labo klinische biologie. De stalen werden eerst enkele seconden gecentrifugeerd aan 2000 g om te zorgen dat alle urine in de buis zou deelnemen aan de metingen. In elke met urine gevulde eppendorf collectiebuis werd er vervolgens 100 µl gedestilleerd water toegevoegd. De eppendorf collectiebuizen werden na deze additie gedurende 10 seconden gevortexd om een maximale menging tussen de twee vloeistoffen te bekomen. Daarna werden de stalen overgepippeteerd in cupjes specifiek voor de Cobas-6000. Deze cupjes werden geplaatst in de "urinerekjes". Om eventuele luchtbellen te vermijden aan het vloeistofoppervlak werd soms nog verder gehomogeniseerd met behulp van een vortex aan zeer lage snelheid. Na deze voorbereidende stappen werden de rekjes met de cupjes overhandigd aan de laborant die het toestel (Cobas-6000) manueel programmeerde.
3.2.3 Bepaling van de proteïnurie De urinaire concentratie van proteïnen werd gemeten aan de hand van pyrogallol rood methode. Het principe van deze meting is als volgt: door de reactie van het rode pyrogallolmolybdaatcomplex en de proteïnen wordt er een wijziging van het absorptiespectrum veroorzaakt in het zichtbare licht (verschuiving van het absorptiespectrum van 467 nm naar 598 nm). De optische densiteit van 598 nm is recht evenredig met de proteïneconcentratie (Orsonneau et al., 1989). Aan het reagens werd het detergens natriumdodecylsulfaat (sodium dodecyl sulphate, SDS) toegevoegd om de kleurbaarheid van de verschillende eiwitfracties zo gelijk mogelijk te maken. De methode maakt gebruik van een eindpuntmeting waarbij de meting gebeurt op een bepaald punt in de tijd i.p.v. intermittente opnames (pseudokinetiek). Het resultaat wordt uitgedrukt in mg/dl. Het reagens (pyrogallol rood) werd aangekocht bij Instruchemie (Delfzijl, Nederland). De analyse werd uitgevoerd op een Cobas 6000 analyzer (Roche, Rotkreutz, Zwitserland).
19
3.2.4 Bepaling van het urinaire creatininegehalte Er werd gebruik gemaakt van een kinetische rate-blanked compensated Jaffé methode zonder onteiwitting. Er wordt gemeten met behulp van een colorimetrische analyse. Creatinine + picrinezuur → creatinine-picrinezuur complex (oranje- rood) De snelheid van interactie van creatinine met picrinezuur in alkalische milieu, met vorming van een oranje rood- rood gekleurd complex, is een maat voor de creatinineconcentratie. De specificiteit van de meting wordt verhoogd door de timing van de aflezing te optimaliseren. De Jaffé-reactie verloopt in drie fases. In een eerste fase (ca 30 s) reageren de snelreagerende niet-creatinine chromogenen, in een tweede fase (ca 2 min) reageert hoofdzakelijk het creatinine, in een derde fase reageren de langzaam reagerende niet-creatinine chromogenen. Het creatininegehalte wordt uitgedrukt in mg/dl. De methode werd gestandaardiseerd volgens de moderne NIST SRM 967 ID-MS (isotope dilution mass spectrometry) standaard.
Figuur 2:De basis van de Jaffe-methode: de reactie van alkalisch natriumpicraat met creatinine met vorming van een Janovsky complex (Vasiliades, 1976).
Na verwerking werden de stalen opnieuw in hun oorspronkelijke eppendorfcupjes gepipetteerd en daarna opgeslagen in de diepvries bij een temperatuur van -20 ° C.
3.3 Urinaire elektroforese Voor het uitvoeren van de urinaire elektroforese werd gebruik gemaakt van een Protur Hisikit® van Analis. De kit wordt gebruikt voor de elektroforetische scheiding van eiwitten in niet-geconcentreerde urine. Eiwitten in een elektrisch veld migreren in de agarosegel op basis 20
van hun lading met een verschillende snelheid naar een van de elektrodepolen. De migratie scheidt de eiwitten. Na migratie worden de eiwitten gekleurd met een eiwitspecifieke kleurstof voor visuele interpretatie en vergelijking met een gekend referentiepatroon (controle). De gevoeligheid van deze eiwitkleuring bedraagt ongeveer 0,4 g/L. Er werd een verdund serumstaal (zowel humaan als van een muis) gebruikt als merker. Voorbereiding: De elektroforesebuffer werd bereid door de toevoeging van 200 ml buffer aan 800 ml gedeïoniseerd water. Door menging van 100 ml kleurstof (bijgeleverd met de kit) en 200 ml zure alcohol oplossing verkrijgt men de kleuroplossing. De zure alcoholoplossing ontstaat door het mengen van 500 ml gedeïoniseerd water, 300 ml methanol en 200 ml ijsazijn. Bij het equilibratieproces wordt de gel eerst gevloeid en daarna wordt er 20 ml equilibratiebuffer toegevoegd in het gelschaaltje. De gel wordt met de agaroselaag naar beneden geplaatst in de buffer gedurende 30 minuten. Het doosje mag hierbij niet worden gesloten. In de applicatiefase wordt opnieuw de gel gevloeid waarna het staaltemplate wordt geplaatst. Het is noodzakelijk dat er een goed contact is tussen de gel en de template door middel van een smal vloeipapier. Er wordt exact 5 microliter staal aangebracht. Men wacht tot het volledige monster in de gel is ingetrokken alvorens men de template wegneemt. Vervolgens wordt 45 ml buffer in ieder compartiment van de cel gegoten. De gel wordt vervolgens op de drager geplaatst waarna er een stroom van 100 V wordt gecreëerd gedurende een periode van 25 minuten. Na de eigenlijke elektroforesefase volgt de kleuring/ontkleuring van de gel. Eerst wordt kleuroplossing aangebracht (10 min). Vervolgens wordt er gespoeld met gedeïoniseerd water (10 minuten). De gel wordt daarna gedroogd in de droogstoof. Vervolgens wordt er weer gespoeld met de zure alcoholoplossing gedurende 1 minuut, gevolgd door opnieuw een spoeling met zure alcoholoplossing gedurende 1 minuut tot de achtergrond helder wordt. Tenslotte wordt er nogmaals gespoeld met gedeïoniseerd water (5 s), gevolgd door een droogperiode in de droogstoof. De uiteindelijke evaluatie gebeurt door de gel te laten aflezen door een densitometer (Hyris 2, Sebia) bij 600 nm.
3.4 Perifeer Bloed onderzoek Het muizenbloed werd afgenomen door mijn begeleider Dr. J. Van Praet en opgevangen in een K2EDTA buis bestemd voor pediatrisch gebruik. Het bloed werd afgenomen via een staartsnede. Het afgenomen bloedvolume bedroeg ongeveer 100 µl. De bloedstalen werden 21
verwerkt in het labo klinische biologie van het UZ Gent op het Sysmex XE-2100- L toestel (Sysmex, Kobe, Japan). Dit toestel is uitgerust met 4 detectoren en 7 kanalen. Vol bloed wordt hierbij opgezogen uit het K2EDTA-buisje en vervolgens verdeeld via een sample rotor valve over de verschillende kanalen. Voor onze metingen werd gebruik gemaakt van het hemoglobinekanaal, het rode bloedcel (RBC)/ bloedplaatjes (PLT) kanaal en het witte bloedcel (WBC)/ Baso kanaal. Het hemoglobine wordt fotometrisch bepaald. Een deel van het bloed, ongeveer 3,0 µl wordt vanuit de buis opgenomen en vervolgens verdund met een diluent (Cellpack®) waarna een lyse gebeurt van de RBC met een natriumlaurylsulfaatbuffer (Sulfolyser®). Het vrijgekomen hemoglobine bindt met het natriumlaurylsulfaat en vormt op die manier een stabiel chromogeen. Dit chromogeen kan dan spectrofotometrisch gemeten worden bij een golflengte van 540 nm. Het RBC/PLT kanaal bepaalt het aantal erythrocyten en bloedplaatjes. Een bloedvolume van ongeveer 4,0 µl wordt eerst verdund met diluent (cellpack) en dan verstuurd naar de RBC mengkamer. Van hieruit wordt een tweede verdunning gemaakt en naar de RBC/PLT meetkamer gestuurd. Hier gebeurt de telling door middel van de sheath flow direct current methode. De RBC of de plaatjes passeren hier één voor één de meetopening. Hierdoor ontstaat een wijziging van de elektrische weerstand die gepaard gaat met de vorming van een puls. De hoogte van de puls is evenredig met het celvolume. Op basis van de discriminators wordt er dan een onderscheid gemaakt tussen rode bloedcellen en bloedplaatjes. Voor de telling van het aantal leukocyten is er een groter bloedvolume nodig van ± 18 µl. Het opgezogen volume wordt eerst vermengd met stromatolyser-fb ® oplossing waardoor de rode bloedcellen en de plaatjes lyseren. Vervolgens worden de witte bloedcellen geteld op basis van flowcytometrie.
3.5 Aspartaat amino transferase/ Alanine amino transferase Bloedafname bij de muizen werd verricht door mijn begeleider Dr. J. Van Praet via een staartsnede. Het bloed (± 100 µl) werd opgevangen in een serumbuis geschikt voor pediatrisch gebruik. De monsters werden vervolgens gecentrifugeerd in een eppendorf centrifuge gedurende 4 minuten aan een snelheid van 1500 g. Het serum (50µl) werd vervolgens overgepippeteerd in een eppendorfcup en 1 op 2 verdund met een fysiologische zoutoplossing en daarna gevortext gedurende 10 s. De stalen werden daarna verwerkt in de Cobas 6000 analyser (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Zwitserland). Alle serumstalen werden geanalyseerd op de dag van afname. 22
3.5.1 Activiteitsbepaling van alanine aminotransferase (ALT) De activiteit van ALT (bij 37 °C) wordt op een kinetische fotometrische manier bepaald (bichromatisch: 340 nm en 700 nm) volgens de IFCC methode zonder toevoeging van de cofactor pyridoxaalfosfaat (vitamine B6). De transaminase reactie kan niet rechtstreeks gevolgd worden en wordt gekoppeld aan specifieke dehydrogenasereacties: α-ketoglutaraat + L-alanine----ALT L-glutamaat + pyruvaat Pyruvaat + NADH + H+ ----LDH lactaat + NAD+ Er gebeurt een kinetische meting van de absorbantie op welbepaalde tijdstippen (∆ absorbantie/∆ tijd) op de Cobas 6000 analyser.
3.5.2 Activiteitsbepaling van aspartaat amino transferase (AST) De activiteit van AST (bij 37 °C) wordt op een kinetische fotometrische manier bepaald (bichromatisch: 340 nm en 405 nm) volgens de IFCC methode zonder toediening van pyridoxaalfosfaat. De transaminase reactie kan niet rechtstreeks gevolgd worden en wordt gekoppeld aan specifieke dehydrogenasereacties: α-ketoglutaraat + L-aspartaat---AST L-glutamaat + oxaloacetaat Oxaloacetaat + NADH + H+ ----MDH malaat + NAD+ Er gebeurt een kinetische meting van de absorbantie op welbepaalde tijdstippen (∆ absorbantie/∆ tijd) op de Cobas 6000 analyser.
3.6 Dataverwerking en statistiek Op het einde van de experimentfase beschikten we over een database met de resultaten van 400 urineresultaten en een twintigtal PBO‟s. Dataverwerking en grafische figuren werden gemaakt aan de hand van SPSS 15 (SPSS Inc.) en Graphpad (GraphPad Software Inc.). Indien er twee urineresultaten van eenzelfde muis in dezelfde tijdsperiode waren, werd het gemiddelde genomen van beide waarden. In de analyse van de urineresultaten werd, net als bij de analyse van de PBO‟s, geen gebruik gemaakt van exclusiecriteria. Bij analyse van de levertesten werd er één waarde weerhouden (afkomstig van een C57BL/6 muis). Deze was later uitgevoerd dan de andere controles en gaf zeer sterk afwijkende waarden. Om deze reden werd beslist dit resultaat niet te laten deelnemen aan de analyse. Bij de analyse van de ALT/AST parameters werd er vooral belang gehecht aan de waarde van ALT. Deze keuze gebeurde voornamelijk omdat we de factor hemolyse zoveel mogelijk wilden uitsluiten (tweemaal zoveel AST als ALT in RBC). Bovendien is de waarde van ALT veel specifieker voor de lever dan deze van AST.
23
Voor elke onderzochte continue variabele werd nagegaan of de verdeling al dan niet normaal verdeeld was. De symmetrie werd beoordeeld door een Box-and whisker plot en de standaard beschrijvende variabelen van elke distributie (gemiddelde, 5% trimmed gemiddelde, mediaan, kurtosis en scheefheid). Een Kolmogorov-Smirnov test werd uitgevoerd om te controleren of de waarden normaal verdeeld waren en de Q-Q plot beoordeeld. Indien niet anders vermeld, zijn de gerapporteerde beschrijvende parameters het gemiddelde en de standaarddeviatie.
De statistische testen die werden gebruikt om verschillende groepen te vergelijken werden bepaald door het al dan niet parametrisch karakter van de te vergelijken variabelen. Indien parametrische testen toegelaten waren, werd er vooral gebruik gemaakt van de ongepaarde Ttest. Indien het nodig was om te controleren op gelijkheid van de varianties in de verschillende groepen, werd er gebruik gemaakt van de Levene-test. Als niet-parametrische test werd er voornamelijk gebruik gemaakt van de Mann-Whitney U test. Resultaten werden statistisch significant beschouwd indien p< 0.05. Continue variabelen die op verschillende tijdspunten gemeten werden, zijn geanalyseerd met een „linear mixed model analysis with random slopes and random intercepts‟. Dit is een vorm van longitudinale data analyse die corrigeert voor de correlatie die er bestaat tussen de metingen binnen eenzelfde individu. De nulhypothese bij deze analyse is dat verschillende covariabelen geen invloed hebben op de helling van de rechte die de verandering van de variabele in functie van de tijd weergeeft. Er werd ook nagegaan of er een significante interactie was tussen de verschillende covariabelen.
24
4 Resultaten 4.1 Perifeer Bloed Onderzoek 4.1.1 Hemoglobine Op de leeftijd van 37 weken werd er van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen bloed afgenomen en het hemoglobinegehalte bepaald. Uit figuur 3 valt af te leiden dat de hemoglobineconcentratie bij C57BL/6 muizen (n = 14; 11,89 ± 1,27 g/dL) lager is dan deze bij LTβR -/- muizen (n = 11; 14,1 ± 0,79 g/dL). Dit verschil bleek statistisch zeer sterk significant te zijn (p <0.001, ongepaarde t-test). Opmerkelijk hier is dat de C57BL/6 stam (de controles) een lager hemoglobinegehalte blijkt te hebben dan de LTβR -/- stam (de cases). Uit verdere analyse bleek ook dat het MCV tussen beide stammen significant verschillend was (p<0.001, ongepaarde t-test). De karakteristieken van de C57BL/6 (n = 14; 45,16 ± 2,62 fL) en de LTβR -/- muizen (n = 11; 49,22 ± 1,41 fL) tonen dit duidelijk aan (geen grafiek getoond).
Hemoglobinegehalte 16
g/dL
14
12
10
8 C57BL/6
LTBR-/-
stam Figuur 3: Hemoglobinegehalte bij de LTβR -/- en C57BL/6 muizenstam (p<0.001). Getoond zijn het gemiddelde en de standaarddeviatie.
Uit bovenstaande gegevens kan men dan ook afleiden dat er geen argumenten zijn voor het aanwezig zijn van hemolytische, ferriprieve of een andere vorm van anemie bij de LTβR -/muizen.
25
4.1.2 Leukocyten
Leukocytenaantal 50
10³/microliter
40 30 20 10 0 C57BL/6
LTBR-/-
stam Figuur 4: Leukocytenaantal bij de LTβR -/- en C57BL/6 muizenstam (p< 0.001). Getoond zijn het gemiddelde en de standaarddeviatie.
In figuur 4 wordt het leukocytenaantal weergegeven bij de C57BL/6 muizen (n = 14; 12,1 ± 3,0 103/mm3) en LTβR -/- muizen (n = 11; 34,7 ± 6,1 103/mm3). Uit deze figuur blijkt dat er een duidelijk verschil is tussen de twee muizenstammen. Om verschillen aan te tonen werd er gebruik gemaakt van een ongepaarde t-test die een zeer sterk significant verschil (p< 0.001) weergaf. Zoals eerder aangehaald in de inleiding was dit resultaat te verwachten. Aangezien er een totale afwezigheid is van lymfeknopen bij de LTβR -/- muizenstam, resulteert dit bijgevolg in een verhoogd aantal circulerende leukocyten in het bloed. Hierdoor kan het verhoogde leukocytenaantal bij de LTβR -/- muizen, ondanks deze grote verschillen, moeilijk geïnterpreteerd worden als een merker van verhoogde immunologische activiteit.
4.1.3 Thrombocyten Betreffende het verschil in thrombocytenaantal tussen de C57BL/6 muizen (n = 14; 883 ± 185 103/mm³) en de LTβR -/- muizen (n = 11; 636 ± 111 103/mm³), getoond in figuur 5, kan worden opgetekend dat dit verschil sterk statistisch significant is (p = 0.003, ongepaarde ttest). De afwezigheid van de LTβ-receptor blijkt dus duidelijk een invloed te hebben op het thrombocytenaantal.
26
Thrombocytenaantal
10³/microliter
1500
1000
500
0
C57BL/6
LTBR-/-
stam Figuur 5: Thrombocytenaantal bij de LTβR -/- en C57BL/6 muizenstam (p = 0.003). Getoond zijn het gemiddelde en de standaarddeviatie.
4.2 AST/ALT Op de leeftijd van 6 maanden werd er bloed afgenomen bij zowel C57BL/6 muizen als bij LTβR -/- muizen. Hierop werd de AST- en ALT- activiteit in serum bepaald. In figuur 6 wordt de spreiding weergegeven van de ALT- waarden. Er is een duidelijk verschil in serum ALT – activiteit waarneembaar tussen de stammen. Bij uitvoering van een Mann-Whitney U test werd een sterk significant verschil aangetoond (p = 0.001). Er zijn dus argumenten om aan te nemen dat er bij de LTBR-/- stam wel degelijk leverschade aanwezig is. Hoewel minder leverspecifiek werden ook de AST-waarden onderzocht in het muizenserum (weergegeven in figuur 7). Een statistische analyse toonde aan dat ook de verschillen in AST activiteit significant verschillend waren tussen beide stammen (p = 0.007, Mann-Whitney U test). Beide levertesten tonen dus een statistisch sterk significant verschil aan wat het vermoeden van aanwezigheid van leverpathologie bij de LTβR -/- muizen versterkt. Er dient wel opgemerkt te worden dat slechts een beperkt deel van de LTβR -/- muizen (± 20%) een stijging vertoont van de leverenzymen en dit in beide geslachten. Dit contrasteert met de C57BL/6 muizen waar geen enkele muis uit de “normale range” viel. Niet alle muizen lijken dus leverschade te ontwikkelen door de afwezigheid van de LTβ-receptor . 27
ALT-activiteit 200
Units/L
150
100
50
0
C57BL/6
LTBR -/-
stam Figuur 6: Box-and whisker plot van ALT-activiteit in serum bij C57BL/6 en LTβR -/- muizen. Mediaan en IQR bij C57BL/6 muizen bedroegen respectievelijk 40 en 13 U/L. Mediaan en IQR bij LTβR -/- muizen bedroegen respectievelijk 59 en 60 U/L. (p = 0.001)
AST-activiteit 400
Units/L
300
200
100
0
C57BL/6
LTBR -/-
stam Figuur 7: Box- and whisker plot van de AST-activiteit in serum bij C57BL/6 en LTβR -/- muizen. De mediaan en IQR bij C57BL/6 muizen bedroegen respectievelijk 61 en 38 U/L. De mediaan en IQR bij LTβR -/- muizen bedroegen respectievelijk 103 en 197 U/L. ( p = 0.007) 28
4.3 Proteïnurie Aangezien uit de voorlopige resultaten al vroeg bleek dat er een duidelijk geslachtsverschil aanwezig was in de kwantitatieve urinaire proteïne excretie, werd er een urinaire elektroforese uitgevoerd om te achterhalen of er ook een kwalitatief verschil was tussen beide geslachten.
4.3.1 Urinaire elektroforese Uit de vergelijking tussen figuur 8 en figuur 9 kan er verondersteld worden dat het geslachtelijke verschil in proteïnurie te wijten is aan de dikkere eiwitband die gelegen is voor het albumine. Door vergelijking met zowel humaan- als muizenserum, gebruikt als merker, kan men afleiden dat dit eiwit muizen pre-albumine is (moleculaire massa van ± 20.000 Dalton) (Reuter et al., 1968). Om nog een betere kwantificatie van dit laatste eiwit te bekomen, werd getracht het eiwit te doseren met behulp van immunonefelometrie (BN II nefelometer, Siemens, Marburg) en een polyclonaal (anti-humaan) pre-albumine antilichaam (Siemens). Helaas kon geen kruisreactiviteit tussen muis-en menselijk pre-albumine worden vastgesteld. Het geslachtelijke verschil in de urinaire excretie van pre-albumine wordt bevestigd door de literatuur (Rumke, 1964). Deze publicatie bevestigde onze vaststelling dat de hoeveelheid urinair pre-albumine bij mannelijke muizen 2,5 tot 15 maal zoveel bedraagt als deze bij de vrouwelijke muizen. Omwille van het geslachtsverschil werden de analyses van mannelijke en vrouwelijke muizen apart geanalyseerd. Er werd een urinaire elektroforese uitgevoerd om te kijken of er kwalitatieve verschillen aanwezig waren tussen urinaire proteïnen die gedetecteerd werden bij de mannelijke C57BL/6 muizen en de LTβR -/- muizen (figuur 8). Er waren niet echt duidelijke verschillen aan te tonen afgezien van de veel intensere albumineband bij de LTβR -/- muizen. Deze intensere band was aanwezig bij beide geslachten (zie ook figuur 9). In vergelijking met de controles blijkt het relatieve verschil in dikte van de albumineband vooral aanwezig te zijn bij de vrouwelijke muizen. Tevens valt in deze laan ook een sterkere intermediaire band waar te nemen. Het glomerulaire membraan verhindert in fysiologische omstandigheden dat plasma-eiwitten met een moleculaire massa groter dan 68 kiloDalton (kDa) in de urine terechtkomen. Uit het urinaire eiwitpatroon bij de LTβR -/- muizen (met een matig albumineverlies (68 kDa) en spoorhoeveelheden transferrine (80 kDa)) is te zien dat eiwitten met een moleculair gewicht groter dan 68kDa in de urine terechtkomen. Dit wijst dus op een selectieve beschadiging van de glomerulus. De bijkomende eiwitten op de elektroforese die anodisch van het albumine 29
aangetroffen worden kunnen normaal de glomerulus passeren en worden geresorbeerd in de proximale tubulus van de nier. Aangezien deze pre-albumines ook in de urine van LTβR -/muizen werden aangetroffen (en dus niet volledig geresorbeerd worden in de proximale tubulus), wijst dit op een bijkomende tubulaire beschadiging. Als besluit weerhouden we dan een proteïnurie van het gemengde glomerulaire-tubulaire type.
Pre-albumine Albumine
Transferrine
Figuur 8: Urinaire eiwitelektroforese (agarosegel) van mannelijke muizen (leeftijd: 5 maand). Laan 1-4 toont het patroon van de mannelijke C57BL/6 muizen, laan 5 humaan serum, laan 6 muizenserum, laan 7-9 mannelijke LTβR -/- muizen. Er zijn duidelijke intensere banden te zien bij de LTβR -/- muizen in de albumineregio (vooral uitgesproken in laan 8 en 9).
Net als bij de elektroforese van de mannelijke urine is er bij de urinaire eiwitelektroforese van de vrouwelijke muizen (figuur 9) vooral een duidelijk verschil vast te stellen in de albumineregio. Tevens er is een sterkere aanwezigheid van een eiwit, ongeveer overeenkomend met de α1-globulineregio in serum, bij de vrouwelijke LTβR -/- muizen. Dit eiwit konden we helaas niet identificeren. Ook bij de vrouwelijke muizen is er dus vooral een glomerulaire pathologie aanwezig met kenmerken van een tubulaire pathologie.
30
Pre-albumine Albumine Transferrine
Figuur 9: Urinaire eiwitelektroforese (agarosegel) van vrouwelijke muizen. Laan 1-4 toont het eiwitspectrum van vrouwelijke C57BL/6 muizen, laan 5 bevat humaan serum, laan 6 bevat muizenserum, laan 7-10 bevat urine van vrouwelijke LTβR-/- muizen. Er valt een duidelijk verschil te zien voor wat betreft de albumineregio tussen de LTβR -/- muizen en de C57BL/6 muizen alsook in de regio “ervoor”.
In een poging om uit te maken of er bij de LTβR -/- muizen in de “dikke eiwitbanden” voor het albumine nog iets aanwezig was, werd getracht te werken met kleine concentraties (figuur 10). Deze toonde duidelijk een verhoogde concentratie in de urine van LTβR -/- muizen aan van wat vermoedelijk pre-albumine is.
Figuur 10: Uitvergrote elektroforese in de albumine/ pre-albumineband. Alle stalen werden op een gelijkmatige concentratie aan urinaire proteïnen (0,5 g/L) electroforetisch gescheiden. De eerste vier stalen aan de linkerzijde zijn vrouwelijke controle C57BL/6 muizen. De vijfde laan toont humaan serum met dikke eiwitband die humaan albumine voorstelt. De vijf stalen aan de rechterzijde zijn vrouwelijke LTβR -/- muizen. Er is duidelijk een extra “boog” te zien op het albumine van de LTβR -/- muizen. Dit is vermoedelijk pre-albumine.
4.3.2 Vergelijking van proteïnurie tussen C57BL/6 muizen en LTΒR -/muizen.
4.3.2.1 Analyse op de leeftijd van 3 maanden Figuur 11 toont de grafische weergave van de ratio urinaire proteïnen t.o.v. creatinine. Er is een duidelijk verschil op te merken tussen de mannelijke muizen van de C57BL/6 stam
31
(n = 7; 9,96 ± 4,1) en de mannelijke muizen van de LTβR -/- stam (n = 13; 32,13 ± 15,42). Bij het uitvoeren van statistische testen werd dit verschil als sterk significant beschouwd (p = 0.011, Mann-Whitney U test). Bij de vrouwelijke muizen krijgt men ook een duidelijk grafisch verschil bij de box- and whisker plot. Zo is de ratio van urinaire proteïnen t.o.v. het urinaire creatinine bij de vrouwelijke C57BL/6 muizen (n = 5; 1,73 ± 0,77) merkelijk lager dan deze van de vrouwelijke LTβR -/- muizen (n = 8; 7,48 ± 1,91). Ook hier werd er een Mann-Whitney U test uitgevoerd die een significant verschil aangaf (p=0.02). Het verschil in proteïnurie tussen cases en controles in beide geslachten lijkt ongeveer hetzelfde te bedragen namelijk een factor 3. Wel blijkt de variatie in proteïnurie bij de mannelijke LTβR -/- muizen veel groter te zijn dan deze van de vrouwelijke muizen. De variatie in proteïnurie is analoog aan de verhoogde leverenzymen die ook maar aanwezig waren bij een beperkt deel van de LTβR -/muizenpopulatie. Uit deze resultaten kan er duidelijk worden weerhouden dat op de leeftijd van 3 maanden het afwezig zijn van de LTβ-receptor een belangrijke pathologische impact heeft en dit in zowel de mannelijke als in de vrouwelijke populatie. Proteïnurie bij LTBR-/- en C57BL/6 muizen op de leeftijd van 3 maanden geslacht M V
urinaire proteïne/creatinine ratio
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
C57BL/6
LTBR -/-
stam
Figuur 11: Box-and whisker plot weergave van de urinaire proteïne/creatinine ratio bij mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 en LTβR -/- muizen op de leeftijd van 3 maanden. Voor beide geslachten is het verschil significant.
32
4.3.2.2 Analyse op de leeftijd van 6 maanden Net als op de leeftijd van 3 maanden, zien we een groot verschil tussen de C57BL/6 en de LTβR -/- muizen en dit in beide geslachten (figuur 12). Dit verschil bleek sterk significant te zijn, zowel bij de vrouwelijke (p<0.001, ongepaarde t-test) als bij de mannelijke muizen (p=0.002, ongepaarde t-test). Als we kijken naar de populatiekarakteristieken van de mannelijke muizen, zien we slechts een lichte stijging van het gemiddelde t.o.v. deze op de leeftijd van 3 maanden. Dit is zowel aanwezig bij de C57BL/6 stam (n = 8; 14,32 ± 8,84) als bij de LTβR -/- muizen (n = 7; 38,99 ± 15,25). Ook de vrouwelijke C57BL/6 populatie (n=15; 1,32 ± 0,94) is grotendeels hetzelfde gebleven wat betreft de urinaire uitscheiding van proteïnen. Enkel bij de vrouwelijke LTβR -/- muizen (n = 7; 4,80 ± 1,25) zag men een lichte terugval voor wat betreft proteïnurie. De reden hiervoor is niet duidelijk. In vergelijking met de analyse op de leeftijd van 3 maanden zien we ook dat de relatieve hoeveelheid proteïnurie van de cases t.o.v. van de controles dezelfde blijft (een factor 3 ongeveer). Dit wijst erop dat er geen verergering van proteïnurie ontstaat in de loop van de tijd alsook dat de afwezigheid van de LTβ-receptor , onafhankelijk van geslacht, dezelfde renale schade doet ontstaan. Proteïnurie bij LTBR -/- en C57BL/6 muizen op de leeftijd van 6 maanden geslacht M V
urinaire proteïne/creatinine ratio
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
C57BL/6
LTBR -/-
stam
Figuur 12: Box- and whisker plot weergave van de urinaire proteïne/creatinine ratio bij mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 en LTβR -/- muizen op de leeftijd van 6 maanden. Het verschil is significant voor beide geslachten. 33
4.3.3 Vergelijking van proteïnurie tussen MRL muizen en MRL/Lpr muizen. Om te controleren of onze methode van proteïnuriemeting accuraat was, werd beslist om een ander lupus muizenmodel te volgen namelijk de MRL/Lpr muizenstam.
4.3.3.1 Vergelijking tussen de vrouwelijke muizen In figuur 13 is de urinaire proteïne/creatinine ratio van de vrouwelijke MRL/Lpr muizen weergegeven in de tijd. Men merkt een duidelijke stijging op van de ratio naarmate de tijd vordert. De proteïnurieanalyse van de vrouwelijke MRL/Lpr muizen werd gestopt rond de leeftijd van 25 weken aangezien veel van de vrouwelijke MRL/Lpr muizen op dat moment al dood waren. Dit is conform met de vroeger beschreven levensduur (gemiddeld 17 weken) van de vrouwelijke leden van deze stam. Uit figuur 13 valt af te leiden dat op dat ogenblik het maximum aan proteïnurie werd bereikt. Het is dus waarschijnlijk dat de aanwezige nierschade een rol speelt in de mortaliteit van de vrouwelijke MRL/Lpr muizen. De vrouwelijke MRL muizen echter vertonen een constante ratio van urinaire proteïnen t.o.v. creatinine in het verloop van de tijd. Enkel op het einde van de metingen werd er nog een lichte stijging waargenomen doch deze was niet noemenswaardig t.o.v. deze van de vrouwelijke MRL/Lpr muizen. Deze stijging kan echter wel het begin zijn van een glomerulonefritis bij de MRL muizen. Deze ontstaat, in vergelijking met de MRL/Lpr muizen, veel later in het leven. In tabel 1 worden de eigenschappen vermeld van de onderzochte populatie getoond in figuur 13. Men ziet een grote variatie in de urinaire proteïne/creatinine ratio bij de pathologische MRL/Lpr muizen terwijl deze veel minder is uitgesproken bij de vrouwelijke MRL controle muizen. Dit kan erop wijzen dat niet elke muis even zware renale schade ondervindt van de mutatie in het Lpr-gen. Dit is analoog aan onze bevindingen bij de LTβR -/- muizen. stam
MRL/Lpr
MRL
leeftijdscategorie Aantal
gemiddelde
Standaarddeviatie
Variatiecoëfficient
5 tot 10 weken
10
2.32
1.50
64.7%
10 tot 15 weken
9
24.01
58.71
244.6%
15 tot 20 weken 20 tot 25 weken Totaal 5 tot 10 weken
6 6 31 5
57.87 69.29 32.33 3.05
63.03 64.77 54.83 1.15
108.9% 93.5% 169.6% 37.6%
10 tot 15 weken
4
1.95
1.12
57.6%
15 tot 20 weken
3
3.57
1.57
44.1%
20 tot 25 weken
3
2.19
0.54
24.8%
25 tot 30 weken Totaal
2 17
10.43 3.60
11.44 4.01
109.7% 111.5%
Tabel 1: Beschrijvende statistiek van de urinaire proteïne/ creatinine ratio bij vrouwelijke MRL/Lpr en MRL muizen.
34
Proteïnurie bij vrouwelijke MRL en MRL/Lpr muizen
gemiddelde urinaire proteïne/creatinine ratio
stam MRL/Lpr MRL 60,00
40,00
20,00
0,00 5 tm 10 weken
10 tm 15 weken
15 tm 20 weken
20 tm 25 weken
25 tm 30 weken
leeftijdscategorie
Figuur 13: Visuele voorstelling van de gemiddelde urinaire proteïne/creatinine ratio voor vrouwelijke MRL en MRL/Lpr muizen in het verloop van de tijd.
Aangezien in het verloop van de tijd voldoende data konden worden verzameld, stelde dit ons in staat om een mixed model analyse (tabel 2) uit te voeren. Uit de mixed model analyse die werd uitgevoerd, kan men duidelijk opmaken dat de stam een significante rol speelt in het verschil in proteïnurie (p = 0.028). Door de afwezigheid van een interactie tussen stam en leeftijdscategorie was er geen aparte analyse van de subgroepen (MRL en MRL/Lpr) noodzakelijk. Als conclusie kan men stellen dat er een duidelijk verschil is tussen vrouwelijke MRL en MRL/Lpr muizen voor wat betreft proteïnurie en dat deze duidelijk toeneemt met de tijd. Source
Numerator df
Denominator df
F
Significantie
Intercept
1
44
10.321
0.002
stam
1
44
5.157
0.028
leeftijdscategorie
3
44
3.236
0.031
Tabel 2: Mixed model analyse van MRL en MRL/Lpr muizen voor de urinaire proteïne/ creatinine ratio. 35
4.3.3.2 Vergelijking tussen de mannelijke muizen Wegens afnamemoeilijkheden en een kleinere cohorte van mannelijke MRL en MRL/Lpr muizen was het niet (volledig) mogelijk een mixed model analyse te verrichten. Daarom werd geopteerd om aan het begin van de metingen (6 - 13 weken) en aan het einde van de metingen (20 - 27 weken) een vergelijking te maken tussen de mannelijke MRL en mannelijke MRL/Lpr muizen (figuur 14). In beide leeftijdscategorieën werd er een significant verschil gevonden tussen de beide stammen. In de leeftijdsklasse 6 - 13 weken vonden we een significant verschil (p = 0.03, MannWhitney U test) tussen de mannelijke MRL/Lpr populatie (n = 9; mediaan 28,2 en IQR 5,3) en de MRL populatie (n = 5; mediaan 5,0 en IQR 4,7). Dit significant verschil bleek ook aanwezig te zijn in de leeftijdsklasse van 20-27 weken (p = 0.034, Mann-Whitney U test) tussen de MRL muizen (n = 3; mediaan 12,5; IQR 5,2) en de MRL/Lpr muizen (n = 4; mediaan 26,8 en IQR 9,5). Wel blijkt het verschil in proteïnurie te verkleinen tussen beide stammen op dit laatste meetpunt. Net als bij de vrouwelijke muizen kan dat misschien geïnterpreteerd worden als de start van een glomerulonefritis. Men merkt tevens op dat de proteïnurie bij de mannelijke MRL/Lpr muizen, in vergelijking met de vrouwelijke MRL/Lpr muizen, minder ernstig is. Relatief gezien is het verschil in proteïnurie tussen cases (MRL/Lpr) en controles (MRL) veel groter bij de vrouwelijke muizen dan bij de mannelijke. Dit pleit voor een belangrijke geslachtelijke factor in de renale pathofysiologie van de MRL/Lpr stam.
36
Vergelijking proteïnurie tussen mannelijke MRL en MRL/Lpr muizen stam MRL/Lpr MRL
Urinaire proteïne/ creatinine ratio
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
6-13 weken
20-27 weken
leeftijdscategorie Figuur 14: Visuele weergave van het verschil in urinaire proteïne/ creatinine ratio tussen mannelijke MRL/Lpr en MRL muizen in de periode van 6 - 13 weken en 20 - 27 weken. Er is een statistisch significant verschil in beide leeftijdscategorieën.
4.3.4 Vergelijking van proteïnurie tussen C57BL/6-pristane en C57BL/6PBS muizen. Aangezien de gegevens betrokken uit de MRL/Lpr stam wel degelijk onze methode valideerden, werd er ook geopteerd voor het volgen van een ander lupus muizenmodel namelijk het pristane induced lupus model. Hierbij werden C57BL/6 muizen geïnjecteerd met pristane (C57BL/6- pristane) en hun respectievelijke controles met PBS (C57BL/6-PBS).
4.3.4.1 Vergelijking tussen de vrouwelijke muizen. Net als bij de overige muizenstammen werden er longitudinaal gegevens verzameld. Dit liet ons toe om een mixed model analyse uit te voeren (tabel 4). In de literatuur werd beschreven dat de proteïnurie bij het pristane-model normaal rond 6 maanden na injectie zou optreden. Toen deze niet optrad rond 24 weken na injectie, werd besloten om de opvolging van deze muizen stop te zetten. 37
In figuur 15 worden de resultaten voorgesteld van de urineanalyses die verricht werden bij de vrouwelijke muizen op de leeftijd van 2, 5, 10, 13 en 24 weken na injectie. De “dip” die aanwezig is op 10 weken na injectie, en die ook aanwezig is bij de urineanalyses van de mannelijke dieren na 10 weken, is waarschijnlijk te wijten aan variatie van de meetmethode. De karakteristieken van de geanalyseerde vrouwelijke populatie zijn weergegeven in tabel 3. Uit figuur 15 valt duidelijk af te leiden dat de twee analyses bijna parallel lopen voor wat betreft de urinaire proteïne/creatinine massaverhouding. Hierbij valt op dat de C57BL/6pristane muizen vreemd genoeg een lagere urinaire proteïne/creatinine ratio hebben dan de C57BL/6-PBS muizen en dit verschil wordt behouden tot aan het einde van de metingen. Aangezien we merken dat dit verschil al aanwezig was op twee weken post-injectie en injectie met pristane op zo een korte termijn geen renale schade kan veroorzaken, gaan we ervan uit dat de twee populaties al van bij het begin van de metingen verschilden in proteïnurie. Door het aanvankelijke verschil en het feit dat dit wordt behouden in de loop van de tijd, kan er worden aangenomen dat pristane-injectie bij C57BL/6 muizen geen weerslag heeft op de nierfunctie van deze dieren. Helaas werd er geen “baseline” analyse uitgevoerd van de onderzochte populaties. Onze mixed model analyse toonde wel een significant verschil aan voor zowel de invloed van stam (p<0.001) als de tijdsperiode na injectie (p<0.001). Deze moet wel geïnterpreteerd worden met bovenstaande argumentatie in gedachten. Hoewel de tijdsperiode na injectie in deze populatie sterk significant is, lijkt deze van een totaal andere grootorde te zijn dan de invloed van leeftijd bij MRL/Lpr muizen. Er werd geen significante interactie gedetecteerd tussen stam en leeftijd (p = 0.298).
ID
Aantal weken Na injectie 2 5 10
Totaal 13 24 Totaal
stam
aantal
gemiddelde
Standaarddeviatie Variatiecoëfficiënt
C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS
5 5 4 3 4 3 5
7.41 4.06 7.76 4.77 4.79 2.44 6.03
0.34 2.16 0.28 0.13 1.52 1.14 0.64
4.6% 53.2% 3.6% 2.8% 31.8% 46.7% 10.5%
C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS
4 4 3 22
3.39 3.73 2.14 6.02
1.04 0.81 0.80 1.69
30.7% 21.8% 37.6% 28.1%
C57BL/6 pristane
18
3.44
1.55
45.2%
Tabel 3: Kruistabel met de karakteristieken van de onderzochte vrouwelijke C57BL/6-pristane en C57BL/6- PBS muizenpopulatie. Voorgesteld zijn het gemiddelde, standaarddeviatie en variatiecoëfficient van de urinaire proteïne/ creatinine ratio. 38
Proteïnurie bij vrouwelijke C57BL/6-PBS en C57BL/6-Pristane muizen
Gemiddelde urinaire proteïne/ creatinine ratio
8,00
stam C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00 2
5
10
13
24
Aantal weken na injectie
Figuur 15: Visuele voorstelling van de gemiddelde urinaire proteïne/creatinine ratio bij vrouwelijke C57BL/6-PBS muizen en C57BL/6-pristane muizen in het verloop van de tijd.
Source
Numerator df
Denominator df
F
Significantie
Intercept
1
11.227
845.154
<0.001
Stam
1
7.243
319.632
<0.001
Aantal weken na injectie
2
9.683
55.870
<0.001
Tabel 4: Mixed model analyse van vrouwelijke C57BL/6- pristane en C57BL/6- PBS muizen voor de urinaire proteïne/creatinine ratio.
4.3.4.2 Vergelijking tussen de mannelijke muizen Net als bij de vrouwelijke muizen zien we bij de mannelijke muizen al vanaf de “baseline” een belangrijk verschil tussen de C57BL/6-PBS muizen en de C57BL/6-pristane muizen (figuur 16). Dit aanvankelijke verschil wordt behouden gedurende het verloop van de analyse doch lijkt te verkleinen naar het eind van de metingen toe. Net als bij de vrouwelijke populatie lijkt het er dus op dat pristane, in vergelijking met de controle PBS - groep, geen nierschade 39
veroorzaakt. De karakteristieken van de onderzochte populatie worden weergegeven in tabel 5. Onze mixed model analyse (tabel 6) toonde echter opnieuw een significant verschil aan tussen de PBS-groep en de pristane-groep (p< 0.001) en schreef ook een belangrijke invloed toe aan het aantal weken na de injectie (p = 0.014). Er werd, in tegenstelling tot de vrouwelijke muizen, een minimale interactie aangetoond tussen stam en het aantal weken na injectie (p = 0.041) doch er werd omwille van het “borderline” karakter van deze significantie niet besloten tot een aparte re-analyse van de twee stammen. Dit is conform de literatuur (Fitzmaurice et al., 2004). Proteïnurie bij mannelijke C57BL/6-PBS en C57BL/6-Pristane muizen stam
Gemiddelde urinaire proteïne/ creatinine ratio
17,50
C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane 15,00
12,50
10,00
7,50
5,00
2
5
10
13
24
aantal weken na injectie
__
Figuur 16: Visuele voorstelling van de gemiddelde urinaire proteïne/creatinine ratio bij mannelijke C57BL/6-PBS muizen en C57BL/6-pristane muizen in het verloop van de tijd.
40
ID
Aantal weken na injectie 2 5 10
Totaal 13 24 Totaal
stam
aantal
gemiddelde
Standaarddeviatie
Variatiecoëfficiënt
C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane C57BL/6 PBS C57BL/6 pristane
4 5 5 4 5 5 5 4 4 4 23 22
15.07 9.35 16.69 11.04 14.23 4.08 15.30 8.36 11.57 10.42 14.68 8.47
1.594 10.581 1.059 4.098 0.610 2.948 2.275 2.735 2.887 3.336 2.353 5.900
10.6% 113.2% 6.3% 37.1% 4.3% 72.3% 14.9% 32.7% 24.9% 32.0% 16.0% 69.6%
Tabel 5: Kruistabel met de karakteristieken van de onderzochte mannelijke C57BL/6 –pristane en C57BL/6-PBS muizenpopulatie. Voorgesteld zijn het gemiddelde, standaarddeviatie en variatiecoëfficient van de urinaire proteïne/creatinine ratio.
Source
Numerator df
Denominator df
F
Significantie
Intercept
1
13.769
319.077
<0.001
stam Aantal weken na injectie
1
13.769
20.764
<0.001
4
14.677
4.501
0.014
Tabel 6: Mixed model analyse van de mannelijke C57BL/6-pristane en C57BL/6- PBS muizen voor de urinaire proteïne/creatinine ratio.
41
5 Discussie Het is al langer gekend dat het lymfotoxinesysteem, een deel van de TNF-superfamilie, betrokken is bij de regulatie van de centrale tolerantie. Afwezigheid van de LTβ-receptor leidt dan ook tot het ontstaan van auto-immuunfenomenen. In deze thesis werd met behulp van LTβ-receptor knock-out muizen achterhaald welke fenotypische gevolgen de afwezigheid van deze receptor veroorzaakt op hematologisch, hepatologisch en nefrologisch gebied. De karakteristieken die teruggevonden werden bij deze muizen, werden vergeleken met manifestaties van het prototype van een auto-immuunaandoening, namelijk systemische lupus erythematosus (SLE). Onze bevindingen toonden aan dat afwezigheid van de LTβ-receptor leidt tot het ontstaan van belangrijke proteïnurie alsook thrombopenie, twee kenmerken passend bij het beeld van SLE. Tevens vonden we aanwijzingen voor de aanwezigheid van auto-immuun hepatitis, een aandoening die zelden is geassocieerd met SLE.
5.1 Perifeer Bloedonderzoek We onderzochten het bloed van C57BL/6 en LTβR -/- muizen en vergeleken het hemoglobinegehalte, het aantal witte bloedcellen en het plaatjesaantal tussen deze twee muizenstammen om hematologische kenmerken van SLE te detecteren. De gevonden hematologische parameters van de C57BL/6 muizen waren lager dan deze gegeven door de leverancier doch dit is waarschijnlijk te wijten aan omgevingsfactoren. Door de aanwezigheid van verschillende auto-antilichamen bij LTβR -/- muizen hadden we verwacht een vorm van hemolytische, ferriprieve of een anemie van chronische ziekte aan te treffen zoals vaak bij SLE het geval is. Dit blijkt echter niet zo te zijn: bij de analyse van de bloedresultaten werd opgemerkt dat er bij de LTβR -/- muizen een hoger hemoglobinegehalte aanwezig was dan bij de controlepopulatie bestaande uit C57BL/6 muizen. In de literatuur is weinig bekend over de hematologische effecten die optreden bij afwezigheid van de LTβ-receptor . De reden voor het hogere hemoglobinegehalte bij onze LTβR -/- muizen is daarom niet helemaal duidelijk en vormt een onderwerp voor verder onderzoek. De bevinding van het significant hogere leukocytenaantal in het bloed van de LTBR -/muizen bevestigt vroegere onderzoeken en is te verklaren door de totale afwezigheid van lymfeknopen bij de LTβR -/- muizen. Hierdoor worden de leukocyten gedwongen te circuleren in het bloed. Het is dus onmogelijk te oordelen over het al dan niet aanwezig zijn van leukopenie, die vaak aanwezig is bij SLE.
42
De reden van het lagere thrombocytenaantal bij de LTβR -/- muizenstam is niet helemaal duidelijk. Een interessante vaststelling is dat SNP‟s in het lymfotoxine α gen zouden bijdragen tot een verhoogde vatbaarheid voor het ontwikkelen van chronische immune thrombocytopenische purpura (ITP) (Satoh et al., 2004). De pathogenese bij deze pathologie lijkt dezelfde te zijn als deze van lupus, namelijk de vorming van auto-antilichamen gericht tegen glycoproteïnen IIb/IIIa die aanwezig zijn op het plaatjesoppervlak. De frequentie van circulerende B-cellen die anti - glycoproteïne IIb/IIIa antilichamen produceerden, was significant hoger in ITP patiënten met bepaalde lymfotoxine α fenotypes. Aangezien LTα een essentieel deel is van het heterotrimeer LTα1β2, kan het zijn dat, net als bij ontwikkeling van lymfoïde organen, de acties van LTα zich zouden voortzetten in de werking van dit belangrijke ligand. De aanwezigheid van de anti-glycoproteïnen IIb/IIIa antilichamen werd evenwel niet onderzocht in onze studie. Men kan concluderen dat voor de hematologische complicaties van humaan lupus de LTβR -/- muis geen goed model zou zijn. Zo waren er geen tekenen van anemie en omwille van de afwezigheid van lymfeknopen is een mogelijke leukopenie moeilijk te beoordelen. De enige hematologische parameter bij de LTβR -/- muizen die overeenkomt met humane lupus is de thrombocytopenie. Het zou nuttig zijn om ook bij de LTβR -/- muizen de aanwezigheid van antilichamen tegen glycoproteïnen IIb/IIIa te onderzoeken om het precieze mechanisme hiervan te ontrafelen.
5.2 AST- en ALT activiteit Onze bevindingen toonden aan dat er een significant verschil was in zowel de AST- als de ALT-serumactiviteit tussen de LTβR -/- muizen en de C57BL/6 muizen. Hierbij werd er opgemerkt dat slechts een beperkt deel van de onderzochte LTβR -/- muizen een stijging vertoonde van de leverenzymen. Het beperkte aantal muizen met verhoogde leverenzymen contrasteert met de veel hogere prevalentie van anti-Smooth Muscle antilichamen die werden teruggevonden bij de LTβR -/- muizen (87%) (Vanassche, 2009). Lymfocytaire infiltraties in de lever werden al eerder aangetoond bij de LTβR -/- muizen (Boehm et al., 2003). Deze waren toe te schrijven aan verstoorde centrale tolerantie eerder dan aan de afwezigheid van lymfeknopen. Boehm (2003) vond echter geen antilichamen die gericht waren tegen de lever. Dit contrasteert met onze bevindingen (aanwezigheid van antiSmooth Muscle antilichamen) die worden gestaafd door de verhoogde activiteit van leverenzymen in het serum van de LTβR -/- muizen. Slechts een deel van onze LTβR -/muizen vertoonde een activiteitsstijging van de leverenzymen. Dit is analoog aan de 43
bevindingen van Boehm die aantoonde dat niet alle LTβR -/- muizen schade vertoonden aan welbepaalde organen maar dat er een gevarieerd patroon van getroffen organen aanwezig was (bepaald door detectie van auto-antilichamen). Naast bovenvermelde immunologische acties van de LTβ-receptor op de lever is er ook ontdekt dat de LTβ-receptor een essentiële rol speelt bij het leverherstel (Anders et al., 2005). Na partiële hepatectomie zag men dat de LTβR -/- muizen in vergelijking met de controles een veel hogere mortaliteit vertoonden alsook toegenomen levernecrose. Dit ging gepaard met een AST-activiteit die respectievelijk 2 tot 3 maal zo hoog was als deze bij de controles. Deze bevindingen werden later bevestigd (Tumanov et al., 2009). Dit impliceert dat, eens er leverschade is opgetreden bij de LTβR -/- muizen, deze veel moeilijker te herstellen is. Het ontstaan van een negatieve spiraal waarbij auto-immuniteitsfenomenen inflammatie en schade veroorzaken die vervolgens niet meer kan hersteld worden, is dus reëel. Een longitudinale cohorte met regelmatige opvolging van AST/ALT-activiteit bij de LTβR -/- muizen zou dit goed kunnen aantonen. Aangezien leveraantasting bij SLE zeer zelden voorkomt, is de LTβR -/- muizenstam geen goed model voor deze belangrijke medische aandoening.
5.3 Proteïnurie. Vermits onze methode (proteïne/creatinine ratio met verdunning) niet algemeen gebruikt wordt om renale schade bij muizen te detecteren (in andere publicaties maakt men gebruik van dipsticks of onverdunde stalen), werd beslist onze methode te valideren met behulp van de MRL/Lpr muizenstam, een ander lupus muizenmodel.
5.3.1 MRL en MRL/Lpr We vonden bij de MRL/Lpr muizen, zoals verwacht, een ernstigere proteïnurie dan bij de MRL muizen. Dit was vooral uitgesproken bij de vrouwelijke MRL/Lpr muizen zoals duidelijk blijkt uit onze grafieken. In de literatuur wordt vermeld dat er een incomplete penetrantie is van de renale afwijkingen (slechts 50% van de vrouwelijke proefdieren ontwikkelt proteïnurie). Dit blijkt ook uit onze resultaten aangezien de standaarddeviatie van onze urinaire proteïne/ creatinine ratio, net als de variatiecoëfficiënt, aanzienlijk is. Aangezien onze metingen bijna allemaal worden gestaafd door vroegere resultaten uit de literatuur, kan onze methode dus als accuraat bestempeld worden. Zelfs de ratio van proteïnurie cases t.o.v. controles komt grotendeels overeen (www.harlan.com). Bij de mannelijke muizen vonden we een ratioverschil dat niet zoveel bedroeg als dit tussen de vrouwtjes. Dit wijst op een geslachtsspecifieke factor die meespeelt in renale pathologie bij de MRL/Lpr muizen.
44
Doordat onze resultaten sterk overeenkwamen met eerder gepubliceerde gegevens, konden we besluiten dat onze meetmethode accuraat is. Dit spoorde ons aan om de aanwezigheid van proteïnurie te onderzoeken bij pristane-geïnjecteerde muizen.
5.3.2 C57BL/6-PBS en C57BL/6-pristane Onze gegevens toonden aan dat er wel degelijk een verschil was in proteïnurie tussen de C57BL/6 muizen die ingespoten werden met PBS (controles) en diegene die ingespoten werden met pristane (cases). Opmerkelijk was wel dat in onze longitudinale analyse het juist de pristane-geïnjecteerde muizen waren die een lagere hoeveelheid proteïnurie hadden dan de PBS - geïnjecteerde muizen. Deze bevinding was aanwezig in beide geslachten. Aan de hand van onze gegevens kon vermoed worden dat het hier eerder om een baseline verschil ging dan om de aanwezigheid van renale schade. Dit was onverwacht aangezien er wel degelijk autoantilichamen aanwezig waren bij de pristane-geïnjecteerde muizen terwijl deze afwezig waren bij PBS-geïnjecteerde muizen (Vanassche, 2009). In de literatuur werd er wel proteïnurie gevonden bij pristane-geïnjecteerde BALB/c muizen, een lupusresistente stam, en dit door de vorming van immuuncomplex glomerulonefritis (Satoh et al., 1995). Aangezien de pristane geïnduceerde auto-immuniteitsfenomenen voor het eerst werden waargenomen op BALB/c muizen, werd vooral onderzoek gedaan op deze muizenstam. Slechts weinig auteurs gebruikten C57BL/6 muizen als achtergrond voor het pristane lupusmodel. Bij de weinige studies waarbij er toch werd gewerkt met pristanegeïnjecteerde C57BL/6 muizen, werd proteïnurie zelden onderzocht en was er vooral aandacht voor de inductie van auto - antilichamen. Sheehan (1999) meldde het ontstaan van nefritis of proteïnurie bij intraperitoneale pristane-geïnjecteerde C57BL/6 muizen maar verwijst hiervoor naar niet gepubliceerde eigen bevindingen. Aan deze resultaten kan dus getwijfeld worden. Onze proteïnurieresultaten toonden duidelijk aan dat pristane-injectie geen extra renale schade berokkende aan C57BL/6 muizen. De reden waarom dit bij BALB/c muizen gebeurt en niet bij C57BL/6 muizen is een onderwerp voor verder onderzoek.
5.3.3 LTBR -/- en C57BL/6 We troffen een duidelijk verhoogde proteïnurie aan bij de LTβR -/- muizen en dit bij zowel de mannelijke als de vrouwelijke muizen. Dit kan wijzen op de aanwezigheid van belangrijke renale schade bij de LTβR -/- muizen. Net als bij de meeste stammen treft men een grotere proteïnurie aan bij de mannelijke muizen dan bij de vrouwelijke, doch de onderlinge verhouding in proteïnurie tot de controles in beide geslachten lijkt dezelfde te zijn. Een
45
geslachtelijke component in de renale schade is dus niet aanwezig. Wel bemerkten we bij de mannelijke muizen een grotere variatie in de hoeveelheid proteïnurie. Uit de urinaire eiwitelektroforese konden we afleiden dat bij de vrouwelijke muizen de proteïnurie vooral tubulair gelokaliseerd is met ook een glomerulaire component. Analyse van de urinaire macroproteïnen (met molmassa > 60 kDa) toont aan dat de urinaire excretie van macroproteïnen beperkt is tot een matige hoeveelheid albumine en sporenhoeveelheden transferrine. Dit wijst op een selectieve glomerulaire proteïnurie. De poriënletsels ter hoogte van het glomerulaire basale membraan zijn dus van de grootorde 35 – 40 Ǻ (tabel 4).
Proteïne
Mol massa (kDa)
Prealbumine Albumine Transferrine
19.5 (monomeer, soms als tetrameer aanwezig) 68 80
Stokes’ straal (Ǻ)
Concentratie in serum (g/L)
~ polymerisatie
± 0,2
35 40
± 36 ±3
Tabel 7: Moleculaire massa, Stokes’ straal en serumconcentraties van de waargenomen urinaire eiwitten bij LTβR -/- muizen.
De extra “eiwit-band” die we aantroffen bij de LTβR -/- muizen en niet bij de C57BL/6 muizen werd geïdentificeerd als pre-albumine. Aangezien dit eiwit een moleculaire massa heeft van rond de 20.000 Dalton en de moleculaire “zeef” van het glomerulaire membraan enkel plasma-eiwitten tegenhoudt tot ± 68.000 Dalton, kan het verschijnen van dit eiwit niet worden toegeschreven aan een glomerulaire pathologie. Uit de literatuur was al bekend dat pre-albumine bij de muis wordt geresorbeerd in de proximale tubulus (Sousa et al.,2000) . Wij vermoeden dan ook dat de pathologie vooral hier is gesitueerd. Of deze tubulaire schade primair is, dan wel te wijten aan “overflow” van glomerulaire proteïnurie die vervolgens leidt tot beschadiging van de proximale tubulus, dient nader te worden onderzocht. Glomerulaire schade resulteert immers in de hyperfiltratie van plasmaproteïnen, die deels worden opgenomen door de proximale tubuluscellen. Bij overbelasting van dit systeem treedt er accumulatie op van proteïnen in de tubuluscellen, wat leidt tot inflammatie, productie van vasoactieve en inflammatoire componenten en uiteindelijk fibrosering en verminderde functie van de tubuluscellen (Remuzzi en Bertani, 1998). Aangezien we beschikken over een databank met histologische coupes van zowel LTβR -/- als C57BL/6 muizen, zou in de toekomst kunnen onderzocht worden waar het renale defect zich
46
bevindt en of dit al dan niet te wijten is aan een aanlegstoornis, dan wel aan een auto-immuun proces.
47
6 Referenties ANDERS R. A., SUBUDHI S. K., WANG J., PFEFFER K. and FU Y. X.: Contribution of the lymphotoxin beta receptor to liver regeneration. J. Immunol., 2005, 175(2), 1295-1300. BALOW J.E.: Clinical presentation and monitoring of lupus nephritis, Lupus. 2005, 14(1), 25-30. BEYAN E., BEYAN C., TURAN M.: Hematological presentation in systemic lupus erythematosus and its relationship with disease activity, Hematology, 2007, 12(3), 257-261. BEYNON R. J., HURST J. L.: Urinary proteins and the modulation of chemical scents in mice and rats. Peptides, 2004, 25(9), 1553-1563. BOEHM T., SCHEU S., PFEFFER K. and BLEUL C. C.: Thymic medullary epithelial cell differentiation thymocyte emigration, and the control of autoimmunity require lymphoepithelial cross talk via LT beta R. J. Exp. Med., 2003, 198(5), 757-769. BOGDANOS D. P., INVERNIZZI P., MACKAY I. R. and VERGANI D.: Autoimmune liver serology: Current diagnostic and clinical challenges. World J. Gastroenterol., 2008, 14(21), 3374-3387. BRENNEMAN M., RIGBY P.: Protein electrophoretic patterns of serum and peritoneal fluid in normal, tumor-bearing, and immune mice. Cancer Res. 1968, 28(6), 1138-1142. BROWNING J. L.: Inhibition of the lymphotoxin pathway as a therapy for autoimmune disease. Immunol. Rev., 2008, (223), 202-220. CALVANI N., SATOH M., CROKER B. P., REEVES W. H. and RICHARDS H. B.: Nephritogenic autoantibodies but absence of nephritis in Il-12p35-deficient mice with pristane-induced lupus. Kidney Int., 2003, 64(3), 897-905. CAMERON J. S.: Lupus nephritis. J. Am. Soc. Nephrol., 1999, 10(2), 413-424. CHIN R. K., LO J. C., KIM O., BLINK S. E., CHRISTIANSEN P. A., PETERSON P., WANG Y., WARE C. and FU Y. X.: Lymphotoxin pathway directs thymic Aire expression. Nat. Immunol., 2003, 4(11), 1121-1127. CHIN R. K., ZHU M. Z., CHRISTIANSEN P. A., LIU W. H., WARE C., PELTONEN L., ZHANG X. J., GUO L. J., HAN S. H., ZHENG B. and FU Y. X.: Lymphotoxin pathwaydirected, autoimmune regulator-independent central tolerance to arthritogenic collagen. J. Immunol., 2006, 177(1), 290-297. D'CRUZ D. P., KHAMASHTA M. A. and HUGHES G. R. V.: Systemic lupus erythematosus. Lancet, 2007, 369(9561), 587-596. ELEWAUT D., WARE C. F.: The unconventional role of LT alpha beta in T cell differentiation. Trends Immunol., 2007, 28(4), 169-175.
48
FITZMAURICE G. M., LAIRD N. M., WARE J. H., Applied longitudinal analysis. John Wiley and Sons Ltd., New York, 2004. GIANNOULI S., VOULGARELIS M., ZIAKAS P. D. and TZIOUFAS A. G.: Anaemia in systemic lupus erythematosus: from pathophysiology to clinical assessment. Ann. Rheum. Dis., 2006, 65(2), 144-148. GOMMERMAN J. L., BROWNING J. L.: Lymphotoxin/light, lymphoid microenvironments and autoimmune disease. Nat. Rev. Immunol., 2003, 3(8), 642-655. HOCHBERG M. C.: Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum., 1997, 40(9), 1725-1725. KEELING D. M., ISENBERG D. A.: Hematological Manifestations of Systemic LupusErythematosus. Blood Rev., 1993, 7(4), 199-207. KOKORI S. I. G., IOANNIDIS J. P. A., VOULGARELIS M., TZIOUFAS A. G. and MOUTSOPOULOS H. M.: Autoimmune hemolytic anemia in patients with systemic lupus erythematosus. Am. J. Med., 2000, 108(3), 198-204. KRAWITT E. L.: Medical progress: Autoimmune hepatitis. N. Engl. J. Med., 2006, 354(1), 54-66. KRAWITT E. L.: Clinical features and management of autoimmune hepatitis. World J. Gastroenterol., 2008, 14(21), 3301-3305. KYEWSKI B., KLEIN L.: A central role for central tolerance. Annu. Rev. Immunol., 2006, (24), 571-606. LEUNG Y. Y., SZETO C. C., TAM L. S., LAM C. W. K., LI E. K., WONG K. C., YU S. W. and KUN E. W.: Urine protein-to-creatinine ratio in an untimed urine collection is a reliable measure of proteinuria in lupus nephritis. Rheumatology, 2007, 46(4), 649-652. MANNS M. P., VOGEL A.: Autoimmune hepatitis, from mechanisms to therapy. Hepatology, 2006, 43(2), S132-S144. MARTINS V. C., BOEHM T. and BLEU C. C.: Lt beta r signaling does not regulate airedependent transcripts in medullary thymic epithelial cells. J. Immunol., 2008, 181(1), 400407. NACIONALES D. C., KELLY-SCUMPIA K. M., LEE P. Y., WEINSTEIN J. S., LYONS R., SOBEL E., SATOH M. and REEVES W. H.: Deficiency of the type I interferon receptor protects mice from experimental lupus. Arthritis Rheum., 2007, 56(11), 3770-3783. PAVITHRAN K., RAJI N. L, THOMAS M.: Aplastic anemia complicating systemic lupus erythematosus--report of a case and review of the literature. Rheumatol Int. 2002, 22(6), 253255. RAHMAN A., ISENBERG D. A.: Mechanisms of disease: Systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med., 2008, 358(9), 929-939. Rheumatol. Int. 2002, 22(6), 929-939 49
RAJASHEKAR A., PERAZELLA M. A. and CROWLEY S.: Systemic diseases with renal manifestations. Primary Care, 2008, 35(2), 297-328. REMUZZI G., BERTANI T.: Pathophysiology of progressive nephropathies. N. Engl. J. Med., 1998, 339(20), 1448-1456. REUTER A. M., KENNES F., LEONARD A. and SASSEN A.: Variations of Prealbumin in Serum and Urine of Mice According to Strain and Sex. Comparative Biochemistry and Physiology, 1968, 25(3), 921-928. RUMKE P., THUNG P. J.: Immunological Studies on Sex-Dependent Prealbumin in Mouse Urine + on Its Occurrence in Serum. Acta Endocrinol., 1964, 47(1), 156-164. SATOH M., KUMAR A., KANWAR Y. S. and REEVES W. H.: Antinuclear AntibodyProduction and Immune-Complex Glomerulonephritis in Balb/C Mice Treated with Pristane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92(24), 10934-10938. SATOH T., PANDEY J. P., OKAZAKI Y., YASUOKA H., KAWAKAMI Y., IKEDA Y. and KUWANA M.: Single nucleotide polymorphisms of the inflammatory cytokine genes in adults with chronic immune thrombocytopenic purpura. Br. J. Haematol., 2004, 124(6), 796801. SHAHEEN V. M., SATOH M., RICHARDS H. B., YOSHIDA H., SHAW M., JENNETTE J. C. and REEVES W. H. (1998). Immunopathogenesis of environmentally induced lupus in mice. Workshop on Linking Environmental Agents to Autoimmune Diseases, Res Triangle Pk, North Carolina, Us Dept Health Human Sciences Public Health Science. SOUSA M. M., NORDEN A. G. W., JACOBSEN C., WILLNOW T. E., CHRISTENSEN E. I., THAKKER R. V., VERROUST P. J., MOESTRUP S. K. and SARAIVA M. J.: Evidence for the role of megalin in renal uptake of transthyretin. J. Biol. Chem., 2000, 275(49), 3817638181. SULTAN S. M., BEGUM S. and ISENBERG D. A.: Prevalence, patterns of disease and outcome in patients with systemic lupus erythematosus who develop severe haematological problems. Rheumatology, 2003, 42(2), 230-234. TUMANOV A. V., KOROLEVA E. P., CHRISTIANSEN P. A., KHAN M. A., RUDDY M. J., BURNETTE B., PAPA S., FRANZOSO G., NEDOSPASOV S. A., FU Y. X. and ANDERS R. A.: T Cell-Derived Lymphotoxin Regulates Liver Regeneration. Gastroenterology, 2009, 136(2), 694-704. VANASSCHE I.: Studie van het ontstaansmechanisme van autoreactiviteit tegenover nucleaire antigenen in lymfotoxine deficiënte muizenstammen en validatie van de LIA, Ugent, 2009. VASILIADES J.: Reaction of Alkaline Sodium Picrate with Creatinine .1. Kinetics and Mechanism of Formation of Mono-Creatinine Picric Acid Complex. Clin. Chem., 1976, 22(10), 1664-1671.
50
WARE C. F.: Network communications: Lymphotoxins, LIGHT, and TNF. Annu. Rev. Immunol., 2005, (23),787-819. WARE C. F.: Targeting lymphocyte activation through the lymphotoxin and LIGHT pathways. Immunol. Rev., 2008, (223), 186-201. ZHU M. Z., CHIN R. K., TUMANOV A. V., LIU X. J. and FU Y. X.: Lymphotoxin beta receptor is required for the migration and selection of autoreactive T cells in thymic medulla. J. Immunol., 2007, 179(12), 8069-8075. ZIAKAS P. D., GIANNOULI S., ZINTZARAS E., TZIOUFAS A. G. and VOULGARELIS M.: Lupus thrombocytopenia: clinical implications and prognostic significance. Ann. Rheum. Dis., 2005, 64(9), 1366-1369.
51
