De beoordeling van het effect van een antimicrobieel wondverband op biofilms

De beoordeling van het effect van een antimicrobieel wondverband op biofilms Uit: Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on biofilms Percival S. L., P. Bowler en E.J.Woods. Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on Biofilms. Wound Rep Reg.2008. nr.16, p.52–57 Vrij vertaald door Gratienne Van den Berghe en Luc Gryson

Gratienne Van den Berghe Student postgraduaat wondzorg , stomatherapie en weefselherstel Luc Gryson Voorzitter CNC wondzorgvereniging Coördinator WOUND-Ex Expertisecentrum van de HUBrussel Abstract Dit artikel beschrijft de studie die handelt over het bepalen van de antimicrobiële werking van een zilverbevattend verband op biofilms gekweekt op een in vakken opgedeeld microscoopglas. Vóór het aanbrengen van een wondverband op een 24-uurs biofilm, bestaande uit zowel Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Staphylococcus aureus, of een gemengde bacteriële gemeenschap, werd een fluorescerende kleurstof aangebracht. Dit stelt de levensvatbaarheid vast van bacteriën in die biofilm, te volgen in real-time, met behulp van een confocale ‘laser scanning’-microscoop over een contactperiode van 48 uur. Door analyse van alle drie-dimensionale data, gegenereerd uit de gelijktijdig in focus gebrachte in tijd overlappende sequenties, werd vastgesteld dat 90% van alle aanwezige bacteriën in de biofilm geleidelijk rood werden binnen 24 uur (afstierven). Na 48 uur werden alle bacteriën dood aangetroffen in de biofilm. Dit onderzoek heeft aangetoond dat het wondverband effectief was in het doden van de bacteriën, zichtbaar in de geteste mono-en polymicrobiële biofilms. Er zijn aanwijzingen dat dit verband ook een effect kan hebben op biofilms gevonden in niet-helende chronische wonden. Artikel Er is beschreven dat biofilms vaak voorkomen op die plaatsen waar gezondheidszorg en geneeskunde beoefend wordt. Het NHI (National Health Institute) van het Verenigd Koninkrijk heeft gemeld dat biofilms voorkomen bij 80% van alle bekende infecties. Specifieke gebieden waar biofilms gekend zijn om hun problematische gevolgen zijn, inbegrepen het ziekenhuis en de voorzieningen van drinkbaar water, medische prothesen en katheters, diergeneeskunde en cystic fibrosis. Biofilms worden beschreven als een microbiële gefixeerde gemeenschap, gekenmerkt door cellen die onomkeerbaar of onherroepelijk verbonden zijn of zijn bijgevoegd aan een grondlaag of voedingsbodem of grensvlak dan wel scheidingsvlak of aan elkaar. Ze zijn ook ingebed in een matrix van extracellulaire polymere stoffen die zij hebben geproduceerd en vertonen een veranderd fenotype met betrekking tot groei en gentranscriptie. Momenteel worden de bacteriën, gevonden in chronische wonden, onderkend als deel van een biofilms en zo dragen ze bij tot besmetting en een vertraagde genezing.

Klinisch worden biofilms vaak waargenomen als een doorschijnend, glanzend en slijmerig verschijnsel op gekoloniseerde niet-helende wondoppervlakken. Ze reageren weinig tot niet op traditionele antimicrobiële therapieën en de wonden vertonen geen tekenen van genezing. Het is bewezen dat biofilms mechanismen bezitten die hen toestaan te ontsnappen aan het immuunsysteem van de gastheer, en dat een biofilm de virulentie van bacteriën ondersteunt. Dit heeft als gevolg dat de standaard wondzorgpraktijk ingewikkelder is wanneer er “pathogene” biofilms aanwezig zijn in een wonde. Als er “pathogene” biofilms aanwezig zijn in chronische wonden, brengt dit de normale wondgenezing in gedrang. Het is wenselijk dat alle antimicrobiële middelen die worden gebruikt in de wondzorg effectief zijn in het voorkomen van de ontwikkeling maar ook in het doden van bacteriën, niet alleen in hun vrije zwevende “plankton” vorm, maar ook in hun natuurlijke biofilmvorm. Echter, een groot probleem in de behandeling van niet-genezende en geïnfecteerde wonden is het feit dat bacteriën in een biofilm fenotypisch meer tolerant en resistent zijn tegen antimicrobiële therapieën in vergelijking met hun planktonische tegenhangers in plankton. Antimicrobiële verbanden die Ionisch zilver bevatten, worden steeds vaker gebruikt voor de behandeling van de microbiële bioburden in besmette of mogelijk besmette chronische wonden. Het is wenselijk dat deze verbanden dan ook effectief zijn in het voorkomen en afbreken van biofilmvorming, alsook voor de microben die voorbestemd zijn om een biofilm te doen ontstaan. Met behulp van de real-time analyse werd, tot op heden nog niet eerder vermeld in de literatuur, het effect van een zilverbevattend wondverband op biofilms beschreven. Het doel van deze studie was om de antimicrobiële werkzaamheid van een zilverbevattend Hydrofiber® (SCH) verband te bepalen op bacteriën die groeien in een biofilm. MATERIALEN EN METHODES Test materialen Zowel een zilver bevattend Hydrofiber® (SCH) verband (100% natrium carboxymethylcellulose met 1,2% w / v ionische zilver), als een niet-zilver bevattende Hydrofiber® (NSH) verband werden gebruikt in deze studie. Alle verbanden werden aseptisch gesneden tot een grootte van 1 x 0,5 cm om ze gebruiksklaar te maken voor verwerking in het biofilm model. Micro-organismen De Pseudomonas aeruginosa (NCMIB 8626), Staphylococcus aureus (NCMIB 9318), en Enterobacter cloacae (NCMIB 10005) werden gekweekt met behulp van trypton soja bouillon (TSB) (Oxoid, Cambridge, UK). Voorbereiding van het testmateriaal Om de visualisatie van bacteriën mogelijk te maken in een biofilm werden alle biofilms gekleurd met behulp van de BacLight™ Bacterial Viability Kit (Invitrogen, Paisley, UK). De kit bestond uit twee fluorescente kleurstoffen, propidium iodide (PI) en Syto-9 ™ (S-9). Levensvatbare bacteriën kleuren groen met de S-9 en na de dood verdringt PI de kleurstof S-9 in een rode kleur. De Live/Dead® BacLicht™ kleurstof werd bereid volgens instructies van de fabrikanten. Dit werd opgeslagen op een donkere plaats met een vereiste temperatuur van 4°C. Biofilm model en visualisatie Alle bacteriën werden voorbereid in TSB tot een concentratie van 1.0 x 106 kve/ml. Een microliter (µl) van elk bacterieel inoculum werd afzonderlijk toegevoegd aan een Nunc LabTek™ dekglaasje (Thermo Fischer Scientific, Loughborough, UK, figuur 1) en gekweekt op een rond schudapparaat (300 r.p.m.) voor 24 uur op 35 ± 3°C.

Voor de vorming van een gemengd soort biofilm werd 0,5 ml van 1.0 x 106 kve/ml preparaten van S. aureus en P. aeruginosa toegevoegd aan de LabTek™ model en gemengd in het voorziene putje van het dekglaasje. Na de broedperiode werd TSB aangezogen uit de holtes van de dekglaasjes. Planktonische cellen werden verwijderd uit de stalen door ze tweemaal te wassen in 1ml optimaal oplosmiddel. (MRD, Oxoid). Om een telling van de cellen in biofilms te verkrijgen, biofilms groeiden op een bodem van een dia (n=3), werden ze na het wassen in 30 ml MRD zak geplaatst. De dekglaasjes werden vervolgens aan ultrasone trillingen blootgesteld gedurende 15 minuten in een ultrasone trilwaterbad om cellen te verwijderen uit een trypton soja bouillon (TSA). Met het oog op het fluorescent zien van levende en dode cellen in de biofilm, werd aan elk putje 150 µl van het Live/Dead® Baclight™ kleurstof toegevoegd. Het biofilm model werd vervolgens in het donker gekweekt bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. In dit stadium werd gebruik gemaakt van een confocale microscoop om na te gaan welke dikte de biofilm had op het dekglaasje. Om het effect van de antimicrobiële verbanden op biofilms te testen, werd een stukje van elk Hydrofiber® verband (1 cm x 0,5 cm) gehydrateerd in 150 µl MRD en vervolgens afzonderlijk geplaatst in de putjes die de gekleurde biofilm bevatten. Toen werden er beelden genomen van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen in biofilms, gelegen onder de verbanden, na contacttijden van 3, 24, en 48 uur (alle testmodellen werden gekweekt bij 35 ± 3°C). Alle testen werden driemaal uitgevoerd. Er werden ook passende controles opgezet nl. geen verband (MRD alleen) en een verband NSH. De levensvatbaarheid van de biofilms werd visueel beoordeeld over een minimum van 10 willekeurige driedimensionale gezichtsvelden. Gebaseerd op deze gezichtsvelden werd een schatting gemaakt van het percentage van levende (groen) en dode (rode) gebieden. Hoe werden de resultaten opgenomen en gemeten Biofilms werden waargenomen met behulp van een Leica® TCS SP2 omgekeerde snelle scanning confocale laser microscoop (RSCLM). De set-up van de microscoop was gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen. Er werd voor het onderzoek bij een lage vergroting, een 10 x objectief lens samen met een 10 x oculaire lens gebruikt (formaat in de RCLSM vastgesteld op 512 x 512 pixels in een 1mm² scangebied). Voor een hogere vergroting werd een 40/1.3 x NA objectief lens plus een 10 x oculaire lens gebruikt (een formaat van 512 x 512 pixels in een 250 µm² scangebied). De groei van de biofilm, in de LabTek™ dia, werd in beeld gebracht voor en na de behandeling. Dit met behulp van de RSCLM set om de golflengten tussen 500-530nm (voor de S-9 kleurstof) en 610-640nm (voor de PI kleurstof) in beeld te brengen. Alle foto's werden genomen op 400 x vergroting. Dertig Z scans door middel van 10-40 µm werden genomen op een tijdstip gedurende een 48-uurs tijdsverloop. Er werd opeenvolgend om de 3, 24, en 48 uur beelden van biofilm genomen, blootgesteld aan NSH en SCH verbanden.

Figure 1

LabTek dia biofilm model. Bacteriële biofilms werden gevormd op het oppervlak van glazen dekglaasjes in ‘Nunc four-well LabTek chambered coverglass’ dia's. Een microliter van bacteriële inoculum was toegevoegd aan elk 1.8cm² putje om een biofilm te vormen binnen de 24 uur. Antimicrobiële wondverbanden werden toegevoegd aan het oppervlak van deze biofilms en de visualisatie gebeurd van onder het dekglaasje, zoals afgebeeld, met behulp van een laser scanning confocale microscopie. Overgenomen uit: Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on biofilms Percival S. L., P. Bowler en E.J.Woods. Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on Biofilms. Wound Rep Reg.2008. nr.16, p.52–57

RESULTATEN Uit de LabTek™ werden bacteriële cellen verkregen, reproduceerbaar tot een biofilm na de eerste 24uurs groeifase. P. aeruginosa toont een hoger niveau van groei nl.10 x maal (4,0± 0,4 x 109 CFU / ml) dit vergeleken met S. aureus (2,8 ±0,5 x 108 CFU / ml) en E. cloacae (3,0± 0,4 x108 CFU / mL). Het aantal kiemen binnen de gemengde biofilm van de P. aeruginosa en S. aureus weerspiegelt ook het verhoogde groeipotentieel van P. aeruginosa met een groei van 5,5± 0,3x109 CFU / ml vergeleken met 7,0± 0,7x107 CFU/mL van S. aureus. Biofilms en de bijbehorende structuren waren duidelijk zichtbaar (na toevoeging van de Live/Dead® BacLight™ kleurstof) met behulp van de RCLSM. Het LabTek™ slide model voorziet een ideale ondergrond voor biofilmgroei en biedt de mogelijkheid om de effectiviteit van de SCH verbanden vast te stellen. Drie-dimensionale confocale beelden kunnen de dikte van de biofilms inschatten door de structuur van boven naar beneden te scannen. Alle biofilms werden in tot een dikte van10-60 µm gebracht, afhankelijk van het onderzochte gebied. Biofilms verschenen verdikt rond de randen van de dia, waar de putranden het dekglaasje raken. Dit werd verondersteld een gevolg te zijn van de vergroting van de oppervlakte aan welke de cellen zich kunnen hechten en zich vermenigvuldigen. Na 3 uur contacttijd met MRD (controle) werd de groei van bacteriën met een karakteristieke microcolonie van levensvatbare P. aeruginosa, indicatief voor biofilm ontwikkeling, waargenomen (figuur 2A). Na een contacttijd van 24 en 48 uur met MRD werd een dichte biofilm zichtbaar met overgrote meerderheid van P. aeruginosa cellen in de groen fluorescerende biofilm (figuur 2B en C). Deze zelfde biofilm met de morfologische karakteristieken en eigenschappen, werd ook geconstateerd bij S. aureus en E. cloacae (figuur 2D-F). Het bekijken van de controle biofilms bevestigt dat de specimens in het onderzoek zeer fanatieke levensvatbare biofilm vormers zijn (figuur 2G-L). Bovendien is een ontwikkelde gemengde biofilm van S. aureus en P. aeruginosa ook een uitgebreid Microcolonie oppervlak van het model met het bewijs van duidelijke afbakening tussen de geslachten van antagonistische sociomicrobiologie tussen de stammen (figuur 2J-L). Gemengde biofilms bleken voornamelijk samengesteld te zijn uit P. aeruginosa met kleinere afzonderlijke gebieden van de S. aureus. Deze waarneming geeft de resultaten weer, zichtbaar tijdens de initiële vorming van de biofilm, waar cel aantallen van S. aureus 10 tot 100-voudig lager voorkomen dan P. aeruginosa in enkelvoudige en gemengde biofilms. Alle controle biofilms bleven significant levensvatbaar (> 90%) na meer dan 72 uur wanneer het in contact werd gebracht met de negatieve controle (MRD alleen figuur 2A-L). Na de toevoeging van het controle NSH (nonantimicrobial) controle verband, was de levensvatbaarheid van een 24-uurs biofilm van P. aeruginosa (figuur 3A-C), S. aureus (Figuur 3D-F), E. cloacae (figuur 3G-I), en de gemengde biofilm (figuur 3J-L) duidelijk zichtbaar in de gehele testperiode van 48 uur. Echter, een interessante observatie was het vermogen van enkele vezels van het Hydrofiberverband om de groei van biofilms te remmen op het oppervlak van het dekglaasje. Biofilms behandeld met de NSH schijnen met minder dicht en met minder microkolonies voor te komen ten opzichte van de MRD controles.

Dit blijkt in figuur 3 (C, E-G-en L), bovendien blijkt het intieme contact tussen de vezels van het Hydrofiber® verband en het dia-model oppervlak aangetoond (dit gebied is aangegeven met pijlen). Terwijl de E. cloacae, S. aureus, P. aeruginosa consequent groeide, over een totale periode van 72 uur in aanwezigheid van de NSH verband, was er een duidelijk bewijs over de gevoeligheid (dood) van de P. aeruginosa biofilms op de SCH verband na 24 uur (figuur 4A-C). Na penetratie van PI in de bacteriën treedt er celdood op en dit resulteert in de opgenomen rode kleur in de cel. Beelden voor zowel S. aureus (Figuur 4D-F) en E. cloacae (figuur 4G-I) en een gemengd biofilm van P. aeruginosa en S. aureus (figuur 4J-L) bevestigen de doeltreffendheid van het SCH verband op de biofilm. In biofilms, bestaande alleen uit P. Aeruginosa, begon celdood voor te komen in sommige cellen na slechts 3 uur contact met het SCH verband, zoals aangegeven door de verschijning van PI-gekleurde bacteriën (figuur 4A en G). Meer dan 90% celdood stelt men vast bij de P. aeruginosa Biofilm (Figuur 4B), de E. cloacae biofilm (figuur 4H), en de gemengde biofilm na 24 uur blootstelling aan ionisch zilver. Het doden van alle bacteriën in alle biofilms werd bereikt binnen de 48 uur (Figuur 4F en L), dit kon bepaald worden door het volledig ontbreken van groene cellulaire vlekken in het hele gebied van de biofilm onder het verband. DISCUSSIE Het is gekend dat infectie de genezing van chronische wonden verhindert. Residerende bacteriën in wonden, in het bijzonder binnenin de biofilms, worden geacht vertraging te veroorzaken van de wondgenezing louter omwille van hun aanwezigheid in de wonde. Biofilms, gunstige of pathogene, worden verondersteld aanwezig te zijn in alle chronische wonden. Pathogene biofilms en de extracellulaire polymere stoffen, exo-enzymen en toxinen gevonden in de biofilm, verlengen de chronische ontsteking in deze wonden. Deze pathogene biofilms vormen daarom een belangrijk aandachtspunt in de wondzorg vanwege hun versterkte microbiële activiteit en de verminderde doeltreffendheid van de antimicrobiële stoffen in hun aanwezigheid. Bijgevolg is het wenselijk dat wondverbanden met antimicrobiële stoffen, zoals ionisch zilver, werkzaam zijn tegen de nadelige effecten van biofilms in wonden en dus bacteriën doden. Binnen deze studie poogde men te bepalen of een zilver met Hydrofiber® verband (SCH) effectief was in het doden van bacteriën in een biofilm, waarvan men weet dat deze zou kunnen voorkomen in chronische wonden. Men maakte gebruik van een speciaal geselecteerd model voor de visualisatie van biofilms. Eerste laboratorium studies toonden aan dat alle soorten van bacteriën hiervoor gebruikt, gemakkelijk biofilms vormen na slechts drie uur groeien in de LabTek™ slide model. Na real-time visualisatie op lange termijn studies (tot 72 uur), bleek het SCH verband effectief te zijn in het doden van de geteste bacteriën, zowel binnen de geteste mono-en poly-microbiële biofilms en dit binnen de 48 uur. Uit dit resultaat, in aanvulling eerder werk, is gebleken dat het SCH verband effectief is bij het remmen van bepaalde biofilms en het doden van bepaalde bacteriën in een biofilm. Gelijktijdig met deze studie, was er een recente studie uitgevoerd door Chaw et al. die konden aantonen met behulp van elektronen microscoop dat de zilver-ionen de mogelijkheid hebben om biofilm structuren af te breken en te verstoren bij concentraties van meer dan 50 p.p.b. Onderzoeken uitgevoerd door Newman et al. hebben aangetoond dat plankton P. aeruginosa al begonnen dood te gaan na een contacttijd van 20 minuten met de SCH verband en na 100 minuten werden vrijwel alle planktonische bacteriën fluorescerend rood, dus celdood.

Daarentegen, in onze studie, werden de bacteriën, die groeiden tot een biofilm fenotype, gedood na 3 uur. Meer dan 90% van het doden, was echter bereikt na een 24-uurs contacttijd met de SCH verband. Dit geeft aan hoe fenotypisch resistente bacteriën kunnen worden bij het kweken in een biofilm in vergelijking met hun planktonische tegenhangers. De resultaten ontstaan uit Newmans en uit deze huidige studie, suggereren ook dat S. Aureus minder gevoelig is voor ionisch zilver dan P. Aeruginosa. Dit blijkt omdat een langere blootstelling aan zilver nodig is om S. aureus te doden (24 uur, figuur 4E) ten opzichte van P. aeruginosa (3 uur, figuur 4A). In het geval dat er SCH verbanden gebruikt worden en het ionische zilver in contact komt met een biofilm, kan dit leiden tot een beperking van pathogene weefsel, een vermindering van de nadelige effecten op gezond weefsel en tot een vermindering van de totale wondbelasting. ''Anti-biofilm'' wondverband, zoals de SCH dressing, kan ervoor zorgen dat het natuurlijk genezingsproces de overhand krijgt en de microbiële belasting in de biofilm afneemt. De resultaten verkregen in deze studie, suggereren dat het SCH verband een rol heeft gespeeld bij het behandelen van mogelijks besmette biofilms en bij geïnfecteerde niet helende chronische wonden. Bovendien werd er in de vezels van het Hydrofiber® verband, in sommige gevallen toch, het remmen van de vorming van biofilm getoond, ongeacht de werkzame stof. Wanneer het SCH verband, gebruikt in de studie, de beschikbaarheid van ionische zilver op de biofilm in de wonde voor een langere periode optimaliseert, dan kan de biofilm ontwikkeling en bepaalde bacteriële hergroei vertraagd worden. Dit onderzoek is een voorbereiding op toekomstige onderzoeken naar de differentiële effecten van de infectiecontrole op de bacteriën in een biofilm. De LabTek™ biofilm model voorziet het ideale platform om potentiële biofilm behandelingen te testen. Via dit systeem kunnen de effecten visueel worden vastgesteld wat betreft hun doeltreffendheid in-vitro en het resultaat van het zilver Hydrofiber verband op de overleving van biofilms met bekende bacteriën kan worden aangetoond. Samengevat, de LabTek™ diakamer voorziet een robuust en reproduceerbaar ssyteem om biofilms te visualiseren en de verbanden te beoordelen op vlak van de efficiëntie op de biofilms van de wonde. Het SCH verband heeft aangetoond dat het een hoog percentage (meer dan 90 %) van de geteste bacteriën in biofilms kan doden binnen de 24 uur, met een 100% bactericide werking binnen de 48 uur. Op basis van de resultaten van deze studie, kunnen de fysieke en antimicrobiële eigenschappen van de SCH wondverbanden synergetisch werken, preventief zijn en ook steun bieden bij het behandelen van biofilmvorming in wondgeassocieerde bacteriën. *Hydrofiber® is a registered trademark of E.R. Squibb and Sons, LLC. All other trademarks are the property of their respective owners.

Figuur 2 Groei van de controle LabTek biofilms op dekglaasjes, onbehandelde biofilms van Pseudomonas aeruginosa (A-C), Staphylococcus aureus (D-F), Enterobacter cloacae (G-I), en een mix van P. aeruginosa en S. aureus (J-L) werden onderzocht over een tijdsverloop vergelijkbaar aan die behandeld werden met verbanden, om ontwikkeling te volgen van de biofilm. Biofilms werden afgebeeld op 3 uur (A, D, G en J), 24 uur (B, E, H en K), en 48 uur (C, F, I en L) na de eerste 24uurs periode van groei. Deze serie illustreert de vorming en de rijping van een samenvloeiing van de biofilm over het oppervlak van de dia van het dekglaasje. De rode kleur, propidium jodide, komt overeen met niet-levensvatbare cellen en de groene kleur, syto 9, komt overeen met levensvatbare cellen. Overgenomen uit: Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on biofilms Percival S. L., P. Bowler en E.J.Woods. Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on Biofilms. Wound Rep Reg.2008. nr.16, p.52–57

Figuur 3 Toevoeging van een nonsilver Hydrofibers (NSH) tot LabTek dekglaasje op biofilms. De NSH werd toegevoegd aan het oppervlak van de 24-uurs biofilms gevormd door Pseudomonas aeruginosa (A-C), Staphylococcus aureus (D-F), Enterobacter cloacae (G-I), en een mix van P. aeruginosa en S. aureus ( J-L). Beelden van gebieden van biofilm onder het verband werden verkregen op 3 uur (A, D, G en J), 24 uur (B, E, H en K), en 48 uur (C, F, I en L) na de toevoeging van het verband. Beelden tonen dat de aanwezigheid van de NSH aan het oppervlak van de biofilm de groei eronder remt in vergelijking met de controle biofilms over een soortgelijk tijdsbestek (figuur 1). Pijlpunten geven de omtrek aan van verbandvezels, illustreren intiem contact tussen het verband en de oppervlakte van de biofilm. De rode kleur, propidium jodide, komt overeen met niet-levensvatbare cellen en de groene kleur, SYTO 9, komt overeen met levensvatbare cellen. Overgenomen uit: Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on biofilms Percival S. L., P. Bowler en E.J.Woods. Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on Biofilms. Wound Rep Reg.2008. nr.16, p.52–57

Figuur 4. Toevoeging van zilver bevattende Hydrofibers (SCH) op LabTek coverglass biofilms. Het zilver bevattende verband SCH werd toegevoegd aan het oppervlak van de 24-uurs biofilms van Pseudomonas aeruginosa (A-C), Staphylococcus aureus (D-F), Enterobacter cloacae (G-I), en een mix van P. aeruginosa en S . aureus (JL). Confocale beelden van biofilms onder het verband werden verkregen op 3 uur (A, D, G en J), 24 uur (B, E, H en K), en 48 uur (C, F, I en L) na het aanbrengen van het verband. Bewijs van celdood was zichtbaar na 3 uur, met > 90% van de biofilm gedood na 24 uur. Volledige celdood werd gezien bij alle onderzochte biofilms na 48 uur. Pijlpunten geven de omtrek van het vezelverband aan, illustreren intiem contact tussen het verband en het oppervlak van de biofilm. De rode kleur, propidium jodide, komt overeen met niet-levensvatbare cellen en de groene kleur, SYTO 9, komt overeen met levensvatbare cellen. Overgenomen uit: Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on biofilms Percival S. L., P. Bowler en E.J.Woods. Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on Biofilms. Wound Rep Reg.2008. nr.16, p.52–57