38
DAFTAR PUSTAKA Aebi, H., (1984), Catalase. In Packer (Ed). Methods in Enzymology, Academic Press Orlando, 105 : 121 – 126. Alexander, R.R. and Griffiths, J.M., (1993), Basic Biochemical Methods, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, p.44-60. Beaumont, F., Jouvec, H., M., Gagnon, J., Gaillard, J., and Pelmont, J., (1990), Purification and Properties of a Catalase from potato tubers (Solanum tuberosum L), J. Plant Science, 72, p.19-26. Boyer, R.F., (1993), Modern Experimental Biochemistry, 2nd Benjamin/Cummings Pub., Co., Inc., California, p.42-210.
Edition,
The
Bradford, MM., (1976), A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding., Analytical Biochemistry, 72, p. 248-254. Delpech, R., (2007), Microscale Investigation with Catalase, Student Sheet 24, SAPS. Demir, H., Yoruk, H., Ekici, K., and Savran, A., (2005), Purification and Properties of Catalase from Van Apple (Golden Delicious), Pakistan Journal of Nutrition, volume 4, p. 8-10. Depdikbud, (2007), Garis Besar Program Pengajaran (GBPP) Biologi SMU dan sederajat, Standar isi KTSP 2006, Jakarta. Depdikbud, (2007), Garis Besar Program Pengajaran (GBPP) Kimia SMU dan sederajat, Standar isi KTSP 2006, Jakarta. Dikdasmen, Depdikbud, (2007), Pengembangan Silabus dan Sistem Penilaian Mata pelajaran Biologi, Standar isi KTSP 2006, Jakarta. Dikdasmen, Depdikbud, (2007), Pengembangan Silabus dan Sistem Penilaian Mata pelajaran Kimia, Standar isi KTSP 2006, Jakarta. Fersht, A., (1999), Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding, 2nd Edition, W. H. Freeman, New York. Hames, B.D., (1998), Gel Elektrophoresis of Proteins: A Practical Aproach, 3rd Edition, Oxford Univ. Press, Oxford., p. 1-50.
39 Holme, D.J. and Peck, H., (1993), Analytical Biochemistry, 2nd Edition, Longman Scientific & Technical, Singapore, p. 38-45 International Chemistry Olympiad, (2006), 38th Preparatory Problems, Problem 36., Enzyme Kinetic of Catalase, p. 72 – 75. Luck, H., (1974), Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer, H. U.; Gawehn, K., Eds.; Academic: New York, pp 885894 Matthews. C.K., Van Holde, K.E. and Ahern, K.G., (2000), Biochemistry, 3rd Edition, Addison Wesley Pub. Co., San Fransisco, p. 340-375 Michael Purba, (2007), Kimia untuk SMU/MA kelas XII, Erlangga, Jakarta, h.94-126. Murshudov, G., N., (1992), FEBS Lett., volume 312, p. 127. Sadikin, Moh, Haji, (2002), Biokimia Enzim, cetakan I, Widya Medika, Jakarta, h. 23115 Scopes, R.K., (1994), Protein Purification: Principles and Practise, New York: SpringerVerlag, New York. Snyder, J., and Desborou, S., (1978), Rapid estimation of potato tuber total protein with Coomassie Brilliant Blue G-250, Theo. Appl. Genet., 52, p. 135-139. Stoscheck, CM., (1990), Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182, p. 50-69. Sudarmadji, S.,Haryono, B., Suhardi, (1984), Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian, edisi ke-3, Liberty, Jogjakarta, h. 132-136. Syamsuri, I., dkk, (2007), Biologi untuk SMU/MA kelas XII, Erlangga, Jakarta, h.24-29. Wales, J., & Sanger, L., (2001), Kentang, Dari Wikipedia Indonesia, ensiklopedia bebas berbahasa Indonesia, http://id.wikipedia.org/wiki/kentang., diakses tanggal 12 Desember 2007. Walsh, C., (1979), Enzymatic Reaction Mechanisms, W. H. Freeman: San Francisco. Voet, D., Voet, J.G., Pratt, C.W., (2006), Fundamentals of Biochemistry, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York.
40
LAMPIRAN - LAMPIRAN
41 Lampiran A. Fraksinasi Amonium sulfat
42 Lampiran B. Demonstrasi percobaan kinetika enzim katalase
I. Tujuan 1. Menentukan nilai kecepatan maksimum (Vmaks) enzim katalase dari ekstrak kentang 2. Menentukan nilai tetapan kesetimbangan Michaelis-Menten (KM) enzim katalase dari ekstrak kentang
II. Alat dan Bahan 1. Alat kinetika enzim katalase
1 set
2. Gelas kimia
1 buah
3. Pipet tetes
1 buah
4. Kentang 5. Air 6. Sabun cair 7. H2O2 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, dan 6%.
III. Cara Kerja 1. Pengesetan Alat
2. Membuat ekstrak kentang dengan cara menghaluskan kentang bersama es dengan berat yang sama kemudian meme rasnya dengan kain kassa dan air perasan itu
43 disimpan dalam gelas kimia 100mL yang ditutup alumunium foil dalam wadah berisi es. 3. Membuat gelembung sabun dengan menekan bola karet pada set alat (diupayakan ada gelembung tunggal yang mulai dari skala 0 pada buret). 4. Memasukan 2 mL ekstrak kentang ke dalam labu Erlenmeyer yang sudah diisi 30 mL Larutan H2O2 0,5%. 5. Tepat pada detik ke-60 setelah ekstrak kentang dimasukkan, motor pengaduk magnet (magnetic steerer) dihidupkan bersamaan dengan menekan stop watch untuk mengukur waktu yang diperlukan gas oksigen menaikkan gelembung sabun sampai volume tertentu. Sebagai kontrol menambahkan juga 2 mL ekstrak kentang pada 30 mL air 6. Mengulangi percobaan diatas untuk tiap konsentrasi larutan H2O2 yang lainnya.
IV. Tabel Pengamatan [H2O2] (%v/v)
t (detik)
0,5 1 2 3 4 6
V. Diskusi 1. Ubah konsentrasi substrat kedalam satuan molar 2. Jika dianggap keadaan STP, maka tentukan konsentrasi gas oksigen yang dihasilkan 3. Hitung Laju reaksi penguraian H2O2 4. Buat grafik 1/[S] terhadap 1/v dan tentukan nilai Vmaks dan KM
44 Lampiran C. Kuisioner Percobaan Kinetika Enzim Katalase Kuisioner untuk Guru No
Pernyataan
1.
Percobaan ini benar-benar dapat didemonstrasikan
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
di hadapan siswa kelas 3 SMU dan / atau MA tempat bapak / ibu mengajar 2.
Bapak / ibu mampu untuk mendemonstrasikan percobaan ini di hadapan siswa
3.
Biaya untuk pengadaan alat dan bahan yang dipergunakan dalam percobaan ini benar-benar tidak memberatkan pihak sekolah / madrasah
Kuisioner untuk Siswa No
Pernyataan
1.
Percobaan ini benar-benar menarik untuk dipelajari
2.
Konsep yang digunakan dalam percobaan ini berhubungan dengan konsep kimia / biologi yang telah dipelajari
3.
Prinsip dasar percobaan ini mudah dipahami
4.
Dengan percobaan kinetika enzim katalase diperoleh gambaran nyata ( visualisasi ) tentang kinetika enzim
5.
Bahan yang dipergunakan dalam percobaan ini bisa disediakan sendiri
Ket :
1 menyatakan sangat setuju, 2 menyatakan setuju, 3 menyatakan kurang setuju, 4 menyatakan tidak setuju, 5 menyatakan sangat tidak setuju
45 Lampiran D. Penentuan Konsentrasi Substrat Optimum
[S](mM) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
A240 0 0.05 0.114 0.869 1.115 1.32 2.334 1.844 1.235 0.917 0.905
Kurva serapan substrat pada berbagai konsentrasi
2.5
A 240
2 1.5 1 0.5 0 0
10
20
30
40
50
Konsentrasi Substrat (mM)
Dari kurva terlihat serapan maksimum pada konsentrasi substrat 30 mM
60
46 Lampiran E. Penentuan Aktifitas Spesifik EKE Katalase Volume larutan EKE = 117 mL I. Penentuan aktivitas enzim katalase Ak 240 = 0,269
As 240 = 0,062
∆A = 0,269-0,062 = 0,207
Penurunan [S] ~ aktivitas katalase = 0,207/0,0101 = 20,49 unit Unit aktivitas katalase = 20,49 unit/50.10-3 mL = 409,90 unit/mL Aktivitas total = 409,90 unit/mL x 117 mL = 47958,3 unit Kurva Standar Substrat untuk penentuan aktivitas EKE 0.6 0.5
y = 0.0101x R2 = 0.9947
A 240
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
10
20
30 [S] (m M)
40
50
60
II. Penentuan kandungan protein A595 = 0,228
[Protein] = (0,228-0,1562)/0,0006 = 119,67 μg/μL = 119,67 mg/mL
Kandungan protein total = 119,67 mg/mL x 117 mL = 14001,39 mg Kurva Standar BSA untuk penentuan protein EKE 0.25
A595
0.2 0.15 y = 0.0006x + 0.1562 R2 = 0.9721
0.1 0.05 0 0
20
40
60
80
[BSA] ( (μg/μL)
100
120
47 Lampiran F. Penentuan aktifitas spesifik katalase hasil fraksinasi amonium sulfat I. Penentuan aktivitas katalase Fraksi 0-20% 20-80% 80-100%
Volume (mL) 3,1 35,2 1,7
∆A 0,022 0,342 0,011
Aktivitas 2,178 33,861 1,089
Unit aktivitas 43,564 667,227 21,782
Aktivitas total 135,049 23486,390 37,029
Kurva Standar Substrat untuk penentuan aktivitas enzim Fraksinasi 0.6 0.5
y = 0.0101x R2 = 0.9946
A 240
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
10
20
30 [S] (m M)
40
50
60
II. Penentuan kandungan protein Fraksi 0-20% 20-80% 80-100%
Volume (mL) 3,1 35,2 1,7
A595 0,296 0,211 0,293
[Protein] 234,215 92,000 228,667
Kandungan Protein total 7260,667 3238,400 388,733
Kurva Standar BSA untuk penentuan protein Hasil Fraksinasi 0.25
A595
0.2 0.15 y = 0.0006x + 0.1558 R2 = 0.9979
0.1 0.05 0 0
20
40
60
80
[BSA]
(μg/μL)
100
120
48 Lampiran G. Data hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE-selulosa No Tab. A 280 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0.012 0.011 0.012 0.01 0.01 0.015 0.027 0.016 0.211 0.012 0.026 0.017 0.901 0.511 0.004 0.258 0.209 0.162 0.156 0.155 0.109 0.006 0.398 0.076 0.086 0.066 0.055 0.098 0.199 0.142 0.103 0.048 0.081 0.08 0.063 0.077 0.064 0.048 0.048 0.084 0.078 0.108 0.194
Akt.spesifik (unit/mg)
0.095
1.062
1.987
2.067
3.901
2.875 28.934
No Tab.
A 280
Akt. spesifik (unit/mg)
44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85
0.332 0.358 0.323 0.28 0.22 0.182 0.16 0.21 0.162 0.12 0.163 0.146 0.138 0.176 0.249 0.198 0.145 0.078 0.048 0.026 0.021 0.026 0.027 0.035 0.07 0.154 0.267 0.32 0.359 0.368 0.365 0.328 0.324 0.265 0.112 0.035 0.012 0.008 0.197 0.009 0.012 0.012
29.817 30.321 28.092 26.034 25.27 21.526 25.111 29.086 21.11 23.182 26.312 35.125 39.054 32.207 29.166 30.231 1.976
49 Lampiran H. Penentuan aktifitas spesifik katalase hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE-selulosa Volume larutan enzim hasil kromatografi kolom = 23,3 mL I. Penentuan aktivitas katalase Ak 240 = 0,272
As 240 = 0,024
∆A = 0,272-0,024 = 0,248
Penurunan [S] ~ aktivitas katalase = 0,248/0,0101 = 24,55unit Unit aktivitas katalase = 24,55unit/50.10-3 mL = 491 unit/mL Aktivitas total = 491 unit/mL x 23,3 mL = 11440,3 unit Kurva Standar Substrat untuk penentuan aktivitas enzim DEAE-selulosa 0.6 0.5
y = 0.0101x R2 = 0.996
A 240
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
10
20
30 [S] (m M)
40
50
60
II. Penentuan kandungan protein A595 = 0,161
[Protein] = (0,161-0,1562)/0,0006 = 8 μg/μL = 8 mg/mL
Kandungan protein total = 8 mg/mL x 23,3 mL = 186,4 mg Kurva Standar BSA untuk penentuan protein Hasil Kromatografi Kolom DEAE-selulosa 0.25
A595
0.2 0.15 y = 0.0006x + 0.1562 R2 = 0.9978
0.1 0.05 0 0
20
40
60
80
[BSA] (μg/μL)
100
120
50 Lampiran I. Penentuan aktifitas spesifik katalase akhir I. Penentuan aktivitas enzim katalase Tahap EKE 20-80% Kolom
Volume (mL) 100 35,2 23,3
∆A 0,206 0,241 0,248
Aktivitas 20,495 23,960 24,555
Unit aktivitas 409,900 479,207 491,090
Aktivitas total 40990 16868,1 11442,4
Kurva Standar Substrat untuk penentuan aktivitas enzim akhir
A 240
0.6 0.5
y = 0.0101x
0.4
R2 = 0.995
0.3 0.2 0.1 0 0
20
40
60
[S] (mM)
II. Penentuan kandungan protein Volume (mL) 100 35,2 23,3
A595 0,228 0,196 0,161
[Protein] 120,167 66,829 8,485
Kandungan Protein total 12016,7 2352,4 197,7
Kurva Standar BSA untuk penentuan protein akhir 0.25 0.2
A595
Tahap EKE 20-80% Kolom
0.15 y = 0.0006x + 0.1559 R2 = 0.9989
0.1 0.05 0 0
20
40
60
80
[BSA]
(μg/μL)
100
120
51 Lampiran J. Penentuan bobot molekul katalase hasil pemurnian berdasarkan pita hasil SDS-PAGE Rf
Log kDa
0.085 0.149 0.243 0.295 0.346 0.398 0.487 0.596 0.745 0.851
2.352 2.176 2 1.875 1.771 1.699 1.544 1.398 1.176 1
Kurva Standar Protein Marker SDS-PAGE 2.5
log kDa
2 1.5 1 0.5 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Rf
Jarak pita larutan enzim hasil kromatografi kolom DEAE-selulosa 1,62 cm dan jarak batas bawah sampai atas gel 4,7 cm diperoleh Rf 0,346. Jika diintrapolasi terhadap kurna standar protein marker diperoleh log kDa sebesar 1,771 sehingga bobot molekulnya adalah 59 kDa.
52 Lampiran K. Penentuan parameter kinetika katalase dari kentang 1. Data serapan pada panjang gelombang 240nm untuk setiap [S] dalam rentang waktu 160 detik t (s)
A240 untuk setiap [S] : 5mM 10mM 15mM 0.2862 0.2997 0.3942 0.2321 0.2615 0.346 0.1898 0.2226 0.3071 0.1487 0.1808 0.2653 0.1121 0.1276 0.2121 0.0834 0.0839 0.1684 0.0621 0.0704 0.1628 0.0512 0.0596 0.1606 0.0504 0.0584 0.1556 0.0497 0.0533 0.1548 0.0491 0.0563 0.1541 0.0486 0.0554 0.1535 0.0482 0.0546 0.1531 0.0479 0.0539 0.1528 0.0477 0.0533 0.1524 0.0476 0.0532 0.1521 0.0476 0.0531 0.152
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
20mM 0.4057 0.3768 0.3283 0.2737 0.2246 0.1834 0.1718 0.1704 0.1693 0.1684 0.1676 0.1651 0.1657 0.1654 0.1652 0.165 0.165
25mM 0.4996 0.4514 0.4054 0.3534 0.3024 0.2692 0.2572 0.2554 0.254 0.2528 0.2517 0.2508 0.2501 0.2495 0.2491 0.2489 0.2488
30mM 0.5195 0.4876 0.4391 0.3845 0.3357 0.2945 0.2643 0.2484 0.2458 0.2404 0.2373 0.2365 0.2328 0.2325 0.2324 0.2323 0.2322
35mM 0.5291 0.4901 0.4441 0.3921 0.3441 0.3001 0.2899 0.2842 0.2728 0.2617 0.2507 0.2498 0.2409 0.2383 0.2377 0.2372 0.2368
40mM 0.6076 0.5532 0.4993 0.4551 0.3989 0.3728 0.3708 0.3693 0.3629 0.3618 0.3611 0.3609 0.3606 0.3604 0.3602 0.3601 0.3601
45mM 0.6784 0.6251 0.5712 0.527 0.4708 0.4447 0.4427 0.4412 0.4348 0.4325 0.4314 0.4309 0.4301 0.4298 0.4296 0.4295 0.4294
50mM 0.7264 0.6722 0.6183 0.5741 0.5172 0.4911 0.4891 0.4876 0.4812 0.4765 0.4734 0.4711 0.4695 0.4691 0.4687 0.4683 0.4682
2. Kurva penentuan laju awal untuk setiap konsentrasi substrat [S] = 15 m M
[S] = 10 m M
[S] = 5 m M
0.45
0.35
0. 35
0.4 0.3
0. 3
y = -0.004x + 0.2765 R 2 = 0.9 905
0. 25
y = -0 .0 044 x + 0.30 48 R 2 = 0 .9966
0.25
y = -0 .0 0 45x + 0 .3 9 4 5 R 2 = 0 .9 9 8 3
0.35
0.3
0. 2
0.2
0. 15
0 . 15
0.25
0.2
0 . 15
0. 1
0.1
0.1
0. 05
0.05
0.05
0
0
0
0
50
100
150
200
0
50
10 0
15 0
200
y = -0 .0 0 46 x + 0.4147 R 2 = 0 .9 94 2
15 0
200
0.6
y = -0 .0 0 4 7x + 0 .4 9 8 2
0.5
y = -0 .0 0 4 7x + 0 .52 7 R 2 = 0 .9 9 57
0.5
R 2 = 0 .9 9 71
0.3
10 0
[S] = 30 m M
0.6
0.45
0.35
50
t ( d et i k)
[S] = 25 m M
[S] = 20 m M
0.4
0
t ( d et i k )
t ( d et i k )
0.4
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
0.25
0.2
0 . 15
0.1 0.1
0.1
0.05
0
0
0
50
10 0
t ( d e t i k)
15 0
200
0
0
50
10 0
t ( d et i k)
15 0
200
0
50
10 0
t ( d et ik)
15 0
200
53
[S] = 45 m M
[S] = 40 m M
[S] = 35 m M
0.8
0.7
0.6
y = -0 .0 0 4 8 x + 0 .6 0 12
0.6
y = -0 .0 0 4 7x + 0 .53 3 4 R 2 = 0 .9 9 8 6
0.5
y = -0 .0 0 4 8 x + 0 .6 72 6
0.7
R 2 = 0 .9 9 2 4
R 2 = 0 .9 9 2 1
0.6
0.5
0.4 0.5 0.4
0.4
0.3 0.3
0.3
0.2 0.2
0.2
0.1 0.1
0
0.1
0
0
0
50
10 0
15 0
200
0
50
t ( d et i k)
10 0
15 0
200
0
[S] = 50 m M 0.8
y = -0 .0 0 4 8 x + 0 .72 0 3
0.7
R 2 = 0 .9 9 2 3 0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0
50
10 0
15 0
200
t ( d et ik)
3. Kurva Lineaweaver-Burk 300
1/Vo (detik)
250 200
y = 230.69x + 204.5 R2 = 0.988
150 100 50 0 0
0.05
0.1
0.15
1/[S] (1/m M)
50
10 0
t ( d et i k)
t ( d et i k)
0.2
0.25
15 0
200
54 Lampiran L. Hasil demonstrasi percobaan Kinetika Enzim Katalase IChO 2006 1. Data hasil percobaan [S] (%) 0.5 1 2 3 4 5
[S] (M) 0.166108 0.332216 0.664432 0.996648 1.328865 1.993297
MGMP t 310 174 106 86 70 68
1/[S] 6.020177 3.010088 1.505044 1.003363 0.752522 0.501681
SMU 23 t 312 170 98 77 70 70
SMU 1 t 306 170 106 84 70 70
SMUT KRIDA T 310 172 106 86 70 68
MAN 2 t 309 172 106 84 70 69
2. Kurva Lineaweaver-Burk Hasil Demonstrasi di SMU 23 6
5
5
4
4
3 y = 0.795x + 0.7255 R2 = 0.9989
2 1
1 /V ( d e t /M )
1 /V ( d e t /M )
Hasil Demonstrasi di MGMP 6
3 y = 0.8128x + 0.6424 R2 = 0.9956
2 1
0
0
0
1
2
3 4 1/[S] (1/M)
5
6
7
0
1
5
4 3 y = 0.781x + 0.7343 R2 = 0.9982
1 /V (d e t/M )
5
5
6
7
4 3 2
y = 0.7941x + 0.7181
1
R2 = 0.9985
0
0 0
1
2
3 4 1/[S] (1/M)
5
6
0
7
2
4 1/[S] (1/M)
Hasil Demonstrasi di SMUT Krida Nusantara 6 5 1/V (det/M)
1 /V ( d e t /M )
6
1
3 4 1/[S] (1/M)
Hasil Demonstrasi di MAN 2
Hasil Demonstrasi di SMU 1 6
2
2
4 3
y = 0.7935x + 0.7224 R2 = 0.9988
2 1 0 0
1
2
3 4 1/[S] (1/M)
5
6
7
6
8
