CLIA Komplexnost: Vysoká CDC Identifikační kód analytu: 0497 CDC Identifikační kód testu: 28281 NÁVOD K POUŽITÍ
REF
1114A
48 stanovení (8 x 6)
POUŽITÍ Nepřímý imunofluorescenční test pro kvalitativní a semi-kvantitativní detekci protilátek proti endomysiu (EMA) v lidském séru. Test slouží pro diagnostiku onemocnění celiakií a dermatitis herpetiformis. ÚVOD Protilátky proti endomysiu (EMA), jak je uváděno v literatuře, jsou primárně detekovány na tkáňových řezech hladkého svalu opičího esofágu pomocí nepřímé imunofluorescence. Detekce EMA napomáhá při diagnostice gluten senzitivních enteropatií, např. celiakie a dermatitis herpetiformis. U pacientů s těmito onemocněními jsou vytvářeny protilátky proti endomysiu, retikulinu a gliadinu1-12. Organizace European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition nedávno zařadila tyto sérologické markery do revidovaných kritérií pro diagnostiku celiakie. Z různých protilátek, jako markerů celiakie a dermatitis herpetiformis, jsou EMA protilátky třídy IgA považovány za nejvíce senzitivní a specifické markery. EMA protilátky třídy IgG se vyskytují buď při vysokých titrech EMA protilátek třídy IgA nebo u pacientů, kteří jsou IgA deficientní. Rapidní pokles hladin EMA protilátek je vázán na bezlepkovou dietu. V přítomnosti lepku nebo při nedodržování bezlepkové diety dochází ke vzniku či vzestupu titrů endomysiálních protilátek. U pacientů, kteří dodržují bezlepkovou dietu déle než 9 měsíců, jsou velmi nízké či zcela negativní hladiny EMA protilátek1,6-8,10. PRINCIP TESTU V nepřímé imunofluorescenční metodě použité v tomto testu jsou pacientská séra inkubována na tkáňových řezech tak, aby se protilátky navázaly k substrátu. Nenavázané protilátky jsou odstraněny promytím. Navázané IgA protilátky jsou detekovány pomocí inkubace substrátu s fluoresceinem značeným, anti-lidským, imunoglobulinovým konjugátem. Při pozorování pod fluorescenčním mikroskopem, vybaveným příslušnými filtry, se pozitivní reakce objevují jako jablkově zelená fluorescence endomysiálních linií u svazků hladkých svalů. Titr, což je převrácená hodnota nejvyššího ředění s pozitivní reakcí, je stanoven na základě analýzy sériového ředění14. SKLADOVÁNÍ A PŘÍPRAVA Všechny reagencie skladujte při 2-8°C. Všechny reagencie jsou připraveny k použití po vytemperování na laboratorní teplotu. SOUČÁSTI SOUPRAVY ImmuGloTM EMA IFA Kit REF 1114A Kit obsahuje dostatečné množství reagencií k provedení 48 stanovení. 8 x SORB / SLD / 6 6-ti jamková sklíčka osahující opičí hladký sval jako substrát 1 x 0,5 ml CONTROL / + / EMA* EMA pozitivní kontrola, obsahuje lidské sérum. 1 x 0,5 ml CONTROL / - * negativní kontrola, obsahuje lidské sérum. 1 x 5 ml IgA-CONJ / FITC* Anti-lidský IgA FITC konjugát. Chráněn před světlem. 1 x 60 ml BUF* Ředící pufr 2 x vialka BUF / WASH Fosfátový pufr (PBS). Rozpustit každou vialku v 1 litru. 1 x 5 ml MOUNTING / MEDIUM* Montovací medium. Nezmrazujte 1 x 1 ml EVANS Evan´s Blue 1 x 12 COVER / SLD Krycí sklíčka * obsahuje < 0,1% NaN3 POŽADOVANÝ, ALE NEDODÁVANÝ MATERIÁL • • • • • • • • • •
fluorescenční mikroskop mikropipeta nebo pasteurova pipeta serologické pipety nádobka na barvení sklíček (např. Coplinova nádoba) malé testovací zkumavky (např. 13 x 75 mm) a stojánek na zkumavky destilovaná nebo deionizovaná voda 1 litrová nádoba promývací láhev absorpční papír inkubační komůrka
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Pouze pro in vitro diagnostiku. Všechny použité lidské komponenty byly testovány na HbsAg, HCV, HIV-1, HIV-2, HTLV-I a byly zjištěny negativní výsledky dle FDA požadovaných testů. Se vzorky nakládejte jako s potenciálně biologicky nebezpečným materiálem. Postupujte dle správné laboratorní praxe při skladování, výdeji a likvidaci tohoto materiálu. UPOZORNĚNÍ - Azid sodný (NaN3) může reagovat s olovem a mědí za vzniku vysoce výbušných azidů. Při odstraňování kapalin vypláchněte
1
velkým množstvím vody tak, aby se zabránilo nahromadění velkého množství azidů. Azid sodný může být po požití toxický. V případě požití okamžitě kontaktujte vedení laboratoře. Provádějte přesně dle uvedených instrukcí k zajištění platných výsledků. Nepoužívejte nebo nemíchejte reagencie z různých souprav a šarží. Nepoužívejte po uplynutí doby expirace. ODBĚR VZORKU A JEHO SKLADOVÁNÍ Pouze vzorky séra by měly být použity pro tento test. Silně hemolyzované, lipemické nebo mikrobiologicky kontaminované vzorky mohou ovlivnit výsledky tohoto testu, tudíž nemohou být použity. Vzorky mohou být skladovány při teplotě 2-8 °C maximálně 1 týden. Pro delší dobu skladování, muže být sérum zamrazeno při -20 ° C. Rozmražené vzorky znovu nezmrazujte. PRACOVNÍ POSTUP Testovací metoda A. Screening 1. Nařeďte každé pacientovo sérum 1:2,5 s přiloženým ředícím pufrem (0,2 ml séra + 0,3 ml pufru). Neřeďte pozitivní ani negativní kontroly. Uložte neředěné sérum pro případné stanovení titru protilátek, pokud bude screeningový test pozitivní. 2. Sáčky obsahující sklíčka nechte temperovat při laboratorní teplotě 10-15 minut. Opatrně vyjměte sklíčka, nedotýkejte se přitom subtrátu. 3. Sklíčka označte a umístěte je do inkubátoru na papírový ručník navlhčený vodou, aby se zabránilo vysychání. 4. Kápněte 1 kapku (přibližně 50 µl) negativní kontroly do 1. jamky a 1 kapku pozitivní kontroly do 2. jamky. Vyvarujte se přeplnění jamek. 5. Mikropipetou nebo Pasteurovou pipetou aplikujte 1 kapku (přibližně 50 µl) naředěného pacientova séra do ostatních jamek. Vyvarujte se přeplnění jamek. 6. Sklíčko inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě v inkubační nádobě zakryté víkem. 7. Vyjměte sklíčko z inkubační nádoby, držte jej za okraj a jemně opláchněte asi 10 ml PBS za pomocí pipety. Nepoužívejte promývací láhev. Poté ihned přeneste sklíčko do Coplinovy nádoby a promývejte 10 minut. Proces opakujte u všech zbývajících sklíček. 8. Vyjměte sklíčko z Coplinovy nádoby. Absorpčním papírem vysušte přebytečné PBS z okraje sklíčka. Umístěte sklíčko do inkubační nádoby a ihned aplikujte 1 kapku (přibližně 50 µl) konjugátu do každé jamky. 9. Opakujte postup 7 a 8 na každém sklíčku. 10. Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě. 11. Vyjměte sklíčko z inkubační nádoby. Držte sklíčko za okraj a ponořte jej do kádinky s PBS pro odstranění přebytečného konjugátu. Umístěte sklíčko do nádobky naplněné PBS na 10 minut. V případě potřeby, přidejte 2-3 kapky Evan´s Blue do konečného promývání. Opakujte postup u všech sklíček. POZNÁMKA: Nesprávné promytí může vézt ke zvýšení fluorescence na pozadí. 12. Vyjměte sklíčko z promývačky. Absorpčním papírem vysušte přebytečné PBS z okraje sklíčka. Kvůli zabránění vysušení sklíčka, pokračujte ihned dalším krokem, dokud je sklíčko mokré. 13. Pomocí 3 kapek "Mounting Medium" umístěte krycí sklíčko na podložní sklíčko. Vyvarujte se použití nepřiměřeného tlaku a zabraňte bočnímu pohybu krycího sklíčka. 14. Opakujte postup 12 a 13 na každém sklíčku. 15. Zkoumejte specifickou fluorescenci pod fluorescenčním mikroskopem při zvětšení 200x nebo větším. Sklíčka mohou být odečtena co nejdříve po testu. Nicméně, vzhledem k přítomnosti krycí tekutiny v montovacím mediu, nedochází k žádné významné ztrátě intenzity barvení, jestliže dojde k odečtení do 48 hodin. Sklíčka musí být skladována při teplotě 2-8°C ve tmě. B. Endpoint stanovení (titrace) Pozitivní sérum ve screeningové zkoušce může být dále testováno kroky 5 až 13 k určení titru. Každý proces testování by měl zahrnovat pozitivní a negativní kontroly. Sériové dvojí ředění začíná při 1:2,5. Převrácená hodnota nejvyššího ředění, vytvářející pozitivní reakci, je titr. Příprava sériového ředění Zkumavky jsou označeny čísly 1-4. Přidejte 0.4 ml Diluentu do zkumavky č.1 a 0.2 ml do zkumavky č.2-4. Pipetujte 0.2 ml neředěného séra do zkumavky č.1 a důkladně promýchejte. Přeneste 0.2 ml ze zkumavky č.1 do zkumavky č. 2 a důkladně promýchejte. Pokračujte přenesením 0.2 ml z jedné zkumavky do další (vedlejší) po promýchání tak, aby vzniklo ředění, které je znázorněno v následující tabulce.
KONTROLA KVALITY V každém testu by měla být zahrnuta pozitivní i negativní kontrola. Negativní kontrola by neměla ukázat žádnou specifickou fluorescenci endomysiálních linií u svazků hladkých svalů. Pozitivní kontrola by měla mít 2+ nebo vyšší barevnou intenzitu tubulů těchto struktur. Jestliže nejsou získány očekávané výsledky, měl by být proces zopakován. Pokud nadále dochází k selhání kontrol, může to být způsobeno: • • •
Zákal - vyřaďte a použijte novou kontrolu Problémy s optickým systémem fluorescenčního mikroskopu - nesprávné nastavení, žárovka za hranicí životnosti atd. Možnost vysušení sklíčka
2
INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky testů na EMA protilátky mohou být interpretovány jako negativní (<2,5) nebo pozitivní (≥20) či pozitivní se specifickým endpoint titrem. Pozorujte specifické barvení endomysiálních linií u svazků hladkých svalů (viz obrázek č. 1 na konci tohoto příb. letáku). EMA protilátky reagují jako síť tenkých, nepravidelných linií okolo sarkolemy jednotlivých fibril hladkých svalů. Toto je v ostrém kontrastu k protilátkám proti hladkému svalstvu (ASMA), které reagují se sarkoplasmou. (viz obrázek č. 2) Ostatními detekovatelnými protilátkami, kromě ASMA protilátek, jsou anti-nukleární protilátky (ANA). Je známo, že v přítomnosti ASMA protilátek dochází ke vzniku EMA falešně negativních výsledků. Pokud jsou detekovány ASMA protilátky, měl by být vzorek testován při vyšších ředěních1. ANA reakce na tkáni hladkého svalu, pokud se vůbec objeví, jsou obvykle slabé a řídce distribuované, nicméně i tyto reakce mohou vést k falešně negativním výsledkům. OMEZENÍ TESTU V některých případech, séra pozitivní na EMA protilátky mohou být buď velmi slabá nebo negativní při úvodním screeningovém ředění díky prozónovému efektu. V takovýchto pochybných případech by měla být séra vyšetřena při vyšších ředěních, v případě pozitivity je stanoven titr protilátek. Přítomnost dvou či více typů protilátek v séru, které reagují se stejnou tkání, může způsobovat interference při jejich detekci pomocí imunofluorescence. Tato interference může způsobovat buď selhání v detekci EMA protilátek, nebo potlačení jejich titru, a to v tom případě, že interferující protilátky mají vyšší titr než EMA protilátky. Nejběžnějším zdrojem takové interference je u EMA testů koexistence protilátek proti hladkému svalstvu (ASMA). U sér pacientů, která obsahují i ASMA protilátky, je doporučeno další testování při vyšších ředěních. ASMA protilátky třídy IgA se běžně nevyskytují. Část ASMA protilátek třídy IgG reaguje se sarkoplasmou u svazků hladkých svalů a neblokuje EMA protilátky třídy IgA, nicméně druhá část ASMA protilátek třídy IgG reaguje i s endomysiem sarkolemy okolo svazků hladkých svalů. Anti-retikulinové protilátky neinterferují s EMA protilátkami, protože vůbec nereagují s tkání opičího hladkého svalstva. U některých pacientů s celiakií a IgA deficiencí chybí EMA protilátky třídy IgA zcela, nicméně tito pacienti jsou obvykle pozitivní na EMA protilátky třídy IgG. Pacienti s celiakií, kteří dodržují bezlepkovou dietu více než 9 měsíců, jsou trvale negativní na EMA protilátky. Při tvorbě diagnózy musí být vždy všechny výsledky laboratorních testů hodnoceny společně s celkovou klinickou historií pacienta. OČEKÁVANÉ HODNOTY Jak je vidět z tabulky č. 1, EMA protilátky, které jsou detekovány pomocí řezů opičích hladkých svalů, jsou vysoce specifickými markery pro diagnostiku celiakie a dermatitis herpetiformis. Přítomnost EMA protilátek odpovídá spíše než přítomností kožních lézí, souvislosti s intestinální patologií týkající se celiakie a dermatitis herpetiformis (viz obr. č. 3). CHARAKTERISTIKA TESTU Souprava ImmuGloTM Anti-Endomysial Antibody (EMA) Test Kit využívající opičí hladký sval jako substrát a polyvalentní konjugát, byla srovnávána s dalším komerčně dostupným fluorescenčním testem využívajícím taktéž polyvalentní konjugát a opičí esofagus jako substrát. Do porovnání bylo zahrnuto celkem 68 sér: 20 od pacientů s klinicky suspektní celiakií a 48 od zdravých dárců. Séra byla testována dle postupu doporučeného výrobcem. Bylo použito screeningové ředění 2,5 a všechna séra pozitivní na EMA protilátky byla titrována. Výsledky byly následující: IMMCO EMA POS (+) Ostatní EMA IFA
NEG (-)
TOT (=)
POS (+)
18
0
18
NEG (-)
2
48
50
TOT (=)
20
48
68
Relativní specificita: 97% Relativní senzitivita: 100% Relativní shoda: 96% LITERATURA 1. Chorzelski TP, Beutner EH, Kumar V and Zalewski TK (Eds). Serologic Diagnosis of Celiac Disease. CRC Press Boca Raton; 1990. 2. Levenson SD, Austin RK, Dietler MD, Kasarda DD and Kagnoff MF. Specificity of antigliadin antibody in celiac disease. Gastroenterology; 1985, 89:1-5. 3. Tucker NT, Barghuthy FS, Prihoda TJ, Kumar V, Kerner A and Lebenthal E. Antigliadin antibodies detected by enzyme linked immunosorbent assay as a marker of childhood celiac disease. J Pediatric; 1988, 113:286-289. 4. Hallström O. Comparison of IgA-class reticulin and endomysium antibodies in coeliac disease and dermatitis herpetiformis. Gut; 1989, 30:1225-1232. 5. Khoshoo V, Bhan MK, Unsworth DJ, Kumar R and Walker-Smith A. Anti-reticulin antibodies: useful adjunct to histopathology in diagnosing celiac disease, especially in developing country. J Pediatric Gastroenterol Nutr; 1988, 7: 864-866. 6. Kapuscinska A, Zalewski T, Chorzelski TP, Sulez J, Beutner EH, Kumar R and Rossi T. Disease specificity and dynamics of changes in IgA class anti-endomysial antibodies in celiac disease. J Pediatric Gastroenterol Nutr; 1987, 6: 529-534. 7. Rossi TM, Kumar V, Lerner A et al. Relationship of endomysial antibodies to jejunal mucosal pathology: specificity towards both symptomatic and asymptomatic celiacs. J Pediatric Gastroenterol Nutr; 1988, 7: 858-863. 8. Kumar V, Lerner A, Valeski JE et al. Endomysial antibodies in the diagnosis of celiac disease and the effects of gluten on antipody titers. Immun Invest; 1989 18: 533544. 9. Calabuig M, Torregosa R, Polo P, Tuset L et al. Serological markers and celiac disease: a new diagnostic approach. J Paediatric Gastroenterol Nutr; 1990, 10:435-442. 10. Karpati S, Bürgin-Wolff A, Krieg T, Maurer M et al. Binding to human jejunum of serum IgA antibody from children with coeliac disease. Lancet; 1990, 336: 13351338. 11. Kumar V, Hemedinger E, Chorzelski TP et al. Reticulin and endomysial antibodies in bullous disease - comparison of specificity and sensitivity. Arch Dermatol; 1987, 123: 1179-1182. 12. Peters MS and McEvoy MT. IgA antiendomysial antibodies in dermatitis herpetiformis. J Am Acad Dermatol; 1989, 21: 1225-1231. 13. Walker-Smith JA, Quandalini S, Schmitz J et al. Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Report of working group of European Society of Paedriatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child; 1990, 65:909-911. 14. Beutner EH, Kumar V, Krasny SA and Chorzelski TP. Defined immunofluorescence in immunodermatology. In “Immunopathology of the Skin”, Beutner EH, Chorzelski Tp and Kumar V, Eds, John Wiley and Sons New York; 1987, 3rd Ed, 3-40. 15. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control, National Institutes of Health, 1993 (HHS Pub. No. {CDC} 93-8395).
3
Obrázek č. 1: EMA fluorescenční reakce na opičím tkáňovém řezu hladkého svalu, 200x Jablkově zelená fluorescence endomysiálních linií u svazků hladkých svalů
Obrázek č. 2: ASMA fluorescenční reakce na opičím tkáňovém řezu hladkého svalu, 200x Jablkově zelená fluorescence sarkoplasmy hladkého svalu
Obrázek č. 3: Korelace IgA-EMA titrů u vilózní atrofie:
4
Tabulka č. 1: Výskyt EMA protilátek třídy IgA
Pro technickou pomoc prosím kontaktujte:
nebo Vašeho místního distributora:
GALI spol. s r.o. Ke Stadionu 179, Semily 513 01 Tel. 481 689 050 Fax. 481 689 051 E-mail:
[email protected]
5
