Chromatofokusace • separace proteinů na základě jejich pI • vysoké rozlišení • není potřeba připravovat pH gradient • zaostřovací efekt • jednoduchost
Polypufry - amfolyty Polybuffer 96 Polybuffer 74
-
pH 9-6 pH 7-4
Pharmalyte
-
pH 8-10,5
Stacionární fáze PBE94
PBE118
Princip fokusace
MonoP Beads – směs kvartérních a terciálních aminů
Dvoudimensionální chromatografie Beckman Coulter – PF 2D
Dvoudimensionální chromatografie
hydrofobicita
pH
frakce
Disulfidový můstek -oxidací SH skupin Cys -silná kovalentní vazba
Vodíková vazba příklady postranních aminokyselinových řetězců, které spolu mohou tvořit vodíkové vazby: dva alkoholy: ser, thr a tyr alkohol a kyselina: asp a tyr dvě kyseliny: asp a glu alkohol a amin: ser a lys alkohol a amid: ser a asn
Solný můstek
- interakce mezi pozitivně nabitou amino- a záporně nabitou karboxy- skupinou
Hydrofobní interakce
Hydrofobicita proteinu insulin malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy tpktrreaed lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn
Hydrofobní chromatografie
vliv soli na protein
Stacionární fáze vazba hydrofobních oblastí na povrchu proteinu v H2O slabé interakce⇒přídavek soli méně hydrofobní než RPC
Mobilní fáze H2O/sůl (~1 M) nejčastěji (NH4)2SO4
Eluce klesajícím gradientem soli (1 M – 0 M)
stacionární fáze
nejméně hydrofobní látka
středně hydrofobní látka
velmi velmi hydrofobní hydrofobní kontaminace látka
typy stacionární fáze
výběr ligandu
Ether < Isopropyl < Butyl < Octyl < Phenyl
efekt ligandu na purifikaci
efekt mobilní fáze
A
B
C
typy gradientů
Experiment vysoké rozlišení (gradientová eluce) stacionární fáze kolona
mobilní fáze
velikost částic 10-30 µm
velikost částic 30 µm nebo větší – vyšší průtok
délka 1 - 10 cm (krátká kolona nevhodná pro pozvolný gradient)
nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok
20 – 50 mM pufry v rozmezí pH 4-8 (pH má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH4)2SO4)
20 – 50 mM pufry v rozmezí pH 4-8 (pH má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH4)2SO4)
objem vzorku na objemu nezáleží množství vzorku
skupinová separace (kroková eluce)
5-10 % celkové vazebné kapacity (bez ztráty rozlišení)
na objemu nezáleží ~ 40 % celkové vazebné kapacity
použití hydrofobní chromatografie vysoké rozlišení (gradientová eluce)
skupinová separace (kroková eluce)
separace proteinů na základě jejich hydrofobicity
koncentrace naředěného vzorku
vhodná jako první nebo střední purifikační krok
vhodná jako purifikační krok po precipitaci síranem amonným
Jako první krok purifikace alkoholdehydrogenasy z Pseudomonas sp. jste zvolili srážení síranem amonným (Mr 132,14 g/mol) a to do 50 %. Alkoholdehydrogenasu jste po srážení detekovali v supernatantu (objem supernatantu je 20 ml). Jako další krok purifikace chcete zvolit hydrofobní chromatografii na koloně Butyl-Sepharose. Jak byste postupovali?
Chromatografie na reversní fázi
•separace látek na základě jejich hydrofobicity hydrofobní chromatografie x chromatografie na reversní fázi •hydrofobní interakce musí být podpořena solí •eluce snižující se koncentrací soli
lysozym
•stacionární fáze je vysoce substituovaná CH řetězci vysoká hydrofobicita •proteiny, peptidy a oligonukleotidy se adsorbují i v čisté H2O •desorbce organická rozpouštědla (např. acetonitril v H2O) vysoká hydrofobicita nižší hydrofobicita vysoce hydrofilní méně hydrofilní
Mechanismus rozdělení látky mezi dvě fáze (různé polární vlastnosti)
Nepolarní látky – Van der Waalsovy interakce – odolné vůči polárním rozpouštědlům
Polární látky – dipolové interakce, vodíkové vazby Voda – rozpouštědlo pro polární látky (HX- skupiny X: O, Cl, F, N)
Mechanismus adsorbce •malé organické molekuly +/rozpustné ve stacionární fázi
•Peptidy i proteiny mohou interagovat s hydrofobním nosičem •Větší velikost ⇒nemohou být kompletně pohlceny hydrofobní stacionární fází •Velká pravděpodobnost interakce více míst molekuly
Pokles polarity mobilní fáze oslabuje hydrofobní interakce
Eluční křivka odpovídá distribuci mezi stacionární a mobilní fázi.
Isokratická eluce vliv koncentrace organického rozpouštědla
Gradientová eluce
nejméně hydrofobní látka
středně hydrofobní látka
velmi velmi hydrofobní hydrofobní kontaminace látka
stacionární fáze
Ekvilibrace
Aplikace vzorku a promytí
Gradientová eluce
Regenerace
Vliv typu mobilní fáze
Mobilní fáze
Vliv koncentrace rozpouštědla
Mobilní fáze Organické rozpouště dlo
Vhodné pro:
Viskosita
Poznámka
Methanol
•Org. molekuly
Střednínízká
možná destabilisa ce struktury
Ethanol
•Org. molekuly
Střednínízká
možná destabilisa ce struktury
Isopropanol •Proteiny •Peptidy
Vysoká
nejmenší efekt na strukturu
Nízká
nízký efekt na strukturu
Acetonitril (ACN)
•Org. molekuly •Proteiny •Peptidy
Spektrofotometrické vlastnosti rozpouštědel
Stacionární fáze Silikagel •poresní silika gel – zvýšení efektivního povrchu •inertní materiál •stabilní v pH 2-7,5
Polymerní nosič •poresní polymer – zvýšení efektivního povrchu •nepolární •stabilní v pH 2-11 Vliv délky řetězce na rozlišení hydrofobní organické látky
peptidy, proteiny
Stacionární fáze - funkční skupiny
Vliv funkční skupiny na rozlišení
Pufr A: 0,1 % TFA + H2O Pufr B: 0,1 % TFA + acetonitryl
gradient
A214nm
rozpouštědlový pík
retenční čas / min
Sekvence
MW
RT
2
RGGGGIGLGK
871,0 15,0
1
RGGGGIGIGK
871,0 10,5
3
RGGGGLGLGK
871,0 20,5
Čas
%A
%B
0
100
0
3
100
0
30
70
30
Experiment vysoké rozlišení (gradientová eluce)
skupinová separace (kroková eluce)
velikost částic 10 - 30 µm - pro purifikace 5 - 12 µm - pro analytiku polymerní –lepší pro separaci proteinů (lze čistit pomocí NaOH)
velikost částic 30 µm nebo větší – vyšší průtok
délka 1 - 10 cm
nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok
Oligonukleotidy – alkalické podmínky Peptidy – ACN, TFA ~ pH 2
nemá významný vliv (50 %ACN)
objem vzorku
0,5 - 5% objemu kolony při isokratické eluci bez omezení při gradientové eluci
na objemu nezáleží
množství vzorku
5 - 10 % celkové kapacity kolony (dobré rozlišení)
40 % celkové kapacity kolony
stacionární fáze
kolona mobilní fáze
použití RPC vysoké rozlišení (gradientová eluce)
skupinová separace (kroková eluce)
separece peptidů, proteinů a oligonukleotidů podle jejich hydrofobicity
Zakoncentrování oligonukleotidů a peptidů
Vhodná jako střední purifikační krok nebo závěrečný purifikační krok Purifikace syntetických peptidů
Vhodná pro odsolování peptidů a oligonukleotidů
Technika pro analysu peptidů a peptidové mapování
Tipy pro přípravu pufru •Upravte pH před přidáním organického rozpouštědla •Upravte pH pufru při teplotě experinemtu •Ověřte stabilitu proteinu •Pro analytické experimenty použijte „HPLC grade“ chemikálie
Tipy pro přípravu vzorku •Zfitrujte nebo stočte vzorek před aplikací na kolonu •pH a iontová síla (!velký objem vzorku!) stejná jako ve startovacím pufru (PD10) •Teplota vzorku stejná jako startovacího pufru (!velký objem vzorku!)
