Expresní systémy živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek (především proteinů)
Heterologní expresní systémy • Bakteriální • Kvasinkové • Hmyzí buňky • S Savčí čí b buňky ňk • Transgenní rostliny
1
charakteristika
E. coli
kvasinky
hmyzí buňky
savčí buňky
buněčný růst
rapidní (30min)
rapidní (90min)
pomalý (18-24h)
pomalý (24 h)
požadavky na růstové medium
minimální
minimální
komplexní medium
komplexní medium
cena růstového media
nízká
nízká
vysoká
vysoká
množství exprimovaného proteinu
velké
malé až velké
malé až velké
malé nebo střední
extracelulární exprese
sekrece do inkluzních tělísek
sekrece do media
sekrece do media
sekrece do media
posttranslační modifikace
skládání proteinů
obvykle nutné dodatečné složení
v některých případech nutné dodatečné složení
řádně složené proteiny
řádně složené proteiny
N-glykosylace
-
vysoký obsah manosy
jednoduché, jednoduché bez sialové kyseliny
komplexní
O-glykosylace
-
+
+
+
fosforylace
-
+
+
+
acetylace
-
+
+
+
acylace
-
+
+
+
γ-karboxylace
-
-
-
+
Bakteriální expresní systémy Escherichia coli
+ rychlá produkce + nejvýkonnější (až 0.5 g na 1 litr kultury) + levné a jednoduché na manipulaci
-
chybí h bí posttranslační tt l č í úprava ú proteinů t i ů (neaktivní produkty eukaryotních genů)
-
přirozeně neprobíhá sekrece do média preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota
2
rekombinatní genetická informace je vklonována do vhodného expresního plasmidu, nedochází k integraci do genomu
TA klonování
TA TOPO klonování
rekombinační klonování • místně specifický rekombinatní systém bakteriofága lambda – att • attB x attP ↔ attL x attR (“x” znamená rekombinaci). • vzájemná rekombinace mezi nimi probíhá podle daných pravidel • obě rekombinace jsou katalyzovány proteiny kódované jak αDNA tak bakteriální. • selekce antibiotikum a gen ccdB mezi rekombinantními místy, protein ccdB inhibuje bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor
3
LR reakce se účastní integrasa a ekscionasa (α (αDNA) a IHF (integration host factor) z bakterie
BP reakce se účastní IHF a integrasa
rekombinační klonování
• Invitrogen dodává všechny typy vektorů kompatibilních pro rekombinantní klonování • Reakce trvá 1 hodinu při laboratorní teplotě • zachovávání čtecích rámců (ORF), žádné složité plánování
4
PG1
N-terminal 6xHis tag umožňuje velice účinnou purifikaci proteinu pomocí metal-chelatační chromatografie popř. popř detekci pomocí Anti-HisG protilátky EK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinasu, odštěpuje His-tag T7 transcription termination region silný terminační systém T7 bacteriofága T7 promoter proteinu
přesná
exprese
heterogenního
Ribosome binding site TOPO klonovací místo pro PCR produkt Xpress™ epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-AspLys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-Xpress™ protilátky
gen pro rezistenci k ampicilinu umožňuje selekci plasmidu v E. coli pUC origin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli C-terminal V5 epitope tag umožňuje detekci fúzního pomocí Anti-V5 protilátky
proteinu
exprimovaný protein
reverse primerTAG
„“ signální peptid
exprimovaný protein
V5 epitop
his tag
ATGforward primer
detekce
his tag
x-press
reverse primerTAG
„“ signální peptid
izolace
exprimovaný protein
forward primer
izolace
detekce
5
Snímek 9 PG1
T7 bakteriofág, nejsilnější známy promotor, T7 RNA polymerasa je v baktérii pod IPTG inducibilním promotorem galuszka; 11/03/2007
PG2
usnadnění izolace rekombinantního proteinu koncové značky nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): His His--tag pro metal chelatační chromatografii (Ni) FLAG epitope epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka)
CBP - calmodulin binding peptide (26 AK AK)) CBD - cel elllulose binding domain
TRANSFORMACE baktérii a kvasinek přímý přenos genetické informace z okolí do organismu • • •
•
buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Hemorheae influenze atd. všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: A) ELEKTROPORACE buňky se pořádně promyjí diH2O smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou také v diH2O a vloží do elektroporátoru
B) CHEMICKÁ METODA buňky se ošetří roztokem rubidné a vápenaté soli, které způsobují větší permeabilitu membrány DNA se smísí s těmito buňkami a provede se tzv. HEAT SHOCK (45 sec. 42°C)
↑ EFEKTIVITA ↓ ↑ NÁROČNOST ↓
6
Snímek 11 PG2
FLAG hydrofilní epitop rozpoznatelný specifickou protilátkou celulosa váže aromatické residua AK galuszka; 11/03/2007
Který kmen E.coli zvolit?
tonA ton A mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony lacZ.M15 částečná delece wild-typového lacZ genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci lacZ.M15 potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal endA1 end A1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA lacIq lac Iq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru; zrušení přídavkem IPTG mcrA, mcr A, mcr mcrBC, BC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA recA1 rec A1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli
regulace exprese pod T7 promotorem • exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový protein • pro expresii jje nutno t d dodat d td do h hostitelským tit l ký b buněk ěk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi. • v sytému pCR®T7 TOPO® TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována lacZ promotorem pomocí IPTG a tento systém je uložen v genomu hostitelských buněk
7
kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS
• před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein • kmen E.coli BL BL21 21(DE (DE3 3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacZ promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. fága Přirozený lac represor, represor jehož gen je taktéž vložený genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG) • někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promoter vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL BL21 21(DE (DE3 3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol. • T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice • T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.
8
Jaké geny lze v E.coli exprimovat? • většinu z prokaryotických organismů • eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím • většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná) • geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA (podobný genetický kód, evoluční příbuznost)
• všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě
odchylky v genetickém kódu? snižují výtěžek heterologní exprese výjimky:
jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC
E. coli AGA 2.2% AGG 1.6%
AGA AGG
Arabidopsis th.
H. sapiens
AGA 18.9% AGG 11.0%
AGA 11.9% AGG 12.1%
9
mutace místně cílená (site--directed mutagenesis) (site
Stratagene®
• gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba naklonovat do vhodného vektoru • navržení dvou komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, mutovat nesoucí tuto mutaci M
původní sekvence forward primer reverse primer
G
A
L
L
W
L
5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’ 3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’ 5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’
M
G
A
L
L
S
L
• PCR s těmito tě it primery i na templátový t lát ý plasmid l id a s Pfu Pf polymerasou (se samoopravnou funkcí) • vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv (tzv.. nick) • ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, tedy templátový plasmid) • transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu
stabilizace exprimovaného proteinu
2004
SUMO peptide – Small Ubiquitin like MOdifier ochrana před proteolýzou zvyšování rozpustnosti proteinu zvyšuje množství exprimovaného proteinu
Sumo proteasa
10
testování exprese - optimalizace • po transformaci expresního plasmidu do vhodných buněk se namnoží prvotní kultura, selektuje se na vhodném antibiotiku (1.den) • prvotní kultura se pak vhodně naředí čistým médiem na OD600 0.3 – 0.5 (2.den) • indukuje se exprese přídavekem IPTG (0.1-1.0 mM) do kultury (2.den) • kultura se inkubuje na třepačce (aerace) při 1818-37 37°°C (2.-5. den) a odebírají se vzorky ve kterých se detekuje exprimovaný protein. protein. teplota: 25-18 2518°°C – pomalý růst, pomalá exprese, protein je vylučován do cytosolu 37°C - intenzivní růst, mohutná exprese, pokud je 37° ale protein toxický pro bakterii (většina) je ukládán do tzv. INCLUSION BODIES mikrotělíska zůstávající v bakteriální cytoplasmě – ztížená izolace!!! E.coli nikdy nesekretuje protein do média!
izolace proteinu z bakteriální kultury: • pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem
IB
wash I
wash II
100mM
200mM
imidazol 0.5mM
1M
IB
marker
• poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!!
bakt.extraktt
• pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem
11
exprese proteinů ve velkém měřítku: FERMENTORY regulace: • teplota • pH • obsah kyslíku (případně jiných plynů) • přesné dávkování
problémy a nedostatky exprese v E.coli problém
příčina
řešení
buňky umírají, nedaří se selekce
toxický produkt, vysoká bazální exprese
slabší promotor, kontrola bazální exprese, exprese snížení teploty kultivace
nerozpustný produkt (ukládá se do inkluzních tělísek)
redukce disulfidických můstků v redukčním prostředí cytoplasmy
transport do periplasmy snížení teploty snížení exprese fúze s hydrofilní značkou
neaktivní protein
redukce v cytoplasmě afinitní značka ovlivňuje aktivitu
změna typu a polohy značky zvýšení osmotického tlaku média (1M sorbitol)
žádný protein
preference jiného genetického kódu
dodání raritních tRNA silnější promotor zvýšení počtu kopií plasmidů
12
Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy • • • •
gram pozitivní půdní bakterie není lidský ýp patogen g má vyvinutý sekreční systém neprodukuje žádné endotoxiny (rek. proteiny se dají využít v medicíně)
Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy laboratorní a průmyslově využívané kmeny B.subtilis mají tyto mutace:
• delece genu produkujícího tenzidy (sfrC) • delece genu produkujícího červený pigment • delece genu pro exogenní proteasy
13
Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy Bacillus subtilis je přirozeně kompetentní (má systém přenášející DNA přes buněčnou membránu do buňky)
integrace do genomu pomocí homologní rekombinace
amyE gen kóduje neesenciální alfa alfa--amylasu
14
PG1
Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy
využití pro průmyslovou produkci proteas (prací prášky) a amylas (sladovnictví) a hlavně průmyslově nejdůležitější zdroj kyseliny hyaluronové (polysacharid)
operon genů pro syntézu hyaluronové kyseliny z rodu Streptococcus vklonován do genomu Bacillus
15
Snímek 29 PG1
HK dříve se vyráběla z kohoutku kohoutu Petr Galuszka; 12/03/2007
PG3
silný sekreční mechanismus, žádné kontaminující proteiny
Streptomyces lividans - půdní bakterie Caulobacter crescentus - vodní baktérie Staphylococcus carnosus - nepatogenní produkce proteinů se zabudovanými radioisotopy 13C, 15N a deuteriem
Anabaena sp sp. - sinice
využití rekombinantních bakterií v potravinářství Biotech chymosin enzym používaný pro srážení mléka v sýr kvasinkový gen transformovaný do bakterie biotechnologie nahrazuje chymosin izolovaný z poražených telat
bST (bovine somatotropin) hormon zvyšující u krav produkci mléka gen z genomu krávy naklonován do baktérie přidává se do krmiva v kravínech Source: Rent Mother Nature
dříve se používal hormon pracně izolovaný z hypofýzy poražených krav
16
Snímek 31 PG3
aktinomycety Vláknité a rozvětvené bakterie či houby s velmi jemným miceliem (podhoubím), statisíce - miliony/g půdy, velmi dobré proti vysychání. Nejhojnější z nich Streptomycetes, které jsou zodpovědné za zvláštní vůni půdy bohaté na humus. Vysoká celulolytická a amonifikační aktivita, 60% těchto bakterií vykazuje silný antagonismus vůči ostatním bakteriím a houbám vyskytujícím se v jejich blízkosti, působí proti nim vylučováním toxických látek - antibiotik, zvláště streptomycinu, použití i v humánní medicíně galuszka; 12/03/2007
využití rekombinantních bakterií v potravinářství
využití rekombinantních bakterií ve farmacii 2002 – 250 miliónů lidí využívalo léčiv a vakcín produkovaných mikroorganismy
lidský in inzul ulíín (Humulin®) inzulín – polypeptid (51 ak) inzulín pro léčbu diabetiků byl extrahován z pankreasu prasat a krav prasečí inzulín se liší pouze dvěmi ak někteří diabetici však produkovali protilátky proti živočišnému insulinu lidský inzulín se začal syntetizovat uměle (drahé) 1982 poprvé připraven pomocí rDNA technologie od devadesátých let se produkuje ve velkém a levně lidský insulin pomocí transgenních E.coli nebo kvasinek (např. Humulin®)
17
využití rekombinantních bakterií ve farmacii lidský růstový hormon (HGH (HGH)) produkovaný hypofýzou je důležitý regulátor vývoje člověka děti s vrozenou deficienci genu pro HGH trpí dwarfismem (zakrslostí) pravidelné injekce toho hormonu mohou obnovit normální růst živočišný GH je pro léčbu značně neúčinný HGH se také izoloval z hypofýz lidských mrtvol byl zaznamenán zvýšeny výskyt Creutzfeldt-Jakobsovy choroby ((kopurifikace p p prionu)) velice drahé a velká spotřeba mrtvol (např. na izolaci 5 mg hormonu je třeba půl milionů jehněčích mozku) od devadesátých let produkován pomocí rekombinantních bakterií litr bakteriální kultury vyprodukuje 5 mg GH za 15 hodin
PG4
exprese v rostlinách
rostlinné buněčné linie se pro produkci látek nepoužívají
BY--2 tobacco cells BY • odvozené z dřeně Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow-2 v Japonsku (1974) • rychle rostou (12 hod.), netvoří kalusy • snadno absorbují různé sloučeniny – studium metabolismu • snadná synchronizace – studium buněčného cyklu • snadná transformace Agrobacteriem
18
Snímek 36 PG4
rostlinné bunky v suspenzi často vytvařejí kalusy, buněčná stěna produkuji spoustu sekundarních metabolismu mohou produkovat terapeuticky využitelné sekundarni metabolismy galuszka; 13/03/2007
PG5
TAXOL
Hellwig S. et al. al. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nature Biotechnology 22(11), 2004, 14151415-1424.
19
Snímek 38 PG5
Taxol z jehlic tisu cytostatikum jedina komerčně vyráběna látka přes plant cell cultures galuszka; 13/03/2007
molekulární farmářství rostlinné – jedlé vakcíny jako transgeny se používají oslabené toxiny původců mnohých chorob stimulace mukózního imunitního systému v epitelu trávícího traktu (účinná imunizace) velice levné a efektivní značné uplatnění v rozvojových zemích, pojídáním čerstvých plodů se získá imunita vůči nemocem, které v těchto zemích způsobují milióny úmrtí. vše ve formě testů v rostlinách tabáku a bramboru – zatím úspěšné zubní kaz – protein spaA ze Streptococcus mutans hepatitida B – povrchový antigen HBsAg viru cholera – termolabilní enterotoxin B z Vibrio cholerae 1 g brambor vyrobí 30µg tohoto toxinu brambory se uvaří a toxin denaturuje testy na myši prokázaly vysokou účinnost a neškodnost
1997 poprvé testováno na člověku
hlavní snaha vědců je produkce těchto vakcín v plodinách rozšířených ve třetím světě jako je banánovník
molekulární farmářství
plantibodies
v rostlinách připravené živočišné protilátky nebo části protilátek v rostlinách lze produkovat i monoklonální protilátky protilátky jsou vylučovány do mezibuněčného prostoru mohou sloužit přímo v rostlině (jako (jako ochrana proti patogenům) patogenům) nebo mohou být extrahovány a použity v diagnostice či medicíně výrazně se sníží náklady a čas na tvorbu protilátek (hybridomové buňky)
20
molekulární farmářství
plantibodies
• hlavní problém – rozdíly v NN-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a rostlin • plantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete vyvolávají nechtěnou imunitní odpověď • řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,41,4galaktosyltransferasu – rostlina pak produkovala „polidštěné protilátky“ • jako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidem
scFv – single chain variable fragment
non non--hodgkinský lymfom – rakovina lymfatických uzlin (B (B--lymfocytů) nádorové buňky produkují specifické protilátky (zachycené na svém povrchu, liší se od zdravých) tabák infikován TMV s vloženou části genu pro scFV myši tabák produkuje scFv nádorových buněk
21
tabák produkuje funkční antigen, který po aplikaci myši produkuje protilátky proti nádorovým buňkám imunitní odpověď nevznikla na mezidruhovou odlišnost „ produkt rostliny – odlišná glykosylace, špatně ustřižený signální peptid 80% myší přežilo antigen vytvořen během 6 týdnů velice jednoduchá izolace – RYCHLE A LEVNĚ léčba (vakcína) dělaná pacientovi přímo na míru
PG6
v současné době klinicky testované plantibodies antigen
rostlina
typ rekomb. Protilátky
aplikace
povrchový antigen Streptokoka
tabák
sekreční IgA CaroRx™
terapeutická povrchová aplikace
Herpes simplex virus
sója, rýže
IgG
terapeutická povrchová aplikace
sperma
kukuřice
IgG
antikoncepce ve formě gelu
non-Hodginský nonlymfom
tabák
scFv
personalizovaná vakcína
virus vztekliny
tabák
IgG
terapeutická intravenosně
CEA - cancer embryonic antigen
tabák, rýže, pšenice, rajče
scFv, diabodies, chimerické protilátky
terapeutická diagnostická
Stoger et al., Recent progress in plantibody technology, Curr. Pharm Design 11, 2005
22
Snímek 44 PG6
What is CEA? CEA stands for carcinoembryonic antigen. CEA is a type of protein molecule that can be found in many different cells of the body, but is typically associated with certain tumors and the developing fetus. The word "carcinoembryonic" reflects the fact that CEA is produced by some cancers ("carcino-") and by the developing fetus ("-embryonic"). How is CEA measured? CEA is most frequently tested in blood. It can also be tested in body fluids and in biopsy tissue. What is the normal range for CEA blood levels? The normal range for CEA in an adult non-smoker is <2.5 ng/ml and for a smoker <5.0 ng/ml. How is the CEA test used? The best use of CEA is as a tumor marker, especially for cancers of the gastrointestinal tract. When the CEA level is abnormally high before surgery or other treatment, it is expected to fall to normal following successful surgery to remove all of the cancer. A rising CEA level indicates progression or recurrence of the cancer. In addition, levels >20 ng/ml before therapy are associated with cancer which has already spread (metastatic disease). What conditions can cause an elevated CEA? Both benign and malignant (harmless and cancerous) conditions can increase the CEA level. The most frequent cancer which causes an increased CEA is cancer of the colon and rectum. Others include cancers of the pancreas, stomach, breast, lung, and certain types of thyroid and ovarian cancer. Benign conditions which can elevate CEA include smoking, infections, inflammatory bowel disease, pancreatitis, cirrhosis of the liver, and some benign tumors in the same organs in which an elevated CEA indicates cancer. Chemotherapy and radiation therapy can cause a temporary rise in CEA due to the death of tumor cells and release of CEA into the blood stream. Benign disease does not usually cause an increase above 10 ng/ml. What are the limitations of CEA testing? CEA is not an effective screening test for hidden (occult) cancer since early tumors do not cause significant blood elevations. Also, many tumors never cause an abnormal blood level, even in advanced disease. Because there is variability between results obtained between laboratories, the same laboratory should do repeat testing when monitoring a patient with cancer. galuszka; 14/03/2007
molekulární farmářství
biodegradovatelné plasty
některé bakterie jsou schopny uchovávat uhlík a energii ve formě osmoticky inertních polymerů (polyester k. hydroxymaselné PHB) tyto jsou pak v přírodě rychle degradovatelné tři geny z baktérií byly vloženy do rostlin Arabidopsis 3-ketotiolasa NADH--dep NADH dep.. acetoacetylacetoacetyl-CoA CoA--reduktasa PHB--polymerasa PHB syntéza PHB navazuje na syntézu mastných kyselin, jejíž část probíhá bíhá v chloroplastech hl l t h pokud byly tyto geny vloženy do jaderného genomu pod 35S 35S promotorem docházelo k nadměrné produkci polyhydroxybutyrátu v listech (PHB tvořil 0.14% 14% sušiny) pokud byly produkty transgenů cíleny pomocí signálních peptidů do chloroplastů zvýšila se produkce až 100 100x x
23
molekulární farmářství
biodegradovatelné plasty
A bid Arabidopsis i slouží l ží jako j k modelová d l á rostlina tli předpokládá se že, tento model bude přenesen do nějaké rostliny, která produkuje velké hlízy nebo semena a není konzumována ani člověkem ani zvířaty (skočec Ricinus communis communis)) transgenní g řepka p vyprodukuje yp j až 10 g PHB na rostlinu fa MONSANTO zatím tento projekt pozastavila, jelikož to stále ještě není ekonomicky výhodné (výroba plastů z fosilních zdrojů je daleko levnější)
další využívané transgeny
bezkofeinová káva
7-metylxantin N N--metyltransferasa a theobromin NN-metyltransferasa JAPONSKO 2003 exprese genů ů inhibována á metodou RNAi druh Cofea canephora transformován Agrobaktériem transformované rostliny stejné jako wild type Cofea canephora se pěstuje na Madagaskaru a má 2x větší obsah kofeinu než nejrozšířenější Cofea arabica v mladých listech: ↓ theobromin 30 30--80% ↓ kofein 5050-70%
24
YEAST TWO HYBRID SYSTEM HYBRIDNÍ EXPRESNÍ KNIHOVNY systém pro studium interakce protein - protein, bait vektor (návnada) obsahuje gen pro protein, který studujeme a fish (prey) vektor (obsahuje danou cDNA expresní knihovnu)
PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN PROTEIN PROTEIN naklonovaná cDNA INTERAKCÍ – význam pro studium knihovna z libovolného euk.organismu regulačních a signálních drah konstitutivní promotor
kvasinkový chromozom
oddělení molekulární biologie katedry biochemie, PřF UP
různé expresní p vektory y s HIS HIS--tagy gy na C a N konci p pro expresi p v E.coli různé expresní kmeny E.coli expresní vektory s HIS HIS--tagy na C a N konci odvozené ze systému pPICZ a pGAPZ (Invitrogen) pro expresi v Pichia pastoris expresní vektory pro expresi v Saccharomyces cerevisiae – replikační i pro integraci expresní kmeny kvasinek Pichia pastoris a Saccharomyces cerevisiae různé vektory pro transformaci jednoděložných i dvouděložných rostlin
25
