Chapter 7
Summary and concluding remarks Samenvatting en eindconclusies
123
chapter 7
Summary and concluding remarks When comprehending the scale at which the Gram-positive lactic acid bacterium Lactococcus lactis is used in the dairy-industry, one can imagine the consequences of fermentation failures. To date, the most serious threat to these large scale fermentation processes is the omnipotence of bacteriophages that parasitize on lactococcal hosts. As a result, these molecular parasites have been studied extensively. For long, however, lactococcal bacteriophages were only regarded as particles that frustrated fermentation processes. For this reason and, of course, several practical limitations, research was mainly directed towards the grouping of the various bacteriophages. In recent years, lactococcal bacteriophages and their interactions with their hosts have been subjected to analysis at the molecular level. Chapter 1 gives an overview of the research that has led to a better insight into the life cycles of both temperate and lytic lactococcal bacteriophages. The work described in this thesis demonstrates that fundamental knowledge can be exploited for the development of basic genetic tools. As there is a growing need for systems that can facilitate the controlled production of proteins by L. lactis, we set out to develop an inducible gene expression system on the basis of the temperate lactococcal bacteriophage r1t. Bacteriophage r1t was isolated from its lysogenic host and its genome, a double-stranded linear DNA molecule with cohesive ends, was subjected to nucleotide sequence analysis (chapter 2). It was shown to be composed of 33 350 bp. Nucleotide sequence comparisons, N-terminal amino acid sequencing and functional analyses enabled the assignment of possible functions to a number of DNA sequences and several of the 50 ORFs that were identified. The ORFs appeared to be organized in two oppositely oriented, life cycle-specific clusters consisting of 3 and 47 ORFs. Both clusters are separated from each other on one side by the attachment site (required for site specific integration of the phage genome into that of its host) and on the other side by an intergenic region involved in the regulation of the lysogenic and lytic mode of excistance of r1t. Chapter 3 describes the cloning and characterization of this genetic switch. The region was shown to encompass the two divergently oriented genes rro, encoding the phage repressor, and tec, (the topological equivalent of Escherichia coli bacteriophage lambda cro) which are both preceded by consensus -35 and -10 promoter sequences (P1 and P2 , respectively). Three 21-bp direct repeats with internal dyad symmetry contained within this region were implicated to act as binding sites for Rro. A lacZ translational fusion with an open reading frame following tec was used to analyze transcription of this region. When placed on a plasmid, this regulatory 124
summary and concluding remarks
region was shown to be useable for inducible gene expression in L. lactis. Expression of the lacZ fusion, repressed by Rro under conditions favouring the lysogenic life cycle of r1t, could be induced by the addition of mitomycin C at a concentration which normally promotes the switch in the growth of the phage from the lysogenic to the lytic life cycle. The system was shown to hold promise for applications in the dairy industry (acceleration of cheese ripening) as was demonstrated by the induced expression of the r1t lytic cassette (chapter 4). This two-component lysis system is involved in the liberation of progeny phage by the breakdown of the host cell wall, thereby completing the lytic life cycle of the phage. The cassette encompasses the cell wall-lytic enzyme LytR and LytP, a protein that enables LytR to reach its murein-substrate. By combining the r1t genetic switch and the lytic cassette on a plasmid, an inducible lysis system was obtained (Fig. 1). It was shown that the controlled overexpression of the lyt genes in L. lactis resulted in cell lysis.
Figure 1. Schematic representation of the r1t genome. The genetic switch (a) and the lytic cassette (b), that were
combined on a plasmid to form the inducible lysis system, are boxed.
In order to refine the system and make it usable for applications in the food industry, comparative molecular modelling was used in order to obtain thermolabile derivatives of Rro (chapter 5). Conserved structural features rather than primary sequence homologies were used to build a model of a specific region of Rro on the basis of the 3D-structures of two related repressors. This study enabled the identification of Rro residues presumed to stabilize a conserved hydrophobic pocket which, for CI of the Escherichia coli bacteriophage lambda, was
125
chapter 7
shown to be important for thermostability (Fig. 2). By randomizing these positions in Rro, derivatives were obtained that exhibited various thermo-sensitive phenotypes. On the basis of one of the Rro mutants, Rro12, a temperature-inducible gene expression system was developed.
Figure 2. Ribbon drawing of the N-terminal domains of the r1t repressor dimer (indicated in yellow and green) that interact with the DNA (purple). The residues that were randomized are indicated (for clarity, these positions are depicted in only one monomer by red spheres).
Chapter 6 deals with the characterization of the r1t group I intron scrI. An intervening sequence of 928-b is excized from the primary mRNA, which results in the joining of the ORFs 40 and 42 messages. The I-LabI gene, present on scrI, specifies an H-N-H motif-containing endonuclease.The study provided the first evidence for the involvement of the H-N-H class of nucleases in a process known as intron homing; the copying of an intron (DNA) sequence in a cognate intronless allele. The enzyme was shown to introduce a nick in the sense strand of the cognate intronless allele, 3 bp upstream of the intron insertion site. I-LabI thereby promotes the transfer of scrI from a plasmid-borne intron donor to a recipient allele on a second plasmid without the need for additional r1t-encoded proteins.
126
summary and concluding remarks
In conclusion, this study demonstrates that bacteriophages should not only be regarded as parasites frustrating fermentation processes that should be banned from lactococcal life. Rather, they can be benificial for todays (applied) researchers. The exploitation of the phage immunity region in combination with the lytic casette is only one example of phage-derived (genetic) tools that can be used in both fundamental and applied research. In addition, unravelling the life cycles of bacteriophages will also teach us more about L. lactis, as these molecular parasites highly depend on interactions with their respective hosts. In this respect, the modular arrangement of specific functions on the phage genomes could be used advantageously for artificial rearrangements. Although this research will always require the functional analysis of the genes and their products, the availability of complete nucleotide sequences has proven to offer a highly valuale instrument to get insight in bacteriophage genomic structures and to locate genes for desired functions. For r1t it clearly constituted the starting point for research aimed at understanding the events that take place when this “sleeping beauty” is awakening.
127
chapter 7
128
samenvatting en eindconclusies
Samenvatting en eindconclusies Wanneer men zich de schaal waarop de Gram-positieve melkzuurbacterie Lactococcus lactis wordt gebruikt bij de bereiding van gefermenteerde voedingsmiddelen realiseert, kan men zich gemakkelijk de catastrofale gevolgen van het slecht functioneren van deze bacteriën voorstellen. Tot op heden is de besmetting van melkzuurbacterie cultures met bacteriofagen de grootste bedreiging voor de grootschalige fermentatie processen. Teneinde enig inzicht te krijgen in de levenscyclus van bacteriofagen wordt aan deze moleculaire parasieten tegenwoordig vrij veel onderzoek verricht. Aanvankelijk werden de Lactococcus bacteriofagen slechts beschouwd als deeltjes die het fermentatie proces kunnen ontregelen. Mede daarom, en als gevolg van enkele praktische beperkingen, was dit onderzoek er tot betrekkelijk kort geleden dan ook voornamelijk op gericht de verschillende bacteriofagen te categoriseren. De laatste jaren zijn deze bacteriofagen en hun interacties met de gastheer ook op moleculair niveau bestudeerd. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de huidige kennis op het gebied van de levenscycli van zowel lytische als gematigde Lactococcus bacteriofagen. Zoals blijkt uit het werk dat in dit proefschrift is beschreven, kan de nieuwe kennis worden toegepast in zowel fundamenteel onderzoek als in de praktijk. Daar er een groeiende behoefte is aan systemen die de gecontroleerde productie van eiwitten door L. lactis kunnen bewerkstelligen, werd een induceerbaar gen-expressie systeem ontwikkeld op grond van regulatorische sequenties van de gematigde bacteriofaag r1t. Hiertoe werd het dubbelstrengs lineaire DNA molekuul dat de erfelijke informatie van bacteriofaag r1t bevat, geïsoleerd en onderworpen aan nucleotidensequentie analyse (hoofdstuk 2). Het r1t genoom bleek te bestaan uit 33 350 baseparen. Door de nucleotidensequentie te vergelijken met reeds bekende sequenties, het bepalen van de N-terminale aminozuursequenties van structurele eiwitten en de functionele analyse van enkele door r1t-gecodeerde producten, bleek het mogelijk aan bepaalde DNA sequenties en enkele van de 50 mogelijke eiwit coderende sequenties (open reading frames, ORFs) een waarschijnlijke functie toe te schrijven. Deze ORFs blijken te zijn georganiseerd in twee clusters van 3 en 47 ORFs die waarschijnlijk specifiek zijn voor de twee verschillende levens stadia van dit gematigde bacteriofaag. Beide (divergente) clusters worden van elkaar gescheiden door de zogenaamde “attachment site”, die is betrokken bij de integratie van het bacteriofaag genoom in dat van zijn gastheer tijdens de zogenaamde lysogene fase, en een gebied dat is betrokken bij de regulatie van de lysogene en lytische fasen van r1t.
129
chapter 7
Hoodstuk 3 beschrijft de klonering en de karakterisering van het laatsgenoemde gebied. Dit gebied omvat de twee divergent getranscribeerde genen rro, dat codeert voor een repressor, en tec. Beide genen worden voorafgegaan door consensus -35 en -10 promoter sequenties (respectievelijk P1 en P2 ). Door gebruik te maken van een translationele fusie van het $galactosidase gen (lacZ) met het ORF direkt stroomafwaarts van tec kon de transcriptionele regulatie van het gebied worden bestudeerd. Hieruit bleek dat het regulatorische gebied, wanneer aanwezig op het plasmide pIR12, gebruikt kon worden om de expressie van het lacZ gen in L. lactis te induceren. Onder condities waarin r1t zich in de lysogene fase bevindt, werd het aflezen van de lacZ fusie verhinderd door binding van faag repressor (Rro) aan drie repeterende sequenties van 21 baseparen die in het gebied aanwezig zijn. De expressie van de lacZ fusie kon worden geïnduceerd door toevoeging van mitomycine C aan een culture van plasmidebevattende cellen. De aanwezigheid van mitomycine C resulteert in de overgang van r1t van de lysogene naar de lytisch fase als gevolg van de (door RecA bewerkstelligde) autodigestie van het repressor eiwit. De toepasbaarheid van deze “genetische schakelaar” voor een specifieke industriële applicatie werd aangetoond door deze te koppelen aan de lytische cassette van r1t (hoofdstuk 4). De laatsgenoemde module is verantwoordelijk voor het vrijkomen van bacteriofaag nakomelingen door de celwand van de gastheer af te breken. De lytische levenscyclus wordt daarmee gecompleteerd. De cassette bestaat uit twee componenten, namelijk een gen dat codeert voor het celwand-lytische enzym LytR, en het lytP gen, waarvan het produkt LytR toegang verschaft tot de celwand van de gastheer. Door het regulatorische gebied en de lytische cassette te combineren op een plasmide werd een induceerbaar lysis systeem voor L. lactis verkregen (Fig. 1). Het bleek dat L. lactis cellen die het plasmide bevatten lyseerden wanneer de expressie van de lytische cassette werd geïnduceerd.
Zie figuur 1 op pagina 125. Schematische weergave van het r1t genoom. De “genetische schakelaar” (a) en de lytische cassette (b) die op een plasmide werden gecombineerd voor de constructie van het induceerbare lysis systeem, zijn omlijnd.
130
samenvatting en eindconclusies
Teneinde het systeem te optimaliseren en bruikbaar te maken voor toepassingen in de voedingsmiddelenindustrie werden temperatuur gevoelige varianten van Rro gemaakt (hoofdstuk 5). Op grond van geconserveerde structurele eigenschappen werd, door gebruik te maken van de bekende 3D-structuur van verwante repressoren van de E. coli bacteriofagen lambda (8) en 434, met behulp van moleculaire modelling een 3D model van een specifiek domein van Rro gemaakt. Dit model maakte het mogelijk Rro residuen aan te wijzen die, op grond van de informatie van de thermosensitieve 8 CI repressor CI857, waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de thermo-stabiliteit van het eiwit. De residuen maken deel uit van een geconserveerde hydrofobe pocket. Drie posities werden gerandomniseerd door middel van PCR. Door gebruik te maken van plasmide pIR12 was het mogelijk voor die Rro varianten te screenen die bij hogere temperaturen niet meer in staat waren de expressie van lacZ te represseren.Van enkele Rro mutanten die een karakteristiek temperatuursensitief phenotype te zien gaven, werden de specifieke mutaties bepaald. Op basis van één van de Rro mutanten, Rro12, werd een temperatuur induceerbaar gen expressie systeem voor L. lactis ontwikkeld.
Zie figuur 2 op pagina 126. Representatie van de N-terminale domeinen van de r1t repressor-dimeer (aangegeven in geel en groen) die binden aan het DNA (paars). De residuen die werden gerandomniseerd zijn weergegeven (voor de duidelijkheid zijn deze posities slechts in één monomeer aangegeven met rode bollen).
Hoofdstuk 6 beschrijft de karakterisatie van het groep I intron scrI van r1t. Deze 928 basen bevattende sequentie wordt uit het primaire RNA transcript verwijderd, hetgeen resulteert in de fusie van de coderende sequenties van ORF40 en ORF42. Het I-LabI gen dat op dit intron is gelegen, specificeert een zogenaamd H-N-H endonuclease. Dit onderzoek verschafte het eerste bewijs voor de betrokkenheid van deze specifieke klasse van endonucleasen in intron homing: het kopiëren van een intron (DNA) sequentie in een homoloog intronloos allel. Het enzym maakt een enkelstrengsbreuk in het intronloze allel, 3 base paren stroomopwaarts van de plaats waar het intron wordt geïnserreerd. Door gebruik te maken van een plasmide-naarplasmide homing assay werd de mobilisatie van scrI naar een recipiënt allel aangetoond. Het bleek dat voor homing van scrI geen additionale door r1t-gecodeerde eiwitten zijn vereist.
131
chapter 7
Wat duidelijk uit deze studie naar voren is gekomen, is dat bacteriofagen niet enkel en alleen beschouwd moeten worden als parasieten die fermentatieprocessen verstoren en derhalve geëlimineerd zouden moeten worden. Bacteriofagen kunnen ook van nut zijn voor zowel fundamenteel als toegepast onderzoek. Het gebruik maken van de genetische schakelaar en de lytische cassette is slechts één voorbeeld van de mogelijke applicaties. Bovendien zal onderzoek aan Lactococcus fagen inzicht verschaffen in de gastheer L. lactis, daar deze moleculaire parasieten afhankelijk zijn van nauwe interacties met de gastheer. De modulaire organisatie van het bacteriofaag genoom kan het bestuderen van deze interacties vergemakkelijken. Hoewel dit onderzoek altijd de functionele analyse van genen en de produkten zal vereisen, bleek het voorhanden zijn van de complete nucleotidensequentie van groot belang voor het verkrijgen van enig inzicht in de chromosomale organisatie en het opsporen van bepaalde funkties van r1t. Voor r1t betekende dit in ieder geval het begin van onderzoek dat uiteindelijk inzicht zal verschaffen in wat er precies gebeurd wanneer deze schone slaapster ontwaakt.
132
