Základy biochemie KBC / BCH
Centrální metabolické děje Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Centrální metabolické děje • Osnova: • Cyklus trikarboxylových kyselin a glyoxylátový cyklus. • Oxidativní fosforylace. • Tvorba ATP. • Rozpojovače a inhibitory oxidativní fosforylace.
2
Cyklus trikarboxylových kyselin (TCA). Citrátový cyklus, Krebsův cyklus. •
• • • •
3
Citrátový cyklus je sled osmi důmyslných reakcí ve kterém dochází v cyklu k oxidaci acetylové skupiny acetyl CoA na dvě molekuly CO2 a uvolněná volná energie se ukládá do redukovaných koenzymů NADH a FADH2. Produktem jednoho cyklu jsou dvě molekuly CO2, tři NADH, jedna FADH2 a jedna makroergická sloučenina GTP (=ATP). Sled těchto reakcím byl intenzivně studován mezi léty 1932 až 1937 řadou badatelů na létacích svalech holubů. V roce 1935 publikoval maďarský vědec Albert Szent-Gyorgyi poznatek, že respirace se urychlí přidáním malého množství sukcinátu, fumarátu, malátu nebo oxaloacetátu. Efekt působení těchto látek byl katalytický. Další, jako Carl Martius a Franz Knoop ukázali, že citrát může být převeden na α-oxoglutarát. Hans Krebs, který publikoval inhibici přechodu sukcinátu na fumarát (sukcinátdehydrogenasa) malonátem, reakce zastavuje celou oxidaci, tak měl k dispozici sekvenci reakcí: citrát → akonitát → isocitrát → αoxoglutarát → sukcinát → fumarát → malát → oxaloacetát. Citrát musí být obnovován.
Historie objevu citrátového cyklu •
• • • • •
4
V roce 1937 publikovali Martius a Knoop klíčový poznatek, který Krebsovi chyběl pro spojení oxidace v citrátovém cyklu s metabolismem glukosy. Oxaloacetát a pyruvát mohou být převedeny na citrát za působení peroxidu vodíku. Pyruvát jako produkt odbourávání glukosy v glykolýze se tak stal spojovacím článkem mezi metabolismem sacharidů a citrátovým cyklem. Krebs již měl zkušenost s cyklickým dějem – v roce 1932 publikoval spolu Kurtem Henseleitem močovinový (ornithinový) cyklus. Krebsův první pokus o publikaci citrátového cyklu v Nature byl neúspěšný. Práce byla přijata do méně prestižního časopisu Enzymologia. Krebs, H.A. and Johnson, W.A.: The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues. Enzymologia 4, 148 – 156 (1937). Hans Adolf Krebs (1900 – 1981) obdržel Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii v roce 1953 spolu s Fritzem Albertem Lipmannem.
Charakteristika citrátového cyklu
5
•
Citrátový cyklus je ústřední metabolická dráha vedoucí k zisku energie ze substrátů jako jsou sacharidy, mastné kyseliny a aminokyseliny, které se odbourávají na acetyl CoA.
•
Citrátový cyklus je lokalizován v matrix mitochondrií.
•
Citrátový cyklus je aerobní metabolická dráha.
•
Citrátový cyklus je amfibolický. V cyklu dochází ke katabolické reakci (odbourávání acetyl CoA na CO2). Meziprodukty cyklu se využívají k syntézám dalších látek – anabolické reakce.
•
Sumární rovnice citrátového cyklu:
3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + acetylCoA → → 3 NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2 CO2
Přehled vstupu substrátů do citrátového cyklu. Glykogen
Glukosa Glykolýza Pyruvát CO2 Aminokyseliny
Mastné kyseliny
Acetyl-CoA
CITRÁTOVÝ CYKLUS
6
2 CO2
Pyruvátdehydrogenasový komplex
–
tvorba acetyl CoA z pyruvátu.
•
Pyruvát je za aerobních podmínek transportován z cytoplasmy do matrix mitochondrie transportním proteinem ( pyruvát – H+ symport).
•
Multienzymový komplex pyruvátdehydrogenasy je skupina tří nekovalentně vázaných enzymů, který katalyzuje na sebe navazující reakce.
•
Výhodou multienzymového komplexu je: A) Sled reakcí je urychlován, protože jsou minimální vzdálenosti mezi enzymy. B) Přímá návaznost reakcí zamezuje vedlejším reakcím. C) Reakce na komplexu mohou být koordinovaně kontrolovány.
7
Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu: • Pyruvátdehydrogenasa (E1) • Dihydrolipoyltransacetylasa (E2) • Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3) • Např. komplex E. coli je 4 600 kd proteinový komplex. Mitochondriální komplex je 10 000 kd protein, obsahující 20 E2 trimerů obklopených 30 E1 heterotetramery a 12 E3 dimerů. • Pyruvátdehydrogenasový komplex katalyzuje sekvencí tří reakcí, sumárně: Pyruvát + CoA + NAD+ → acetyl CoA + CO2 + NADH
8
• Komplex využívá pěti různých koenzymů: Thiaminpyrofosfát (TPP), koenzym A (Co A SH), NAD+, FAD a lipoamid.
Pyruvátdehydrogenasa (E1) Dekarboxyluje pyruvát za tvorby hydroxyethyl-TPP meziproduktu. H3C
R1
R2 N
+
C-
H3C
S E1
R1
TPP E1
+
-
O
C
C
O
O
Pyruvát
9
CH3
H
+
CO2
H
R2 N
O
+
C C -
S E1 CH3
Hydroxyethyl-TPP E1
Lipoamid a dihydrolipoamid. Lipoová kyselina je vázána na E2 amidovou vazbou přes ε-aminoskupinu Lys. Lipoová kyselina
S S
Lysin
CH2 CH2 CH2
NH
O
CH CH2
CH2
CH2
C
NH
(CH2)4
CH C
Lipoamid
O
2H+ + 2eHS
CH2 CH2
HS
CH2
10
NH
O
CH CH2
CH2
CH2
C
Dihydrolipoamid
NH
(CH2)4
CH C
O
Hydroxyethylová skupina je přenesena na dihydrolipoyltransacetylasu (E2).
Hydroxyethylový karbanion je současně oxidován na acetyl a lipoamid redukován na disulfid. H3C H3C
R1 H
R2 N
O
+
C C -
S E1 CH3
H3C
H+
R1 H
R2 N
O
+
C C
S
S
S
HS E2
Lipoamid-E2
S E1
R1
H+
R2 N
+
C -
S E1
TPP E1
+
CH3 O
C
CH3
S E2
HS E2
Acetyl-dihydrolipoamid-E2
11
E2 poté katalyzuje transesterifikací, při které se acetyl přenese na CoA za tvorby acetyl-CoA. O CoA O
CoA
SH
C
CH3
HS
HS
HS
Acetyl-dihydrolipoamid-E2
C
CH3
Acetyl-CoA
S
E2
12
S
+
E2
Dihydrolipoamid-E2
Regenerace lipoamidu na E2. Reoxidace probíhá přes kovalentně vázaný FAD.
HS
FAD S
+
S
E3 (oxidovaná forma)
13
S
FAD SH
HS E2
+
SH
E3 (redukovaná forma)
S E2
Reoxidace redukovaného E3. Elektrony z FADH2 se přenáší na NAD+ za tvorby NADH. FAD slouží spíše jako vodič elektronů !!!
FAD
FADH2
FAD
SH
S
S
SH
S
S NAD+
E3 (redukovaná forma)
14
NADH + H+
E3 (oxidovaná forma)
Aktivní místo dihydrolipoamiddehydrogenasy.
FAD NAD+
Cys43 Cys48
Tyr 181
15
Lipoyllysylové raménko E2 S HC
S CH2 CH2
H2C
CH2
• Raménko přenáší meziprodukty reakce mezi jednotlivými enzymy.
H2C CH2 140 nm
O
C NH H2C CH2 H2C CH2 HC
C O
16
N H
Lipoyllysylové raménko (plně roztažené)
Toxicita arsenitanu a organických sloučenin arsenu.
Inhibují pyruvátdehydrogenasu a 2-oxoglutarátdehydrogenasu a tím i respiraci.
-
O
OH As OH
+
HS
-
O
HS
S As S
R
Arsenitan
R1
As
O
2 H2O
+
H2O
R
Dihydrolipoamid
+
Organická sloučenina arsenu
17
+
HS
S R1
HS
As S
R
R
Citrátový cyklus. Citrátsynthasa - první reakce.
Tvorba citrátu z acetyl CoA a oxaloacetátu. Asp jako báze. His 320
His 320
H
H
-
OOC
C
-
OOC
O
H2C
COO
-
1
+
His 274
-
SCoA
His 274
O
H2C
SCoA
Acetyl-CoA O
18
N
H
O
H
-
N
H
H2C
COO
Oxaloacetát
N N
O
H2C
Oxaloacetát
+
C
-
H
O
Asp 375 O
Asp 375 O
Enol forma acetyl CoA jako nukleofil !! N
His 320 H -
OOC
C
N O
OOC
-
-
OOC
Oxaloacetát
+
H
-
COO
H2C
2
OH C CH2
CH2
O C
SCoA
Citryl-CoA
N
H
O
His 274
N
Asp 375 O
H -
O
H2C
H2O 3
SCoA
CoASH -
OOC
H
19
His 274
O
-
Asp 375 O
OOC
OH C
CH2
CH2
Citrát
COO
-
Akonitasa – druhý krok.
Reverzní izomerizace citrátu a isocitrátu přes cis-akonitát.
COO
-
H2O
CH2 HO
C
COO
H
C
H
COO
-
Citrát
20
-
COO H2C
H
-
COO
-
COO
H2O
-
CH2
C
H
C
COO
C
HO
C
H
COO
-
cis-Akonitát
COO
-
Isocitrát
-
NAD+ dependentní isocitrátdehydrogenasa
COO
-
CH2 C
C
HO
C
H
C
-
O
Isocitrát
21
O
-
CH2
O
H
O
COO
H
-
NAD+
NADH + H+
O
COO
C
C
O
C
-
O
COO
CH2
O
C
-
H
2+
Mn
O
Oxalosukcinát
CO2
O
-
CH2
C
H -
C
O
C
-
O
2+
Mn
H+
O
C
H
C
O
C
-
O
2-Oxoglutarát
2-Oxoglutarátdehydrogenasa
Oxidační dekarboxylace – analogie pyruvátdehydrogenasy. E2 -dihydrolipoyltranssukcinylasa
COO
-
CoA-SH
CH2
CO2
CH2 C O
C
-
CH2 CH2
O O
-
2-Oxoglutarát
22
COO
C NAD+
NADH + H+
S
O CoA
Sukcinyl-CoA
Sukcinyl-CoAsynthetasa (sukcinátthiokinasa). • • •
Savčí enzym obvykle katalyzuje tvorbu GTP z GDP a Pi. U rostlin a bakterií je to ATP z ADP a Pi. ATP a GTP jsou energeticky ekvivalentní, nukleosiddifosfátkinasa dochází k přechodu: GTP + ADP
GDP + ATP
díky
enzymu
Δ Go´= O !!
•
Reakce katalyzovaná sukcinyl-CoA synthetasou je další příklad fosforylace na úrovni substrátu (nezávisí na přítomnosti kyslíku).
• • • •
Reakce probíhá ve třech stupních: A) Sukcinyl-CoA reaguje s Pi za tvorby sukcinylfosfátu a CoA. B) Transfer fosfátu z sukcinylfosfátu na His enzymu za uvolnění sukcinátu. C) Fosfát z enzymu je přenesen na GDP za tvorby GTP.
•
V tomto bodě citrátového cyklu je acetyl kompletně oxidován na dvě CO2, dva NADH a GTP. Další část cyklu je převod sukcinátu na oxaloacetát.
23
První fáze sukcinátthiokinasové reakce:
COO CH2 CH2 O
C
-
OH
+
S CoA
Sukcinyl-CoA
24
COO
O
P O
O
-
-
CH2
1
CH2
-
O
C
O
+ 2PO3
Sukcinyl-fosfát
HS CoA
Druhá fáze sukcinátthiokinasové reakce.
COO
-
CH2 CH2 O
C
O
Enzym
+ 2PO 3
Sukcinyl-fosfát
25
N N
COO H
2
CH2
O
C
O
Enzym
+
CH2 H+
His
-
-
Sukcinát
N N
H
+ 2-
PO 3
3-Fosfo-His
Třetí fáze sukcinátthiokinasové reakce.
Enzym
Enzym O G
O
P
-
O O
O
GDP
26
-
P O
O -
+
N N
H
3
+
2PO3
3-Fosfo-His
N N
H+
His
H
O
+
G
O
P O
-
O O
P O
GTP
-
O O
-
P O
O -
Sukcinátdehydrogenasa
Stereospecifická dehydrogenace sukcinátu na fumarát. • •
Enzym je jediným z citrátového cyklu lokalizovaný v mitochondriální membráně a obsahující kovalentně vázaný FAD, který je redukován na FADH2. FAD se obvykle účastní oxidace alkanů za tvorby alkenů. Pro další katalytický cyklus musí být FADH2 nejdříve reoxidován. Přenos elektronů je součástí mitochondriálního elektronového transportního řetězce. COO H
C
H
H
C
H
COO
27
-
-
Sukcinát
H
+
E-FAD
-
OOC
C C
COO
-
+ H
Fumarát
E-FADH2
Kovalentní vazba FAD na His sukcinátdehydrogenasy.
Enzym CH2
His
N N H2C
H3C
28
H2C
R
HO
C
H
HO
C
H
HO
C
H
CH2 N
N NH
N
FAD
O
O
Inhibice sukcinátdehydrogenasy substrátovým analogem malonátem – jeden z Krebsových příspěvků k objasnění citrátového cyklus.
COO COO
-
-
Malonát 29
CH2 CH2
CH2 COO
-
COO
-
Sukcinát
Fumarasa (fumaráthydratasa)
Adice vody na dvojnou vazbu za tvorby malátu. Reakce probíhá přes karbaniontový přechodový stav. Adice OH – předchází adici H+. H -
OH
H -
OOC
C C
COO
H
Fumarát
30
OOC
COO
-
C C
H
-
OH H+
Karbaniontový přechodový stav -
H
H -
COO
C
OOC
C H
Malát
OH
-
Malátdehydrogenasa • • •
H
COO
C
OOC
C H
Malát
31
regenerace oxaloacetátu
Mechhanismus přenosu hydridového aniontu na NAD+ je obdobný jako u laktátdehydrogenasy. Malátdehydrogenasová reakce má Δ Go´= + 29, 7 kJ.mol-1 a proto je koncentrace oxaloacetátu v rovnováze velmi nízká. Reakci udržuje odběr oxaloacetátu citrátsynthasou, protože citrátsynthasová reakce má Δ Go´= - 31, 5 kJ.mol-1.
H -
-
OH
-
+
H +
NAD
-
OOC
H C C
COO
-
+ O
Oxaloacetát
NADH
+
H+
Bilance citrátového cyklu •
Oxidace jednoho acetylu v jednom cyklu vede ke tvorbě dvou CO2 (Pozor: to nejsou atomy uhlíku vstupujícího acetyl-CoA) ve 4 x dvouelektronovém procesu.
•
Dalším ziskem jsou tři molekuly NADH a jedna FADH2 a jedno GTP.
•
Elektrony z redukovaných koenzymů jsou přeneseny do elektronového transportního řetězce, který vede k redukci O2 na H2O a uvolněná energie se zachytí jako ATP.
•
Oxidace jednoho NADH vede ke tvorbě tří ATP a oxidace jednoho FADH2 ke tvorbě dvou ATP.
•
Jeden cyklus vede ke tvorbě 12 ATP!!!
•
Vyjdeme-li z molekuly glukosy, získáme za aerobních podmínek cca 38 ATP!!!
32
Aerobní zisk ATP z glukosy: Glukosa 2 NADH
6 ATP 2 ATP
2 Pyruvát
2 NADH
6 ATP
6 NADH
18 ATP
2 FADH2
4 ATP
2 GTP
2 ATP
2 Acetyl-CoA
33
Regulace pyruvátdehydrogenasového komplexu •
Pyruvátdehydrogenasa je jediný savčí systém tvorby acetyl CoA z pyruvátu.
• • •
Dva regulační systémy: A) Inhibice produkty – NADH a acetyl-CoA. B) Kovalentní modifikace systémem fosforylace / defosforylace E1.
•
A) Vysoké poměry NADH / NAD+ a acetyl-CoA / CoA udružují enzym E2 v acetylovaném stavu, který nepřijímá hydroxyethylovou skupinu – zpomalení pyruvátdehydrogenasy.
•
B) U eukaryot produkty jako NADH a acetyl CoA, aktivují pyruvátdehydrogenasakinasu. Výsledná fosforylace specifického Ser vede k inaktivaci pyruvátdehydrogenasy. Insulin, signál dostatku glukosy, aktivuje pyruvátdehydrogenasafosfatasu a tím enzym aktivuje.
34
Aktivace a deaktivace pyruvátdehydrogenasy defosforylací a fosforylací.
Pi
E1-OH (aktivní)
Pyruvátdehydrogenasa fosfatasa H2O
35
ATP Pyruvátdehydrogenasa kinasa
E1-OPO3
2-
(inaktivní)
ADP
Energetické změny jednotlivých reakcí citrátového cyklu • Změna standardní volné energie (Δ Go´) a fyziologická změna volné energie (Δ G) reakcí citrátového cyklu.
• • • • • • • • •
36
1 2 3 4 5 6 7 8
Reakce Enzym
Δ Go´ (kJ.mol-1)
Δ G (kJ.mol-1)
Citrátsynthasa Akonitasa Isocitátdehydrogenasa 2-Oxoglutarátdehydrogenasa multienzymový komplex Sukcinyl CoAsynthetasa Sukcinátdehydrogenasa Fumarasa Malátdehydrogenasa
- 31, 5 ~5 - 21 - 33
Negativní ~0 Negativní Negativní
- 2, 1 + 6, 0 - 3, 4 + 29, 7
~0 ~0 ~0 ~0
Regulace citrátového cyklu •
Identifikace rychlost limitujících pochodů CC je obtížná, protože neznáme přesné koncentrace substrátů a produktů, které se pohybují mezi matrix a cytosolem.
•
Tři enzymy CC jsou za fyziologických podmínek mimo rovnováhu: 1) citrátsynthasa 2) NAD+-dependentní isocitrátdehydrogenasa 3) 2-oxoglutarátdehydrogenasa.
•
V srdečním svalu je průtok metabolitů CC závislý na spotřebě kyslíku.
•
Citrátový cyklus je kontrolován: A) Dostupností substrátů B) Inhibicí produkty. C) Kompetitivní zpětnovazebnou inhibicí meziprodukty cyklu.
37
Regulace citrátového cyklu •
Acetyl CoA a oxaloacetát jako hlavní substráty jsou přítomny v matrix v nízkých koncentracích, které nesaturují citrátsynthasu.
•
Metabolický tok přes citrátsynthasu závisí na dostupnosti substrátů.
•
Koncentrace oxaloacetátu, který je v rovnováze s malátem se pohybuje v závislosti na [NADH] / [NAD+ ] dle rovnice:
K = [oxaloacetát].[NADH] / [malát].[ NAD+ ] •
38
Znamená to, že v pracujícím svalu při zvyšující se respiraci klesá současně [NADH] v mitochondrii. To doprovází vzrůst [oxaloacetátu], který stimuluje citrátsynthasu.
Další momenty regulace citrátového cyklu Pyruvát Ca2+
Acetyl-CoA
Oxaloacetát Citrát
Malát
Fumarát
NADH
Isocitrát Ca2+ ADP
Sukcinát
GTP
Sukcinyl-CoA
2-Oxoglutarát Ca2+
ATP
39
Amfibolické funkce citrátového cyklu Pyruvát
CO2
Acetyl-CoA Aminokyseliny
Glukosa
Aspartát Fenylalanin Tyrosin
Mastné kyseliny
Cholesterol
Oxaloacetát Citrát
Malát
Fumarát
Isocitrát
Sukcinát
Sukcinyl-CoA
2-Oxoglutarát
Porfyriny
40
Isoleucin Methionin Valin
Aminokyseliny Prodloužení řetězce mastných kyselin
Kataplerotické reakce
- dráhy využívající meziprodukty citrátového cyklu. •
1. Glukoneogeneze – oxaloacetát k syntéze glukosy. Oxaloacetát musí být transportován do cytosolu, kde glukoneogeneze probíhá. Vstupuje tam ve formě malátu nebo aspartátu. Vzhledem k cyklickému charakteru CC, může být takto využit k syntéze glukosy každý meziprodukt.
•
2. Biosyntéza mastných kyselin – probíhá v cytosolu. Acetyl CoA je do cytosolu transportován ve formě citrátu.
•
V cytosolu je ATP-citrátlyasa která katalyzuje reakci: ATP + citrát + CoA → ADP + Pi + oxaloacetát + acetyl CoA.
•
3. Biosyntéza aminokyselin oxaloacetát na Asp.
41
–
2-oxoglutarát
přechází
na
Glu
a
Glutamátdehydrogenasová reakce tvorby glutamátu:
COO
-
COO
CH2
CH2
+
CH2 C
O
COO
-
2-Oxoglutarát
42
-
NADH
+
H+
+
NH4+
+
CH2 H
+
C
NH3
COO
-
Glutamát
NAD+
+
H2O
Transaminace oxaloacetátu na aspartát
COO
-
COO CH3
CH2 C
O
COO
-
Oxaloacetát
43
+
H3N
+
CH3
CH2
C
H
COO
-
Alanin
-
H3N
+
C
H
COO
-
Aspartát
+
C
O
COO
-
Pyruvát
Anaplerotické reakce
– doplňující meziprodukty citrátového cyklu. • Nejdůležitější anaplerotickou reakcí je pyruvátkarboxylasová: Pyruvát + CO2 + ATP + H2O → oxaloacetát + ADP + Pi • Reakce je také prvním stupněm glukoneogeneze. • Pyruvátkarboxylasu aktivuje acetyl CoA. • Další anaplerotickou látkou je sukcinyl-CoA, který se tvoří při odbourávání mastných kyselin s lichým počtem uhlíků a některých aminokyselin. • Dále 2-oxoglutarát a 44 transaminací Glu a Asp.
oxaloacetát
vznikající
reverzibilní
Anaplerotické reakce citrátového cyklu: Glykolýza
Pyruvát CO2
CO2
Acetyl-CoA
Oxaloacetát
Glutamát
CITRÁTOVÝ CYKLUS
45
2-Oxoglutarát
Alanin
Glyoxylátový cyklus
Rostliny, bakterie a plísně obsahují enzymy, které katalyzují konverzi acetyl-CoA na oxaloacetát. •
Glyoxylátový cyklus probíhá v glyoxysomech a mitochondriích. Glyoxysomy jsou na membránu vázané organely, specializované peroxisomy.
• •
Řada enzymů je společných s citrátovým cyklem. Navíc: glyoxysomální isocitrátlyasa a malátsynthasa.
•
Výsledkem glyoxylátového cyklu je převod dvou molekul acetyl CoA na sukcinát, kdežto v citrátovém cyklu se uhlíky acetyl CoA uvolňují jako CO2.
•
Vytvořený sukcinát je transportován do mitochondrie - do CC a převeden na malát- anaplerotická reakce !!
•
Malát může být převeden na oxaloacetát, nebo transportován do cytosolu a tam převeden na oxaloacetát jako prekurzor glukosy v glukoneogenezi.
46
Reakce glyoxylátového cyklu v glyoxysomech: GLYOXYSOM
COO -
OOC
C
SCoA
2
C
COO
Akonitasa Citrátsynthasa
O OOC
COO -
CH2
Citrát
1
Acetyl-CoA
-
C
-
OH
HSCoA
O H3C
CH2
CYTOSOL
-
OOC
CH2
CH COO -
CH
Isocitrát OH
COO -
CH2
-
Oxaloacetát NADH + H+
Malátdehydrogenasa
5
-
OOC
+
NAD
OOC
CH
CH2
COO
-
Malátsynthasa
Malát
47
H
CH2 COO -
O
+
C
COO -
Glyoxylát
4 HSCoA
Do cytosolu
CH2
Sukcinát
OH -
3
Isocitrátlyasa
O
H3C
C
SCoA
Acetyl-CoA
Do mitochondrie
Část glyoxylátového cyklu v mitochondrii MITOCHONDRIE
-
OOC
CH2
CH2 COO -
Sukcinát FAD
Sukcinátdehydrogenasa FADH2 -
OOC
H C
C H
COO -
Fumarát H2O
Fumarasa OH -
OOC
CH
CH2
COO -
Malát
48
Citrátový cyklus
Dráha malátu v cytosolu
CYTOSOL OH -
OOC
CH
O CH2
COO -
-
OOC
Malát
CH2
Oxaloacetát NAD+
49
C
NAD + H+
COO -
GLUKONEOGENEZE
Význam glyoxylátového cyklu •
Celková reakce glyoxylátového cyklu: 2 Acetyl CoA + 2 NAD+ + FAD → → oxaloacetát + 2 CoA + 2 NADH + FADH2 + 2 H+
• • •
Isocitrátlyasa a malátsynthasa existují jen u rostlin. Umožňují klíčícím rostlinám využívat skladované triacylglyceroly. Jedná se o anaplerotickou reakci !! Vnáší oxaloacetát do citrátového cyklu.
•
Patogen, jako Mycobacterium tuberculosis přežívá v plících aniž by bylo odhaleno imunitním systémem. Využívá glyoxylátový cyklus. Možnost zásahu - inhibice isocitrátlyasy. Obdobně kvasinka Candida albicans.
50
Elektronový transport a oxidativní fosforylace • • • •
Mitochondrie Elektronový transport Oxidativní fosforylace Kontrolní systém oxidativního metabolismu.
• Moto: • Odpočívající lidské tělo spotřebuje asi 420 kJ energie za hodinu, což odpovídá spotřebě 100 W žárovky. • Energie se získává elektrochemicky v mitochondriích při napětí 0, 2 V (v el. síti 220 V), ale proud odpovídá 500 Amp, což reprezentuje transmembránový pohyb přibližně 3 x 1021 protonů za sekundu. Tento pohyb vede k tvorbě ATP.
51
Mitochondrie
•
Mitochondrie jsou místem eukaryotního oxidačního metabolismu.
•
Mitochondrie obsahují: Pyruvátdehydrogenasu, enzymy citrátového cyklu, enzymy katabolismu mastných kyselin a enzymy, spolu s proteiny, elektronového transportního řetězce a oxidativní fosforylace.
52
Mitochondrie
Vnější membrána Vnitřní membrána Kristy Matrix
Mezimembránový prostor Drsné endoplazmatické retikulum
53
Mitochondriální transportní systém •
Vnější mitochondriální membrána, stejně jako bakteriální, obsahuje poriny, proteiny, které dovolují volnou difůzi molekul do 10 kd. Je tedy ekvivalentní s cytosolem.
•
Vnitřní membrána, která je hmotnostně složena ze 75 % z proteinů, volně propouští O2, CO2 a H2O. Jinak obsahuje řadu transportních proteinů, které kontrolují průchod metabolitů jako jsou ATP, ADP, pyruvát, Ca2+ a fosfát.
•
Redukované ekvivalenty (NADH) se transportují z cytosolu do mitochondrie, buď malát-aspartátovým člunkem nebo glycerol-3fosfátovým člunkem.
• •
NADH transportované glycerol-3-fosfátovým člunkem poskytuje po oxidaci jen 2 ATP !
54
Malát-aspartátový člunek -
Cytosol
COO C
HO
H
Vnitřní mitochondrionální membrána
-
Mitochondrie
COO C
HO
CH2
CH2
COO-
NAD+
Malát
Malát
Malátdehydrogenasa
COO-
NAD+
Malátdehydrogenasa
NADH + H+
NADH + H+
-
-
COO
COO
O
C
Oxaloacetát
Oxaloacetát
CH2
O
C CH2
COO-
COO-
Aminokyselina
Aminokyselina Aspartátaminotransferasa
Aspartátaminotransferasa
α-Ketokyselina
α-Ketokyselina
-
COO H3N
+
C
Aspartát
Aspartát
H
+
C CH2
COO-
Glukoneogeneze
-
COO H3N
CH2
55
H
H
COO-
PEP
PEP
Glycerol-3-fosfátový člunek: NADH + H+
Cytosolická glycerol-3-fosfát dehydrogenasa
CH2OH O
NAD+
CH2OH HO
C 2-
2-
Glycerol-3-fosfát
Dihydroxyacetonfosfát
Mitochondrionální glycerol-3-fosfát dehydrogenasa
Cytosol E-FADH2
QH2
Matrix
H
CH2OPO3
CH2OPO3
56
C
E-FAD
Q
Vnitřní mitochondriální membrána
Translokátor ADP – ATP •
Většina v mitochondrii vytvořeného ATP se využívá v cytoplasmě.
•
Vnitřní mitochondriální membrána obsahuje ADP-ATP translokátor transportující ATP do cytosolu a ADP z cytosolu do mitochondrie.
•
Translokátor je dimer identických 30 kd podjednotek s jedním vazebným místem pro ADP i ATP, které vzájemně kompetují.
•
Translokátor mění konformaci při vazbě buď ADP nebo ATP.
•
Export ATP (4 záporné náboje) proti importu ADP (3 záporné náboje) je elektrogenní antiport poháněný rozdílem membránového potenciálu.
57
Konformační změny ADP-ATP translokátoru MITOCHONDRIE
CYTOSOL
ATP / ADP
58
ATP / ADP
KONFORMACE 2
KONFORMACE 1
Transport fosfátů
•
K syntéze ATP z ADP a Pi je nutné transportovat fosfát cytosolu do mitochondrie.
•
Fosfátový nosič – lze charakterizovat jako elektrochemický Pi-H symport poháněný rozdílem (Δ pH) (transmembránový protonový gradient).
•
Vytvořený transmembránový protonový gradient nevede pouze syntéze ATP, ale také k transportu ADP a Pi.
59
z
k
Termodynamika elektronového transportu. • •
Elektronové nosiče přenášející elektrony z NADH a FADH2 na kyslík jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně. Oxidace NADH je silně exergonická. Měřítkem afinity substrátu k elektronům je standardní redukční potenciál (ξo´). Čím vyšší hodnota, tím větší afinita k elektronům.
• • • •
Poloreakce oxidace NADH kyslíkem jsou: NAD+ + H+ + 2 eNADH ξo´= - 0, 315 V H2O ξo´= 0, 815 V ½ O2 + 2 H+ + 2 eNADH je donor elektronů, O2 akceptor.
• Celková reakce: ½ O2 + NADH + H+ → H2O + NAD+ Δ ξo´= 0, 815 V – (-0, 315 V) = 1, 130 V !!!
60
Oxidace NADH ve vnitřní mitochondriální membráně •
Oxidace NADH poskytuje Δ Go´ = - 218 kJ.mol-1 volné energie.
•
K syntéze jednoho molu ATP z ADP a Pi je třeba 30, 5 kJ.mol-1.
•
Energetický rozdíl Δ Go´ = - 218 kJ.mol-1 nelze přímo převést na několik ATP.
•
Ve vnitřní mitochondriální membráně je soustava tří proteinových komplexů přes které putují elektrony z NADH ke kyslíku.
•
Celková volná energie je tak rozdělena na tři menší části z nichž každá se podílí na tvorbě ATP oxidativní fosforylací. Oxidace NADH poskytne přibližně 3 ATP.
•
Termodynamická efektivita za standardních biochemických podmínek je 42 %. (3 x 30,5 kJ.mol-1 x 100 / 218 kJ.mol-1).
61
Komplexy sekvence elektronového transportu •
Komplexy jsou řazeny podle vzrůstajícího redukčního potenciálu.
•
Komplex I: Katalyzuje oxidaci NADH koenzymem Q (CoQ). NADH + CoQ (oxidovaný) → NAD+ + CoQ (redukovaný) Δ ξo´= 0, 360 V; Δ Go´ = - 69, 5 kJ.mol-1
• Komplex III: Katalyzuje oxidaci CoQ (red.) cytochromem c. CoQ (redukovaný) + 2 cytochrom c (oxidovaný) → → CoQ (oxidovaný) + 2 cytochrom c (redukovaný) Δ ξo´= 0, 190 V; Δ Go´ = - 36, 7 kJ.mol-1 •
62
Komplex IV: Katalyzuje oxidaci redukovaného cytochromu c kyslíkem – terminálním akceptorem elektronů. 2 cytochrom c (red.) + ½ O2 → 2 cytochrom c (oxid.) + H2O Δ ξo´=0, 580 V; Δ Go´ = - 112 kJ.mol-1.
Komplex II. •
Komplex II: Katalyzuje oxidaci FADH2 koenzymem Q. FADH2 + CoQ (oxid.) → FAD + CoQ (red.) Δ ξo´= 0, 085 V; Δ Go´ = - 16, 4 kJ.mol-1
•
Redoxní reakce neposkytuje dostatečné množství energie pro tvorbu ATP. Funkcí je, pouze předávat elektrony z FADH2 do elektronového transportního řetězce.
• •
Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec: Rotenon – rostlinný toxin používaný indiány na Amazonce k lovu ryb, také insekticid) Amytal – barbiturát. Antimycin - antibiotikum. Proč lze inhibici rotenonem zrušit přídavkem sukcinátu??
• • •
63
Přehled elektronového transportu mitochondrie -0.4 NAD+ (-0.315 V)
NADH
2eKOMPLEX I Δξ°´= 0.360 V (ΔG = -69.5 kJ.mol-1)
-0.2
0
(+0.031 V) Sukcinát
2e-
Fumarát
Δξ°´(V)
+0.2
FADH2
ADP + Pi
Rotenon, amytal
ATP
CoQ (+0.045 V)
KOMPLEX II
KOMPLEX III Δξ°´= 0.190 V (ΔG = -36.7 kJ.mol-1)
ADP + Pi Antimycin A ATP
Cytochrom c (+0.235 V) +0.4
+0.6
KOMPLEX IV Δξ°´= 0.580 V (ΔG = -112 kJ.mol-1)
ADP + Pi CNATP
2e-
64
+0.8
2 H+ + 1/2 O2
H2O (+0.812 V)
Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec OCH3
CH3
H3CO H
O
H2C
O
H
O
O
Rotenon
O
CH2
O
O NH
-
C
Kyanid
O
CH3
H3C OH HN
65
N H
Amytal
O N
CH2 CH3
CH3
H
CH3
CH2
HN O
CH
CHO
Antimycin A
O
O
(CH2)5
O H3C
CH3 CH2
CH3
Mitochondriální elektronový transport
4H+
4H+
2H+
Mezimembránový prostor Vnitřní mitochondriální membrána
Cyt c1
FeS
CuA
FeS
FeS FMN
Cyt c
Q
Cyt a
Cyt bL
Cyt a3 - CuB
Cyt bH
Matrix
1/2 O2 + 2H+
NADH
H2O KOMPLEX I
66
KOMPLEX III
KOMPLEX IV
Komplex I – NADH – koenzym Q oxidoreduktasa • Komplex I je největší protein v mitochondriální membráně – 43 podjednotek o celkové hmotnosti 900 kd. • Komplex I obsahuje jednu molekulu FMN a 6 až 7 komplexů (klastrů) železo-síra. • Klastry jsou prostetickými skupinami proteinů železo-síra nebo jinak nehemové proteiny. • FMN je pevně vázaný na proteiny; zatímco CoQ je, díky svému hydrofobnímu isoprenoidnímu řetězci, volně pohyblivý v lipidové dvojvrstvě membrány. • U savců obsahuje řetězec 10 C5 isoprenoidních jednotek (Q10). U některých organismů je kratší – 6 nebo 8 jednotek.
67
Klastry železo-síra. Přechod elektronů mezi Fe2+ a Fe3+.
Cys Cys Cys
Cys
S2-
2-
S Fe
[2Fe-2S]
Cys Cys
Fe S2-
Fe
Fe S2-
68
Cys
S2-
Fe S2-
Fe
[4Fe-4S]
Cys
Oxidační stavy
2-
H2C
OPO 3
H3C
C
CH3
H3C
C
CH3
H3C
C
CH3
H H3C
O
CH2 N
N
O N
N
H3C
FMN a koenzymu Q (CoQ):
H
H3CO
CH3 CH3
H
H3CO
CH2 O
O
Flavinmnonukleotid (FMN) (oxidovaná nebo chinonová forma)
N
H3C
N H
N N
H
O
H3CO
CH3
H
H3CO
R OH
O
Koenzym QH nebo ubisemichinon (radikálová nebo semichinonová forma)
69
H
R
H
H3C
N
N
H3C
N H
H
O
H
H
n
H
FAMNH (radikálová nebo semichinonová forma)
H
CH2
Koenzym Q (CoQ) nebo ubichinon (oxidovaná nebo chinonová forma)
R
H3C
C
Isoprenoidní jednotky
H H
CH
OH
N
O
H3CO
CH3
H
H3CO
R
O
FMNH2 (redukovaná nebo hydrochinonová forma)
OH
Koenzym QH2 nebo ubichinol
(redukovaná nebo hydrochinonová forma)
Přenos elektronů a translokace protonů v komplexu I.
•
Tok elektronů z NADH na CoQ probíhá stupňovitě mezi redox centry.
•
NADH se účastní vždy jen dvouelektronové výměny. FMN a CoQ mohou přenášet jak dva, tak jeden elektron a proto tvoří elektronovou spojku mezi dvouelektronovým NADH a jednoelektronovými akceptory – cytochromy.
•
Při toku elektronů mezi redox centry komplexu I jsou transportovány čtyři protony z matrix do mezimembránového prostoru.
70
Komplex II (sukcinát-koenzym Q oxidoreduktasa) •
Komplex II obsahuje enzym citrátového cyklu sukcinátdehydrogenasu. Přenáší elektrony z FADH2 na CoQ.
•
Komlex II obsahuje sukcinátdehydrogenasu s kovalentně vázaným FAD, několik klastrů Fe-S a jeden cytochrom b560.
•
Komplexy I a II nejsou v sérii.
•
Komplex II přenáší elektrony z sukcinátu na CoQ.
•
CoQ je mobilní sběrač elektronů.
•
Cytochrom b560 slouží pravděpodobně k odstraňování kyslíkatých radikálů vznikajících vedlejšími reakcemi.
71
–
Cytochromy-hemové transportní proteiny. Během transportu elektronů alternují mezi Fe2+ a Fe3+. PROTEIN CH3 H2C HO
CH
CH2
CH
1
+
CH
S CH3
H3C
CH
Cys
CH3
S
N
CH
CH2
H3C
CH N
+
2+
N
+
5
N CH3
CH2
H3C
N Fe
7
CH N
+
2+
N 2+
Fe N
+
N
H3C
CH3
N
+
H3C
CH3
6
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
COO
-
Hem a
72
CH2
H
CH
4
N Fe
O
3
3
N
8
CH2
CH3
2
H3C
C
Cys
COO
-
COO
-
COO
-
Hem b (Fe-protoporfyrin IX)
COO
-
COO
Hem c
-
CH3
Hemové skupiny redukovaných Fe2+ cytochromů mají charakteristická absorpční spektra ve viditelné oblasti (Soretovy pásy). γ
ABSORBANCE
γ
β
Cytochrom a
439
Cytochrom b
429
532
563
Cytochrom c
415
521
550
Cytochrom c1
418
524
554
Cytochrom c
α β 300
73
400
α
500 Vlnová délka (nm)
600
600
Komplex III (Koenzym Q – cytochrom c oxidoreduktasa) •
Komplex III (také jako cytochrom bc1) redukovaného CoQ na cytochrom c.
•
Obsahuje: Dva cytochromy typu b, jeden c1 a jeden klastr [2Fe-2S], znám také jako Rieskeho centrum.
•
Transport elektronů a pumpování protonů probíhá tzv. Q cyklem.
•
CoQH2 podstupuje dva cykly reoxidace za tvorby stabilních meziproduktů – semichinonů CoQ.
•
Existují dvě nezávislá centra pro koenzym Q: Qo vážící CoQH2 a vážící semichinon CoQ..
74
transportue elektrony z
Qi
Reakce Q cyklu • První cyklus: CoQH2 + cytochrom c1 (Fe3+) → → CoQ. + cytochrom c1(Fe2+) + 2 H+ (mezimembránový prostor) • V druhém cyklu nejdříve další CoQH2 opakuje první cyklus. CoQH2 + CoQ. + cytochrom c1 (Fe3+) + 2 H+ (z matrix) → → CoQ + CoQH2 + cytochrom c1 (Fe2+) + 2 H+ (do mezimembrány) •
Z každých dvou CoQH2 vstupující do Q cyklu, je jeden regenerován.
• Celková reakce: CoQH2 + 2 cytochrom c1(Fe3+) + 2H+ (z matrix) → → CoQ + 2 cytochrom c1 (Fe2+) + 4 H+ (do mezimembránového prostoru). •
75
Elektrony jsou následně přenášeny na cytochrom c, který je transpotuje do komplexu IV.
První část Q cyklu.
M E Z I M E M B R Á N O V Ý
76
Z KOMPLEXU I
QH2
2H+
P R O S T O R
FeS-protein
QH2 Q e-
e-
bL
e-
bH
e-
c1
Q Q
o
PRVNÍ CYKLUS
e-
Q Q Q
i
M A T R I X
Druhá část Q cyklu
M E Z I M E M B R Á N O V Ý
77
Z KOMPLEXU I
QH2
2H+ FeS-protein P R O S T O R
QH2 Q e-
e-
QH2
bL
e-
bH
e-
c1
e-
Q Q
o
DRUHÝ CYKLUS
Q Q
i
Q
M A + 2H T R I X
Komplex IV (cytochrom c oxidasa) •
Komplex IV katalyzuje jednoelektronovou oxidaci čtyřech redukovaných cytochromů c a současnou čtyřelektronovou redukci jedné molekuly O2. 4 Cytochrom c (Fe2+) + 4 H+ + O2 → 4 cytochrom c (Fe3+) + 2 H2O
•
Komplex IV obsahuje čtyři redoxní centra: cytochrom a, cytochrom a3, atom mědi značený jako CuB a dvojici atomů mědi označovaných jako CuA centrum. Redukce O2 cytochrom c oxidasou je postupný složitý proces. Cytochrom c oxidasa má dva kanály translokace protonů. Čtyři tzv. chemické nebo skalární protony jsou odňaty z matrix během redukce kyslíku za tvorby dvou molekul vody. Proces je spojen s translokací čtyř tzv. pumpovaných nebo vektorových protonů z matrix do mezimembránového prostoru.
• •
•
Při reakci komplexu IV je celkově transportováno přes vnitřní mitochondriální membránu celkem osm protonů. 8 H+(matrix) + O2 + 4 cytochrom c (Fe2+) → → 4 cytochrom c (Fe3+) + 2 H2O + 4 H+ (do mezimembránového prostoru)
78
Oxidativní fosforylace-ATPsynthasa (Komplex V).
Energetické spojení. Volná energie transportu protonů se uplatní při tvorbě ATP.
Vnější mitochondriální membrána Mezimembránový prostor Vnitřní mitochondriální membrána
79
H+
+ + ++
H+
H+
Vysoká [H+]
H+
++
++
+ + +++
+++ +
--
--
- - ---
--- -
e-
- - --
Nízká [H+] 1/2 O2
H2O
ADP + Pi
ATP
Chemiosmotická hypotéza oxidativní fosforylace – Peter Mitchell (1920-1992), Nobelova cena za Fyziologii a medicínu 1978. Mitchell, P., Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature 191, 144-148 (1961). Volná energie elektronového transportu je realizována pumpováním H+ z mitochondriální matrix do mezimembránového prostoru za tvorby elektrochemického H+ gradientu přes membránu. Elektrochemický gradient je posléze uplatněn při syntéze ATP. Tato volná energie se nazývá protonmotivní síla. Naměřený membránový potenciál přes membránu jaterní mitochondrie je 0, 168 V (v matrix negativní). Naměřené pH v matrix je o 0, 75 jednotky vyšší než v mezimembránovém prostoru. ΔG pro transport protonů z matrix je 21, 5 kJ.mol-1 – endergonní proces. Rušení gradientu, syntéza ATP, je proces exergonní!!
80
ATP synthasa – protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa. • • • • • • • •
81
ATP synthasa je multipodjednotkový transmembránový protein o celkové molekulové hmotnosti 450 kd. ATP synthasa je složena ze dvou funkčních jednotek (komponent), Fo a F1. (Fo vyslovuj ef nula - o znamená na oligomycin citlivá komponenta). Fo je ve vodě nerozpustný transmembránový protein obsahující více jak osm různých typů podjednotek. F1 je vodě rozpustný periferní membránový protein složený z pěti typů podjednotek, které lze jednoduše oddělit od Fo působením močoviny. F1 komponenta ATPsynthasy má podjednotkové složení α3β3γδε. Rozpuštěná F1 komponenta (oddělená od Fo) hydrolyzuje, ale nesyntetizuje ATP. Fo komponenta je složena z vícečetných podjednotek. V E.coli např. existují tři transmembránové komponenty: a, b, a c - ve formě a1b2c9-12 komplexu.
Schematický nákres komponentového složení F1Fo-ATPasy z
E. coli
δ α3β 3 γ b
ε c
82
ab2
Rentgenostrukturní snímek kvasničného F1-c10 komplexu.
83
Model F1Fo-ATPasy z E. coli. Komplex γε-c12 je rotor a část αβ2−α3β3δ komplex je stator.
84
Mechanismus rotace F1Fo-ATPasy. •
Protony z mezimembránového prostoru vstupují do podjednotky c, kde reagují s podjednotkou a a vystupují ven až se c kruh otočí o jednu otočku (černá šipka), kdy se podjednotka c znovu setká s podjednotkou a. H+
HH HH
85
Pohyb protonů přes membránu pohání rotaci c kruhu. H+
H+ H
H
+
+
H+
H+ H
H+ Mezimembránový prostor
+
H
+
H
H
+
H+
H+
+
H
H+
H+ H H
+
H+
+
HH HH
Matrix
Nemůže rotovat oběma směry
H+
H+ H H
+
H
H+
+
+
H+
H+ H
+
H
+
H+
H
+
H
+
+
H
H+
H+
H
H
H+
H+ H H
+
+
H
+
H
H+
+
H+
H
+
H+
H+
H+
+
H
H H
H
H+
+
+
H
+
H
+
H
+
H
H+
+
H+
H
+
H+
H+
H H
H
H+
+
+
H+
H+ H
+
H
+
HH HH
H
H
H+ H+
H+
H+ H+
Rotace ve směru H+ hodinových ručiček
H+ +
HH HH
H+
H+
H
H+
H+
H
+
H+
H+
H+ +
+
HH HH
H+
H+
H+
H+
H+
HH HH
86
H
H
+
+
+
HH HH
H+
H+
H
+
H+
H+
+
H+ H+
H
+
H+
H+
H+
H+ H+
Mechanismus vazebné změny – tvorba ATP z ADP a Pi •
F1 komponenta má tři reaktivní katalytické protomery (αβ jednotky), každý ve jiném konformačním stavu.
• • • •
L - váže substrát a produkt slabě (L = loosely) T - váže pevně (T = tightly) O - neváže vůbec, je otevřený (O = open) Uvolněná energie translokací protonů se realizuje přechodem mezi těmito stavy. Fosfoanhydridová vazba ATP je syntetizována jen ve stavu T a ATP se uvolňuje ve stavu O.
•
• • • •
87
Tři stupně: ADP a Pi se váží do stavu L. Průchod protonů mění konformaci L na T. ATP je syntetizované ve stavu T, druhé ATP se dostává pohybem rotoru do stavu O a oddisociuje.
Mechanismus vazebné změny tvorby ATP.
O
88
T
AT P
L
1
L O
T
AT P
ADP + Pi
ADP Pi
Mechanismus vazebné změny tvorby ATP.
ADP Pi
ENERGIE
ADP Pi
L
89
2
L
O
AT P
T
AT P
O
T
Mechanismus vazebné změny tvorby ATP.
ADP Pi
H 2O
ATP
ATP
T
90
O
AT P
L
T
3
L
O
F1Fo-ATPasa je točivý stroj. •
•
•
• • 91•
Model Masamitsu Futai. Sferoid α3β3 z E. coli F1Fo-ATPasy byl upoután hlavou dolů na skleněnou desku. Šest postupných His zbytků (zvané Histag) bylo mutagenezí navázáno na N-konec α podjednotky, která je lokalizována na vrcholu α3β3. His-tag komplet byl uchycen na povrch skleněné desky potažené křenovou peroxidasou (přilnavá ke sklu) konjugované s Ni2+-nitriloctovou kyselinou [ Ni2+- N(CH2COOH)3], která váže pevně His-tagy. Část Fosměřuje nad povrch. Glu jedné z podjednotek c byl mutagenezí zaměněn za Cys a ten kovalentně spojen s avidinem. Fluorescenčně značený a biotynylovaný (na jednom konci) filament svalového proteinu aktinu byl navázán na c podjednotku přes můstek tvořený straptavidinem (bakteriální protein, který silně váže biotin ke všem čtyřem vazebným místům). Takto sestaven se otáčí rotor opačným směrem, pumpuje protony zevnitř ven na úkor hydrolýzy ATP. Pozorováno fluorescenčním mikroskopem v roztoku 5 mM MgATP. Takto bylo prokázáno, že γ podjednotka rotuje po 120o.
F1Fo-ATPasa je točivý stroj. Model Masamitsu Futai
Aktinové filamentum
ATP + H2O
α
92
β
ADP + Pi
Poměr P / O • Poměr P / O reprezentuje relaci mezi množstvím syntetizovaného ATP (P) a množství redukovaného kyslíku (O). • Tok dvou elektronů přes komplexy I, III a IV vede ke translokaci 10 protonů. Zpětný tok těchto protonů pře ATPasu poskytuje 3 ATP. • Elektrony z FADH2, vynechávají komplex I, vedou ke translokaci 6 protonů, což poskytuje jen 2 ATP. • U aktivně respirujících mitochondrií nebývá poměr P / O celé číslo. • Peter Hikle prověřoval P / O poměry a prokázal, že aktuální hodnoty jsou blíže číslů 2, 5 a 1, 5 a 1.
93
Rozpojovače oxidativní fosforylace. Probíhá respirace – netvoří se ATP.
MATRIX
CYTOSOL
+
Nízká [H+]
Vysoká [H ]
-
OH
O
NO2
NO2 +
H
OH
+ NO2
NO2
2,4-Dinitrofenol (DNP)
94
-
O NO2
Difuze
NO2
+
NO2
2,4-Dinitrofenol (DNP)
NO2
+
H
Kontrolní mechanismy oxidativní fosforylace • • • • • • • •
95
Dospělá žena spotřebuje denně 6 300-7 500 kJ metabolické energie. To odpovídá volné energii hydrolýzy 200 molů ATP na ADP a Pi. Celkové množství v těle přítomného ATP je méně než 0, 1 molu !!! ATP musí být nutně recyklován a jeho produkce regulována, protože se neprodukuje nikdy více ATP než je potřeba. Oxidativní fosforylace (od NADH k cytochromu c) je v rovnováze: ½ NADH + cytochrom c (Fe3+) + ADP + Pi → ½ NAD + cytochrom c (Fe2+) + ATP Δ G´ ≅ 0 Keq = ([NAD+] / [NADH])½.[c2+] / [c3+]. [ATP] /[ADP].[Pi] Reakci nelze ovlivnit přídavkem ATP, protože cytochrom c oxidasová reakce je ireversibilní !! Reakce se ovlivní dostupností cytochromu c (c2+) a tedy poměry [NADH] / [NAD+] a [ATP] / [ADP] .[Pi]. Čím vyšší je poměr [NADH] / [NAD+] a nižší [ATP] / [ADP] .[Pi], tím vyšší je koncentrace cytochromu c a vyšší cytochrom c oxidasová aktivita.
Reaktivní kyslíkaté radikály (ROS) • • • • • •
•
96
Čtyřelektronová redukce kyslíku cytochrom c oxidasou je rychlá a precizní. Přesto vznikají kyslíkaté radikály, které reagují s různými buněčnými součástmi. Nejznámější je superoxidový radikál: O2 + e- → O2- . Superoxidový radikál je prekurzorem silnějších oxidačních radikálů jako jsou protonovaný O2- . → HO2. a hydroxylový radikál . OH Antioxidační mechanismus: superoxiddismutasa (SOD) přítomná téměř ve všech buňkách. Katalyzuje přechod O2- . na peroxid vodíku. Vytvořený peroxid vodíku je degradován katalasou na vodu a kyslík: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 nebo glutathionperoxidasou: 2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O Dalšími potenciálními antioxidanty jsou rostlinné sloučeniny jako askorbát (vitamin C) a α-tokoferol (vitamin E). Pravděpodobně chrání rostliny před oxidačním stresem během fotosyntézy, kdy je H2O oxidována na O2.
