Célzott daganat-terápiás kezelésben alkalmazható új célgének vizsgálata tumor sejtkultúrákon

Homonnay Csilla

Célzott daganat-terápiás kezelésben alkalmazható új célgének vizsgálata tumor sejtkultúrákon Molekuláris bionikus mérnöki BSc

Témavezető: Dr. Győrffy Balázs 2015

Alulírott Homonnay Csilla, a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai és Bionikai Karának hallgatója kijelentem, hogy ezt a szakdolgozatot meg nem engedett segítség nélkül, saját magam készítettem, és a szakdolgozatban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen a forrás megadásával megjelöltem. Ezt a Szakdolgozatot más szakon még nem nyújtottam be.

..........................................................

Tartalomjegyzék 1.

Tartalmi összefoglaló .................................................................................................. 4

2.

Summary ..................................................................................................................... 6

3.

Bevezetés .................................................................................................................... 8

4.

Feladatkiírás................................................................................................................ 9

5.

Előzmények ............................................................................................................... 11 5.1.

Az emlőrák ........................................................................................................ 11

5.1.1. 6.

Kezelési módszerek................................................................................... 12

A tervezés leírása ...................................................................................................... 16 6.1.

A gyógyszerek kiválasztása ............................................................................... 16

6.1.1 Doxorubicin-rezisztenciához kapcsolódó gének .............................................. 16 6.2

Célgének kiválasztása ....................................................................................... 20

6.3 Használt sejtvonalak, fenntartásuk ......................................................................... 21 6.3.1 MCF-7 sejtvonal ............................................................................................... 21 6.3.2 MDA-MB-231 ................................................................................................... 21 6.3.3 Módszerek ....................................................................................................... 22 6.4 Kísérletek menete ................................................................................................... 23 6.4.1 qPCR reakció .................................................................................................... 23 6.4.2 TP53 mutáció ellenőrzése a sejtvonalakon...................................................... 27 7.

Értékelés ................................................................................................................... 28

8.

Összefoglalás ............................................................................................................ 30

9.

Köszönetnyilvánítás .................................................................................................. 32

10.

Irodalomjegyzék ................................................................................................... 33

11.Mellékletek .................................................................................................................. 35 11.1 Doxorubicin-rezisztenciához kapcsolódó gének ................................................... 35 11.2 qPCR reakcióhoz tervezett primerek .................................................................... 35 11.3 qPCR mérések eredménye .................................................................................... 36 MCF-7: ....................................................................................................................... 36 MDA-MB-231: ........................................................................................................... 36

1. Tartalmi összefoglaló A

szakdolgozatom

elkészítése

során

célunk

emlődaganatra

alkalmazható

új

gyógyszerkombinációk hatásának vizsgálata. A kombináció egyik összetevőjének egy antraciklin típusú gyógyszert, a doxorubicin kemoterápiás szert választottuk melyet több mint ötven éve használnak többféle daganat kezelésére. Azonban gyakran a doxorubicin alapú kezelés hatástalan, a daganatsejtek rezisztenciát alakítanak ki vele szemben. A gyógyszerkombináció másik összetevőjének olyan gyógyszert választottunk, amely a doxorubicin-rezisztencia kialakulásában szerepet játszó folyamatokra befolyással bírhat. Első lépésben irodalmi áttekintést végeztem a doxorubicin hatásmechanizmusáról, illetve a vele szembeni rezisztencia kialakulásáról. Az irodalomkutatás során kigyűjtöttem azokat a géneket, amelyek részt vesznek ezekben a folyamatokban, majd megállapítottam, hogy a rezisztencia kialakulása során a kifejeződésük nő, vagy csökken. Erre azért volt szükség, hogy olyan doxorubicin tartalmú gyógyszer-kombináció alkalmazására tehessek javaslatot, amely ellenkező hatással bír ezekre a génekre. Ehhez a MTA TTK Lendület Tumor Biomarker Kutatócsoport által kidolgozott off-target adatbázist használtam, amelyből kigyűjthető azon gyógyszerek listája, melyek befolyással vannak a kiválasztott gének expressziójára. Az összes kezelésre lefuttattam a keresést és a kapott gyógyszereket sorrendbe állítottam a génexpresszió megváltoztatása szerint. Ennek a műveletnek a során lettem figyelmes az anasztrozol gyógyszerre, mely egy aromatáz-inhibitor hormonterápiás szer emlőrák kezelésére. Egyes gének estében az anasztrozol kezelés ugyanabba az irányba tolta el a gén expressziót, mint a doxorubicin-rezisztens sejtekben az irodalmi adatok alapján jellemző, ugyankor bizonyos gének esetében gén expressziójuk ellentétesen változott, mint a doxorubicin-rezisztens sejtekben. Ez alapján nem egyértelmű, hogy az anasztrozol alkalmazása segíti a rezisztencia kialakulását vagy gátolja. Ennek eldöntésére tettünk kísérletet ennek a dolgozatnak keretein belül in vitro sejtvonalakon végzett kísérletekkel. Kísérletes munka során két emlő karcinóma sejtvonalat alkalmaztunk: MCF-7 és MDA-MB231. Az MCF-7 sejtvonal ösztrogén receptor pozitív (ER+), és vad típusú TP53 gént hordoz, míg az MDA-MB-231 sejtvonal ösztrogén receptor negatív (ER-) és mutáns TP53 génnel rendelkezik. A két sejtvonal közötti TP53 mutációs státusz ellenőrzését genomi PCR-t követő szekvenálással végeztük el. A szekvenálást követően az anasztrozol hatását vizsgáltuk olyan génekre, amelyek részt vesznek a doxorubicin-rezisztenciában. Mivel számos olyan génről tudunk, melyeknek szerepe 4

lehet a doxorubicin-rezisztencia kialakításában, kiválasztottunk három gént, a TOP2A-t, a BRCA1-et és a BRCA2-t. A két sejtvonal sejtjeit három napig kezeltem anasztrozollal, öt különféle koncentrációban. A három nap letelte után mindegyik csoportból kivontam a bennük található RNS-t. A kiválasztott gének expresszióját egy anasztrazollal nem kezelt kontroll csoporthoz hasonlítva az mRNS mennyisége alapján kívántuk meghatározni kvantitatív PCR (qPCR) segítségével. Ehhez első lépésként a kivont RNS-t reverz transzkripciós PCR segítségével cDNSé alakítottuk. Ezután lefuttattuk a qPCR reakciót a három kiválasztott génnel illetve egy negyedik, háztartási génnel (RPLP0) mind az öt gyógyszer koncentrációra, illetve egy kezeletlen kontroll-csoportra mindkét sejtvonalra. Az PRLP0-ra azért volt szükség, mert nem biztos, hogy a reakció során minden mintában ugyanannyi kezdeti RNS volt megtalálható, de az RPLP0 háztartási gén lévén minden sejtben (és sejtvonalban) hasonlóan fejeződik ki, így a segítségével normalizálni lehet a kapott adatokat, és az eltérő kezdeti mennyiségből fakadó pontatlanságot megszüntethetjük. A mérési eredmények feldolgozása után azt kaptuk, hogy a BRCA1 és BRCA2 gének expressziója nem mutatott összefüggést a gyógyszer koncentrációval egyik sejtvonalon sem. A TOP2A expressziója az MCF-7 sejtvonalon nem mutatott összefüggést a kezeléssel, ugyanakkor az MDA-MB-231 sejtvonalon a kapott gyógyszer koncentrációjának növekedésével megnőtt a TOP2A gén expressziója. Ezen eredményeink alapján nem vonható le egyértelmű következtetés az anasztrozol kezelés hatásáról a doxorubicin-rezisztenciában szerepet játszó gének expressziójára. Mivel a vizsgált gének nem mutattak egyértelmű összefüggést az anasztrozol kezelés hatására, további terveink közt szerepel további gének bevonása a kezelés hatásának vizsgálatába, valamint sejt gyógyszer-érzékenység vizsgálat (MTT teszt) segítségével meghatározni ugyanezen sejtvonalak érzékenységét doxorubicinnal szemben, illetve doxorubicin és anasztrozol kombinációs kezeléssel szemben is. A szakdolgozat során megismerkedtem a két gyógyszer hatásmechanizmusával, doxorubicin-rezisztenciával, és elkezdtem egy olyan kísérletsorozatot, ami több idő elteltével eredményre vezethet.

5

2. Summary The goal of my thesis was to find a new combination of drugs to cure breast cancer. One component of this combination was chosen to be doxorubicin, which is an anthracycline type chemotherapy drug, used for over 50 years in treating various types of cancer. One of the biggest problems with it is that the tumor cells are able to develop resistance to doxorubicin and in this case the therapy is not successful. This is why I wanted to find another drug that could impact the processes involved in doxorubicin-resistance. To accomplish this, I had to understand the mechanisms of action of doxorubicin and the features of the resistance to it. While doing this, I collected the genes that partake in these processes and determined if the expression of these genes is up- or downregulated. I wanted to find a drug to go with doxorubicin that has an adverse effect to these genes. To do this, I used the off-target database which, in contrary to other databases doesn’t search in drugtargeted gene, but in targeted genedrug direction. I ran all genes through this database and sorted the resulted drugs by the affection of gene-expression. I found the drug called anastrozole at a lot of genes. Anastrozole is an aromatase-inhibitor hormone therapy drug that is used to treat breast-cancer. This drug affected some of the genes in the same direction as doxorubicinresistance in cells, and some in the other. Based on this, it is not clear if using anastrozol as treatment helps or inhibits the cells from developing doxorubicin resistance. We tried to specify this within the framework of this thesis by conducting experiments on in vitro cell lines. I conducted experiments on two cell lines, MCF-7 and MDA-MB-231. MCF-7 is estrogenreceptor positive (ER+) and carries wild type TP53 gene, while MDA-MB-231 is estrogenreceptor negative (ER-) and carries mutant TP53 gene. Determining the status of difference between the TP53 mutation was carried out by genomic PCR followed by sequencing. I examined the effect of anastrozole on genes that partake in doxorubicin-resistance. Since there are a lot of these, we chose three to examine, TOP2A, BRCA1 and BRCA2. I treated cells from both cell lines for three days with anastrozole in five varying concentration. Then I extracted the RNA from all cell-groups. I wanted to determine the difference in the geneexpressions from the change of quantity of the RNA found in the cells. This can be done with qPCR reaction, but that requires DNA instead of RNA. The first step was to convert the RNA into cDNA with the help of reverse PCR. After this, we ran the qPCR reaction on both cell lines for all 5 drug-concentration plus a control group that didn’t get any drug, for 4 genes, the first 3 being our genes of interest and the fourth RPLP0, which is a housekeeping gene. We need this, 6

because when assembling the reaction, we can’t be sure that there is the same amount of initial RNA in all samples, but RPLP0 being a housekeeping gene has the same level of expression in all cells (and cell lines), making it possible to normalize the output data and eliminate the inaccuracies originating from the different initial RNA-amount. After analyzing the output data, the outcome is that BRCA1 and BRCA2 genes don’t respond to anastrozole on neither cell line. TOP2A expression is the same on MCF-7, sometimes a little over-sometimes a little underregulated, uncorrelated to the amount of drug it has been treated with. On the other hand, it shows a nice correlation with the drug-concentration on the MDA-MB-231 cell line, expressing more and more protein getting more drug. Unfortunately in the case of doxorubicin-resistance the expression levels of TOP2A is reduced 200-fold. This would mean that anastrozole helps the cell to evade developing doxorubicin-resistance, which is the contrary of our theory. This is only 3 genes though, chosen from a lot, so it doesn’t prove anything. Plans for the future include observing expression-changes of more genes, and assembling MTT-assay for doxorubicin and doxorubicin-anastrozole combination to see if it helps the cells to stay alive. While preparing my thesis but I have become acquainted with the actions of mechanism of the two drug and the resistance of doxorubicin. I started a series of experiments that, in time, could lead to important results.

7

3. Bevezetés A világon a vezető halálozási okok közé tartoznak a daganatos megbetegedések. A nők körében magasan a leggyakoribb halálozási ok az emlőrák, ezért fontos, hogy minél hatásosabb kezeléseket dolgozzunk ki a betegség legyőzésére. azonban nagyon gyakori jelenség, hogy tumoros sejtekben, hogy a sikeres kezelést megakadályozó tényező; a kapott gyógyszerrel szembeni rezisztencia alakul ki. Szakdolgozatomban a doxorubicinnel kezelt emlőrákos sejtekben, a doxorubicin rezisztencia kialakulásának megakadályozásával foglalkozom. Olyan gyógyszerek alkamazására van szükség, amit a doxorubicinnel kombinált kezelésként alkalmazva a doxorubicinnel szembeni rezisztencia kialakulásának kisebb a valószínűsége. Ehhez elengedhetetlen a doxorubicin rezisztenciamechanizmusának alapos ismerete, ennek birtokában olyan gyógyszert szeretnénk találni, ami a rezisztenciamechanizmusok működését gátolja. Habár a legtöbb gyógyszernek ismert a célgénje, nincs tudomásunk a gyógyszer összes hatásáról. Azokat a hatásokat, amik nem a cél-gént érik, off-target hatásnak nevezzük. Ha létezik gyógyszer, ami a doxorubicin-rezisztencia ellen hatékony, nem biztos, hogy a megadott, célzott hatása váltja ki a rezisztencia-ellenes befolyást. Az MTA TTK Lendület Tumor Biomarker Kutatócsoportnak célja volt, dr. Győrffy Balázs vezetésével egy olyan adatbázis összeállítása, amely gyógyszer kezelések génexpresszióra gyakorolt hatását tartalmazza (az adatbázis publikusan nem elérhető). Az off-target adatbázis összeállításában nem vettem részt. Az offtarget adatbázisból bizonyos génre rákeresve megkapható azoknak a gyógyszereknek a listája, amelyek hatással voltak a gén expressziójára. Az adatbázisban így megkereshető, hogy van-e olyan gyógyszer, ami esetleg a doxorubicin elleni rezisztenciamechanizmusban résztvevő több génre is ellenkező irányú hatást fejt ki. Ha megtaláltam a számomra megfelelő gyógyszert, sejtvonalas kísérletek során megpróbálom igazolni, hogy valóban a megfelelő gyógyszert találtam-e meg.

8

4. Feladatkiírás 1. Tanulmányozza az emlő daganatos megbetegedéseket, és kezelésükben alkalmazott terápiákat szakmai cikkek feldolgozásával. Mivel a szakdolgozat elkészítése során végzett munkámban emlőtumoros sejtvonalakon fogom a doxorubicin-rezisztencia körülményeit vizsgálni, fontos hogy tisztában legyek az ezzel kapcsolatos szakirodalomban fellelhető cikkekkel. Ezért az első feladat; a munka megalapozása, hogy az emlőtumoros megbetegedéssel kapcsolatban elmélyítsem az ismereteimet. A doxorubicin hatásmechanizmusának beható ismerete és a vele szemben kialakuló rezisztencia működésének megismerése elengedhetetlen ahhoz, hogy olyan gyógyszert találhassunk, ami befolyással van erre a folyamatra. 2. Tekintse át vizsgálatok során alkalmazott emlő tumoros sejtvonalak irodalmi hátterét, és sejtkultúrás fenntartásának körülményeit. A vizsgálatok során az MCF-7 illetve az MDAMB-231 sejtvonalakat használom, mindkettővel párhuzamosan végzem a vizsgálatokat. Ezért fontos, hogy tudjam, mik a jellemzőik és milyen körülmények szükségesek a fenntartásukhoz, hogy a velük való munka során mindent az előírásoknak megfelelően végezzek el. 3. Vegyen részt a sejtvonalak TP53 mutációjának meghatározásában PCR segítségével. A tp53 gén nagyon fontos szerepet játszik a legtöbb daganat kialakulásában. Tudjuk, hogy az MDA-MB-231 sejtvonal TP53-mutáns, míg az MCF-7-ben vad típusú TP53 gén található. Azonban hogy biztosak lehessünk abban, hogy ez valóban így van szükséges a TP53 gén felerősítése PCR segítségével, majd az ezt követő szekvenálása mindkét sejtvonal esetében. 4. Határozza meg a sejtvonalak érzékenységét célzott terápiás szerek és ismert kemoterápiás szerekkel szemben. Kemoterápiás gyógyszerként a doxorubicint választottuk, azonban mivel igen gyakori a doxorubicinra kialakuló rezisztencia, olyan másik gyógyszert kívántunk találni, ami segíthet a rezisztencia-kialakulás esélyének csökkentésében. Ehhez irodalomkutatás segítségével olyan géneket kellett keresnem, amelyek kapcsolódnak a doxorubicin-rezisztenciához. Az így kapott génekhez az off-target adatbázis segítségével kerestem ki, mely gyógyszerek befolyásolják gén expressziójukat. Ha a rezisztencia során megnő a gén kifejeződése, azokat a gyógyszereket fogom megfontolásra venni, amelyek csökkentik a génexpressziót és fordítva: a rezisztencia során csökkent kifejeződésű géneknél azokat a gyógyszereket választom ki, melyek növelik a 9

génexpressziót. Ezek után olyan gyógyszert célszerű választani, amelyik lehetőleg több gén esetében is kedvező irányba viszi az génkifejeződést. Ehhez a két sejtvonalon qPCR reakció segítségével megmérem azoknak a géneknek a kifejeződését, amiket az adatbázis alapján a választott gyógyszer befolyásol. Ezt követően a két sejtvonalat a kiválaszotott gyógyszerrel kezelem, majd ugyanezen gének expresszióját a kezeletlen sejtvonalakon mért expressziós értékekhez hasonlítom. Ha az expresszió mértéke megváltozott, helyesek voltak az adatbázisból gyűjtött adatok és jó gyógyszert választottunk. Ezután megvizsgálom, hogy doxorubicinnel kombinálva a választott gyógyszer hogyan hat a sejtekre. Ezt sejt viabilitás vizsgálat (MTT vizsgálat) elvégzésével lehet megtenni. Ez a módszer annak megállapítására alkalmas, hogy mely gyógyszer koncentráció esetén marad életben a sejtek 50%-a (IC50 érték). Először kizárólag doxorubicinnel kezeljük a sejteket, majd elvégezzük a kísérletet doxorubicin és választott gyógyszer kombinációval.

10

5. Előzmények 5.1. Az emlőrák A tumor korlátlanul osztódó sejtek összessége. A tumort jóindulatúnak nevezik, amíg az osztódó sejtek együtt maradnak. A tumor rosszindulatúvá válik, ha a zabolátlanul osztódó sejtek szétszóródnak a szervezetben és áttéteket képeznek. A rosszindulatú tumorokat nevezik rákos daganatnak. Rákos sejt úgy tud kialakulni, hogy egy sejt több, egymástól független mutációt halmoz fel a genomjában, melyekkel új funkciókat nyer, és ezekkel gyakran gyorsabban tud osztódni, növekedni, illetve tovább él, mint az egészséges szöveti sejtek. Jelenlegi álláspont szerint ezek a különleges funkciók a következők: apoptózis (programozott sejthalál) elkerülése, növekedési szignálokkal való önellátás, növekedés-gátlással szembeni ellenállás, érképző képesség, korlátlan osztódási képesség, áttétképzés [1]. Ezekkel a tulajdonságokkal a legtöbb tumorsejt rendelkezik. Példának szeretném kiemelni az ’apoptózis elkerülése’ képességet. Ezt a legtöbb daganatsejt a TP53 gén funkcióvesztéses mutációjával éri el. Ez a gén a p53 fehérjét kódolja, ami képes érzékelni a DNS-ben fellelhető hibákat (pl. száltörés) és ilyen esetben javító mechanizmusokat indít. Ha javíthatatlan hiba lép fel, akkor apoptózist indít. Így biztosítja, hogy a károsodott DNS-ű sejtek ne szaporodhassanak tovább, ne kerülhessenek rossz mutációk a genomba. Épp ezért a TP53 gént a „genom őrzője” névvel szokták illetni. Ha azonban mutáció következik be benne és funkcióját elveszti, a sejt mutációs rátája megnő.

Épp ezért a

tumorsejtekben az egyik leggyakoribb mutáció a TP53 [2]. A dolgozat szempontjából azért fontos a TP53 gén mutációja, mert az élősejtes kísérletetek folyamán a gyógyszeres kezelést két sejtvonalon fogom alkalmazni, melyek közül az egyik TP53 mutációval rendelkezik, míg a másikban vad típusú, egészséges TP53 gén található.

Egyes rákos daganatok felemésztik a szervezet erőforrásait, mások elfedik a légzőhámot, ismét mások véredényeket zárnak el és így okozzák a tumoros élőlény pusztulását. A világon évente több mint 10 millió új rákos beteget jegyeznek, melyből 8 millió beteg a betegség következtében életét veszti [3]. A nőknél a leggyakoribb rákos megbetegedés ez emlőrák, az összes nőknél jelentkező rosszindulatú tumor 25,2 %-a [4]. Az emlőrák olyan daganat, amely az emlő szövetéből alakul ki. Kialakulásának valószínűsége a menopauzán átesett nőknél a legnagyobb, míg férfiaknál sokkal ritkább betegség [5]. Sajnos a kezelés sem garantálja a daganat remisszióját, feladatunk, hogy minél hatékonyabb terápiákat dolgozzunk ki. 11

5.1.1. Kezelési módszerek A rákos daganatok kezelésére sokféle módszert alkalmaznak. Kiválasztásuk a betegség típusától, előrehaladottságától, illetve a beteg életkorától és állapotától is függ [6]. Mindegyik kezelési mód célja a rákos sejtek eltávolítása a szervezetből. Amennyiben a rákos sejtek még nem képeztek áttétet, műtéti úton eltávolíthatóak. Ez emlődaganat esetében jelentheti a rákos sejtek és közvetlen környezetük eltávolítását, amit lumpektómiának nevezünk. Ha azonban a rákos sejtek nem különülnek egyértelműen el az egészséges sejtektől, a daganat nagyobb, mint 4 cm vagy több tumor is található a mellben, teljes mell-eltávolító műtétet is szoktak végezni, melynek masztektómia a neve. A műtét mellett kiegészítő kezelésként sugárkezelést szoktak alkalmazni, általában a műtét után. Célja a daganat kiújulásának megelőzése. A sugárkezelés során nem csak a rákos, hanem az egészséges sejtek is sérülnek, de az egészséges szövet képes a gyógyulásra. A műtéti utón való eltávolítás és a sugárterápia a test azon pontjára fókuszál, ahol a daganat van. Azonban ha a rákos sejtek elkezdtek áttétet képezni, szisztémás kezelésre van szükség, ami a test egész területén hat. Ennek egyik módja a kemoterápia, ami a rákos sejtek gyógyszeres kezeléssel való elpusztítását jelenti. Ezeket a gyógyszereket citosztatikumnak, azaz sejtosztódás-gátlónak is nevezzük. A citosztatikumok kifejezetten a gyorsan osztódó sejtekre hatnak. Gyakran olyan két gyógyszer kombinációját kapják a betegek, melyek erősítik egymás hatását. Kemoterápiát alkalmazhatnak műtét előtt, műtét után, vagy ha a betegen valamilyen oknál fogva nem végezhető műtét, helyette is. Szisztémás kezelés a kemoterápia mellet az immunterápia. Ennek célja az, hogy a beteg immunrendszerét elősegítsék a rákos sejtek elpusztításában. Az immunterápia azt használja ki, hogy a rákos sejtek felszínén eltérő számú vagy eltérő molekulák találhatóak, mint az egészséges sejtekén, és az immunrendszert ezek ellen a receptorok ellen irányítja. Ezek mellett lehetőség van hormonterápiára, ami azon a tényen alapul, hogy a daganat ösztrogén jelenlétében gyorsabban nő, a terápia ezért a szervezetben található ösztrogénmennyiséget csökkenti. A hormonterápia csak azokban a mellrákos betegekben alkalmazható, akiknek ösztrogén-receptor pozitív daganatuk van.

5.1.1.1. Doxorubicin A doxorubicin egy antraciklin típusú kemoterápiás gyógyszer, többféle daganattípus kezelése lehetséges vele , köztük az emlőráké. Az antraciklinek csoportjába a Streptomyces baktériumból kivont gyógyszerek tartoznak, jelenleg ezek az egyikei leghatékonyabb daganat elleni gyógyszereknek [7]. Az 1950-es években Olaszországban izolálta egy kutatócsoport 12

először a daunorubicint, majd a doxorubicint [8], amit akkor adriamycinnek neveztek el az adriai tenger után. A doxorubicin hatékonyabbnak bizonyult a daunorubicinnál, és azóta is aktívan használják a daganatterápiákban. A doxorubicin egy nem sejtciklus specifikus gyógyszer, vagyis a sejtek működését legnagyobb hatásfokkal a G0 fázisban, de a többi fázisban is gátolja. A gyógyszer nem ismeri fel a daganatsejteket, minden az átlagosnál gyorsabban osztódó sejtre ugyanazt a hatást fejti ki. Az egészséges sejtek idővel regenerálódnak, de a kezelés során mellékhatások lépnek fel a pusztulásuk miatt. Gyorsan osztódó sejtek találhatóak a vérben, szájban, hasban és bélben, illetve a szőrtüszőkben, ezért a betegek a kemoterápia során hajhullást, szájszárazságot, hányingert és alacsony vörösvértestszámot a tapasztalhatnak. A doxorubicint intravénásan kapják a betegek, a sejtekbe a sejtmembránon át történő diffúzióval jut be. A doxorubicin egyszerre többféleképpen akadályozhatja a sejt normális működését [9]. Egyik fontos hatásmechanizmusa a DNS-be való beépülés, amellyel száltörést okoz, illetve gátolja a DNS kettőződést és ezzel a sejtosztódást. Ezzel egy időben gátolja a topoizomeráz II enzimet [10], amivel stabilizálja a DNS-enzim komplexet a másolódás során, ami kettős száltörést okoz. A károsodott, kijavíthatatlan DNS hiba a tp53 jelátviteli útvonal közvetítésével apoptózist indukál. Másrészt a doxorubicint több oxidoreduktáz is tudja redukálni, DOXszemikinont létrehozva. Ennek a reoxidációja reaktív oxigéngyököket és hidrogén-peroxidot eredményez. Az ilyen típusú molekulák jelenléte apoptózishoz vezet az NF-kB aktiválásának segítségével [11]. Az 5.1-es ábrán összefoglalva láthatjuk a doxorubicin hatásmechanizmusát. Az ábrán a DOX jelöli a doxorubicint, a ROS pedig a reaktív oxigén-gyököket. Az ábrán szerepelnek továbbá az ABC-transzporterek több alcsaládjai, az ebbe a családba tartozó transzmembránfehérjék pumpálják ki a gyógyszert a sejtből.

5.1. ábra: A Doxorubicin hatásmechanizmusa [22]

13

5.1.1.2. Rezisztenciamechanizmusok A rákos sejtek által kialakított rezisztencia lehet eleve meglévő (ez a gyakoribb) vagy szerzett. A mechanizmusok hasonlóak, a különbség a kezelés szempontjából jelentős: az eleve meglévő rezisztencia esetén a tumor nem válaszol a kezelésre, míg a szerzett rezisztencia esetén az eleinte kedvezően reagáló tumor a kezelés során lesz rezisztens. A pontos rezisztenciamechanizmusok megértésével olyan kezelési módszereket dolgozhatunk ki, melyekkel megkerülhető a gyógyszerrel szembeni rezisztencia, illetve azok kialakulása. Doxorubicin rezisztencia kialakulásáért többféle mechanizmus tehető felelőssé [12], melyek közül a leggyakoribbak: (1) A klasszikus MDR, azaz „multidrug resistance” fenotípus: az egyik leggyakoribb rezisztenciamechanizmus, nem csak doxorubicinnel szemben. Ezeket a sejteket a Pgylcoprotein transzmembrán fehérje (PGP) kifejeződése jellemzi, amit emberekben az mdr1 gén megnövekedett expressziója okoz. A PGP az ABC-transzporterek családjába tartozik, és képes kipumpálni a rákos sejtből sokféle gyógyszert, köztük a doxorubicint, így okozva rezisztenciát: hiába jut be a sejtbe a gyógyszer, kikerül a citoplazmából, mielőtt hatni tudna. [13]. (2) Nem PGP-mediált MDR fenotípus: ezek a sejtek is többféle gyógyszerrel szemben rezisztensek, ám nem a PGP fehérje segítségével pumpálják ki a gyógyszert a sejtből, hanem az MRP (multidrug resistance-associated protein) segítségével. Ez a fehérje is az ABC-transzporterek családjába tartozik. (3) A gyógyszer sejten belüli eloszlásának megváltozása: a nem-rezisztens sejtekben a gyógyszer inkább a sejtmagban koncentrálódik, míg a rezisztens sejtekben több gyógyszermolekula található a sejtmagon kívül hólyagokban, vagy a hólyagok membránjához kapcsolódva. Ez az MVP génhez köthető, ami LRP transzportfehérjét kódol, ami a gyógyszer sejtmagból való kiviteléért felelős. A gyógyszer eltérő eloszlása rontja a hatékonyságát, így okozva rezisztenciát. (4) Glutation transzferáz (GST): A GSTP1 gén kifejeződésének megnövekedésével a GSTP1 enzim glutationt kapcsol a doxorubicinhoz, vízoldékonyabbá téve azt, amivel elősegíti a sejtből való eltávolítását MRP transzportereken keresztül [14]. Legtöbbször szerzett rezisztenciaként nyilvánul meg. (5) A TOPO-II-ben történő változások: azokat a sejtvonalakat, melyek a TOPO II-ben bekövetkező változások miatt lettek rezisztensek, at-MDR-nek nevezzük („altered TOPO II

14

activity” kifejezésből származik az elnevezés). Két csoportba oszthatók: (I) mennyiségbeli változás, például csökkent TOPO-II szint, és (II) minőségbeli változások, például egy mutáció miatt kifejeződött fehérje kötődése a DNS-gyógyszer komplexhez vagy módosult enzimatikus működés transzláció után változások miatt. Az at-MDR gyakori a rezisztens sejtekben, de általában más mechanizmusokkal együtt található meg. (6) A szabad gyökök inaktiválása: mint már korábban megállapítottuk, a doxorubicin egyik hatásmechanizmusa a rákos sejtben apoptózis indukálására, szabad gyökök létrehozása a sejtben. A sejt ez ellen úgy tud védekezni, hogy megnöveli az EPHX1 gén expresszióját, aminek a terméke az epoxid hidroláz enzim, ami többféle reaktív anyagot hatástalanítani tud, így a doxorubicin által létrehozottakat is, és így gátolja a szabad gyökök képződését [15]. Mint láthatjuk, a doxorubicin-rezisztencia kialakulásának sokféle módja van, és ezek csak azok, amiket jelenleg ismerünk. 5.1.1.3. Anasztrozol Az anasztrozol egy aromatáz-inhibitor gyógyszer emlőrák hormonterápiás kezelésére. A vér ösztradiol szintjét csökkenti úgy, hogy az aromatáz enzimet gátolja, ami az androgénok ösztrogénné alakításáért felelős. Ezáltal a testben, és így a tumorban is csökken az ösztrogénkoncentráció, ami a tumor méretének csökkenését és progressziójának lassulását okozza [16]. További hatásait sejtmechanizmusokra kutatás tárgyát képezik. Férfiak és gyermekek számára nem ajánlott. Menopauzán átesett nők korai hormonreceptor-pozitív emlőrákja esetén adjuváns terápiaként alkalmazzák [17]. Áttétet képzett és előrehaladott hormonreceptor-pozitív emlőrák esetében pedig első vonalbeli kezelésként alkalmazzák, szintén menopauzán már átesett nőknél. Tabletta formában kapja meg a beteg.

15

6. A tervezés leírása 6.1. A gyógyszerek kiválasztása Első lépésként ki kellett választani azt a gyógyszert, amelyet a doxorubicinnel kombinációban vizsgálni érdemes. Szakirodalmi adatok alapján a következő gének kerültek kiválasztásra:

6.1.1 Doxorubicin-rezisztenciához kapcsolódó gének Ebben a fejezetben azok a gének kerülnek bemutatásra, amelyek a doxorubicinrezisztenciában szerepet játszanak szakirodalmi adatok alapján. A felsorolt gének két csoportra oszthatóak a rezisztens tumorokbeli gén kifejeződésük alapján: azok a gének, akikben a fehérje expresszió megnövekszik, illetve azok, akikben nem.

Expressziójuk megnövekszik: ABCC1: A Multidrog resistance associated protein 1 fehérjét fejezi ki, amely egy ABC transzporter, szerves anionok és gyógyszerek sejtből való exportjáért felelős. Kifejeződésének felerősödése esetén segít a sejtnek kipumpálni magából a doxorubicint, így vesz részt a rezisztencia kialakításában. ABCC2: Az MRP2 fehérjét kódolja, szintén az ABC transzporterek családjába tartozik. Eredetileg a májsejtek apikális részében fejeződik ki, és az epébe való transzportban vesz részt. Képes azonban gyógyszerek transzportjára is, így ha rákos sejtek fejezik ki, csökkenti a gyógyszermennyiséget a sejt belsejében. ABCB1: A P-gp (permeability glycoprotein) fehérjét kódolja. A P-gp egy fontos sejtmembrán fehérje, rendkívül sokféle idegen anyagot áramoltat ki a sejtből. Az ABC-transzporterek családjába tartozik. A legtöbb gyógyszer-rezisztenciában szerepet játszik. ABCG2: A BCRP fehérjét kódolja. ABC transzporter, eredetileg vesében és vesén kívüli húgysav kiválasztásért felelős. Porfin homeosztázisban is szerepet játszik. Xenobiotikum transzporter is, valószínűleg fontos szerepet játszik a xenobiotikumok agyból való kizárásának. Több daganatos sejtvonalban fontos szerepet játszik a multidrog rezisztencia kialakulásában. Doxorubicin-rezisztens sejtvonalakon többen is kimutatták a túlműködését [18].

16

LRP1/MVP: Az LRP fehérjét kódolja. Ez egy nem ATP-függő sejten belüli transzporterfehérje, ami a sejtmagból való gyógyszerkiáramlásért felelős. A fehérje kifejeződésének felerősödése valószínűleg azért függ össze a doxorubicin-rezisztenciával, mert képes a gyógyszer koncentrációját csökkenteni a sejtmagban. RALBP1: Az általa kifejezett RALBP1 fehérje a DNP-SG és a doxorubicin ATP-függő transztportját irányítja a RAL fehérje aktiválásán keresztül. Ezen kívül képes segíteni endocitótikus komplex kialakításában más fehérjéknek az interfázis során és CDK1-el komplexet tud képezni, hogy az endocitózist leállítsa. CYP1A1 és CYP1A2: A citokróm p450 enzimet fejezi ki mindkét gén, a CYP1A1 az 1A1 míg a CYP1A2 az 1A2 izomert (a két gén körülbelül 25 kilobázispár közelségben helyezkedik el egymástól a 15-ös kromoszómán). Ezek az enzimek monooxigenázok, sok reakciót katalizálnak, például a testidegen anyagok, gyógyszerek metabolizmusában és hormonok bioszintézisében. A doxorubicin-rezisztens sejtvonalakon kimutatták a p450 enzim megnövekedett mennyiségét, valószínűleg a gyógyszer hatástalanításában vesz részt, de jelenleg tisztázatlan mechanizmussal. GSTP1: A GSTP1 (Glutation S-transzferáz P) emésztőenzimet fejezi ki. Glutation konjugációját katalizálja nagyszámú anyaghoz, így a gyógyszerekhez is. Ezzel vízoldékonyabbá teszi őket, elősegítve a sejtből való kijutásukat. Gyógyszer ellen kialakult rezisztencia esetén a GSTP1 fehérje megnövekedett kifejeződése gyakran együtt jár ABC-transzporterek kifejeződésével, így még hatékonyabb a gyógyszer sejtből való eltávolítása. EPHX1: Az EPHX1 enzimet fejezi ki, ami reaktív vegyületek hidrolízisét katalizálja, így hatástalanítva őket. Valószínűleg úgy van kapcsolatban a doxorubicin-rezisztenciával, hogy a doxorubicin által létrehozott reaktív anyagokat hatástalanítja és csökkenti a szabad gyökök képződését. CDKN1A: A CDKN1A vagy p21 fehérjét fejezi ki. Fontos szerepet játszik a p53 fehérje által közvetített apoptózis útvonalban. Hozzákötődik és gátolja a ciklin-dependens kináz aktivitását, ezzel a sejtciklust szabályozza. Képes addig megállítani a sejtet G 1 fázisban, ha a p53-tól erre felszólítást kap. SOD1 SOD2 és SOD3: Az általuk kifejezett fehérjék a szervezetre toxikus gyököket képesek elpusztítani. Ezzel gyengítik a doxorubicin hatását, mivel annak az egyik hatásmechanizmusa pont, hogy a gyökök létrehozása, amivel mérgezni tudja a sejtet.

17

TOP1: DNS topoizomerázt kódol, ami egy olyan enzim, ami a DNS topológiáját képes megváltoztatni és vezérelni az átíródás során. A DNS replikációja és transzkripciója során a DNS szerkezete megváltozik, ami strukturális feszültséget okoz, ezért száltöréshez vezethet. A topoizomerázok ezt a feszültséget oldják fel vagy hozhatnak létre szuper szerkezeteket egyes szálak eltörésével és újra összekapcsolásával. MAD1L1: Mitotikus orsó összeszerelődés checkpoint-fehérjét kódol, csak akkor engedi a sejtet anafázisba lépni mikor minden kromoszóma megfelelően a helyére került. Így részt vesz a sejtciklus szabályozásában. Ha nem megfelelően működik, hibás sejtosztódás következhet be, így a tumor-szuppresszor csoportba is szokták sorolni. MAD2L2: A MAD2B fehérjét kódolja, ami szintén egy mitotikus orsó összeszerelődési checkpoint-fehérje. Azon kívül, hogy gátolja az anafázisba lépést, amíg a kromoszómák nem megfelelően helyezkednek el, DNS-javító mechanizmusokban is részt vesz. BUB1: Szintén mitotikus checkpoint fehérjét kódol, a BUB1 (budding uninhibited by benzimidazoles) enzimet. A mitotikus orsó checkpoint összeállításában és a kromoszóma kongresszióban segít. Hiányában aneuploid sejt és kromoszomális instabilitás alakulhat ki. BUB3: A BUB3 fehérjét kódolja, amely a mitotikus orsó összeszerelődési checkpoint szabályozásában vesz részt. Segít létrehozni a helyes kinetochor-mikrotubulus kapcsolatokat és helyére vinni a BUB1-et. Képes továbbá foszforilálni a MAD1L1-et. APC: Az APC fehérjét fejezi ki. Ez a béta-katenin koncentrációnak egy negatív regulátora és az E-kadherinre tud hatni, mindkettő a sejt adhézióját szabályozza. Az APC tumor-szupresszor gén. Segít befolyásolni, milyen gyakran osztódik a sejt, hogyan kötődik más sejtekhez. A megfelelő kromoszómaszám ellenőrzésében is segít. HMGB1: A HMGB fehérjét kódolja. DNS-hez képes kötődni és meg tudja hajlítani a DNS-t. Sok más gén transzkripcióját segíti elő transzkripciós faktorok megkötésével. Nukleoszómákkal is kölcsön tud hatni, hogy meglazítsa a DNS-t.

Expressziójuk csökken: CDK2: A CDK2 fehérje a ciklin E/CDK2 komplex részeként fontos szabályozója a sejt G1-ből S fázisba való lépésének. Azzal, hogy a sejt megakadályozza ennek a komplexnek a létrejöttét azt éri el, hogy nem tud S fázisba lépni, ahol a doxorubicin ki tudná váltani a toxikus hatását, így védve meg magát az apoptózistól.

18

MYC: A mielocitomatózis onkogén transzkripciós faktor képes elősegíteni a sejtburjánzást. DNS-hez tud kötődni egy bizonyos szekvencia felismerésével. Növekedéshez kapcsolt gének átíródását aktiválja. TP53: A p53 fehérjét kódolja, a szervezetünkben található egyik legfontosabb tumorszuppresszor. DNS-hiba esetén javító mechanizmusokat indít, ha pedig javíthatatlan hibát talál, apoptózist indít. A genom őrzője néven is nevezik. A doxorubicin hatásmechanizmusában is fontos szerepet játszik, ugyanis a doxorubicin ezen az útvonalon indít apoptózist. ATM: Az ATM fehérjét kódolja, ami egy fontos sejtciklus checkpoint-kináz. Sokféle „downstream”-fehérje regulátora, például a p53-é és a BRCA1-é. Jelenlegi ismereteink szerint az egyik fő irányítófehérjéje a sejtciklus checkpoint jelátvivő-útvonalainak, amelyek a sejt DNSkárosodásra és genom stabilitásra való válaszához szükségesek. Az ATM gén kifejeződésének csökkenése a tp53 útvonal elnyomását eredményezi. BRCA1 és BRCA2: Ezen két gén mutációja ismerten emlőrákra való hajlamot jelent. Tumorszuppresszor gének. Sok tanulmány született már a BRCA gének és a doxorubicin-rezisztencia kapcsolatáról, de nincs közvetlen bizonyíték az összefüggésükről. Mindkét gén DNS-javító mechanizmusokban vesz részt, de más-más módon.

Expressziós változása nem egyértelmű: TOP2A: A TOP2A fehérje a doxorubicin mechanizmusának elsőszámú célpontja. A rezisztens sejtvonalakat többen vizsgálták, egyesek csökkent [15], mások növekedett [19] TOP2A aktivitást találtak. Érdekes, hogy a többi topoizomeráz (TOP1 és TOP2B) kifejeződése nem változott jelentősen, ez azt jelzi, hogy a doxorubicin ezt az alfa izomert részesíti előnyben. Mivel a doxorubicin ezen a fehérjén keresztül fejti ki a hatását, nem meglepő hogy a daganatos sejt a gén kifejeződésének manipulálásával próbál védekezni. Mindegyik választott gén vizsgálatára sor került off-target adatbázisban, melyet az MTA TTK Lendület Onkológiai Biomarker kutatócsoport hozott létre Dr. Győrffy Balázs vezetésével (nem publikus). Elkészítése során több, mint 100.000 gén-chip mintát dolgoztak fel, és más adatbázisoktól eltérően nem gyógyszerbefolyásolt gén irányba lehet keresni, hanem befolyásolt géngyógyszer irányba. Egyenként kiválasztásra került, hogy melyik génre milyen gyógyszerek vannak hatással, és szűkítettem a találatokat azokra a gyógyszerekre, melyek a rezisztenciával ellentétes irányba tolják el a gének kifejeződését. Kevés olyan gyógyszer volt, ami dokumentáltan több választott génre is hatott, ezek közül az anasztrozol volt az, amit mellrák kezelésére használnak. A 11.1-es mellékletben található a gének kifejeződésére tett hatása. A 19

vizsgált 28 génből 15-nek változtatta meg a kifejeződését, fele arányban a rezisztenciával megegyező illetve ellentétes irányba. Ezen előzetes eredmények alapján nem lehetett egyértelműen megállapítani, hogy az anasztrozol kezelés elősegíti vagy gátolja a doxorubicin rezisztencia kialakulását, így ennek a kérdésnek megválaszolására törekedtünk vizsgálataink összeállításával.

6.2 Célgének kiválasztása Ideális esetben az összes kiválasztott gén kifejeződésének változását megvizsgálnánk, ám erre nem volt idő és lehetőség. Ezért hármat ragadtunk ki a listából. A TOP2A-t azért választottuk, mert a doxorubicin egyik legfontosabb hatását a topoizomeráz II-n keresztül fejti ki. A BRCA1 illetve BRCA2 gének pedig mindkettő emlőrákhoz kapcsolódó tumor-szuppresszor, összefüggésüket az anasztrozollal vizsgálatra érdemesnek tartottuk. 6.2.1

TOP2A

A DNS topoizomeráz2-alfa fehérjét kódolja. A DNS-kettőződés során játszik fontos szerepet, csökkenti a másolódás során kialakuló feszültséget és extra csavarodást. Mindkét szálat hasítja, majd a kettőződés végén keletkezett DNS gyűrűt szétbontja. A doxorubicin egyik hatásmechanizmusa ezen az enzimen keresztül történik. A doxorubicin a DNS-hez kötődik, és megakadályozza a DNS szintézist. 6.2.2

BRCA1

A BRCA1 fehérjét kódolja, ami DNS-hibajavításért felelős. Neve a Breast Cancer 1, Early Onset rövidítéséből származik. Tumor-szupresszor gén, ezen belül ’caretaker’. Főleg mellszövetben fejeződik ki. A BRCA1 fehérje hibás DNS javításáért felelős, egy komplexben vesz részt, ami kettős száltörést igyekszik javítani homológ javítással. Ha a javítás sikertelen, apoptózis indul. Mutáns gén esetén legtöbbször emlőrák alakul ki, innen kapta a nevét is. 6.2.3

BRCA2

A BRCA2 fehérjét kódolja, neve a BRCA1-hez hasonlóan a Breast Cancer 2, Early Onset rövidítéséből származik. Szintén tumor-szuppresszor gén, mellszövetben fejeződik ki és DNShibajavításért felelős. A BRCA1-el ellentétben nem képez más molekulákkal komplexet, hanem a DNS egyik szálához kötődik és közvetlenül a RAD51 fehérjével lép kapcsolatba. Szintén homológ reparációt végez kettős száltörés esetén, de más mechanizmussal. A két fehérje szerkezete is egészen eltérő. Mivel mindkét gén mutációja tumorhoz vezethet, lehetőség van kifejezetten ennek a két génnek a mutációjára való szűrést végezni.

20

6.3 Használt sejtvonalak, fenntartásuk A szakdolgozat elkészítése során két sejtvonalon végeztem kísérleteket, amelyek a következőek: :

6.3.1 MCF-7 sejtvonal Az MCF-7 sejtvonalat 1970-ben izolálták Frances Mallon, akkor 69 éves europid nőből. Nevét arról az intézetről kapta, ahol a sejtvonalat létrehozták, a Detroit-i Michigan Cancer Foundation 7-ről. Ez azért volt nagyon fontos eredmény, mert az MCF-7 előtt nem volt olyan emlőrák-sejtvonal, amely két hónapnál tovább élt volna. Az MCF-7 két másik sejtvonallal (T-47D és MDA-MB-231) együtt az emlőrákokról publikált cikkek több mint kétharmadában végeztek rajta kísérleteket. Az MCF-7 ösztrogén és progeszteron-receptorokat is kifejez. Sejtkultúrában való tartásához Leibovitz-15 alkalmaztunk, melyhez kiegészítésként 10% FBS-t (fetal bovine serum), 1% penicillin-sztreptomicin antibiotikumot, valamint 0,1% amfotericint adtunk.

6.1. ábra: MCF-7 sejtek

skála:100 µm

6.3.2 MDA-MB-231 Ezt a sejtvonalat egy áttétes emlő tumorú, 51 éves europid nőből izolálták 1973-ban az M.D. Anderson Cancer Center-ben. Mutáns tp53 található benne, ösztrogén és progeszteron receptorokat nem fejez ki. Sejtkultúrában való tartásához Leibovitz-15 alkalmaztunk, melyhez kiegészítésként 10% FBS-t (fetal bovine serum), 1% penicillin-sztreptomicin antibiotikumot, valamint 0,1% amfotericint adtunk. A sejteket 37 °C-on és 5%-os CO2 koncentráció mellett tartottuk.

21

6.2. ábra: MDA-MB-231 sejtek

6.3.3 Módszerek A két sejtvonal hasonló ütemben szaporodik, és ugyanolyan körülmények között kell tartani őket, továbbá ugyanarra a médiumra van szükségük a kultúrában tartáshoz. A sejtvonalakat -80 °C-on tárolják médium, FBS és DMSO keverékében fagyálló tubusokban. Ahhoz, hogy felolvasszuk őket, óvatosan 37 °C-os vízfürdőben melegítjük. Ha a sejtek felolvadtak, 15 ml-es falcon csőbe pipettázzuk át, és lassan 5 ml meleg médiumot csepegtetünk hozzájuk. Ezután 5 percig 1700-as fordulatszámmal centrifugáljuk a sejteket, ettől lesüllyednek a cső aljára. Ekkor leöntjük róluk a médium, FBS és DMSO keverékét, majd 1 ml médiumban alaposan homogenizáljuk a sejteket és flaskába pipettázzuk, összesen 5ml médiumban. Lehetőleg már másnap médiumot cserélünk rajtuk, hogy a maradék DMSO-t is eltávolítsuk róluk. A sejteket inkubátorban tároljuk, állandó hőmérséklet és CO2 mellett (37°C, 5% CO2). 2-4 nap elteltével az elhasználódott médiumot frissre cseréljük. Az élő sejteken végzett munkálatokat mindig steril fülkében végezzük, hogy a fertőződést elkerüljük. A sejtkultúrában tartott sejtek egy ideig exponenciálisan szaporodnak, majd elérnek egy telítési szakaszt, ahol már nem optimális a környezet a további növekedéshez. Ebben a szakaszban (mindkét sejtvonalnál kb. 70-80%-os lefedettség) meghígítjuk a sejteket olyan koncentrációra, amelyben optimális a növekedésük. Ezt a hígítást nevezzük passzálásnak. Ehhez a sejteket fel kell szedni a flaska aljáról. Ezt tripszinnel érjük el, a proteáz megszünteti a sejt-sejt illetve a sejt-flaska kapcsolatokat. A sejtekről lepipettázzuk a médiumot és PBS-sel átmossuk őket. Ezután 10x töménységű tripszint pipettázunk rájuk és kb. 5 percig hatni hagyjuk. Mikroszkóp segítségével ellenőrizzük, hogy a sejtek elváltak-e a flaska aljáról, médiumot adunk hozzájuk (ez hatástalanítja a tripszint, ami önmagában ártalmas a sejteknek) és átpipettázzuk őket egy 15 ml-es falcon csőbe. 5 percig 1700-as fordulatszámon centrifugáljuk őket. A sejtek ettől leülnek a cső aljába, és a médiumtripszin keveréket leönthetjük róluk. Ezután a sejteket médiumban feloldjuk, majd megfelelő 22

mennyiséget visszateszünk a flaskába. A sejtszuszpenzió egy részéből az RNS vagy DNS kivonásra kerül, vagy DMSO és FBS keverékében lefagyaszthatjuk -80 °C-ra. Ekkor a 0,5 ml médiumban felvett sejteket áttesszük egy fagyálló-tubusba, amihez 0,5 ml FBS-t és 0,05 ml DMSO-t adunk, és fokozatosan hűtjük le őket -80 °C-ig, ahol legközelebbi felhasználásokig tároljuk.

6.4 Kísérletek menete Az anasztrozol hatásának vizsgálatát a doxorubicin-rezisztenciára a következő kísérleti összeállítással végeztük el: 1. Két sejtvonal párhuzamos kezelése 5 féle anasztrozol koncentrációval 72h keresztül, kezeletlen kontroll csoport alkalmazása mellett. 2. A kezelést követően a sejtek teljes RNS mennyiségének kinyerése. 3. A választott doxorubicin-rezisztencia gének (TOP2A, BRCA1, BRCA2) expressziójának meghatározása kvantitatív PCR-rel (qPCR). 4. A kontroll és a kezelésen átesett sejtek gén expressziójának összehasonlítása.

6.4.1 qPCR reakció A qPCR reakciót a sejtek általunk választott génjeinek expressziójának mérésére használjuk. A hagyományos PCR során a felsokszorozott szekvenciák mennyiségének megmérése a reakció lefutása után történik. A qPCR, azaz real-time quantitative PCR abban különbözik a PCR-től, hogy folyamatosan figyelhetjük meg a DNS-mennyiségének változását fluoreszcens festék használatának segítségével [20] . A PCR reakció során specifikus primerek segítségével megsokszorozódik az a DNS-szakasz, melyekre a primerek specifikusak. Ezzel nem számszerű adatot kapunk a sejt génexpressziójáról, de két kísérlet végeredményét összehasonlíthatjuk. A mi esetünkben nem DNS-t, hanem RNS-t szeretnénk sokszorozni. Ahhoz, hogy el tudjuk végezni a qPCR-reakciót, először ki kell választanunk, melyik génekre vagyunk kíváncsiak. Mi a TOP2A, BRCA1 és BRCA2 géneket választottuk. A primereket nem tudjuk magunknak előállítani, erre szakosodott cégtől kell rendelni, de meg kell terveznünk milyen primert szeretnénk, hogy rendelni tudjunk.

23

6.4.1.1 Primer tervezése qPCR reakcióhoz A kiválasztott három gén (TOP2A, BRCA1 és BRCA2) expressziójának meghatározásához gén specifikus qPCR primerek szükségesek, melyeket a kutatócsoport maga tervezett. Ehhez az Ensembl adatbázisából kikeressük a gén(eke)t, ami(k)hez primert szeretnénk tervezni. Ezt a http://www.ensebl.org holnapon tudjuk megtenni. A legtöbb génhez több átirat tartozik, olyat kell kiválasztanunk, amelynél nem ’incomplete’ az adat, tartozik hozzá CCDS és fehérjét kódol. Ennek az átiratnak elmentjük a transcript ID-jét. Maga a primertervezés a Roche Universal ProbeLibrary Assay Design Center-en keresztül történik, ami a http://lifescience.roche.com honlapon érhető el. Az automatikus primer tervező program több lehetséges primer párt is eredményez, amelyek közül azt érdemes választani, amelynél a forward és revers primerek olvadási hőmérséklete azonos. A mellékletekben csatolom a tervezett primerpárokat. A primerek gén specifikusságának visszaellenőrzését az USCS In-silico PCR programjával tehetjük meg, a http://genome.uscs.edu honlapon. 6.4.1.2 Sejtek gyógyszeres kezelése Az anasztrozol por formájában állt rendelkezésünkre (Sigma), melyből DMSO-val 10 mM-os törzsoldatot készítünk. A sejtjeinket tripszinnel felszedjük a flaskáról, sejtszámlálást végzünk, és 6 lyukú lemezre tesszük őket, mindegyik lyukba 300’000 db sejtet 3 ml médiumban. 24 órát várunk, amíg letapadnak. Ezután óvatosan lepipettázzuk róluk a médiumot, és gyógyszeres médiumot pipettázunk rájuk. Mindegyik lyuk más-más koncentrációban kapja meg a gyógyszert. Az MCF-7 és az MDA-MB-231 sejteket ugyanazokkal a koncentrációkkal kezeltem, sorban: 0.1 µM, 0.5 µM, 1 µM, 5 µM, 10 µM és a kontroll sejtek, amelyek nem kaptak gyógyszeres kezelést, csak a gyógyszer DMSO oldószerét. A kezeléshez használandó gyógyszer-koncentrációk meghatározását egy 2008-as cikkből tettük, amely (többek között) szintén anasztrozol hatását vizsgálta MCF-7 sejtvonalon [21]. A sejteket 72 óráig hagytuk a gyógyszer hatása alatt. Ezután RNS-kivonást végeztünk.

24

6.4.1.3 qPCR reakció összeállítása, elvégzése A qPCR reakciót nem élő sejteken végezzük el, mivel csak az RNS-re van szükségünk belőlük. Ezért az első feladat, hogy a sejtekből kivonjuk a bennük lévő RNS-t. Ennek során a sejteket tripszinnel választjuk el a 6-lyukú lemeztől, majd médiumban szuszpendáljuk. Ha nem azonnal végezzük el az RNS-kivonást, rövid ideig -20 °C-on tarthatjuk felhasználásig. Az RNS-kivonást QIAGEN RNEasy kit segítségével végezzük a gyártó leírása alapján, lépéseit a jobb oldalon található képen láthatjuk. RNS kivonás után a mennyiségét illetve minőségét NanoDrop spektrofotométer segítségével ellenőrizhetjük. Mivel a qPCR reakció során csak DNS-t illetve cDNS-t tudunk mérni, először a kivont RNSünket át kell fordítanunk cDNS-é. Ezt egy transzkripciós PCR reakció segítségével végezzük el. A reakció elegybe 10 µl RNS, 1 µl reverz-transzkriptáz enzim, 1µl random primer, 2 µl dNTP, 2 µl DTT, 4 µl 5x puffer került bemérésre. A reverz transzkripciós reakció során a következő hőmérsékleti profilt alkalmaztuk: 25 °C 10 másodpercig, 50 °C 15 másodpercig és 85 °C 5 percig. Miután a sejtekből kivont RNS tartalmat cDNS-é fordítottuk, következhet a qPCR-reakció összeállítása. A két sejtvonalat két külön lemezen vizsgáljuk, mert egyre nem férnek rá. Mind az ötféle koncentrációval kezelt + a kontroll sejtek három génjének, illetve egy negyedik gén is, az RPLP0 gén expresszióit vizsgáltuk meg. Az RPLP0 egy úgynevezett háztartási gén, a legtöbb sejttípusban ugyanolyan mértékben fejeződik ki, ezért jó összehasonlítási alapként szolgál egyrészt a sejtvonalak közt, másrészt az egyes lyukak között is: ha az RPLP0 kifejeződésével normáljuk az eredményeket, megszüntetjük az eltérő mennyiségű kiindulási RNS-ből adódó pontatlanságot. Sejtvonalanként a 6 +1 (negatív) féle sejtet tehát 4 különböző primerrel kell ellátni, és a biztonság és pontosság kedvéért mindegyik mérést 3x szeretnénk elvégezni. Ez egy sejtvonalra 3x7x4 = 84 összeállítást eredményez, így egy sejtvonal ráfér egy 96-lyukú lemezre. A primereket liofilizált állapotban szállítja a gyártó, pontosan megjelölve, hogy melyikhez mennyi nukleáz-mentes vizet kell hozzáadni, hogy 100mM koncentrációjú legyen. A primerpárok külön csőben érkeznek, a kísérlet előtt 10mM-os keveréket készítünk belőlük. A qPCR reakció elegye a következőket tartalmazta: 2µl primer keverék, 1 µl cDNS, 10 µl SYBER Green és 7 µl víz. A vizsgálatot 96 lyukú lemezen végezzük, melyet átlátszó fóliával leragasztunk, majd 1 percig centrifugáljuk, hogy ne maradjon semmilyen összetevő a lyukak falán. A qPCR reakciót Roche LightCycler® 480 típusú kvantitatív PCR készüléken végeztük. Az alkalmazott hőprofil értékeket a 6.4. ábra tartalmazza, melyek az alkalmazott primer párok olvadási hőmérsékletének megfelelően lettek megadva. Egy ciklus alatt megkétszereződik az

25

általunk vizsgálni kívánt gén mennyisége. Ezt a ciklust 70x futtattuk le. Az első pár lépés során a gép nem detektál fluoreszcenciát, mert a detekciós küszöbérték alatt van a fluoreszcencia mértéke, de mikor átlépi azt, exponenciális növekedést láthatunk. Miután mindkét lemezt lefuttattuk, már csak az eredmények elemzése van hátra. 100 C°

90 C° 80 C° 70 C° 60 C°

50 C°

egy qpCR ciklus

40 C° 30 C° 20 C° 10 C° 0 C° 1

3

5

7

9

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35

másodpercek

6.4. ábra: qPCR során használt hőmérsékletek

26

6.4.2 TP53 mutáció ellenőrzése a sejtvonalakon Irodalmi adatok alapján a kísérletekben alkalmazott MCF7 sejtvonal vad típusú TP53 génnel rendelkezik. Az MDA-MB-231 sejtvonal mutációt hordoz a gén nyolcadik exonjában, amely egy pont mutáció (G helyett A), melynek hatására a 280. aminosava arginin helyett lizinre változott. Az MDA-MB-231 sejteknek a 7-9 exonjait vizsgáltuk, míg az MCF-7 sejteknek mind a 11 exonját. A primereket a kutatócsoport tervezte úgy, hogy intronban legyenek találhatóak, hogy csak a genomi DNS-t erősítsük fel. A PCR elegy a következőket tartalmazta: 500 ng DNS, 10 mM minden típusú dNTP-ből, 10 µM mind a nyolc primerből, 5 egység Taq polimeráz, 2.5 µl buffer és nukleáz-mentes víz 25 µl-re kiegészítve az elegy térfogatát. A következő hőmérsékleti profilt alkalmaztuk: 3 perc kezdeti denaturációs lépés 94 °C-on, majd 35 ciklus a következő lépésekkel: 94 °C 30 másodpercig, 53 °C 30 másodpercig és 72 °C 2 percig. A PCR reakció lefutása után a terméket megtisztítottuk, és szekvenálásra elküldtük a Semmelweis Egyetem Genomikai Medicina és Ritka Betegségek Intézetébe. A visszakapott adatokat BioEdit programmal dolgoztuk fel:

vad típus MCF-7

MDA-MB-231

6.5. ábra

A kapott szekvenciák elemzésével az MCF-7 sejtvonal vad típusúnak bizonyult, míg az MDAMB-231 esetében az irodalomból ismert mutáció kimutatásra került. Az 6.6. ábrán az MCF7-hez hasonlítva látható az MDA-MB-231, jelölve a megváltozott nukleotidot, ami aminosav cserét okozott.

27

7. Értékelés A szakdolgozat elkészítése során arra kerestem a választ, hogy az anasztrozol kezelés vajon elősegíti vagy gátolja a doxorubicinnal szembeni rezisztencia kialakulását. Ennek vizsgálatára két sejtvonalat anasztrozol kezelésnek tettünk ki három napig (különböző koncentrációkban), és utána qPCR reakció segítségével ellenőriztük három, doxorubicin-rezisztenciával kapcsolatos gén expressziójának változását kezelés hatására. A mért adatokat a 11.3 mellékletben csatoltam. Ezek az egyes minták Ct értékei tartalmazzák. A mérés során mérhető egy kiindulási fluoreszcencia érték, úgynevezett alapvonal. Ehhez képest választjuk meg a küszöbértéket, ami annál az értéknél található, ami jelentős növekedést mutat a választott alapvonalhoz képest. Azért választjuk, hogy a háttérzajtól biztosan elváljanak a jeleink. A Ct értéket úgy tudjuk leolvasni, hogy megnézzük, a mintánk hol éri el azt a fluoreszcencia értéket ahol a küszöbérték is található, és leolvassuk a hozzá tartozó ciklusszámot. Ezekből az értékekből számolhatunk összehasonlító mennyiségi meghatározás segítségével génexpresszió-változást. Ehhez a ΔΔCt módszert használtam, ami kétszer végez összehasonlítást, egyrészt a kérdéses gének expresszióját hasonlítja az általunk választott háztartási gén (RPLP0) expressziójával, másrészt a kontroll (kezeletlen) mintát hasonlítja a kezeltekkel. Ez azért hasznos, mert normalizálja a kapott értékeket, így a különböző kezdeti RNS-koncentrációból származó mérési hibát kiküszöböli. A ΔΔCt módszer elvégzése után azt kapjuk meg, hogy az eredeti génexpresszióhoz képest hányszorosára változott a kezelés hatására a génexpresszió. A két sejtvonalhoz tartozó értékeket két grafikonon ábrázoltam:

Génexpresszió változása anasztrozol-kezelés hatására MCF-7 sejtekben 2 1,8

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2

TOP2A

BRCA1

10 nM

5 nM

1 nM

0,5 nM

0,1 nM

kontrol

10 nM

5 nM

1 nM

0,5 nM

0,1 nM

kontrol

10 nM

5 nM

1 nM

0,5 nM

0,1 nM

kontrol

0

BRCA2

7.1. ábra: Génexpresszió változása anasztrozol-kezelés hatására MCF-7 sejtekben

28

Génexpresszió változása anasztrozol-kezelés hatására MDA-MB-231 sejtekben 7 6 5 4

3 2 1

TOP2A

BRCA1

10 nM

5 nM

1 nM

0,5 nM

0,1 nM

kontrol

10 nM

5 nM

1 nM

0,5 nM

0,1 nM

kontrol

10 nM

5 nM

1 nM

0,5 nM

0,1 nM

kontrol

0

BRCA2

7.2. ábra:Génexpresszió változása anasztrozol-kezelés hatására MDA-MB-231 sejtekben

Az MCF-7-en végzett kísérletek eredménye nem mutat konzisztens változást a génexpresszióban egyik génre sem, a vizsgált három gén expressziója egyes kezelési koncentrációknál növekedett, más koncentrációk esetében csökkent. Az MDA_MB-231 sejtvonal esetében a BRCA1 és BRAC2 expressziós változása nem mutatott összefüggést a kezelés hatására. Ugyanakkor a TOP2A gén kifejeződése magasabb anasztrozol kezelés hatására emelkedett expressziót mutatott. A TOP2A expressziója ugyanakkor nem nőtt egyenes arányban az alkalmazott anasztrozol koncentrációval. Ezen eredményeink alapján nem állapítható meg egyértelműen az anasztrozol kezelés hatása a doxorubicin-rezisztenciában részt vevő gének expressziójára. További a rezisztenciában szerepet játszó gének vizsgálata szükséges, továbbá ezen sejtvonalak gyógyszer érzékenységének megállapítása doxorubicin és doxorubicin-anasztrozol kombinált kezelés hatására.

29

8. Összefoglalás A dolgozat elkészítése során célunk volt olyan gyógyszert találni, amely doxorubicinnel kombinálva befolyásolja a doxorubicin-rezisztencia kialakulását. Először a szakirodalomban bővebben utánanéztem az emlődaganatoknak, kezelési módszereiknek. Ezután a doxorubicin rezisztenciamechanizmusát ismertem meg közelről. Az irodalmazás során kigyűjtöttem minden olyan gént, amely kapcsolatban áll a doxorubicin-rezisztenciával. Ezt követőn a kutatócsoport által fejlesztett adatbázisban (off-target adatbázis) olyan gyógyszerek keresését végeztem el, amelyek befolyásolják a választott gének kifejeződését gén chip adatok alapján. Sok gén kifejeződését befolyásolta az anasztrozol nevű gyógyszer. A befolyásolt gének expressziós változásai alapján nem volt egyértelműen eldönthető, hogy az anasztrozol kezelés elősegíti vagy gátolja a doxorubicin-rezisztencia kialakulását, így további vizsgálataink e kérdés megválaszolására történtek. A vizsgálatokat két emlő tumoros sejtvonalon végeztem, MCF-7 és MDAMB-231 sejtvonalakon. Mindkét sejtvonal sejtjeit öt különböző koncentrációban kezeltem anasztrozollal három napig. Ezután RNS-kivonást végeztem. A sejtekből kivont RNS-t cDNS-é alakítottam reverz transzkripció PCR segítségével. Ezzel a cDNS-sel qPCR reakciót állítottam össze a három a rezisztenciában szerepet játszó génre (TOP2A, BRCA1, BRCA2) és az RPLP0-ra, ami referenciagénként szolgált a mérés során. A mérési eredmények alapján az anasztrozol hatása nem jelentős a BRCA1 és BRCA2 génekre, a TOP2A gén az MCF-7 sejtvonalban nem mutatott szignifikáns változást, az MDAMB-231 sejtvonalban viszont jelentősen nőtt az expressziója. Irodalmi adatok alapján a TOP2A gén expressziója ellentmondásos expressziós mintázatot mutat a doxorubicin-rezisztens sejtekben. Ezen eredményeink alapján nem állapítható meg egyértelműen az anasztrozol szerepe a dorxorubicin-rezisztencia alakulásában. A kérdés tisztázására számos további vizsgálatot tervezünk, új rezisztenciában szereplő gének bevonását, valamint gyógyszer érzékenység vizsgálatokat doxorubicinnel és doxorubicin-anasztrozol kezeléssel szemben.

30

Legvégül munkám összefoglalását egy vázlatos folyamatábrával szeretném összegezni: Célkitűzés: doxorubicin-rezisztenciát megakadályozó gyógyszer keresése

Doxorubicin-rezisztenciához kapcsolódó gének gyűjtése szakirodalomból

Off-target adatbázisban való keresés, adatok feldolgozása

Anasztrozol doxorubicin-rezisztenciára való hatásának bizonyítása

Ennek vizsgálatához szükséges gének kiválasztása

Sejtlaboratóriumban végzett munka

MCF-7 és MDA-MB-231 sejtvonalak tp53 génjének vizsgálata

A két sejtvonal anasztrozol gyógyszeres kezelése

RNS-kivonás mindkét sejtvonal gyógyszerrel kezelt sejtjeiből

RT-PCR segítségével RNS-ből cDNS készítése, majd ezen qPCR reakció futtatása

Kapott adatok elemzése

Eredmény

31

9. Köszönetnyilvánítás Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Győrffy Balázsnak, hogy befogadott a laborjába és lehetőséget adott a szakdolgozatomat elkészíteni. Köszönöm a szuper témát és a segítséget a kidolgozása során. Köszönöm az útmutatást és a rengeteg segítséget Harami-Papp Hajnalkának, akitől az összes gyakorlati tudásomat szereztem a sejtes laborban. Köszönöm a sok hasznos tanácsot a kísérletekkel és az irodalomkutatással kapcsolatban. Köszönöm Dr. Lippai Mónikának, a sejtbiológia tanáromnak hogy olyan lelkesedéssel és hozzáértéssel tartott rendkívül érdekes órákat, hogy felkeltette az érdeklődésemet ez iránt a téma iránt. Köszönöm továbbá Gáspári Zoltánnak, a belső konzulensemnek, hogy segített átverekedni magam az adminisztratív akadályokon. Köszönöm Vidosits Andrásnak a dolgozatom alapos átolvasásáért és helyesírásellenőrzéséért. Köszönöm a családomnak és barátaimnak, hogy mindig megértőek voltak, és nyugodt környezetet biztosítottak a szakdolgozatom elkészüléséhez.

32

10. Irodalomjegyzék [1] D. Hanahan and R. A. Weinberg, "Hallmarks of Cancer: The Next Generation," Cell, vol. 144, no. 5, pp. 646-674, 2011. [2] S. Surget, M. Khoury and J. Bourdon, "Uncovering the role of p53 splice variants in human malignancy: a clinical perspective," Onco Tagets Ther., vol. 7, pp. 57-68, 2013. [3] J. Ferlay, H. Shin, F. Bray, D. Forman, C. Mathers and D. Parkin, "Estimates of worlwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008," Int J Cancer., vol. 127, no. 12, 2010. [4] C. P. Wilde and B. Stewart, World Cancer Report 2014, p. 26. [5] H. Sharon, M. Giordano, U. Aman, M. Buzdar, N. Gabriel and M. Hortobagyi, "Breast Cancer in Men," Annals of Internal Medicine, vol. 137, pp. 678-687, 2002. [6] K. dr. Boér, "Az emlőrák gyógyszeres kezelésének aktuális kérdései," Orvosi Hetilap, vol. 143, no. 14, 2002. [7] G. Minotti, P. Menna, E. Salvatorelli, G. Cairo and L. Gianni, "Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity," Pharmacol Rev., vol. 56, no. 2, 2004. [8] A. Di Marco, M. Gaetani and B. Scarpinato, "Adriamycin (NSC-123,127): a new antibiotic with antitumor activity," Cancer Chemother Rep., vol. 53, no. 1, 1969. [9] G. Hortobágyi, "Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview," Drugs., vol. 54, pp. Suppl 4:1-7, 1997. [10] A. Bodley, L. Liu, M. Israel, R. Seshadri, Y. Koseki, F. Giuliani, S. Kirschenbaum, R. Silber and M. Potmesil, "DNA topoisomerase II-mediated interaction of doxorubicin and daunorubicin congeners with DNA," Cancer Res., vol. 49, no. 21, 1989. [11] S. Wang, S. Kotamraju, E. Konorev, S. Kalivendi, J. Joseph and B. Kalyanaraman, "Activation of nuclear factor-kappaB during doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and myocytes is pro-apoptotic: the role of hydrogen peroxide," Biochem J., vol. 367, no. 3, pp. 729-740, 2002. [12] D. Nielsen, C. Maare and T. Skovsgaard, "Cellular Resistane to Anthracyclines," Gen. Pharmac., vol. 27, no. 2, pp. 251-255, 1996. [13] W. Li and M. Song, "Expression of multidrug resistance proteins in invasive ductal carcinoma of the breast," Oncoogy letters, vol. 8, no. 5, pp. 2103-2109, 2014. [14] A. Harbottle, A. Daly, K. Atherton and F. Campbell, "Role of glutathione Stransferase P1, P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein 1 in acquired doxorubicin resistance," International Journal of Cancer, vol. 92, no. 6, pp. 777-783, 2001.

33

[15] S. AbuHammad and M. Zihlif, "Gene expression alterations in doxorubicin resistant MCF7 breast cancer cell line," Genomics, vol. 101, no. 4, pp. 213-220, 2013. [16] C. Kelly and A. Buzdar, "Anastrozole," Expert Opinion on Drug Safety, vol. 9, no. 6, pp. 995-1003, 2010. [17] F. Lumachi, D. Santeufemia and S. Basso, "Current medical treatment of estrogen receptor-positive breast cancer," World Journal of Biological Chemistry, vol. 6, no. 3, pp. 231-239, 2015. [18] T. Litman, M. Brangi, E. Hudson, P. Fetsch, A. Abati, D. Ross, K. Miyake, J. Resau and S. Bates, "The multidropg-resistant phenotype associated with overexpression of the new ABC half-transporter, MXR (ABCG2)," Journal of Cell Science, vol. 113, no. 11, pp. 2011-2021, 2000. [19] B. Győrffy, P. Surowiak, O. Kiesslich, C. Denkert, R. Schäfer, M. Dietel and H. Lage, "Gene expression profiling of 30 cancer cell lines predicts resistance," Int J. Cancer, vol. 118, pp. 1996-1712, 2006. [20] M. Kubista, J. Andrade, M. Bengtsson, A. Forootan, J. Jonák, K. Lind, R. Sindelka, B. Sjögreen, L. Strömbom, A. Ståhlberg and N. Zoric, "The real-time polymerase chain reaction," Molecular Aspects of Medicine, vol. 27, no. 2-3, pp. 95-125, 2006. [21] S. Masri, S. Phung, X. Wang, X. Wu, Y. Yuan, L. Wagman and S. Chen, "GenomeWide Analysis of Aromatase Inhibitor-Resistant, Tamoxifen- Resistant, and Longerm Estrogen-Deprived Cells Reveals a Role for Estrogen Receptor," Cancer Research, vol. 68, no. 12, pp. 4910-4918, 2008. [22] Á. Semsei, O. Lautner-Csorba, N. Kutszegi, G. Schermann, O. Eipel, A. Falus, C. Szalai, T. Kovács and D. Erdélyi, "A gyermekkori akut limfoid leukémia farmakogenetikája egy gyógyszermellékhatás példáján," Magyar Tudomány, vol. júniusi melléklet, pp. 90-97, 2012.

34

11.Mellékletek 11.1 Doxorubicin-rezisztenciához kapcsolódó gének: ABCC1 ABCC2 ABCC6 ABCB1 ABCG2 LRP1 RALBP1 SOD1 SOD2 SOD3 TOP1 MAD1L1 MAD2L2 BUB-1 BUB-3 APC HMGB1 CYP1A1 CYP1A2 GSTP1 EPHX1 CDKN1A TOP2A ATM CDK2 MYC BRCA1 BRCA2 TP53

felregulálódik rezisztencia során

expressziója csökken rezisztencia során

PGP fehérje kifejezése, gyógyszerek kipumpálása a sejtből szerves anionok kipumpálása a sejtből gyógyszer sejtben való egyenlő eloszlatásáért felelős gyógyszer sejtből való kipumpálása gyógyszer sejtből való kipumpálása receptor, apoptózis során endocitózisért és fagocitózisért felel többek között doxorubicin transzporter Reaktív oxigén gyökök elpusztítása szuperoxid anion gyökök elpusztítása szuperoxid gyökök hidrogén-peroxiddá és oxigénné alakítása topoizomerázt kódol, a replikáció során játszik szerepet mitotikus orsó chekpoint-fehérje DNS-javító mechanizmusokban vesz részt mitotikus checkpoint-fehérje mitotikus orsó összeszerelődésének checkpoint fehérjére tumor-szuppresszor fehérje tisztázatlan, de megfigyelték kapcsolatát a rezisztenciával citokróm p450 enzimeket fejez ki, doxorubicin inaktiváció citokróm p450 enzimeket fejez ki, doxorubicin inaktiváció emésztőenzimet fejez ki mely vízoldékonnyá teszi a DOX-ot reaktív vegyületeket tud inaktiválni, így a DOX-ot is p53-függő apoptózis inhibitora topoizomerázt kódol, a replikáció során játszik szerepet p53 csak a jelenlétében tud aktiválódni, apoptózis-regulátor sejtciklusszabályozásban vesz részt, a sejt nem kerül S fázisba transzkripciós faktor, hiánya rontja a sejt apoptózis-válaszát DNS-javításban vesz részt DNS-javításban vesz részt apoptózist indít

Ábrán alkalmazott jelölések magyarázata: zöld háttér: rezisztenciával ellenkező irányba változik a génexpresszió anasztrozol kezelés hatására, piros háttér: rezisztencával egy irányba változik a génexpresszió anasztrozol kezelés hatására, fehér: nem hat a gén expressziójára

11.2 qPCR reakcióhoz tervezett primerek TOP2A:

35

BRCA1:

BRCA2:

11.3 qPCR mérések eredménye MCF-7: Ct értékek kontrol Test- 0,1 nM Test- 0,5 nM Test- 1 nM Test- 5 nM Test- 10 nM

TOP2A 19,48 19,41 20,72 19,45 18,92 18,92

BRAC1 21,03 21,36 22,17 20,92 20,62 19,94

BRAC2 22,29 22,35 23,41 22,44 21,95 21,43

RPLP0 14,62 14,47 15,48 14,88 14,17 13,84

MDA-MB-231: Ct értékek kontrol Test- 0,1 nM Test- 0,5 nM Test- 1 nM Test- 5 nM Test- 10 nM

TOP2A 20,66 18,60 19,27 18,74 17,99 21,27

BRAC1 21,47 20,29 21,23 20,86 20,54 22,04

BRAC2 23,54 22,64 23,16 23,14 21,88 25,42

RPLP0 14,50 13,65 14,78 13,86 14,18 15,61

*mindkét sejtvonalnál a háromszor végzett mérés átlageredményei

36