Celiakie Histopatologická diagnostika. (bakalářská práce)

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové katedra biologických a lékařských věd

Celiakie – Histopatologická diagnostika (bakalářská práce)

Hradec Králové, 2013

Eva Kalánková

Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.

datum

podpis

Ráda bych poděkovala svému vedoucímu práce panu Doc. Vladimíru Semeckému za cenné rady a připomínky při zpracování mé bakalářské práce. Dále také děkuji histologické laboratoři oddělení patologie v Ústřední vojenské nemocnici v Praze, zejména MUDr. Marii Novákové za ochotu a vstřícnost při poskytování záznamů z archivu hodnocených pacientů.

OBSAH:

Obsah……………………………………………………………………………………………………...4 Souhrn, Summary………………………………………………………………………………………...6 Cíl práce – Zadání...…………………………………………………………………………………..….8

TEORETICKÁ ČÁST 1. CELIAKIE 1.1. Definice…………………………………………………………………………………………….…9 1.2. Lepek………………………………………………………………………………………………..10 1.3. Historie………..…………………………………………………………………………………….11 1.4. Prevalence onemocnění………………………….……………………………………………….13 1.5. Formy celiakie………………………………………………………………………………...……14 1.6. Příznaky onemocnění celiakií………………………………………………………………….…15 2. DIAGNOSTIKA CELIAKIE 2.1. Vyšetření – laboratorní diagnostika………………………………………………………………17 2.2. Sérologické testy………………………………………………………………………..…….……19 2.2.1. Antigliadinové protilátky – AGA (Anti-gliadin antibodies)……………………..…...19 2.2.2 Protilátky ke tkáňové transglutaminase – atTG (Anti-tissue transluglutaminase)…………………………………………………………………………………......20 2.2.3. Protilátky k endomysiu – EMA (Endomysial antibodies)…………………………...20 2.3. Biopsie……………………………………………………………………………………….……...20 2.3.1. Enterobiopsie…………………………………………………………………..............20 2.3.2. Endoskopie…………………………………………………………………….………..21 2.4. Charakteristika diagnostiky…………………………………………………………………….…22 2.5. Léčba a prognóza…………………………………………………………………….……………24 3. CHARAKTERISTIKA GASTROENTEROLOGICKÝCH PROBLÉMŮ 3.1. Anatomie a fyziologie tenkého střeva…...………………………………………...…………….26 3.2. Patologické nálezy……………………………………………………………………………..….28

PRAKTICKÁ ČÁST 4. MATERIÁL A METODIKA 4.1. Cíle praktické části…………………………………………………………………………...……30 4.2. Histopatologické metody………………………………………………………………………….30 4.2.1. Fixace bioptického materiálu………………………………………………………....31 4.2.2. Přikrojení a technické zpracování tkáňového vzorku……………………………....32 4.2.3. Zalévaní a krájení tkáňového bločku……………...……………….……………...…33 4.2.4. Barvící metody…………………………………………………………………….……35 4.2.5. Imunohistochemie…………………………………………...………………..............38

4.3 Mikroskopická diagnostika histologických preparátů………..……………………………….....39 4.3.1. Postupy mikroskopování preparátu……………………….………………………….39 4.3.2. Marshova klasifikace……………………………………………………………..........41 4.4 Přehled všech zkoumaných pacientů…………………………………………………………….43 5. VÝSLEDKY 5.1. Výsledky pacientů se stanovenou diagnozou celiakie……………………….........................45 5.2. Statistické hodnocení Marshovy klasifikace u žen…………………………………………..…48 5.3. Statistické hodnocení Marshovy klasifikace u mužů…………………….……………………..49 5.4 Vizualizace Marshovy klasifikace……………………………………………………….………..50

6. DISKUZE……………………………………………………………………………….……………..53 7. ZÁVĚR……………………………………….……………………………….…………………….…55 8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY………………………………………………….....................57

SOUHRN Celiakie je onemocnění spojené s permanentní nesnášenlivostí lepku, který je součástí některých obilnin. Příznaky onemocnění jsou často nenápadné a formou průběhu atypické. Zavedením citlivých metodik v podobě důkazu sérových markerů došlo k odhalení nových pozitivních případů. Například zvyšující se intenzita screeningu celiakie v populaci dětí i dospělých je onemocnění v Česku stále poddiagnostikované. Bakalářská práce se zabývá histopatologickou diagnostikou. Jde o laboratorní a patologickou korelaci 329 pacientů. Naši cílem bylo poukázat na rizikovou skupinu osob a počet zastoupení

typů

onemocnění

celiakií

dle

Marshovy

klasifikace.

Toto

onemocnění se může svými příznaky projevovat od samého začátku až po samotný relaps. Všechny osoby prodělaly gastroduodenoskopické vyšetření a byli jim odebrány vzorky tkáně sliznice sestupného duodena. Mikroskopicky jde o nález s typickým slizničním poškozením pro celiakii, který je vyjádřen histologickou klasifikací dle Marsha. Závěrem ve smyslu histopatologického vyšetření dokumentujeme nález odpovídající celiakii. Na základě našich dosavadních zkušeností existuje několik doproučení. Nejprve v cíleném screeningu stanovit autoprotilátky k tkáňové transglutamináze. Pokud je totiž vyloučená infekční příčina, symptomy jsou dlouhodobé. A pokud je u příbuzenstva nemocný s celiakií, mělo by být toto vyšetření první volbou a při negativním by se mělo opakovat. Dalším krokem by mohla být biopsie duodenální sliznice, neboť toto je stále osvědčeným postupem v diagnostice celiakie. Metodika s odběrem jednoho vzorku v jedné lokalizaci může ale vést k chybnému závěru. Pro diagnózu celiakální sprue je přínosnější Marshova klasifikace, která vychází ze zjištění, že intraepiteliální infiltrace lymfocyty je prvním histologickým znakem celiakie a změny architektury jsou až následkem poškození enterocytů.

SUMMARY Celiac disease is associated with a permanent intolerance to gluten, which is included in some cereals. Symptoms of the disease are often subtle and atypical form of the course. The introduction of sensitive methodologies in the form of evidence of serum markers were revealed new positive cases. For example, increasing the intensity of population screening for celiac disease in children and adults, the disease is still under diagnosed in the Czech Republic. This thesis deals with the histopathologic diagnosis. These laboratory and pathological correlation 329 patients. Our aim was to highlight the risk group of persons and the number of types of representation celiac disease according to Marsh classification. This disease can manifest their symptoms from the very beginning

to

the

very

relapse.

All

persons

who

have

undergone

gastroduodenoskopické examination and they were sampled tissues lining the descending duodenum. Microscopically for the discovery of mucosal damage typical for celiac disease, which is expressed by Marsha histological classification. Finally, in terms of documenting the histopathological examination findings consistent with celiac disease. Based on our experience, there are several doproučení. First, the targeted screening to determine autoantibodies to tissue transglutaminase. If there is no infectious cause, symptoms are prolonged. And if the relatives sick with the disease should be the first choice examination and a negative should be repeated. The next step would be a biopsy of duodenal mucosa, as this is still a best practice in the diagnosis of celiac disease. The methodology of collection of one sample in one location but may lead to erroneous conclusions. For the diagnosis of celiac sprue is beneficial to Marsh's classification, which is based on the finding that intraepithelial lymphocyte infiltration is the first histological sign of celiac disease and architectural changes are a result of damage to enterocytes.

CÍLE PRÁCE - ZADÁNÍ Téma této bakalářské práce „histopatologická diagnostika“ jsem si vybrala kvůli tomu, abych vysvětlila problematiku kompletního vyšetření onemocnění celiakií. Poukáži na komplikovanost celého procesu diagnostiky od odebrání vzorku, až po zvolení konkrétní léčby. V teoretické části nejprve popíši všechny souvislosti, léčebné postupy a termíny, které se celiakie a její diagnostiky týkají. Ve výzkumné části pak podrobně rozeberu jednotlivé aspekty diagnostiky celiakie a na základě kazuistiky pacientů porovnám výsledky vyšetření. Už z teoretických poznatků vyplývá, že celiakie je nebezpečné onemocnění. Je to vrozená celoživotní nesnášenlivost lepku. Nejčastěji postihuje tenké střevo a to jeho druhou část, kterou nazýváme lačník. Na sliznici tenkého střeva dochází k vymizení slizničních klků. Takto může nastat nedostatečné vstřebávání bílkovin i tuků, vitamínů a železa a hlavně může být porušeno trávení složených cukrů. Je potřeba upozornit, že celiakii nelze vyléčit, ale lze ji úspěšně léčit. Jediným a dostatečným léčebným opatřením je úplné vynechání lepku ze stravy, a to bezlepková dieta. Těžištěm práce je mikroskopická diagnostika tohoto onemocnění a posouzení změny zdravé tkáně od té postižené celiakií. Dále je to statistické vyhodnocení výsledků pacientů s celiakií diagnostikovanými na pracovišti patologie

Ústřední vojenské

nemocnice Praha.

Z toho

nám

vyplyne

percentuální zastoupení pacientů s pozitivní diagnosou celiakie z testovacího souboru pacientů. Cílem této práce je tedy popsat rutinní i nerutinní histopatologické metody a postupy, které zahrnují zhotovení preparátu z tkáně tenkého střeva, ale i mikroskopickou diagnostiku celiakie. Touto bakalářskou prací bych chtěla zjistit, v jak velké míře se v české populaci vyskytují dílčí typy ceilakie dle Marshovy klasifikace a které skupiny obyvatel tímto onemocněním trpí nejvíce. Rozděleni budou jak podle věku tak i pohlaví. Toto téma jsem si vybrala kvůli tomu, že přibývá nemocných právě s celiakií a na našem pracovišti se těmito diagnostikami zabýváme v čím dál větší míře.

1. Celiakie 1.1. Definice

Celiakie je autoimunitní enteropatie indukovaná nesnášenlivostí Iliadinu, která postihuje primárně sliznici tenkého střeva. K typickým klinickým příznakům obvykle patří chronické průjmy, hubnutí, únava, slabost, bolesti břicha a aftózní stomatitida. Atypické (extraintestinální) příznaky zahrnují bolesti kostí,

stagnaci

růstu,

hyposplenizmus,

opožděnou

pubertu,

infertilitu,

opakované potraty, kožní projevy, anémii anebo osteopenii. U mnoha případů je onemocnění asymptomatické nebo se projevuje pouze mírnou únavou či nenápadnou anémií. U tiché (tzv. silent) formy bývá diagnóza celiakie stanovena při vyšetřování jiného základního onemocnění (diabetu, autoimunitní thyreoiditidy, juvenilní revmatoidní artritidy) nebo při vyšetření klinicky zdravých příbuzných pacienta s celiakií. Za velmi obávané komplikace nemoci jsou považovány gastrointestinální karcinomy a lymfomy. Celiakie je tedy celoživotní onemocnění způsobené nesnášenlivostí lepku. Samotné projevy tohoto onemocnění jsou vyvolány autoimunitními mechanismy, které jsou spuštěny vlivem bílkovin-prolaminů. Ty jsou obsaženy v povrchní části obilných zrn žita, ječmene, pšenice a ovsa.(7) Hlavní proteinové složky glutenu jsou gliadin a glutenin, dále pak hordein a secalin, méně pak avenin. Účinkem gliadinu u geneticky vnímavých jedinců následně dochází k slizničním změnám spuštěných přítomností antigliadinových protilátek a protilátek proti tkáňové transglutamináze, které poškozují sliznici a vyvolávají zánětlivý proces, především na sliznici jejuna. Prevalence celiakie je v populaci vysoká, udává se 1:200 až 250. Odhaduje se, že na 1 diagnostikovaného pacienta s celiakií připadá 5 - 7 nepoznaných. Dále bylo také zjištěno, že dochází k nezřetelnému posunu od plně rozvinutých typických forem k formám s minimálními či chybějícími příznaky. Prevalence onemocnění v různých zemích výrazně kolísá. V Dánsku a Spojených státech amerických je 1:10 000 a 1:3 000 ve Švédsku a Velké Britanii. Celosvětový průměr je zhruba 1:3 350. Onemocnění může probíhat v několika formách: celiakie aktivní, tichá, latentní a potenciální. Pro včasnou diagnostiku je nutné brát v úvahu všechny

tyto formy. Je nutné si také uvědomit, že i tzv. tichá či skrytá celiakie zahrnuje postižení střevní sliznice se všemi komplikacemi. V odborné literatuře se dočteme další definice Celiakie. Je to onemocnění, označované v literatuře řadou synonym: celiakální sprue, glutenová enteropatie, primární MAS (malabsorpční syndrom) dospělých, domácí sprue, netropická sprue. Jsou to pouze odlišné názvy pro jednu a tutéž chorobu. Jedná se o vrozenou, celoživotní poruchu tolerance gliadinu, která se může manifestovat v různém období života, a to vlivem různých spouštěcích mechanismů. Onemocnění má nápadnou geografickou epidemiologii s nejvyšší incidencí v Irsku.(14) Aby se choroba projevila, musí mít člověk vrozenou abnormální vnímavost k lepku. To znamená, že se již s touto dispozicí narodí. U takového člověka způsobí lepek chronický zánět sliznice tenkého střeva a vymizení (atrofii) slizničních klků. Nemoc vyvolává zánětlivé postižení oblasti tenkého střeva, nejčastěji jeho druhé části – lačníku, ve kterém probíhá velká část vstřebávání trávené potravy. Zánětlivým procesem může být postižen i dvanáctník. Působením zánětu dochází ke zmenšení střevních klků na podkladě úbytku jeho buněk. Narušeny jsou současně enzymatické procesy. Rozvoj nemoci je rovněž dán genetickými vlivy. Celiakii umíme diagnostikovat a známe poměrně dobře mechanismy jejího vzniku, ale přesto zůstává většina nemocných nediagnostikována.(18) 1.2.

Lepek

Lepek, odborně zvaný gluten, je směsí dvou bílkovin, gliadinu a gluteninu, které se nacházejí společně se škrobem v endospermu semen některých obilnin, především pšenice, ječmene a žita. Lepek je tedy směs bílkovin v povrchní části zrn obilovin. Lepek má zcela zvláštní složení, které nemá obdobu v celé rostlinné říši. Pojmenování „lepek“ pak souvisí s tím, že tato látka způsobuje lepivost těsta. V ovsu sice lepek není, ale některé jeho odrůdy obsahují látky příbuzného složení, které reagují s protilátkami lepku. Celiakie tedy nepochybně souvisí s rozvojem pěstování těchto obilovin, schopných vyvolat autoimunní poruchu. Rozpustnou frakci lepku nazýváme

prolaminy, nerozpustnou gluteniny. Prolaminy pšenice jsou gliadiny, rozpustná frakce žita sekaliny, odpovídající frakce ječmene hordeiny, ovsa aveniny.(19)

1.3.

Historie

Výskyt celiakie je možná překvapivě spojen se vznikem, vývojem a šířením zemědělství, přesněji pěstování obilovin. Nicméně onemocnění celiakií se vznikem zemědělství logicky souvisí. Jeho začátky před 8 000 – 10 000 lety se odkazuje do tzv. „úrodného půlměsíce“, tj. do části Turecka, Iráku a Íránu. Po

zavedení

obilných

produktů

do

lidské

výživy

probíhala

celiakie

pravděpodobně jako těžké onemocnění, které bylo ještě před dosažením reprodukčního věku často smrtelné. Tímto způsobem ustoupila celiakie v průběhu určitého počtu generací dominantní linie a zůstala převážně jen linie recesivní s menší penetrací genetické vlohy u heterozygotů. V rostoucím počtu populací docházelo postupně vlivem modifikovaných genů k větší variabilitě fenotypu a do současného stavu s převahou mimostřevních forem onemocnění, zejména u dospělých osob. Ve 2. stol. n. l. slavný antický lékař Galén jako první popsal tuto nemoc ve spisu Náchylnost k celiakii. Spis vyšel v Evropě až v roce 1856 (původně řec. „koiliakos“). Označení této nemoci nepatří rozhodně až do období moderní medicíny. Souvislost celiakie se zánětlivými střevními změnami pak Galén potvrdil pitvami mnoha nemocných. Roku 1953 americký lékař E. Palmer vynalezl hadičku, kterou bylo možno zavést do tenkého střeva a získat tak vzorek k laboratornímu rozboru. Samuel Gee pak v roce 1888 popsal celiakii podrobněji a konstatoval, že shovívavost k moučným jídlům musí být velmi malá a úprava jídelníčku je součástí léčby. Zároveň se zmiňuje o nepříznivých účincích zejména moučných jídel. Je tedy patrné, že jeho „předpovědi“ byly velice přesné.(8)(14) Dětský lékař C. A. Herter v roce 1908 vydal knihu o celiakii dětí, jelikož se tato choroba projevovala bouřlivěji u dětí než u dospělých. Správně napsal, že tuky snášejí lidé lépe než uhlohydráty. V roce 1918 Sir Frederick Still upozornil na škodlivost chleba. Po 2. světové válce nizozemský pediatr K. W. Dicke ve svých tezích dokázal, že nemocným dětem prospívá pouze vyloučení pšeničné, žitné a ovesné mouky ze stravy. V roce 1950 lékaři z anglického Birminghamu odhalili roli lepku a zavedli bezlepkovou

dietu. J. W. Paulley poprvé popsal abnormalitu střevní výstelky, které si všiml při operaci dospělého. Odhalil abnormalitu střevní výstelky u pacienta s celiakií a současně je birminghamským lékařským týmem v čele s profesorkou Charlottou Andersonovou zjištěn přesný původce, který způsobuje projevy této nemoci – lepek (gluten). Na základě těchto výzkumů je pak bezlepková dieta určena jako základní prostředek v léčbě celiakie. Celiakie patří k řadě dalších onemocnění, o jejíchž projevech nacházíme první zmínky již ve starověku. V tomto případě je to staré Řecko a také některé lékařské spisy z Egypta, kde můžeme objevit nejstarší dochované zmínky o příznacích a průběhu nemoci, které odpovídají projevům celiakie.(23)(21) Od doby průkopnických dietních opatření W. K. Dickeho se výrazně rozšířily znalosti o nutričních potřebách např. aminokyselin, vitamínů, stopových prvků, esenciálních fosfolipidů a esenciálních mastných kyselin. Moderní dieta při celiakii musí tyto nové znalosti a z nich vyplývající nároky na dietu respektovat, a to je příčinou změn v dietních přístupech ve srovnání s obdobím počátků dietologie u tohoto onemocnění.(14) Celiakie proto není uzavřenou kapitolou v oblasti výživy ani z hlediska badatelského, ani z pohledu praktických, klinických a dietetických požadavků. Naopak, nové poznatky z výživy a metabolizmu a nové možnosti dietologie a potravinářských technologií nutí lékaře k zdokonalování léčby tohoto závažného onemocnění dětí i dospělých. Konec 20. století patřil objevům, prokazujícím další imunopatologie v souvislosti s celiakií: Chorzelski objevil protilátky proti retikulinu, Ladinser protilátky proti endomysiu a v roce 1997 zjistil Dieterich, že primárním autoantigenem protilátek proti endomysiu je tkáňová transglutamináza, enzym sloužící k deamidaci glutaminu v gliadinu.

1.4. Prevalence onemocnění

Studie udávají poměr 2:1 v postižení mezi ženami a muži. Celiakie se dědí autonomně dominantně s nekompletní penetrací. Pravděpodobnost výskytu celiakální sprue u příbuzných prvního stupně dosahuje až 20%. Příbuzní druhého stupně s celiakální sprue jsou ale také řazeni do rizikové skupiny tohoto onemocnění. Výskyt celiakie u jednovaječných dvojčat stoupá až na 70% pravděpodobnosti propuknutí choroby. Sloučení celiakie s diabetem závislým na inzulinu se pohybuje v rozmezí 3 až 8%. Diabetes bývá často diagnostikován jako první onemocnění, celiakální sprue se zpravidla k diabetu přidruží později.(8) Podrobné statistiky počtu pacientů s celiakíí nemáme. Patologická pracoviště ani například Ústav zdravotnických informací a statistiky České republiky tato data nesledují. Máme pouze k dispozici kvalifikovaný odhad prevalence v České republice. Na podkladě několika souborů dlouhodobě sledovaných

nemocných

a

jejich

příbuzných,

osob

s

přidruženými

autoimunitními chorobami a screeningových studií činí 1 : 200 až 1 : 250, tj. asi 40 000 až 50 000 nemocných celiakií v celkové populaci ČR. Zatím je však diagnostikováno a odborně sledováno okolo 10 až 15 % z celkového počtu nemocných. Výskyt celiakální sprue je celosvětový, onemocnění postihuje děti i dospělé jedince. Dřívější předpoklad výskytu pouze v dětském věku byl tedy mylný. Pravdivý je však předpoklad výskytu typičtějších příznaků celiakie u dětí a mladistvých než v dospělém věku. To neznamená, že netypické a nenápadné příznaky u dětí nebývají. Výskyt projevů celiakální sprue u dospělých jedinců vrcholí mezi 30. a 40. rokem věku, pozdější výskyt příznaků však není výjimečný. Intenzita projevů celiakální sprue bývá někdy vystupňována po operaci, úrazech, infekčních chorobách, těhotenství, porodu samotném a kojení. Tyto stavy se dají označit jako spouštěcí mechanismy celiakální sprue.(19)(24)

1.5.

Formy Celiakie

Můžeme rozeznat pět forem celiakie. Dělení známe podle Friče, či Mengerové. Jednotlivé formy se od sebe liší charakterem a intenzitou obtíží i histologickým nálezem na střevní sliznici.(24) 1. Aktivní, klasická neboli plně rozvinutá forma: nachází se až u 30 % pacientů. Vyznačuje se kombinací klinických a histologických projevů, je pozitivní imunohistochemické a sérologické vyšetření, může se projevovat typickými či atypickými projevy. Typickými projevy jsou hubnutí, bolesti břicha, průjmy, objemné mastné stolice, slabost, zažívací obtíže, nechutenství, lomivé nehty, různý stupeň podvýživy, bledost. Netypické projevy: zácpa, osteoporóza, osteomalacie, někdy komplikovaná zlomeninami dlouhých kostí, obratlů, intermitentní bolesti břicha, izolovaná elevace jaterních testů, alopecie, neplodnost, samovolné potraty, deprese, slizniční změny a jiné projevy. Dominují tedy střevní příznaky, na sliznici nacházíme pozitivní nález ze střevní biopsie. 2. Tichá celiakie, oligosymptomatická: příznaky jsou málo nebo vůbec vyjádřené, ale nacházíme pro celiakii typický nález na sliznici, který se normalizuje po zavedení bezlepkové diety a pozitivní sérologii. Žádné klinické projevy onemocnění nejsou přítomny, často se vyskytuje pozitivní rodinná anamnéza a celiakální nález na střevní sliznici. 3.

Latentní

forma:

vyznačuje

se

negativním

histologickým

i

imunohistochemickým vyšetřením, ale pozitivní sérologií, často se objevují klinické příznaky, sliznice s normálním nálezem se nachází i přes stravu obsahující lepek. V séru nacházíme pozitivitu protilátek, pacient dobře reaguje na bezlepkovou dietu, dietou bylo již dříve dosaženo úpravy střevního nálezu. Celiakální sprue byla již u nemocných s touto formou celiakie diagnostikována. U části pacientů mohlo dojít jen k přechodné nesnášenlivosti lepku, nebo je lepek dočasně tolerován po léčbě bezlepkovou dietou až do opětovného vytvoření zánětlivých změn na sliznici tenkého střeva. 4. Potenciální forma: je charakterizována negativitou histologie, sérologie i klinických projevů, u těchto pacientů může být přítomno onemocnění, které přímo asociuje s celiakií (např. diabetes) nebo se jedná o pacienta s pozitivní rodinnou anamnézou. Pacient nemá žádné celiakální příznaky, v séru však

mohou být přítomny specifické protilátky. Častý je přechod do jiných forem celiakální sprue. Znak, kterým to poznáme je, že je zvýšený počet IEL nad normu - nad 5IEL/20 enterocytů vrcholků klků. 5. Atypická (mimostřední) forma – výskyt střevních příznaků chybí, v popředí jsou projevy mimostřední a pozitivní nález na střevní sliznici při biopsii.(19) 1.6.

Příznaky onemocnění celiakií

Onemocnění může propuknout kdykoliv, v dětství, v období dospívání, ale i v dospělosti. U dětí a mladistvých nejčastěji brzy po podání stravy obsahující lepek, zatímco u dospělých často až po zátěži organismu. Například u nemocí nebo v těhotenství, navíc příznaky nemusí být zcela zřetelné artralgie, únava, chronická a medikamentózně špatně ovlivnitelná anemie, kazivost zubů, deprese, osteoporóza atd. Klinický obraz může být velmi pestrý, závislý na stupni střevního postižení a stadiu choroby.(25) Jak jsme psali v podkapitole prevalence onemocnění, celiakie se může projevit kdykoliv, i v dospělém věku, nejčastěji pak ale mezi 20. až 30. rokem života. Tato nemoc postihuje ve větší míře ženy než muže, v závislosti na pohlaví se liší také výskyt jednotlivých jejích forem. Zvláštností je při celiakii rozsáhlá paleta příznaků. Ty jsou projevem postižení řady orgánů a systémů, jednak v důsledku globální poruchy funkcí tenkého střeva, a také sdružováním celiakie s jinými autoimunitními chorobami. Z nich bývá nejčastěji zastoupen autoimunitní zánět štítné žlázy, diabetes mellitus závislý na inzulínu, cirhóza jater vzniklá s postižením žlučových cest a další nemoci. U těchto autoimunitních onemocnění mohou dominovat příznaky přidružené choroby a příznaky celiakální sprue bývají jimi zastřeny.(12) Pokud je lepek potravou stále přijímán, mohou vznikat tzv. autoimunitní choroby přidružené, jež postihují různé tělní orgány. Další fáze onemocnění celiakií je charakterizována selháním imunitní odpovědi organismu, jež vede ke vzniku závažných komplikací. Mezi tyto komplikace patří vznik zhoubných nádorů a zhoubná onemocnění vycházejí z lymfatické tkáně. Pozdním stanovením konečné diagnózy se zvyšuje pravděpodobnost propuknutí choroby i se stoupajícím věkem. V současné době se setkáváme s převahou

mimostřevních (atypických) forem celiakální sprue obzvlášť u dospělých jedinců. Typickým příznakem celiakie je chronický zánět sliznice tenkého střeva, neboli Syndrom malabsorbce. Ten způsobí, že některé funkce postižené části tenkého střeva nejsou normální. Porušeno je trávení složených cukrů (např. mléčného, řepného), nedostatečné je vstřebávání bílkovin i tuků, některých vitamínů a železa. Konečným důsledkem je změněná stolice (většinou 3-4 x denně, objemná, zapáchající, s velkým množstvím nestrávených zbytků a tuků), bolesti břicha, nadýmání, nechutenství, úbytek na váze, chudokrevnost. Možných projevů této nemoci, bouřlivých i nenápadných, existuje zvláště u dospělých tolik, že lékařům často trvá i léta, než nemoc odhalí. Celkové příznaky u dětí jsou – pomalý růst, únava, nepřibývání na váze, apatie, neklid, anémie z nedostatku železa, nadýmání, nevolnost, bolesti břicha. Bývá objemná, kašovitá, mastná a velmi zapáchající stolice několikrát denně s nestrávenými zbytky potravy. U dospělých se navíc vyskytuje osteoporóza, bolesti kostí, svalové poruchy, migrény, afty, defekty zubní skloviny, deprese, úzkost, nepravidelná menstruace u žen, neplodnost a jiné. Mimostřevní (atypické) příznaky celiakie jsou: snížení tělesné hmotnosti, chudokrevnost z nejasných příčin, oparovitá zánětlivá onemocnění kůže, metabolická onemocnění kostí, depresivní ladění, úzkostné poruchy, nemoci nervového systému, poruchy menstruace, rozmnožovací poruchy, nízká koncentraci železa v séru, opožděný růst v dětském věku a jiné mimostřevní příznaky. Za typické příznaky celiakie jsou považovány: podvýživa, tělesná slabost, úbytek svalové hmoty kosterního svalstva, otoky kolem kotníků, zánět sliznice dutiny ústní a zánět sliznice jazyka, nezánětlivá onemocnění nervů.

2. Diagnostika celiakie 2.1.

Vyšetření - laboratorní diagnostika

Když lékař konstatuje podezření na celiakii, pošle nemocného na gastroenterologii, kde se zahájí diagnostický program. Tento program obsahuje odběr krve s vyšetřením krevního obrazu, biochemických ukazatelů jako je hladina minerálů, vyšetření hladiny protilátek proti gliadinu, dusíkatých katabolitů, bílkovin, výživných parametrů, orgánových protilátek (protilátky proti endomysinu a retikulinu), vyšetření sérové transglutaminázy (AtTGA).(6) Tyto autoprotilátky se stanovují metodou kvalitativní (tzv. autoprotilátky k endomysiu, AEA) nebo kvantitativně. Kvantitativní metoda je jednodušší, plně automatizována a její významnou předností je také použití jednotného antigenu (rekombinantní lidská tkáňová transglutamináza), což umožňuje srovnávání výsledků provedených na různých pracovištích. Existuje diagnostická metoda finské firmy AniBiotech, což je krevní test podobný těhotenskému, kdy se setře z prstu kapka krve, kápne se na proužek speciálního papíru a za 5 minut se ukáže nebo neukáže přítomnost protilátek k transglutamináze v podobě změny barvy papírku. Spolehlivost je udávaná vysoká 96,3%. Tento test je dostupný v lékárnách.(9)(14) Určení diagnózy celiakie je v mnoha případech dlouhodobou záležitostí. Vzhledem k často nevýrazně se projevujícím příznakům a nutnosti vyloučit jako původce obtíží jiné probíhající onemocnění, může jít i o značný časový úsek. Celiakie může být řadu let skrytá a výrazněji se může projevit až v závislosti na spouštěcím faktoru, například při stresové zátěži, po chirurgickém zákroku, v těhotenství, vlivem infekce apod. V

roce

1990

stanovila

Evropská

společnost

pro

dětskou

gastroenterologii, hematologii a výživu dvě povinná vyšetření. Pouze ten, kdo je absolvuje, si může být stoprocentně jist, že diagnóza je správná a že jediný účinný lék je bezlepková dieta.(14) Sérologické vyšetření krve – touto metodou lze zjistit přítomnost protilátek proti vlastním antigenům. Nejnápadnějším důkazem celiakie je přítomnost autoantigenu k enzymu transglutamináze a dále k endomysiu.

Enterobiopsii se říká vyšetření vzorku střevní tkáně, jež musí následovat za sérologií. Je to tzv. „zlatý standard diagnostiky celiakie.“ Dětem se zavádí trávicí trubicí až do tenkého střeva enterobioptická kapsle, dospělým lidem se dělá klasická gastroskopie plně flexním endoskopem. Odebírá se vzorek sliznice k histologickému vyšetření (biopsie) z druhé a třetí části duodena. Výkon se provádí nalačno, s použitím vhodného sedativa, je nebolestivý a trvá do 10 minut a nepřináší žádná rizika. Pod mikroskopem se ukáže, nakolik je povrch střevní sliznice poznamenaný atrofií klků aj.(11) Vzhledem k tomu, že celiakie je dědičné onemocnění, má vyšetření všech členů rodiny, v níž byla celiakie zjištěna, velký význam především příbuzných prvního stupně – rodičů, sourozenců a dětí. Screening celiakie se doporučuje zejména u těchto osob a chorobných stavů: Příbuzní I. stupně nemocných celiakií (rodiče, sourozenci, děti). Vzhledem ke komplikovanému způsobu dědičnosti je při výskytu dalšího nemocného I. stupně vhodné zvážit screening i u příbuzných II. stupně (prarodiče, strýcové a tety). Dermatitis herpetiformis (Duhringova choroba), chudokrevnost z nedostatku železa, předčasná osteoporóza v mladším věku, neuropsychické abnormality (záněty nervů, poruchy svalové koordinace, deprese a poruchy chování), infertilita (neplodnost) a poruchy reprodukce. Spontánní a opakované potraty jsou častější u neléčených žen, oligospermie a impotence u neléčených mužů. Syndrom dráždivého střeva s průjmem jako vedoucím příznakem (pokud neustupuje po standardní léčbě), diabetes mellitus léčený inzulínem

(DM I

typu),

autoimunitní thyreoiditída,

autoimunitní

hepatitida.(6) Dobře lze alergologicky pojmenovat a vyšetřením prokázat pouze typ A – alergie na lepek díky průkazu protilátek izotopu IgE. Typ B se dá částečně prokázat velmi specializovaným vyšetřením střevní sliznice, což vyžaduje odběr této sliznice (vyšetření enterobioptické – dostupné jen na pracovištích vyššího typu) a dobrou histochemickou laboratoř. Typ C se velmi těžko odliší. Prakticky se neodliší od zkřížené alergie na obilné pyly. Typ D zatím nelze vyšetřením prokázat vůbec, lékař ho může jen tušit.(20) Přesná diagnostika celiakie je dosažena následujícími současnými diagnostickými směrnicemi a má na paměti, že intestinální biopsie zůstává stále jediným obecně přijatelným zlatým standardem diagnostiky. Stanovení je

založené na doporučení odbornou společností ESPGAN (European Society for Paediatric Gastroenterology and Nutrition = Evropská společnost pro dětskou gastroenterologii a výživu), dále NASPGHAN (North American Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition = Severoamerická společnost pro dětskou gastroenterologii, hematologii a výživu) (Briani a kol, 2008). Sérologicky se stanovují protilátky třídy IgA a IgG proti gliadinu, protilátky třídy IgA ke tkáňové transglutaminase a endomysiu. Pokud jsou výsledky testů pozitivní, je doporučena enterobiopsie. Ta se provádí ještě u neléčeného pacienta, aby se ukázalo, zda je sliznice porušena či nikoliv.

2.2. Sérologické testy 2.2.1. Antigliadinové protilátky – AGA (Anti-gliadin antibodies)

Detekce protilátek třídy IgA a IgG proti gliadinu (AGA) jsou nejčastěji a nejdéle používanými sérologickými markery. ELISA metody detekce AGA jsou běžně dostupné a z uvedených markerů celiakie jsou AGA nejlevnější. Měření AGA je vhodné pro dlouhodobé sledování aktuálního stavu pacienta dodržujícího bezlepkovou dietu. Ukazuje se, že IgG AGA dosahují lepší citlivosti, ale zároveň menší specificity v porovnání s IgA AGA (Pietzak, 2005).(14)

2.2.2. Protilátky ke tkáňové transglutaminase – atTG (Anti-tissue transluglutaminase)

Protilátky třídy IgA ke tkáňové citlivosti (tTG), jsou pro diagnostiku velmi přínosné, neboť poskytují dostatečnou citlivost a specificitu za rozumnou cenu. Pozitivní test na protilátky IgA tTG vede k odebrání histologického vzorku tenkého střeva. Pokud je test negativní, ale symptomy napovídají, že se jedná o celiakii, bývá doporučen test na IgG tTG. Je to z toho důvodu toho, že zhruba 3 procenta pacientů celiaků mají IgA deficienci. Stanovení protilátek ke tkáňové

transglutaminase (atTG) má velmi vysokou diagnostickou efektivitu (senzitivita 87-97 % a specificita 88-98 %) (Kocna Gastrolab, internetový odkaz)(9)

2.2.3. Protilátky k endomysiu – EMA (Endomysial antibodies)

Endomysium je pojivový protein hladkého svalstva nacházející se mezi myofibrilami. Pro stanovení protilátek proti endomysiu se používá metoda nepřímé imunofluorescence. Jako substrát se používá například svalovina opičího jícnu. Průkaz EMA protilátek by měl být proveden v několika ředěních vzorku séra od 1:5 (pro základní screening) až 1:40 (průkaz onemocnění). Vzhledem k finanční náročnosti testu je většinou prováděno hodnocení pouze v jediném ředění, nejčastěji 1:20. Vyhodnocení fluorescence v mikroskopu není zrovna jednoduché a vyžaduje dlouhodobé zkušenosti. Endomysiální protilátky jsou rovněž velmi spolehlivým markerem celiakie (citlivost 83-95 % a specificita 94-99 %) (gastrolab).(18)

2.3. Biopsie Biopsie malého vzorku tenkého střeva se provádí dvěma metodami. A to častější enterobiopsií nebo méně častou hloubkovou duodenoskopií. 2.3.1 Enterobiopsie Enterobiopsie je navzdory příchodu klinicky přesných sérologických testů stále důležitým vyšetřením vedoucím k vyvrácení nebo potvrzení celiakie. Může být také prováděna u rizikových pacientů, kteří mají sice sérologické testy negativní, ale lékař má velké podezření na toto onemocnění. Enterobiopsie se provádí i u pacientů trpících kožní formou, Duhringovou herpetiformní dermatitidou. Změny na střevní sliznici se mohou velice lišit: počínaje od částečné po totální atrofii klků. Mohou se také objevovat rozptýlená ložiska atrofovaných klků po celé délce tenkého střeva. Ukazatelem bývá i vysoká koncentrace epiteliálních lymfocytů.

Enterobiopsie se provádí za úplného vědomí, pouze u dětí se podávají sedativa. Ústy se vpraví do těla bioptická kapsle, která je připevněna na vodič. Posouvá se skrze jícen a žaludek až do duodena (dvanáctníku), což je první oddíl tenkého střeva. Na rozdíl od endoskopie, bioptická kapsle se může zavést až do jejuna (lačníku), kde je atrofie klků pravděpodobnější a pro diagnostiku přesnější. Poloha kapsle v trávící trubici se kontroluje pomocí rentgenových snímků břišní dutiny. Když je kapsle na správném místě v jejunu, působením podtlaku se kapsle otevře a odřízne se bioptický vzorek sliznice. Po vytáhnutí kapsle ven se zkontroluje, zda byl vzorek odebrán. Pokud ano, zašle se k histologickému vyšetření. Vzorek vyhodnocuje patolog.(20) 2.3.2 Endoskopie

Za částečného znecitlivení lékař vede dlouhou úzkou trubici, zvanou endoskop, skrze pacientova ústa, jícen a žaludek až do duodena. Endoskop má kameru, takže vyšetřující lékař přímo vidí, v které části trávícího systému se právě nachází. Endoskop se dostane nejdále na konec duodena. Oproti enterobiopsii může endoskopie vykazovat falešně negativní výsledky, protože se zánět může vyskytovat zatím jen v jejunu. Bioptický vzorek za pomoci mikroskopu vyhodnotí patolog.

2.4. Charakteristika diagnostiky

Jestliže jsou morfologické změny při celiakii typické, jsou nespecifické a koněčná diagnóza je klinickopatologická. V morfologii celiakie je stále více diskutabilních otázek týkající se zejména počtu intraepiteliálních lymfocytů, poměru výšky klků a krypt jako místa odběru biopsie.

Histomorfologie neléčené celiakie: Typický nález je charakterizován zmnoženými intraepiteliálních lymfocytů (IEL), hyperplazií krypt a atrofií klků. Stupeň těchto změn však může být velmi variabilní – od architektonicky normální sliznice se zmnoženými IEL, až po totální atrofü a kryptální hyperplazü. Tradičně je popisována nejtěžší postižení sliznice orální částí tenkého střeva s mírnějšími změnami aborálně. Klinické symptomy nejsou závislké od histologického stupně poškození sliznice, ale od celkového

rozsahu

(délky

poškozené

sliznice).

Kompenzované

mírné

poškození dostatečně dlouhého segmentu střeva se může klinicky projevit až při dodatečném inzultu (např. infekce, ischemie, zkrácení střeva).(6) Zvýšení počtu IEL je považované za nejkonzistentnější a nejvčasnější změnu. V současnosti používaná horní hranice normálního počtu IEL v sliznici tenkého střeva je 40 IEL na 100 epiteliálních buněk (EB). Tato hodnota však byla odvozená v sedmdesátých letech z biopsií jejuni. Později stanovený limit pro sliznici duodéna je 20-25 IEL. Tyto o velmi nižší normální hodnoty jsou však v praxi jako v publikované literatuře nepochopitelně ignorované. Formální počítání IEL v 100 až 1000 EB je časově velmi náročné a v rutinní diagnostice nepraktické. Rychlejší skreeningovou metodou může být počítání IEL na 20 EB ve špičce 5-10 klků. Citlivou skreeningovou metodou je posouzení ztráty normálního „decrescendo“ vzoru rozložení IEL. V normální sliznici počet IEL klesá do báze klku směrem k špičce („decrescendo“ vzor). U celiakie je tento vzor narušený a IEL jsou rovnoměrně rozložené po celé délce klku. Na přesné zhodnocení počtu a distribuce IEL je možno v hraničních případech použít imunohistochemickou detekci IEL pomocí protilátky anti-CD3. Vysoký počet CD3+ IEL ve špičce klků k počtu IEL báze klků >1,7 je sugestivní pro diagnózu celiakie. Pro běžnou praxi je taková metodika pro svoji náročnost nevhodná a běžně se neprovádí.

Hyperpláze krypt předchází atrofii klků. Výsledkem hyperplazie je, že například atrofii klků se celková výška sliznice podstatněji nemění. Krypty obsahují pekurzorové pluripotentní buňky, které jsou zdrojem enterocitů a pohárkových buněk při obnově sliznice. Při neléčené celiakii je růstová funkce buněk v kryptách měřená imunohistochemicky pomocí protilátky MIB-1 (detekující antigen prolirefurujících buněk Ki_67) signifikantně vyšší než při léčené celiakii anebo u zdravých kontrol. O použití imunohistichemie s protilátkou detekující Ki_67 však platí stejné konstatování jako v případě detekce IEL pomocí anti-CD3 protilátky. Atrofie klků je považována za nejtypičtější znak celiakie. Normální poměr výšky klkov k hloubce krypt je však ještě stále předmětem sporů. Jsou udávané hodnoty 3-5:1 až 1,2-2,46:1. U dětí je udávaná hodnota 2,5:1 a více. Vzhledem k chybějícím jednoznačných referenčních hodnot jako metodického doporučení týkajícího se způsobu hodnocení (odhadem patologa anebo přesnějšími morfometrickými metodami) je nutné považovat hodnocení atrofie klků, především mírnějšího stupně, za vysloveně subjektivní. Dalšími změnami popisovanými u celiakie, avšak s limitovaným diagnostickým významem je snížená výška entrocytů, pyknóza a ztráta bazální orientace jader enterocytů s pseudostratifikací, snížení počtu pohárikových buněk, redukce výšky mikroklkov, zmnožení chronického zánětlivého infiltrátu v lamina propria (hlavně plazmatických buněk a eozinofilov) a sporadická příměs neutrofilních granulocytů.(9)

Klasifikace histomorfologické léčené celiakie: Klinická odpověď na bezlepkovou dietu je ve většině případů rychlá, většinou jsou to dny až týdny. Ve starších i celkem nových studiích bylo dokázáno, že u dětí i dospělých úprava histologického nálezu trvá mnoho měsíců a ne u všech pacientů dojde k úplné normalizaci. I při dobré spolupráci pacienta, klinické remisi a negativitě protilátek má po přiměřené době dva roky přibližně 74% dětských pacientů a asi 17,5% dospělých pacientů histologicky normální sliznici. Většina pacientů má zvýšený počet IEL anebo mírnou atrofii klků. Serologické markery celiakie mají nízkou negativní prediktivní hodnotu v předpovídání morfologie střeva při bezlepkové dietě. Ve studii 87 dospělých pacientů na bezlepkové dietě mělo 27 pacientů atrofii klků (Marsh typ 3),

přičemž protilátky proti tkáňové transglutamináze byly negativní až u 16 z nich, což bylo 59%. Význam přetrvávajicích histologických změn při bezlepkové dietě v současnosti není znám. Remise celiakie je oproti minulosti definovaná spíše na klinickém podkladu – vymizení symptomů a normalizace laboratorních parametrů. AGA ve svých doporučeních uvádí, že „po 3-4 měsících bezlepkové diety může být zopakovaná biopsie tenkého střeva na důkaz zlepšení morfologie“. NASPGHAN opakovanou biopsii nedoporučuje. Avšak například u dítěte nedojde k zlepšení symptomů anebo jsou pochybnosti o správnosti diagnózy, opakovaná biopsie je potřebná na výlučně jiné příčiny těžkostí, případně může být nevyhnutelná opakovaná biopsie po dietě obsahující glutén (gluténová výzva – „gluten challenge“).(11)

2.5. Léčba a prognóza

Neléčená celiakie je závažným a v krajním případě život ohrožujícím onemocněním. Nejzávažnějším problémem může být včasné nerozpoznání choroby s následnými četnými širokospektními slizničními změnami a komplikacemi. Naopak u pacientů s včasně diagnostikovanou a dobře léčenou celiakií a správně vedenou dietou je prognóza velmi dobrá. Mezi komplikace onemocnění patří, kromě již zmíněných reprodukčních, gynekologických, metabolických, krevních a kostních aj. komplikací, především maligní IgA lymfom tenkého střeva až perforace střeva, případně dochází k úplnému selhání střevní absorpce živin s projevy protahovaných průjmu vyžadujících parenterální výživu. Zmíněným rozsáhlejším komplikacím lze částečně předejít správnou léčbou a dietou.(21) Další jednotkou je tzv. refrakterní sprue, která se projevuje obdobně jako celiakie, avšak nereaguje na bezlepkovou dietu. Může se vyskytovat u pacientů, kteří nedodržují dietu a celiakie tzv.“přestala reagovat na bezlepkovou stravu“. Celiakii ovšem vyléčit nelze. Vzhledem k tomu, že spouštěčem je lepek, je jedinou kauzální léčbou celoživotní bezlepková dieta, kterou je nutno dodržovat plně a trvale i v klinicky bezpříznakovém období. Po nastavení diety dochází k úpravě příznaků, obnovení struktury sliznice a nakonec i k

normalizaci sérologických testů, čehož lze využít i při kontrolní monitoraci dodržování diety u non-compliantních pacientů. Je opravdu nutné vyloučit všechny potraviny obsahující mouku z obilných zrn pšenice, žita, ječmene i ovsa. Nejednou se setkáváme s případy intolerance laktózy v aktivním období onemocnění. Někdy je vhodné dočasně omezit ve stravě i potraviny z mléčných výrobků. Laktáza je enzym ve střevních klcích štěpící mléčný cukr - laktózu. Laktáza je velmi citlivým indikátorem a v případě zánětu či bakteriálních infekcí mizí jako první a dochází k intoleranci laktózy. Samotná bezlepková dieta je zcela plnohodnotná a obsahuje všechny potřebné vitaminy, minerály, vlákninu. V závažných případech je nutné tyto látky na počátku léčby aktivního stadia substituovat parenterálně, často jen přechodně. Nedodržování diety byť občasné může vyústit až k rozvoji komplikací. Stejně tak neplatí i mýtus, že bezlepkovou dietu u pacienta s celiakií diagnostikovanou v dětském věku můžeme vysadit v období dospívání. Dieta je tedy celoživotní.(22)

3. Charakteristika gastroenterologických problémů 3.1. Anatomie a fyziologie tenkého střeva

Tenké střevo je dlouhé asi 3,5-5 m. Je to nejdelší část zažívacího traktu. První oddíl tenkého střeva – dvanáctník – je anatomicky, funkčně i onemocněními řazen k žaludku. Uložen je především retroperitoneálně, další dva oddíly – lačník a kyčelník (jejunum a ileum) jsou uloženy pouze intraperitoneálně, zavěšeny v mezenteriu. Mezenterium fixuje tenké střevo na zadní stěnu břišní, mezenteriem přistupuje ke střevu krevní a lymfatické zásobení. Zásobení tepennou krví se děje téměř výlučně cestou arteria mesenterica superior.(16) Dvanáctník - duodenum má tvar přibližně písmena C a je dlouhý 2530cm. Jeho začátek je za pylorem, je rozšířený a tvoří tzv. bulbus. Následuje sestupná část (D2), která je uložená vpravo od těla obratle L2, načež se opět otáčí doleva a vzhůru krátkým vzestupným úsekem a duodenojejunálním ohybem přechází v jejunum. Sliznice duodena je složena z četné příčné řasy, pouze na mediální stěně sestupné části je vytvořena podélná řasa, kde je vyvýšenina – papilla Vateri, kde do duodena ústí vývod slinivky břišní a žlučovod. V submukóze jsou četné submukózní Brunnerovy žlázky, jejichž sekret společně s alkalickou pankreatickou šťávou a žlučí neutralizuje kyselou žaludeční šťávu, která do duodena proniká s potravou. Lačník – jejunum je asi 2 m dlouhý úsek tenkého střeva, ve kterém probíhá největší resorpce natrávené potravy. Pro zvýšení resorpční plochy je sliznice složena v četné příčné řasy (Kerckringovy řasy), ze kterých ještě vybíhají četné drobné klky. Jsou v ní drobné žlázky a mízní uzlíky. Hladká svalovina je uspořádána ve vnitřní cirkulární a zevní podélnou vrstvu a je, stejně jako v ileu, v celém rozsahu kryta serózou. Kyčelník - ileum je o něco delší než jejunum, cca 3,5 m. Slizniční řasy jsou méně četné, ale je zde větší množství lymfatické tkáně. Ve vzdálenosti 80120 cm od vyústění ilea do tlustého střeva se asi u 5% populace nachází výchlipka, Meckelův divertikl, což je zbytek po embryonální dučeji k pupku. Jejunum i ileum jsou zavěšeny na okruží, mesenteriu, v něm do střeva přicházejí tepny, větve arteria mesenterica superior, procházející žíly vedou do

povodí vena portae přes vena mesenterica superior, a mízní cévy s četnými uzlinami, jdoucí do cisterna chyli jako truncus intestinalis.(17) Stěna tenkého střeva je složena, tak jako jiné části zažívací trubice, ze čtyř vrstev: ze sliznice, z podslizničního vaziva, ze zevní vrstvy svalové a ze serózy. Sliznice spolu s podslizničním vazivem se skládá z příčné kruhovité řasy. Povrch sliznice je dále rozčleněn na velký počet prstovitých výběžků, zvaných stření klky. Záhyby mezi klky se prohlubují v Lieberkünovy krypty. Sliznice se skládá z epitelu, vaziva slizničního a ze svaloviny slizniční. Epitel pokrývající povrch klků a vystýlající Lieberkühnovy krypty je tzv. epitel resorpční. Ten se skládá z jedné vrstvy vysokých cylindrických buněk, opatřených na povrchu žíhaných lemem, který je složen z velkého počtu tenoučkých cytoplazmatických výběžků, zvaných mikroklky. Mezi buňkami resorpčního epitelu, zvanými též enterocyty, jsou jednotlivě roztroušeny buňky pohárkové, vylučující hlen. Dna Lieberkühnových

krypt

jsou

vystlána

buňkami

Panethovými,

jež

mají

v cytoplazmě nad jádrem granula, barvící se silně kyselými barvivy. Mezi buňkami epitelu střevní sliznice, zejména v Lieberkühnových kryptách, jsou jednotlivě roztroušeny buňky endokrinní. Nejvíce jich je v duodenu. Dále se vyskytují mezi epitelovými buňkami střevní sliznice buňky enterochromafiní vylučující serotonin. Pod svalovinou slizniční je uložena silnější vrstva vaziva podslizničního, složená z kolagenního vaziva s pleteněmi krevních a lymfatických cév as podslizniční pletení nervovou. Zadní vrstva svalová se skládá ze dvou vrstev hladkého svalstva, vnitřní kruhovitě uspořádané a zevní podélně uspořádané. Mezi oběma vrstvami probíhají pleteně vegetativního nervstva. Povrch střeva pokrývá seróza.(26) Od obecné stavby trávicí trubice se stěna tenkého střeva liší především úpravou sliznice, která vybíhá ve slizniční řasy a v drobné paličkovité výběžky – klky. Touto úpravou se mnohonásobně zvětšuje vnitřní povrch tenkého střeva, ve kterém dochází k hlavnímu štěpení a vstřebávání živin. Ohromné množství žláz uložených ve sliznici všech úseků tenkého střeva produkuje střevní šťávu složenou z řady enzymů. Většina nejdůležitějších enzymů se ale do tenkého střeva dostává ve šťávě slinivky břišní. Proto má ve štěpných pochodech největší podíl dvanáctník, kam vývody slinivky ústí. Smršťováním hladké

svaloviny ve stěně tenkého střeva se jeho obsah stále promíchává a posunuje do tlustého střeva. Zastaví-li se pohyb svaloviny ve stěně střeva, vzniká střevní neprůchodnost, která rychle vede k celkové otravě organismu rozpadovými produkty.(17) Funkce tenkého střeva je nezastupitelná. Resekce poloviny tenkého střeva je neslučitelná se životem. Odstranění rozsáhlých úseků tenkého střeva vede k malabsorpci a vzniká celá řada metabolických poruch. Rychlost posunu a tím také doba pobytu tráveniny v žaludku i tenkém střevě je pro různé potraviny různě dlouhá. V tenkém střevě asi 4 hodiny. Tekutiny procházejí trávicí trubicí rychleji. Potraviny obsahující více tuků jsou tráveny velmi pomalu. Odhad doby trávení a místa, kde se v trávicím systému nachází trávenina, má význam při otravách požitím léků, nejvhodnějších potravin a jedů.

3.2. Patologické nálezy

K častým změnám dochází především v tenkém střevě, kde vzniká autoimunitní zánět postihující zejména dvanáctník a jejunum. V dolní části tenkého střeva bývá většinou změn méně. Některé změny jsou patrné pouhým okem při endoskopickém vyšetření. Mikroskopické vyšetření odhalí úbytek střevních klků s poruchou vyzrávání buněk střevní výstelky a také zmnožení intraepiteliálních lymfocitů (IEL). Zastoupení různých typů buněk imunitního systému ve slizničním vazivu je výrazně zvýšeno a je přítomen jeho otok. Tyto změny jsou u jednotlivých klinických forem celiakie vyjádřeny v různé intenzitě a rozsahu (difúzní nebo ložiskové), popř. mohou i chybět. V takových případech je nutno pátrat po jiných mikroskopických známkách aktivity imunitního procesu. Autoimunitní zánět patří k nejčastějším projevům celiakie a způsobuje různě intenzivní poruchu funkcí (trávení, vstřebávání, sekrece a hybnosti). Jejím následkem je komplexní porucha výživy a druhotné změny struktury a funkcí řady orgánů (kůže, nervového systému, pohybového, žláz s vnitřní sekrecí a jiných).

Na kůži se mohou objevit puchýřky podobné oparům rtů. Po rozškrabání se mohou zanítit a vznikne krví zbarvený strup. Toto onemocnění je známo pod názvem – herpetiformní dermatitida (Duhringova dermatitida).(15) Malabsorpce je porucha absorpce živin střevní sliznicí (po resekci střeva, infekci střeva, hyperthyreóze). Projevuje se průjmy. Příčinou je porucha motility střev, porucha sekrece trávicích enzymů, porucha trávení e resorpce.(19)

PRAKTICKÁ ČÁST 4. MATERIÁL A METODIKA 4.1. Cíle praktické části V teoretické části jsme vysvětlili problematiku onemocnění celiakie, vymezili jsme základní pojmy a detailně jsme popsali histopatologickou diagnostiku tohoto onemocnění. V této praktické části dále popíšeme rutinní i nerutinní histopatologické metody a postupy, které jednak zahrnují zhotovení preparátu z tkáně tenkého střeva, ale i mikroskopickou diagnostiku celiakie..

Cíle: ▫ Popsat histopatologické a imunohistochemické postupy na zhotovení preparátu. ▫ Mikroskopická diagnostika tohoto onemocnění a posoudit změny tkáně zdravé od tkáně postižené s celiakií. ▫ Statisticky vyhodnotit výsledky pacientů s celiakii diagnostikovanými na pracovišti patologie ÚVN Praha. ▫ Zjistit procentuální zastoupení podezřelých pacientu na onemocnění celiakie s pozitivní diagnózou.

4.2

Histopatologické metody

Histopatologické metody zahrnují mikroskopické vyšetření tkáně za účelem stanovení resp. potvrzení či zamítnutí diagnózy klinickým lékařem. Aby bylo možné studovat tkáně tenkého střeva, je nezbytné zhotovit preparáty histologickými metodami. Metody histologické techniky byly zpočátku prosté, ale postupem času se zdokonalily a obohatily o metody nové. Histologické preparáty, které zhotoví zdravotní laborant se prohlíží pod mikroskopem.(26) Histologické vyšetření je důležitou metodou pro diagnostiku a závisí na něm další léčba a osud nemocného. Tyto metody jsou užívané nejčastěji na oddělení patologické anatomie a v patologicko - anatomických ústavech.

Postup pro zhotovení histologického preparátu (tenkého střeva) v laboratoři: 1) Příjem vyšetřovaného vzorku 2) Přikrojení tkáně a zhotovení ,,tkáňového bločku‘‘ 3) Technické zpracování ,,tkáňového bločku“ 4) Vlastní zalití tkáně 5) Krájení ,,tkáňových bločku‘‘ 6) Barvení a montování histologických řezů 4.2.1 Fixace bioptického materiálu

Cílem fixace je zachování struktury buněk a tkání tenkého střeva. Během fixace dohází k denaturaci bílkovin protoplazmy buněk, které má zabránit k samovolnému rozkladu tkáně – autolýza. Fixace by měla probíhat rychle a šetrně, aby došlo k stejnosměrnému profixování celého odebraného vzorku. Uložení tkáně ve fyziologickém roztoku nebo v lednici autolýze nezabrání. Při fixaci dochází vždy ke změnám struktury oproti struktuře, jakou má tkáň živá a proto je důležité s výběrem kvalitního fixačního prostředku.(26)

Při výběru fixace tkáně je zapotřebí skloubit do jisté míry protichůdné tendence: ● zachovat barvitelnost tkáně ● zachovat morfologii tkáňových struktur ● rychlé pronikání do tkáně ● zachovat antigenicitu a minimalizovat vznik artefaktů Při postupu fixace tkáně musíme dodržovat několik pravidel: ● Odebraná tkáň musím být fixována co nejdříve, jinak by mohlo dojít k autolýze. ● Tkáňový bloček nesmí být příliš velký( cca o velikosti 1cm), je-li příliš velký neprofixuje se celý, pouze jen jeho povrchová část. ● Fixační tekutiny musí být dostatečné množství, přibližně 50x více než je objem odebraného vzorku

Hlavní druhy fixačních tekutin: - Formol - Fixační tekutina s kyselinou pikrovou - Fixační tekutiny se sublimátem

Formol

neboli

formalín

je

vůbec

nejužívanější

fixativem

v histopatologické a imunohistochemické technice. Jedná se o bezbarvou kapalinu s charakteristickým zápachem (silně dráždí sliznici). Formol je triviální název pro roztok formaldehydu a poskytuje nasycený roztok v koncentraci maximálně 40%. Do laboratoře je transportován v lahvi z tmavého skla a obsahuje malé množství kyseliny mravenčí.(26)(27)

4.2.2 Přikrojení a technické zpracování tkáňového vzorku

Odebraná zafixovaná tkáň pro diagnostiku celiakie je třeba následně zpracovat. Tkáň přichází do histologické laboratoře v řádně uzavřeném a správně označeném kelímku shodné se žádankou. Histologický laborant je povinen při převzetí materiálu ihned zkontrolovat, zda je materiál správně označen. Po přijetí vzorku tenkého střeva do laboratoře se zaznamená do NIS (Nemocniční informační systém). Následuje vlastní přikrojení a zhotovení tkáňových bločků tzv. blokování tkáně. Přikrajování tkání provádí lékař za asistence laborantky. Lékař tkáň makroskopicky zhodnotí. Asistující laborantka zaznamená na žádanku lékařem diktovaný popis tkáně, údaje o množství a dalších postupech zpracování. Je třeba z tkáně připravit takový vzorek, který bude splňovat: ● adekvátní velikost ● bude z místa, které je nutné vyšetřit ● bude dostatečně reprezentativní Během

přikrojení

je

neustále

prováděná

kontrola

přikrajovaného materiálu pro vyloučení záměny vyšetřované tkáně.

označení

4.2.3. Zalévaní a krájení tkáňového bločku

Zalévaní tkáně můžeme rozdělit do čtyř etap: ● odvodnění tkáně- dehydratace ● prosycení tkáně intermiediem (tzn.tekutinou mísitelnou s alkoholem) ● prosycení tkáně rozpuštěným parafínem ● vlastní zalití Přikrojený vzorek dále prochází procesem odvodnění a prosycení tkáně tekutým parafínem. Tkáň se dehydratuje proto, aby tkáň zbavená vody mohla být prosycena tekutým parafínem. Odvodnění tkáně se provádí vzestupnou řadou alkoholů (roztoky etanolu) tzn., že se postupně přenáší tkáňový bloček do etanolu a vyšší koncentraci. Vzestupná řada etanolů nám pomůže se vyhnout smrštění tkáně, k němuž by došlo, kdybychom tkáň vložily do koncentrovaného ethanolu.(26)(1) Odvodnění tkáně zahajujeme 70%, 80%, 90%, 96% etanolem a končíme absolutním alkoholem vysušeným síranem sodným.

Tab.č. 1 Přehled (postup) odvodnění – dehydratace tkáně: Etanol- koncentrace

Doba odvodnění tkáňového bločku

1.

70 %

90 min

2.

80 %

120 min

3.

90 %

90 min

4.

96 %

90 min

5.

100 % (vysušený Na2SO4 )

90 min

6.

100 % (vysušený Na2SO4 )

120 min

Po odvodnění se etanol musí dokonale odstranit, neboť se v něm parafín nerozpouští. K prosycení tkáně používáme intermedium, které je schopno rozpustit parafín a zároveň se smísit se 100% alkoholem. Jestliže etanol zůstane v tkáni nebo dojde k špatnému odvodnění, při prosycování parafínem tkáň ztvrdne a špatně se krájí.(28)

Prosycení tkáně intermediem provedeme tak, že tkáňový bloček přeneseme z bezvodého etanolu do xylenu a prosycujeme ji postupně třemi lázněmi po 60 minutách vždy vyměněného xylenu. Po prosycení tkáně xylenem následuje prosycení tekutým parafínem, a to postupně třemi lázněmi při teplotě 56 ºC.(26) Tento proces probíhá ve speciální přístroji - tkáňovém procesoru (např. ,,Technicon“). Odvodněná, projasněná a prosycená tkáň se dále zalévá do čistého, zkvalitněného a přefiltrovaného parafínu. Pro rutinní zpracování tkáňových vzorků se používá zalévací automat (např. ,,Shandon - Histocenter 2“ )

Tab. č.2 Celkový přehled kroků tkáňového procesoru : Lázeň

Čas

Teplota

1.

10% Formol

60min

pokojová

2.

70% Etanol

90min

pokojová

3.

80% Etanol

120min

pokojová

4.

90% Etanol

90min

pokojová

5.

96% Etanol

90min

pokojová

6.

100% Etanol

90min

pokojová

7.

100% Etanol

120min

pokojová

8.

Xylen I.

90min

pokojová

9.

Xylen II..

90min

pokojová

10.

Xylen III.

90min

pokojová

11.

Parafín I.

60min

58 ºC

12

Parafín II.

60min

58 ºC

13.

Parafín III.

60min

58 ºC

Krájení tkáňových bločku se provádí na speciálním přístroji zvaný „mikrotom“. Na tomto přístroji se zhotovují histologické řezy, silné 3-4 µm. Dle způsobu ovládání rozlišujeme zmrazovací, rotační a sáňkový mikrotom. Sáňkový mikrotom je vybaven kluznou plochou pro těžké saně s mikrotomovým nožem, který se pohybuje proti fixnímu bločku. U rotačního mikrotomu na rozdíl od sáňkového - je nůž nehybný a proti němu se pohybuje svorka s bločkem ručním otáčením setrvačníkového kola.(1)

Ukrojený řez z parafínového bločku přeneseme skalpelem nebo „preparační jehlou“ na označené, čisté a dokonale odmaštěné podložní sklo. Poté řez podlijeme 0,5 % roztokem želatiny a přeneseme na speciální ploténku vyhřívanou na 50ºC . Působením tepla se řez napne a parafín změkne. K natahováním parafínových řezů se nejčastěji používá 0,5 % roztok želatiny. Po narovnání parafínového řezu přebytečnou tekutinu odkapeme a uložíme takto zhotovené preparáty do „sušárny“, které jsou připraveny na barvící příp. na imunohistochemické metody.

4.2.4 Barvící metody Neobarvený tkáňový řez napnutý na podložním skle má bělavou barvu, abychom rozeznali jednotlivé složky tkáně pod mikroskopem, je nutné řez obarvit vhodnými barvivy. Na základě rozdílných chemických vlastností jader a cytoplazmy dělíme barviva na barviva zásaditá (bazická) a barviva kyselá. Barviva kyselá barví cytoplazmu a naopak barviva zásaditá barví buněčná jádra, někdy se jim také říká barviva jaderná. Nejzákladnější a nejčastějším histologickým barvením je Hematoxylin – eozin. Hematoxylin patří mezi bazická barviva, které obarví jádra buněk modře. Eozin řadíme mezi kyselá barviva a barví cytoplazmu červeně.(26) Dále existuje celá řada speciálních barvicích postupů pro morfologické rozlišení tkáňových struktur. Při podezření na onemocnění celiakií se tkáň tenkého střeva barví jak základním barvením Hematoxylin – eozin, tak je zde potřebná i speciální barvicí metoda – Alcian blue PAS reakce. PAS reakce je speciální barvicí metoda k průkazu polysacharidu kde vznikají aldehydy, které reagují se Schiffovým reagens fialově červeným zbarvením. Vlastnímu barvení preparátu předchází deparafinace, které slouží k odstranění parafínu z tkáňového řezu. Deparafínování se provádí v lázních xylenu, v etanolu a zakončíme propíráním preparátů pod tekoucí vodou. Až po vyprání řezů přistupujeme k vlastnímu barvení. Po obarvení se preparát musí zbavit vody v lázni etanolu, acetonu a následně se projasněním v xylenu. Obarvený, odvodnění a projasněný preparát se nakonec uzavírá neboli ,,montuje“ krycím sklíčkem pomocí montovacího média.(26)(1)

Postup barvení Hematoxylin – eozin: 1. Deparafínování Tab.č. 3 Deparafínování Název kroku (roztoku)

Čas

1.

Termostat 56 ºC

30 min

2.

Xylen

7 min

3.

Xylen

7 min

4.

Xylen

7min

5.

Etanol 96%

2min

6.

Etanol 96%

2min

7.

Etanol 96%

2min

8.

Voda

5 min

9.

Vlastní barvení

( Zdroj: SOP- Standartní operační postup oddělení patologie Praha)

2. Vlastní barvení Hematoxylin – eozin Tab. č. 4 Vlastní barvení hematoxylin - eozin Název roztoku

Čas

1.

Mayerův hematoxylin

6 min

2.

Voda

8 min

3.

Eozin

20 s

4.

Voda

10 s

5.

Etanol 96%

20 s

6.

Etanol 96%

20 s

7.

Etanol 96%

20 s

8.

Aceton

1 min

9.

Aceton

1 min

10.

Aceton

1 min

11.

Xylen

1 min

12.

Xylen

1 min

13

Xylen

1 min

( Zdroj: SOP- Standartní operační postup oddělení patologie Praha)

3. Výsledek barvení: Jádra

-

Svalstvo -

Modře Červeně

Kolagenní vazivo - Růžově

Postup barvení PAS reakce: 1.Deparafínování Viz. Odparafínování Hematoxylin-eozin

2. Vlastní barvení PAS reakce Tab. č. 5 Barvení PAS reakce Název roztoku

Čas

1.

Destilovaná voda

1 min

2.

Alciánová modř

5 min

3.

Voda

6 min

4.

1% kys. Jodistá

10 min

5.

Voda

3 min

6.

Schiffovo reagens

5 min

7.

Voda

3 min

8.

Mayerův hematoxylin

5 min

9.

Voda

8 min

10.

Etanol 96%

20 s

11.

Etanol 96%

20 s

12.

Etanol 96%

20 s

13.

Aceton

1 min

14.

Aceton

1 min

15.

Aceton

1 min

16.

Xylen

1 min

17.

Xylen

1 min

18.

Xylen

1 min

( Zdroj: SOP- Standardní operační postup oddělení patologie Praha)

3. Výsledek barvení: Jádra

-

modře

Kyselé mukopolysacharidy -

modro- zelené

Neutrální polysacharidy

červeno-fialové

-

4.2.5 Imunohistochemie Termín imunohistochemie můžeme chápat jako aplikaci imunologických principů a metod využívající způsob odhalení přítomnost specifických antigenů, které se nachází v jádře, v cytoplazmě, nebo na povrchu buněk. Antigen nebo antigenní determinantu prokazujeme ve tkáni mono nebo polyklonálními protilátkami, které se nanášejí na tkáňový řez. Pokud je antigenní determinanta, proti níž je specifická protilátka namířena, ve tkáni přítomná, protilátka se na ni svou vazebnou částí naváže.(29) Vazba antigenu a protilátky si můžeme představit jako specifický vztah „zámku a klíče“. Po navázání antigenu na protilátku vzniká komplex, který je potřeba zviditelnit specifickou protilátkou s polymerem. Na oddělení histologie se používá velké množství protilátek, jelikož každá protilátka je specifická pouze pro jeden antigen. Při podezření na celiakii se provádí imunohistologické vyšetření znaků CD3 a CD8 intraepiteliálních lymfocytů. Protilátka CD3 patří mezi tzv. pan T lymfocytární povrchové molekuly, které se vyskytují na všech T lymfocytech periferní krve. U celiakie se ve střevní sliznici vytváří imunitní komplexy (gliadin + protilátka) a to vede k agregaci cytotoxických T-lymfocytů. Povrchový komplex CD3 je asociovaný s receptorem pro antigen na T lymfocytech a přenáší z něho aktivační signály do nitra buňky.(4) Postup - Zhotovení imunohistochemického preparátu protilátkou CD3 - imunohistochemický barvící postup metodou Immuno- Enzymového Polymeru - tkáň: tenké střevo - postup: a) Krájení tkáně tenkého střeva a zhotovení řezu b) Deparafinace: - 2 lázně xylenu (10 minut) - 2 lázně 96% etanolu (10 minut) - oplach destilovanou vodou

c) Demaskování antigenu: - Tris/EDTA pH9 - 30minut ve vodní lázni při cca 98 ºC v pufru o příslušném pH - dále se preparáty ochlazují stáním při pokojové teplotě v kyvetě s pufrem (20minut) - oplach destilovanou vodou (5 minut) d) Blokování endogenní peroxidázy: - skla vložíme do 3 % vodního roztoku H2O2 (20 minut) - oplach v PBS pufru (5 minut) e) Obkroužení řezu PAP – pen for imunohistochemistry f) Preparáty se vloží do vlhké komory,na řez se kápne primární protilátka a inkubuje se při pokojové teplotě (60minut). g) Proplachování 3x v pufru h) Na řez se kápne EnVision – mouse a nechá se působit (30minut) i) Proplachování 3x v pufru j) Na řez se kápne DAB chromogen (5-10minut), který zviditelní reakci mezi protilátkou a antigenem, pozitivita – barva hnědá k) Proplachování v destilované vodě (5 minut) l) Barvení jader Mayerovým hematoxylinem (3 minuty) m) Odvodnění: - 2 lázně 96 % etanolu (1 minuta) - 2 lázně acetonu (1 minuta) n) Projasnění: 3 lázní xylenu o) Montování preparátů pomocí montovacího media (Pertex) (Zdroj: SOP – Standardní operační postup oddělení patologie)

4.3 Mikroskopická diagnostika histologických preparátů 4.3.1 Postupy mikroskopování

Mikroskopické

hodnocení

preparátu

je

prováděno

vždy

lékařem

(patologem). Patolog rozpoznává změny způsobené na sliznici a na základě těchto změn stanovuje diagnózu, stupeň onemocnění popř. doporučí léčbu pacienta. Kvalita histopatologické diagnózy je dána správnou komunikací mezi patologem a gastroenterologem, který předkládá stručnou anamnézu, výsledky

sérologického vyšetření a endoskopický nález. K hodnocení preparátu se nejčastěji používá světelný mikroskop. Mikroskop má ve stanovení diagnózy veliký význam, neboť dokáže zvětšit obraz tkáně tolikrát, aby jej mohlo pozorovat lidské oko. Zvětšení obrazu může být umožněno v několika úrovních a tím nám usnadní hodnocení mikroskopické stavby tkáně. Z tohoto pohledu, je proto nutné znát stavbu čí technické parametry mikroskopu, dodržovat jeho údržbu a umět s nim správně pracovat.(26)

Světelný mikroskop můžeme rozdělit na: a) mechanicko – statickou část (stolek, stativ, revolverový nosič, tubus, makrometrický a mikrometrický šroub) b) optickou část (okulár,objektiv,) c) osvětlovací část (kondenzor, světlo, clony) Postup mikroskopování: - Mikroskop umístíme na vhodné místo (pro pohodlné mikroskopování) - Nastavíme nejmenší zvětšení objektivu - Osvítíme zorné pole - Na stolek mikroskopu umístíme preparát a upevníme ho svorkami. - Posuneme stolek pomocí makrometrického šroubu tak, aby objektiv byl těsně nad krycím sklíčkem. Zároveň sledujeme okulárem preparát a vyhledáváme nejvhodnější část. - Nejvhodnější místo pozorování doostříme mikrometrickým šroubem - Pomocí revolverového nosiče měníme větší zvětšení. - Pozorovaný preparát hodnotíme.

Objektiv v optické části mikroskopu nám dovoluje prostudovat preparát čtyřmi rovinami zvětšení (40 x, 100 x, 200 x a 400 x za použití desetinásobně zvětšujícího okuláru).

Patolog při stanovení diagnózy celiakie

popisuje (hodnotí)

tenkého střeva a to především : ▫ základního uspořádání střevní sliznice : - nejvíce slizničních změn je umístěno v proximálním tenkém střevě

tkáně

- u neléčených pacientů je často střevní sliznice tenčí - změna vzhled klků (atrofie) - snížení a rozšíření, zcela vymizení klků - (Atrofie klků je považováno za nejtypičtější znak u celiakie.) - hyperplazie krypt - prodloužené - porucha ve vyzrávání enterocytů (Enterocyty jsou často tvořené vrstvou “svraštěné“ cytoplazmy s nepravidelnými bazofilními jádry) - zvýšený počet intraepiteliálních lymfocytů(IEL) v epitelu – nejčastější znak. Na pracovišti Patologie v ÚVN, laborantky CD3 provádějí vždy. - výskyt zánětlivé infiltrace (lymfocyty a plazmocyty )

4.3.2 Marshova klasifikace

Celiakální sprue se klinicky projevuje v široké škále histomorfologickými změnami. Na základě těchto změn Marsh navrh čtyř stupňovou klasifikaci tzv. Marsh-Oberhuberův histologický gradig typu 0, I. II., III., IV. s typickým slizničním poškozením.(3)

Marshova klasifikace:

▫ Typ 0 (mírná léze): -normální architektura sliznice ( klků a krypt) - normální počet intraepiteliálních lymfocytů - (< 40 IEL/100 enterocytů)

▫ Typ 1 (infiltrativní léze): - normální architektura sliznice (klků a krypt) - zvýšený počet intraepiteliálních lymfocytů - (> 40 IEL/100 enterocytů)

▫ Typ 2 (hyperplastická léze): - hyperplazie krypt s normální architekturou klků - zvýšený počet intraepiteliálních lymfocytů s prohloubenými Lieberkühnovými krypty - (> 40 /100 enterocytů)

▫ Typ 3 (destruktivní léze): - typické slizniční poškození (atrofie klků, hyperplazie krypt) - (> 40 /100 enterocytů) - histologicky se rozeznává tri podskupiny podle stupně atrofie: 3A - mírná atrofie klků 3B - výrazná atrofie klků 3C – totální atrofie klků s vyhlazenou sliznicí ▫ Typ 4 (hypoplastická léze): - atrofie klků s normálním počtem IEL(3)

Tab č. 6 Stručný přehled Marshovy klasifikace Marsh-

IEL

Krypty

Klky

Typ 0

< 40

Norma

Norma

Typ 1

> 40

Norma

Norma

Typ 2

> 40

Hypertrofie

Norma

Typ 3 A

> 40

Hypertrofie

Mírná atrofie

Typ 3 B

> 40

Hypertrofie

Výrazná atrofie

Typ 3 C

> 40

Hypertrofie

Totální atrofie

Typ 4

< 40

Norma

Totální atrofie

Oberhuber

(Zdroj: Švajdler M., Bohuš P., Česká a Slovenská gastroenterologie a hematologie, Histopatologická diagnóza a diferenciální diagnóza celiakie: přehled pro gatroenterologi, 2010, str 26)

Obrázek. 1. Marshova klasifikace slizničních změn

Obr.č.1 Marshova klasifikace slizničních změn: 0 - preinfiltrativní 1 – infiltrativní, jen s lehkým oploštěním kllů, 2 – infiltrativní hypertrofické, 3 – destruktivní, 4 – atrofické hypoplastické. (Zdroj.Marshova klasifikace slizničních změn. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Coeliac_Disease.png )

Pro diagnózu celiakální sprue je přínosnější Marshova klasifikace, která vychází ze zjištění, že intraepiteliální infiltrace lymfocyty je prvním histologickým znakem celiakie a změny architektury jsou až následkem poškození enterocytů.(3)

4.4 Přehled všech zkoumaných pacientů Do výzkumu byli zařazeni pacienti, kteří byly vyšetřováni v období leden - prosinec 2012. Tito pacienti prodělali gastroduodenoskopickém vyšetření a byli jim odebrány vzorky tkáně sliznice sestupného duodena. Všechny vzorky po odebrání byly fixovány v 10% formaldehydu a dopraveny do laboratoře k histologickému posudku. Pro posouzení byly ukrojeny z tkáňového bloků tři řezy obarvenými Hematoxylinem - eozinem, tři řezy na metodu Acián blue PAS a dva řezy na imunohistochemii (CD 3). Tímto způsobem jsme hodnotili 329 pacientů.

Tab. č.7 Přehled zkoumaných pacientů v období leden – listopad 2012 Pohlaví

Hodnoceno negativně

Hodnoceno pozitivně

MUŽI

86

11

ŽENY

205

27

pacienta

Na základě těchto vyšetření byla histologem potvrzena diagnóza celiakie u 38 osob, z toho 11 můžů (28,95 %) a 27 žen (71,05 %).

Graf. 1 Grafické znázornění vyšetřovaných osob

27

11 86

POZITIVNĚ ŽENY POZITIVNĚ MUŽI NEGATIVNĚ MUŽI

205

NEGATIVNĚ ŽENY

Z grafu je patrné, že z vyšetřovaného souboru pacientů s podezřením na celiakii je negativně diagnostikováno: 205 žen a 86 mužů. Naopak s pozitivním nálezem celiakie bylo diagnostikováno 27 žen a 11 mužů.

5. VÝSLEDKY V této části hodnotíme histopatologické změny střevních biopsií odebraným pacientům s celiakii a statisticky je vyhodnocujeme. Pro histopatologické a statistické hodnocení jsem čerpala informace z výsledkových protokolů pacientů podezřelých na celikakií, které byly vyšetřovány v histologické laboratoři spadající pod oddělení Patologie v Ústřední vojenské nemocnici v Praze. Toto vyšetření prodělalo 329 pacientů a z tohoto souboru bylo histologem diagnostikováno 38 (11,55%) osob s podezřením na celiakální sprue. Soubor pacientů s celiakií jsem rozdělila na muže a ženy a zachycuje analýzu nálezu, popis stavu sliznice a následně určení typu (0 -IV) postižení dle Marshovy patologické klasifikace. Dále je zde statisticky vyhodnoceno zastoupení dle typu postižení, věku a pohlaví.

5.1. Výsledky pacientu se stanovenou diagnózou celiakie

Výzkumný

soubor

38

pacientů

byl

hodnocen

pomocí

světelné

mikroskopie a je prezentován v následující tabulce. Každému pacientovi jsem přidělila jeho osobní číslo a pořadí jsem určila podle data narození. Tab. č. 8 Stručný přehled pacientů s potvrzenou diagnózou celiakie Osobní

Pohlaví

Rok

Věk

narození

číslo

Měsíc

Marshova patologická

vyšetření

klasifikace

1.

Ž

1993

19

Květen

Typ 1

2.

Ž

1989

23

Březen

Typ 3 B

3

Ž

1989

23

Srpen

Typ 3 A

4.

M

1989

23

Prosinec

Typ 3B

5.

Ž

1988

24

Prosinec

Typ 3A

6.

Ž

1986

26

Červenec

Typ 3A

7.

M

1985

27

Leden

Typ 3B

8.

Ž

1981

29

Září

Typ 1

9.

Ž

1982

30

Listopad

Typ1

10.

Ž

1982

30

Březen

Typ 3 B

11.

M

1981

31

Září

Typ 1

12.

Ž

1980

32

Srpen

Typ 1

13.

Ž

1978

34

Březen

Typ 1

14.

M

1978

34

Únor

Typ 3 A

15.

Ž

1976

36

Červenec

Typ 3 C

16.

M

1975

37

Únor

Typ 1

17.

Ž

1974

38

Listopad

Typ 2

18.

Ž

1971

41

Květen

Typ 3 B

19.

M

1968

44

Únor

Typ 1

20.

M

1968

44

Září

Typ 3 C

21.

Ž

1966

46

Květen

Typ 3 B

22.

Ž

1966

46

Březen

Typ 1

23.

Ž

1964

48

Únor

Typ 3 B

24.

M

1964

48

Duben

Typ 3 C

25.

Ž

1964

48

Květen

Typ 3 B

26.

Ž

1963

49

Říjen

Typ 3 C

27.

Ž

1960

52

Únor

Typ 3 C

28.

Ž

1960

52

Duben

Typ 1

29.

Ž

1959

53

Prosinec

Typ 1

30.

Ž

1956

56

Červen

Typ 1

31.

Ž

1954

58

Srpen

Typ 1

32.

Ž

1953

59

Květen

Typ 3 B

33.

M

1952

60

Duben

Typ 1

34.

M

1952

60

Únor

Typ 3 B

35.

Ž

1946

66

Listopad

Typ 3A

36.

Ž

1943

69

Leden

Typ 2

37.

M

1940

70

Duben

Typ 1

38.

Ž

1922

90

květen

Typ 3 B

(Informace získané z archivace oddělení patologie Praze)

V následujícím grafu jsem zaznamenala procentuální výskyt různých věkových skupin osob trpící celiakii. Graf č. 2 Percentuální záchyt ze souboru diagnostikovaných pacientu, dle věku 8%

3% 26%

21%

18% 24%

19-30let

31-40 let

41-50let

51-60let

61-70let

71 a starší

Věková skupina mezi 19 – 30 rokem :

10 pacientů

Věková skupina mezi 31 – 40 rokem : 7 pacientů Věková skupina mezi 41 – 50 rokem : 9 pacientů Věková skupina mezi 51 – 60 rokem : 8 pacientů Věková skupina mezi 61 – 70 rokem : 3 pacientů Věková skupina straší 71 let a starší : 1 pacient

Nejpočetnější věkovou skupinu tvoří pacienti mezi 19 – 30 rokem a nejméně se vyskytuje u osob starších 71 let.

5.2 Statistické hodnocení Marshovy klasifikace u žen V následující tabulce a grafu jsem zveřejnila zastoupení žen, u kterých byl diagnostikován typ Marshovy patologické klasifikace.

Tab. č.9 Přehled Marshova klasifikace u žen, dle věku Marsh. klasifikace

Věk 19 - 30

31 - 55

56 -71

Typ 1

3

5

2

Typ 2

0

1

1

A B

3 2

0 4

1 2

C

0

3

0

0

0

0

Typ 3

Typ 4

Graf č.3 : Přehled zastoupení typů Marshovy patologické klasifikace u žen Zastoupení typů Marshovy klasifikace u žen 19-30 let

31 -55 let

55 -71 let

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Typ 1

Typ 2

Typ 3A

Typ 3B

Marshova klasifikace

Typ 3C

Typ 4

Z hodnoceného souboru pacientek se nejčastěji vyskytuje Marshova klasifikace typu 1 , hned za ni typ 3B, 3A a 3 C. Z celkového počtu 27 hodnocených žen nebyl diagnostikován typ 4.

5.3. Statistické hodnocení Marshovy klasifikace u mužů Graf č 4. Přehled zastoupení typů Marshovy patologické klasifikace u mužů Zastoupení typů Marshovy klasifikace u mužů 19-30 let

31 -55 let

55 -71 let

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Typ 1

Typ 2

Typ 3A

Typ 3B

Typ 3C

Typ 4

Marshova klasifikace

Z hodnoceného souboru mužů se nejčastěji vyskytuje dle Marshovy klasifikace typ 1. Naopak se u nich nevyskytuje typ 2 a typ 4.

5.4.Vizualizace Marshových typů: Nejčastějším typem z hodnocených pacientů ze souboru je typ 1. Na níže uvedeném obrázku je zachycena postižená část tenkého střeva u pacienta s pořadovým číslem 8, který byl vyšetřen v září 2012. Obrázek č. 2 a 3 Marshova klasifikace typu 1 (HE + CD3)

(HE prohlíženo pod zvětšením 200x a CD3 400x) Pacient č. 8 hodnocení: - infiltrativní léze - zachována architektura sliznice - lehce zvýšený počet lymfocytů

Druhým nejčastějším Marshovým typem je typ 3B. Tato ukázka je pacienta č. 18 , který byl diagnostikován v květnu 2012. Obrázek 4 a 5 Marshova klasifikace typu 3B (HE + CD3)

(HE prohlíženo pod zvětšením 200x a CD3 400x) Pacient č. 18 hodnocení : -

destruktivní léze

-

slizniční poškození

-

výrazná atrofie klků

-

zvýšený počet enterocytů.

Dalším typem Marshovy klasifikace je typ 3A, který je prezentován u pacineta č. 35, který byl hodnocen v listopadu 2012. Obrázek 6 a 7 Marshova klasifikace typ 3A (HE + CD3))

(HE prohlíženo pod zvětšením 200x a CD3 400x) Pacient č. 35 - hodnocení: - destruktivní léze - charakteristické slizniční poškození - hyperplazie krypt, mírná atrofie klků

Marshova klasifikace typu 3C se vyskytuje u pacienta č. 15, který byl diagnostikován v červenci 2012. Obrázek č. 8 a 9 Marshova klasifikace typu 3C (HE + CD3)

(HE prohlíženo pod zvětšením 200x a CD3 400x) Pacient č. 15 – hodnocení: - destruktivní léze

- slizniční poškození - totální atrofie klklů

U pacienta č. 17 byl v listopadu 2012 hodnocen typ 2 Marshovy klasifikace. Obrázek č.10 a 11 Marshovy klasifikace typ 2 (HE + CD3)

(HE prohlíženo pod zvětšením 200x a CD3 400x) Pacient č. 17 – hodnocení: - hyperplastická léze - hyperplastické krypty - normální architektura klků - zvýšený počet lymfocytů

6.DISKUZE Diagnostika celiakie se v současnosti opírá o histopatologické vyšetření vzorku z tenkého střeva. K iniciaci endoskopického vyšetření spojeného s bioptickým odběrem vzorku vede laboratorní i klinická symptomatologické onemocnění. Množství literárních údajů ale dokumentuje symptomatický průběh onemocnění v dospělé populaci. Onemocnění zůstává nediagnostikované s možností relapsu. Podle našich výsledků se celikaie může klinicky projevovat i jako funkční dyspeptický syndrom.(3) Základem histopatologické diagnózy celiakie je posoudit výšku klků, hloubku krypt a přítomnost zánětlivé infiltrace, zahrnující kritéria pro hodnocení střevních biopsií podle Marshoých klasifikací. V klinické praxi v současnosti platí, že typické anebo atypické příznaky a podezření na podkladu sérových testů s následnou pozitivní střevní biopsií a příznivou odpovědí na bezlepkovou dietu, můžeme považovat za dostatečné k definitivní diagnóze celiakie. V literatuře jsou ale popsané také případy celiakie s pozitivními autoprotilátkami v asociaci

s normální

duodenální

histologií.

Až

metodami

elektronové

mikroskopie se podařilo dokázat alterace enterocytů, kartáčového lemu se signifikantní redukcí mikroklků.(30) Klasické histologické vyšetření bývá na některých pracovištích doplněno o histochemický důkaz enzymů vázaných kartáčový lem. Jejich aktivita je determinována zhotovením krystalových řezů z nativní tkáně. Které je po odběru rychle zmražené. Mezi tyto enzymy patří patří dipeptidázy a disacharidázy. Mimo to mohou být vyšetření doplněna také o důkaz alkalické fosfatázy v enterocytech a kyselé fosfatázy lyzozómu enterocytů. Histochemickými vyšetřeními se v minulosti poukazovalo na rozdíly mezi primárním a sekundárním malabsorbčním syndromem a při opakované biopsii také na vývoj onemocnění. V tomto smyslu je důležitá lokalizace odběru vzorku, nebo v biopsiích z distálního dudena nemusí být přítomna atrofie klků a také histochemie je méně charakteristická.(26) Cílem této práce je zjistit, v jak velké míře se v české populaci vyskytují dílčí typy ceilakie dle Marshovy klasifikace a které skupiny obyvatel tímto onemocněním trpí nejvíce. Do našeho výzkumu byli zařazeni pacienti, kteří byly

vyšetřováni v období

leden - prosinec 2012. Tito pacienti prodělali

gastroduodenoskopickém vyšetření a byli jim odebrány vzorky tkáně sliznice sestupného duodena. Celkem jsme hodnotili 329 pacientů v poměru 232 žen a 97 mužů. Na základě vyšetření histolog potvrdil diagnózu celiakie u 38 osob, z toho 11 můžů a 27 žen. Nejpočetnější věkovou skupinu tvoří pacienti mezi 19 – 30 rokem a nejméně se vyskytuje u osob starších 71 let. Dále jsme zjišťovali zastoupení žen a mužů, u kterých byl diagnostikován typ Marshovy patologické klasifikace. Z

hodnoceného souboru pacientek se nejčastěji vyskytuje

Marshova klasifikace typu 1 , hned za ni typ 3B, 3A a 3 C. Z celkového počtu 27 hodnocených žen nebyl diagnostikován typ 4. Z hodnoceného souboru mužů se nejčastěji vyskytuje dle Marshovy klasifikace typ 1. Naopak se u nich nevyskytuje typ 2 a typ 4. Vůbec nejčastějším typem z hodnocených pacientů ze souboru je typ 1. Druhým nejčastějším Marshovým typem je typ 3B. Soustavně zvyšující se intenzita screeningu celiakie má za následek růst detekce nových pozitivních případů. Například se v literatuře uvádí mnohem vyšší prevelance onemocnění a to v populaci dětí i dospělých. Z toho vyplývá, že onemocnění je v Česku stále poddiagnostikované, což se dočteme i literatuře.(3)(26) Potvrzují to také výsledky naší bakalářské práce. Realizace vyšetření autoprotilátek je však v rámci jednotlivých regionů stále deficitní, což znemožňuje

zachytit

průběh

celiakie,

včetně

jiných

autoimunitních

a

systémových onemocnění. Lze to vyřešit větším rozšířením akreditovaných pracovišť v České republice.

7. ZÁVĚR V této

bakalářské práci popisujeme

histopatologickou diagnostiku

celiakie u 329 pacientů se stanovením diagnózy funkčního dyspeptického syndromu. V souboru pacientů jsou zaznamenány základní údaje a typ Marshovy klasifikace po laboratorních nálezech v průběhu vstupního vyšetření. Pro diagnózu celiakální sprue je přínosnější Marshova klasifikace, která vychází ze zjištění, že intraepiteliální infiltrace lymfocyty je prvním histologickým znakem celiakie a změny architektury jsou až následkem poškození enterocytů. Zjistili

jsme

procentuální

zastoupení

podezřelých

pacientu

na

onemocnění celiakie s pozitivní diagnózou. Do našeho výzkumu byli zařazeni pacienti, kteří byly vyšetřováni v období leden - prosinec 2012. Tito pacienti prodělali gastroduodenoskopickém vyšetření a byli jim odebrány vzorky tkáně sliznice sestupného duodena. Celkem jsme hodnotili 329 pacientů v poměru 232 žen a 97 mužů. Na základě vyšetření histolog potvrdil diagnózu celiakie u 38 osob, z toho 11 můžů a 27 žen. Nejpočetnější věkovou skupinu tvoří pacienti mezi 19 – 30 rokem a nejméně se vyskytuje u osob starších 71 let. U ženských pacientek se nejčastěji vyskytuje Marshova klasifikace typu 1 , hned za ni typ 3B, 3A a 3 C. Z celkového počtu 27 hodnocených žen nebyl diagnostikován typ 4. U mužských pacientů se nejčastěji vyskytuje dle Marshovy klasifikace typ 1. Naopak se u nich nevyskytuje typ 2 a typ 4. Vůbec nejčastějším typem z hodnocených pacientů ze souboru je typ 1. Druhým nejčastějším Marshovým typem je typ 3B. Histopatologická vyšetření dokumentuje nález odpovídající celiakii. Na základě našich dosavadních zkušeností existuje několik doproučení. Nejprve v cíleném screeningu stanovit autoprotilátky k tkáňové transglutamináze. Pokud je totiž vyloučená infekční příčina, symptomy jsou dlouhodobé. A pokud je u příbuzenstva nemocný s celiakií, mělo by být toto vyšetření první volbou a při negativním by se mělo opakovat. Dalším krokem by mohla být biopsie duodenální sliznice, neboť toto je stále osvědčeným postupem v diagnostice celiakie. Metodika s odběrem jednoho vzorku v jedné lokalizaci může ale vést k chybnému závěru.

Touto bakalářskou prací také chceme připomenout, že na diagnostiku celiakie musíme myslet v každém věku pacienta, a že kromě klasické formy jsou ještě atypické a symptomatické (latentní) celiakie.

8. Seznam použité literatury 1. JIRKOVSKÁ MARIE, Histologická technika, pro studenty lékařství a zdravotnické techniky, první vydání, ISBN80-7262-263-3, Galén 2006, str. 16. - 18, 27 - 38, 66 - 72 2. BARTUŇKOVÁ JIŘINA, HOŘEJŠÍ VÁCLAV, Základy imunologie, druhé vydání, ISBN 80-7254-215-X, Triton 2002, str. 55 – 59 3. TYČOVÁ V.,ŠTEINER I.,Česko- Slovenská patologie a soudní lékařství,ISSN 1210-7875, Česká lékařská společnost J.E. Purkyně, Praha 2008 ,str.16-18,25 4. LUKÁŠ Z., DRÁBEROVÁ E., Feit J.,Vojtěšek B.(1997): Imunohistochemické metody v biologii a v bioptické diagnostice. Masarykova univerzita v Brně. ISBN 80-210-0620-X 5. BUREŠ J., REJCHRT S., Kopáčová M. et al: Endoscopic features of coeliac disease.Folia Gastroenterol. Hepatol. 2005, 3, s. 322-341 6. FASSANO A., CATASSI C.: Current approaches to diagnosis and treatment of celiac disease: an evolving spectrum. Gastroenterology 2001, 120, s.636-651 7. MALÍČKOVÁ K, JANATOVÁ I, ŠANSOVÁ P, Imunologická laboratorní vyšetření při podezření na celiakii, Ústav imunologie a mikrobiologie VFN a 1. LF UK, Praha, 2005 8. FRIČ P.: Celiakální sprue. In Bureš J. et al.: Gastroenterologie 2006. Kap19.,Triton, Praha, 2006, , s. 219-238 9. FRIČ P.: Endoskopická diagnostika celiakální sprue. Endoskopie 2002, 11, s. 69-73 10. MARSH M.N.,CROWE P.T.:Morphology of the muckal intestinal lesion in gluten senzitivity.Baillieres Clin.Gastroenterol.1995,9,s.273-293 11. MICHALSKI J.P.,McCombs C.C.: Celiac disease: clinical features and pathogenesis. Am. J. Med.Sci. 1994,307(3): s.204-211 12. NEVORAL J., KOTÁLOVÁ R.: Celiakální sprue. Postgraduální medicína 2002, 4, s. 14-21 13. PROKOPOVÁ L.: Celiakie-co má vědět ambulantní internista.Interní Med.2008, 10(5),s.233-239 14. ČERVENKOVÁ, R.: Celiakie. 1. vyd. Praha: Galén, 2006. 64 s. ISBN 807262-425-3

15. DÍTĚ, P. a kol.: Gastroenterologie. Učební text pro studující lékařství. 1.vyd. Brno: MU 2000. 196 s. ISBN 80-210-2379-1 16. DYLEVSKÝ, I.: Základy anatomie. 1. vyd. Praha: Triton, 2006, 271 s. ISBN 80-7254-886-7 17. FIALA, P., VALENTA, J., EBERLOVÁ, L.: Anatomie pro bakalářské studium zdravotnických oborů. 2.vyd. Praha: Karolinum 2008. 173 s. ISBN 978-80-246-1491-5 18. FRIČ, P.: Celiakie. VZP ČR, 2009. 11 s 19. FRIČ, P.,MENGEROVÁ, O.: Celiakie. Bezlepková dieta a rady lékaře. 1. vyd. Čestlice: Medica Publishing. 2008. 186 s. ISBN 978-80-85936-62-9 20. FRÜHAUF, P.: Rukověť celiatika. 2. přepr. vyd. Praha: 2005. 52 s. ISBN 80-902803-1-5 21. KOHOUT, P., PAVLÍČKOVÁ, J.: Celiakie. Bezlepková dieta a rady lékaře. 2 rozš. vyd. Praha: Medica Publishing,1999. 112 s. ISBN 8085936-29-1 22. SPOLEČNOST PRO BEZLEPKOVOU DIETU Czech Coeliac Society: Bezlepková dieta při celiakie a Duhringově dermatitídě. In VFN. Praha: 2004, roč. XII, s. 5 23. VÍTOVÁ, Martina a kol. Dětský diabetes a celiakie. In Sestra. Praha: 2003, roč. XIII, č. 9, s. 21-22. ISSN 1210-0404 24. ZOUFALÁ K.: Lékařská ordinace Vyšehrad Celiakie, Practicus 2011 25. LUłNÁ, D., VRÁNOVÁ, D.: Makrobiotický léčebný talíř aneb nemoc není nepřítel II. Olomouc: Anag, 2007. 335 s. ISBN 978-80-7263-421-7 26. VACEK Z.: Histologie a histologická technika. 1.vyd. Praha: Avicenum zdravotnické nakladatelství 1988. 196-200 s. 27. DVOŘÁK K., DVOŘÁKOVÁ Z. a kol: Základy histopatologických vyšetřovacích metod, 2008 , str. 60 28. JELÍNEK R a kolektiv: Histologie a embryologie str.3 29. FUČÍKOVÁ T. et al.:Současná imunologie, Triton, 1993 30. ŠVAJDLER M., BOHUŠ P., Česká a Slovenská gastroenterologie a hematologie, Histopatologická diagnóza a diferenciální diagnóza celiakie: přehled pro gatroenterologi, 2010, str 24-30