Halaman 1 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER FARMASI UGM Dokumen nomor Mengganti nomor URAIAN Jabatan
: CCRC-02-014-00 : ~
Tanggal : 24 Maret 2009 Tanggal : ~
DIBUAT OLEH Staf CCRC
DIPERIKSA OLEH Staf CCRC
DIPERIKSA OLEH Supervisor CCRC
DISETUJUI OLEH Pimpinan CCRC
Aditya Fitriasari 24 Maret 2009
Sendy Junedi
Muthi’ Ikawati
Edy Meiyanto
Paraf Nama Tanggal
PROSEDUR TETAP PREPARASI SAMPEL UNTUK FLOWCYTOMETRY
DAFTAR ISI HALAMAN
DAFTAR ISI
1
A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN
2
B. TUJUAN
2
C. PENDAHULUAN
2
D. OPERASIONAL
3
1. Alat
3
2. Bahan
3
3. Prosedur Kerja
3
4. Analisis dan Interpretasi Data
6
Halaman 2 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER Dokumen nomor Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00 : ~
Tanggal : 24 Maret 2009 Tanggal : ~
A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN No Dokumen -
Isi
No Dokumen CCRC-02014-00
Isi
Tanggal
Dibuat oleh
Diperiksa oleh
Diperiksa oleh
Endah P Riris Istighfari J Septi Staff Supervisor CCRC CCRC Menggunakan format lama Belum ada penomoran dokumen Belum ada prosedur pencatatan pada buku komunikasi harian Tanggal Dibuat oleh Diperiksa oleh Diperiksa oleh Aditya Sendy Junedi Muthi’ Ikawati Fitriasari Staff Staff Supervisor CCRC CCRC CCRC Menggunakan format baru Sudah ada penomoran dokumen Menyebutkan prosedur pencatatan pada buku komunikasi harian
Disetujui oleh Edy Meiyanto Pimpinan CCRC
Disetujui oleh Edy Meiyanto Pimpinan CCRC
B. TUJUAN Memberikan panduan secara detail dan bertahap mulai dari persiapan, pembuatan sampel dan reagen, perlakuan, preparasi sampel untuk flowcytometry, analisis dan interpretasi data hasil flowcytometry. C. PENDAHULUAN Flowcytometry merupakan suatu teknik yang digunakan untuk menganalisis jenisjenis sel yang terdapat pada suatu populasi sel. Sel dilabel fluoresen, dilewatkan celah sempit, dan ditembak sinar. Pada suatu populasi sel yang sejenis, misal pada sel kanker yang diberi perlakuan suatu senyawa sitotoksik, dapat dilakukan analisis terhadap fasefase daur sel, sel apoptosis, serta sel yang mengalami poliploidi. Masing-masing jenis sel tersebut memiliki perbedaan pada jumlah set kromosom di mana pada fase G0/G1, fase S, fase G2/M berturut-turut memiliki 2, 3, dan 4 set kromosom. Semakin banyak jumlah set kromosom, maka intensitas sinyal optik yang diberikan semakin kuat karena kemampuan fluoresen untuk berinterkalasi pada DNA semakin besar. Pada sel yang mengalami apoptosis (sub G0), intensitas fluoresen sangat lemah karena kromosom telah mengalami fragmentasi. Sedangkan pada sel poliploidi, intensitas yang diberikan sangat kuat karena jumlah set kromosom yang lebih dari 4 set.
Halaman 3 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER Dokumen nomor Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00 : ~
Tanggal : 24 Maret 2009 Tanggal : ~
D. OPERASIONAL 1. Alat a. b. c. d. e. f. g. h.
6 well plate Mikropipet 10, 20, 200, 1000 µl Tabung sentrifus 1,5 ml Rak tabung kecil Sentrifugator Inkubator CO2 Penangas air (37°C) FACS-Calibur
2. Bahan a. b. c. d. e. f. g. h.
Sampel dengan konsentrasi tertentu Phosphat Buffer Saline (PBS) 1x pH 7 Media kultur (MK) Tripsin-EDTA 0,25% RNase Propidium iodide Triton-X Buangan untuk media bekas dan PBS
3. Prosedur a. Perlakuan (treatment)
No
Pekerjaan Persiapan
Kerja
Perhatian
1.
Ikuti protokol Laboratorium.
In
Vitro
di
2.
Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel.
Gunakan kultur sel dalam kondisi 70-80% konfluen untuk dipanen.
3.
Panen sel sesuai dengan protokol panen.
-
4.
Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel.
Jumlah sel yang dibutuhkan untuk 6 well plate 5 5 adalah 5x10 sel/sumuran (5x10 sel/1000 µL).
5.
Transfer sel ke dalam sumuran 6 well plate, masingmasing 1000 µl (untuk perlakuan dan untuk kontrol sel).
-
6.
Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan dengan kamera.
-
7.
Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).
Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media dan sel diinkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.
8.
Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi (misal: Doxorubicin) untuk perlakuan.
Untuk masing-masing konsentrasi sampel dan agen kemoterapi buat volume 500 µL (bisa dilebihkan sedikit). Konsentrasi sampel dan Doxorubicin dibuat dua kali konsentrasi untuk perlakuan, karena
Seri konsentrasi terdiri dari 2 konsentrasi: ¼ IC 50 dan 1/10 IC50.
-
Halaman 4 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER Dokumen nomor Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00 : ~
Tanggal : 24 Maret 2009 Tanggal : ~ di dalam sumuran akan mengalami pengenceran oleh sampel/Doxorubicin atau MK.
9.
Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.
-
10.
Buang media sel dengan menggunakan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.
-
11.
Cuci dengan 500 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel.
-
12.
Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahanlahan.
-
13.
Untuk kelompok perlakuan kombinasi :
-
Masukkan 500 µl seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran. Kemudian tambahkan 500 µl seri konsentrasi Doxorubicin untuk kombinasi. 14.
Untuk perlakuan tunggal :
-
Masukkan 500 µl seri konsentrasi sampel atau Doxorubicin ke dalam sumuran. Kemudian tambahkan 500 µl MK. 15.
-
Untuk kontrol sel : Tambahkan 1000 µl MK ke dalam sumuran.
16.
Inkubasi di dalam inkubator CO2 selama 24 jam.
-
17.
Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan dengan kamera.
-
b. Pembuatan reagen flowcytometry 1) Stok awal reagen : a) Propidium Iodide (PI) : 1 mg/ml / 50x •
Timbang 1 mg PI, larutkan dalam 1000 µl PBS.
•
Fungsi : Mewarnai DNA sel (fluorochrome).
•
Penyimpanan : Dibungkus aluminium foil dan di freezer.
b) RNase : 10 mg/ml •
Fungsi : Mendegradasi RNA.
•
Penyimpanan : Di freezer.
c) Triton-X 100 (pro GC - Merck) : 1x •
Fungsi : Melisis membran sel.
•
Penyimpanan : Di temperatur kamar.
Halaman 5 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER Dokumen nomor Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00 : ~
Tanggal : 24 Maret 2009 Tanggal : ~
2) Reagen flowcytometry untuk 1 sampel : 25 µl PI (50x) + 2,5 µl RNase + 0,5 µl Triton-X + PBS ad 500 µl •
Untuk 6 sumuran, buat untuk 6 sampel (dibuat berlebih untuk 7 sampel).
•
Bungkus aluminium foil.
•
Perhatian : Senyawa karsinogen (interkalasi DNA), pakai sarung tangan!
3) Konsentrasi akhir reagen dalam PBS 500 µl : a) Propidium Iodide (PI) : 50
g/ml
b) RNase : 50 µg/ml c) Triton-X 100 (pro GC - Merck) : 0.1 % c.
No
Preparasi sampel untuk flowcytometry
Pekerjaan
Perhatian
1.
Siapkan 2 eppendorf untuk 1 jenis perlakuan.
Eppendorf I dan eppendorf II.
2.
Ambil media dari sumuran dengan mikropipet 1 ml, transfer ke eppendorf I, jika kurang masukkan ke eppendorf II.
-
3.
Sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit (Gambar A).
-
4.
Buang media dengan cara dituang.
-
5.
Isikan @ 500µl PBS ke dalam sumuran.
-
6.
Ambil PBS dengan mikropipet dan transfer ke dalam eppendorf I.
-
7.
Sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit.
-
8.
Buang PBS dengan cara dituang.
-
9.
Ulangi pencucian dengan PBS (tahap 5-8) sekali lagi .
-
10.
Tambahkan 150 µl tripsin-EDTA 0,25%, inkubasi di inkubator selama 3 menit.
Hati-hati, jangan lebih dari 3 menit.
11.
Tambahkan @ 1 ml MK, resuspensi sampai sel lepas satu per satu, amati di bawah mikroskop.
MK untuk menginaktivasi tripsin.
12.
Setelah sel terlepas satu-satu, transfer sel ke eppendorf I dan/ II.
-
13.
Tambahkan kembali 500 µl PBS ke dalam sumuran untuk mengambil sisa sel, kemudian transfer ke dalam eppendorf II.
-
14.
Sentrifus semua eppendorf dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit.
-
15.
Buang MK/PBS dengan cara dituang, tambahkan dan resuspen pellet sel dengan @ 500 µl PBS dingin.
-
16.
Gabungkan suspensi sel dalam kedua eppendorf ke dalam eppendorf I. Bilas eppendorf kosong dengan PBS, transfer ke eppendorf I.
-
Halaman 6 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER Dokumen nomor Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00 : ~
Tanggal : 24 Maret 2009 Tanggal : ~
17.
Sentrifus eppendorf I dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit.
-
18.
Buang PBS dengan cara dituang.
-
19.
Tambahkan reagen flowcytometry resuspen dengan homogen.
20.
Bungkus tiap eppendorf dengan alufoil. penandaan pada bagian atas eppendorf.
21. 22.
Inkubasi di waterbath 37°C, 10 menit. Jangan disimpan di kulkas/freezer/suhu kamar.
23.
Resuspen lagi sebelum ditransfer ke flowcyto-tube.
24.
Transfer suspensi sel ke dalam flowcyto-tube melalui filter (kain nylon/kain kaca) menggunakan mikropipet 1 ml. Baca dengan flowcytometer FACS Calibur untuk mengetahui profil cell cycle (Gambar B).
25. 26.
@ 400 µl, Beri
Setiap selesai melakukan pekerjaan, lakukan sanitasi seperti pada Protokol Persiapan Kerja In Vitro di Laboratorium.
A
Untuk mengaktivasi RNase. Penyimpanan pada kulkas, freezer, dan pada suhu kamar akan meningkatkan debris. Tutup flowcyto-tube dilubangi terlebih dahulu.
Deteksi dilakukan 20.000 sel.
terhadap
10.000
atau
-
B
Gambar. (A) Sentrifugator Sorvall; (B) Flowcytometer FACS-Calibur.
4. Analisis dan Interpretasi Data Data flowcytometry dianalisis dengan program cell quest untuk melihat distribusi sel pada fase-fase daur sel sub G1 (apoptosis), S, G2/M, dan sel yang mengalami poliploidi. Penghambatan daur sel yang terjadi dapat diketahui dengan membandingkan antara efek perlakuan larutan uji dengan kontrol.
Halaman 7 dari 7
CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER Dokumen nomor Mengganti nomor
: CCRC-02-014-00 : ~
Tanggal : 24 Maret 2009 Tanggal : ~
Contoh Hasil Flowcytometry : 44,81% G1 27,64 % G2/M
6,50 %
8,17 %
13,35 %
Sub G1
Polyploid S
37,95% 35,76% G1 G2/M
6,67% Sub G1
9,86% S
10,21 % Polyploid
Analisis daur sel MCF-7 dengan flowcytometry Perlakuan Doxorubicin 350 nM dengan inkubasi 24 jam menunjukkan penghambatan pada fase G1 dan G2/M.
Jika ada sesuatu dalam SOP ini tidak bisa dilakukan atau tidak sesuai dengan kenyataan dilapangan, segera laporkan kepada Staff/Supervisor Staff/Supervisor CCRC
