Affinitás Az az erő, mellyel egy antitest megfog egy epitópot. Nem kovalens kötések, melyek hozzájárulnak: ionos kölcsönhatások, hidrogén kötések, hidrofób kölcsönhatások. Számszerűen megadható az asszociációs konstans (Ka) meghatározásával A meghatározás egyik módszere az equilibrium dialízis.
Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 5-6
Katona Éva
Feltételek: • az antigén (ligand) elég kicsi legyen ahhoz, hogy átjusson egy membrán (pl. celofán) pórusain • Az antigén valamilyen módon jelzett legyen • F kamrába: • B kamrába:
ligand antiszérum v. nonimmun szérum
Rendszeres időközönként mindkét kamrából mintát veszünk és mérjük a jelet. [Ab-Lg] Ka=-------------------[Ab ] x [ Lg]
a Kd reciproka
Scatchard egyenlet r K=------------ (n-r)(c)
Ábrázoljuk az r/c hányadost az r függvényében
r = a kötött ligand és a totál antitest cc. hányadosa n = a ligand kötő helyek száma az antitesten c = a szabad ligand cc.-ja
Ha a Ka valóban konstans, a pontokra egyenes illeszthető és a meredekség=Ka !! IgG esetén az r maximális értéke=2
Egyenest általában csak monoklonális antitest esetén kapunk!
Példa egy poliklonális antitest K értékének meghatározására
KO= átlagos associációs konstans, az a ligand cc. melynél az ag kötő helyek fele telített (IgG esetén ez akkor teljesül, amikor r=1)
1 KO=------------ (2-1)c
KO= a szabad ligand cc.-jának reciproka, amikor r=1. Ez leolvasható a Scatchard görbéről, mivel amikor r=1, r/c=1/c= KO
Az előző adatokat a Sips egyenlet alapján transzformálva log[r/(2-r)] = a logK+ a log c A log[r/(2-r)] -t a log c függvényében ábrázolva egyenest kapunk.
A KO közvetlenül leolvasható a Scatchard görbéről: amikor r = 1, log[r/(2-r)] = 0. Theát KO= reciproka annak a c értéknek, ahol a log[r/(2-r)] = 0. A KO értéke az immunizálás során az idő (és a ráoltások) függvényében emelkedik, feltehetően azért, mert a nagyyobb affinitású antitestet termelő B sejtek szelektálódnak ki. Ez a jelenség az affinitás érés.
1
Az antitest affinitásának meghatározása nem kompetitív ELISA módszerrel
Affinitás érés 1. 2. 3. 4. 5.
Különböző koncentrációjú antigénnel fedjük az ELISA lemezek felszínét (Ag, Ag’…) Az antitest különböző koncentrációit reagáltatjuk mindegyik antigén koncentrációnál A mért OD-kat ábrázoljuk az antitest koncentráció függvényében A maximális OD 50%-nak megfelelő antitest koncentrációkat leolvassuk a görbékről A képlet alapján kiszámítjuk a Kaff értékét
Nem jelenti azt, hogy az antitest specifikusabb lesz!
Az antitest affinitásának meghatározása SPR módszerrel 1. Sensor chip felszínére kovalensen felkötjük az antitestet 2. Különböző koncentrációjú antigén oldatot áramoltatunk a chip felszínén, miközben folyamatosan detektáljuk a lekötődött ag mennyiségét 3. Görbe illesztés 4. kon és koff meghatározása 5. Kd=koff /kon (software elvégzi) Egyéb módszerek: Bioassay PEIA-ellipsometry
Az antitest specificitásának vizsgálata Az eredmény specificitása két dologtól függ: 1) az antitest specificitása
2) az alkalmazott módszer Az antitest kötődése egy fehérjéhez nem jelenti azt, hogy minden módszerben működik (pl. immunhisztokémia).
Immunhisztokémia esetén a reakció specificitásának kontrollálására használnak: negatív kontrollt (az elsődleges antitest helyettesítése nem-immun szérummal) és pozitív kontrollt (olyan sejtek v. metszet reakciója az antitesttel, amely biztosan tartalmazza az adott fehérjét)
Mit akarunk kimutatni a specificitás jellemzésekor? Azt akarjuk demontstrálni, hogy az antitest kizárólag azt a fehérjét köti, amely az immunogén peptidet tartalmazta (ma már sok esetben peptiddel immunizálunk).
Az antitest specificitásának megállapítására legalkalmasabb módszerek az immunoblot és az immunprecipitáció.
Példa 1
Poliklonális antitest élesztő Hda1 fehérje ellen: Immunizálás egy 21 tagú peptiddel Microarray (c): reakció 7 másik fehérjével is Immunoblot (a): reakció 3 másik fehérjével is (a másik 4 fehérjében az epitóp konformáció szenzitív lehet)
Szekvencia összehasonlítás (b): jól magyarázza a keresztreakciót, DE! A szekvencia homólógia előre nem jól jelezte a keresztreakciót: 86 olyan fehérjét találtak az élesztő proteomban, ami nagyobb homológiát mutatott a peptiddel, mint a hét fehérje közül bármelyik. Továbbá csak három fehérje volt a hét közül az első 1000 találatban, melyet 6300 fehérje közül jósoltak.
2
Példa 2
Immunizálás humán myeloma IgG Fc fragmenssel, a monoklonális antitestek specificitásának vizsgálata
Példa 3
Példa 4
Az antitest specificitásának vizsgálata immunprecipitációval 1. Antitest hozzáadása komplex antigén keverékhez (sejtlizátum, plazma, szérum, egyéb testfolyadék stb.) 2. Inkubálás 3. Antitest-ag komplex megkötése Protein G/A Sepharose gél hozzáadásával 4. A gél mosása 5. Ag és at eluálása a gél felszínéről (pl. SDS-PAGE minta pufferrel) 6. SDS-PAGE vagy egyéb kimutatása az eluált komponenseknek
Példa: hiszton poszttranszlációs módosulásaira specifikus antitestek vizsgálata
Az 1-3 lépés helyett lehet immunprecipitálni kovalensen gélhez kötött antitesttel is.
3
Az Ag-At reakció mérését befolyásoló HOMOGÉN - HETEROGÉN Nem szükséges elválasztani az immunkomplexben kötött és nem kötött komponenseket ahhoz, hogy a komplex mennyiségét megmérjük
A komplexben nem kötött komponenst el kell távolítani a komplex mérése előtt
KOMPETITÍV - NEM KOMPETITÍV Jelölt és jelöletlen antigén verseng limitált mennyiségű antitest kötőhelyért
Nincs kompetíció, a kötőhelyek száma nem korlátozott
• • • • •
tényezők
Affinitás Aviditás Ag:Ab arány Az antigén fizikai Formája
• • • • •
Ionerősség pH Hőmérséklet Reakcióidő Hidrofil és hidrofób molekulák jelenléte • A közeg viszkozitása •
PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK antitest túlsúly
antigén túlsúly
ekvivalencia
KVALITATÍV MÓDSZEREK
Passzív géldiffúzió:
kettôs immundiffúzió
Precipitátum mennyisége
Antigén koncentráció
A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében.
(Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe)
ekvivalencia
Felhasználási terület
két vagy több teszt anyagban
lévô antigének azonosságának
vagy különbözôségének eldöntése
immunelektroforézis
myeloma proteinek azonosítása
kétdimenziós immunelektroforézis fehérjekeverékek vizsgálata,
counterimmunelektroforézis
immunfixáció
aktiváció vagy más
molekulákkal való kapcsolódás
kimutatása
bakteriális antigének
kimutatása vérbôl, vizeletbôl,
cerebrospinális folyadékból
myeloma proteinek azonosítása
antigének mennyiségi
meghatározása specifikus
antitestek segítségével
KVANTITATÍV MÓDSZEREK Radiális immundiffúzió
Elektroimmunoassay
Turbidimetria
Nefelometria
A fényszórást befolyásoló tényezők
antigén túlsúly
2 2 2 is = 4π (dn/dc) Mc sin Θ Io Naλ4r2
Precipitátum mennyisége
antitest túlsúly
Elektroforézissel kombinált:
(Rayleigh) partikulum<0.1λ
Is
Antigén koncentráció
A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében.
(Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe)
polarizált fénnyel megvilágított kis méretű partikulumok
által szórt fény intenzirtása Io
a beeső fény intenzitása dn/dc az oldószer/oldat fénytörési index változása Na
Avogadro szám M
molekulatömeg (g/mol) λ
A megvilágító fény hullámhossza Θ
A detektálás szöge R
a detektor távolsága a fényszórás helyétől
4
Turbiditás
KIS PARTIKULUMOK A fény szimmetrikusan szóródik, de 90°-ban kisebb mértékben (RAYLEIGH)
NAGYON NAGY PARTIKULUMOK A fény fôként elôre szóródik (MIE)
NAGY PARTIKULUMOK A fény fôként elôre szóródik
(RAYLEIGH-DEBYE)
A részecskeméret hatása a beeső fény szóródására
A megvilágító fény intenzitásának csökkenése miközben az áthalad egy partikulumokat tartalmazó oldaton. A fényintenzitás csökkenést a fény visszavarődése, szóródása és az abszorpció okozza. A turbiditás a következő képlettel fejezhető ki:
I = Ioe-bt
vagy t = (1/b)lnIo/I
t
turbiditás b
a beeső fény hullámhossza
A turbidimetria és nephelometria mérési elve végpont Ag
At
jel
MINTA CELLA
Wolfram-halogén lámpa (340-800 nm) Hélium-neon lézer (633 nm)
puffer
FÉNYFORRÁS EXCITÁCIÓS OPTIKA
EXCITÁCIÓS FILTER
OPTIKA
0°
90°
DETEKTOR FILTER
A= 0° TURBIDIMÉTER B= 30° NEFELOMÉTER C= 90° NEFELOMÉTER
idô
A fényszórás /abszorbancia változása az idő függvényében
Maximális sebesség Ag
At
sebesség
puffer
DETEKTOR
idô
A reakció sebessége az idő függvényében (kinetikus meghatározás)
Optimális standard görbe turbidimetriás fehérje meghatározáshoz
5
IgG At
Maximális jel
Abszorbancia
Ag
jel
Biztonsági tartomány Minta vak Reagens abszorbancia
első leolvasás
idô
Kritikus pont
második leolvasás
Mérési tartomány
Ag koncentráció
Az abszorbancia változása az idő függvényében Minta vak mérés
jel
Turbidimetria és nefelometria érzékenyítése
antigén
Mérési tartomány
latex partikulumhoz kötött antigénre specifikus antitest
Ag koncentráció
Az antitest koncentráció hatása a biztonsági zónára (szaggatott vonal). 1: alacsony, 2: közepes, 3: magas antitest koncentráció
Turbidimetriás/nefelometriás inhibíciós assay
antigén/antitest komplex
turbidimetriás mérés
HIBALEHETŐSÉGEK: 1. Az antitest nincs feleslegben. 2. A háttér fényszórás túl magas (pl. lipémia) Ebben az esetben a kinetikus meghatározás előnyösebb, mint a végpontos. 3. Színes anyagok okozta interferencia. 4. A keverés nem megfelelő. 5. A mintában lévő immunkomplexek (reuma faktor) fals magas vagy alacsony értékeket okozhatnak a háttér korrekciótól függően. ÉRZÉKENYSÉG: ng/L is lehet!
6
ekvivalencia
antigén túlsúly
Precipitátum mennyisége
antitest túlsúly
Antigén koncentráció
TIME
A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében.
Antigén túlsúly tesztelése (kinetikus nefelometriás meghatározás)
KETTŐS RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓ (Ouchterlony)
(Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe)
RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓ (Mancini)
Módszer: - kb. 3 mm vastag agar géllel (2-4% agar 0.9% NaCl-ban) megtöltött Petri csészét használunk - Megfelelő eszközzel lyukakat készítünk a gélbe, melybe egy csepp 1%-os agart, majd 1-2 µl mintát töltünk Ag antigén Ab antitest
1 feltöltés helye 2 ellenanyagot tartalmazó agar-gél 3 precipitációs gyűrű St1-2-3 ismert koncentrációjú standard fehérjeoldat M vizsgálandó ismeretlen fehérjeoldat
A két antigén immunológiailag A azonos B nem azonos C részlegesen azonos (sarkantyú) D a sarkantyú képz[dés sémája
IMMUNFIXÁCIÓ
IMMUNELEKTROFORÉZIS (IEP)
-IgG
-IgA
Anti -IgM -kappa -lambda
Módszer: - agaróz gélt öntünk üveg vagy műanyag lapra - Megfelelő eszközzel lyukakat készítünk a gélbe, melyekbe néhány µl mintát töltünk (x, y, z) - Az elektroforézis során a mintában lévő fehérjék eltérő elektroforetikus mobilitásuk miatt szétválnak - Az elektroforézis után a szétválasztott fehérjék közötti hosszanti vájatokba (A, B, C) antitszérumot töltünk - Az antitest és a szétválasztott antigének diffúziója precipitációs ívek képződéséhez vezet
Módszer: - Elektroforézist végzünk agaróz gélben - A megfelelő antiszérumot közvetlenül a gélre szélesztjük, az antitest precipitálja az antigént - A precipitátum a gélben marad, a többi fehérjét a gél mosásával eltávolítjuk - A mosás után a gélt fehérje festékkel megfestjük
Elektroforézis után fehérje festés
7
Counterimmuno-elektroforézis
KÉTDIMENZIÓS IMMUNELEKTROFORÉZIS (CRIE)
At
+
-
minta
A gélben egymással szemben vándorol az antigén és az antitest. Ha találkoznak precipitátum képződik.
Az első dimenzióban elektroforézissel szétválasztott fehérje frakciókat a lemezt 90°-ban elforgatva, a második dimenzióban specifikus antitestet tartalmazó gélbe futtatjuk.
KÉTDIMENZIÓS IMMUNELEKTROFORÉZIS (CRIE)
ELEKTROIMMUNOASSAY (RAKÉTA ELEKTROFORÉZIS)
Allergy Methods and Protocols Methods in Molecular Medicine Volume 138, 2008, pp 147-165
+
- Módszer: - Antiszérumot tartalmazó agaróz gélbe készített lyukakba (vagy gélre fektetett applikátor felviteli helyeire) mintákat töltünk - Az elektroforézis során a mintában lévő fehérjék a + pólus felé vándorolnak - Az antigént az antitest precipitálja, ha ekvivalencia koncentrációra hígul a vándorlás során, azaz a képződő rakétacsóva alakú precipitációs ív magassága az antitest eredeti koncentrációjától függ. - Kalibrátorok alkalmazásával kalibrációs görbét készítünk
PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK
KVALITATÍV
A diffúzió típusa
Módszer neve
Felhasználási terület
Passzív
kettős immundiffúzió
két vagy több teszt anyagban lévő antigének azonosságának vagy különbözőségének eldöntése
Elektroforézist követően passzív
Elektroforézis
KVANTITATÍV
immunelektroforézis
myeloma proteinek azonosítása
kétdimenziós immunelektroforézis
fehérjekeverékek vizsgálata, aktiváció vagy más molekulákkal való kapcsolódás kimutatása
Counterimmunelektroforézis
bakteriális antigének kimutatása vérből, vizeletből, cerebrospinális folyadékból
immunfixáció
myeloma proteinek azonosítása
Passzív
Radiális immundiffúzió
Elektroforézis
Elektroimmunoassay
nincs
Turbidimetria
nincs
Nefelometria
antigének mennyiségi meghatározása specifikus antitestek segítségével
8
