Buněčné transplantace: značení buněk a zobrazení pomocí MRI
Obsah • Proč potřebujeme zobrazovat buňky? • Jaké jsou vhodné značky pro buněčné značení? • Jak buňky značit? • Jak to funguje? • Jak buňky sledovat in vivo? • Je informace z MRI dostatečná? • Příklady
1
Úvod • Pokrok v buněčných transplantacích • Pluripotentní buňky- potenciální nástroj léčby? • Náhrada poškozené tkáně s omezenou vlastní schopností sebeobnovy
Úvod Jak vizualizovat buňky? Využijme
MR!
2
Úvod Využijme MR! • Proč nic nevidíme? - stejný signál z transplantovaných buněk jako z hostitelské tkáně - nízké rozlišení MRI => není možné zobrazit jednotlivé buňky ale - je možné detekovat i jednu jedinou buňku
Úvod
3
Úvod
Označenou buňku lze detekovat i při nedostatečném obrazovém rozlišení
Úvod
4
Úvod
Shluk označených buněk v tkáni snadno odlišíme
Úvod
• MR – nástroj pro sledování buňek in vivo • Potřebujeme nějaké značky pro buňky!
5
Kontrastní látky Buněčné kontrastní látky • Superparamagnetické kontrastní látky => silný T2 a T2* efekt - Oxid železa obalený dextranem - např. MION, Endorem-Feridex, Resovist… • Paramagnetické kontrastní látky => T1 efekt - Založeny na chelátech Gd
Superparamagnetismus Superparamagnetické kontrastní látky - Vysoká magnetická susceptibilita => Vznik lokálních nehomogenit magnetického pole („homogeneity spoilers“) Defázování protonů difundujících v blízkosti SPM částic – dominantní vliv na T2 a T2*
6
Srovnání PM a SPM látek Celulární markery Superparamagnetické kontrastní látky – silný T2 a T2* efekt (oxidy železa)
Paramagnetické kontrastní látky dominantní T1 efekt (cheláty Gd)
Jaké buňky lze značit kontrastními látkami? Prakticky jakékoliv! Kmenové buňky kostní dřeně potkana Embryonální kmenové buňky potkana Lidské buňky kostní dřeně Lidské hematopoetické buňky CD 34+ Langerhansovy ostrůvky potkana Buňky tumorů, lidské i potkaní …
7
Značení buněk Nespecifické značení buněk Kontrastní látka se přidá do média s buněčnou kulturou, je pohlcena fagocytózou Možnost využít transfekční činidla - poly-L-lysin…
Značení buňek Nespecifické značení buněk Kontrastní látka se přidá do média s buněčnou kulturou, je pohlcena fagocytózou Možnost využít transfekční činidla - poly-L-lysin… Arbab AS, et al. Mol Imaging 2004; 3:24-32
8
Značení buněk Přítomnost železa v buňkách, viabilita B
A
50µm
500nm
C
15µm
D
15 µm
E
15 µm
Značení buněk Specifické značení buněk Vazba kontrastní látky na povrch buňky pomocí vhodně zvoleného antigenu
Bulte JW, et al.: Magn Reson Med. 1992 May;25(1):148-57. Jendelová P, et al. Cell Transplant 2005; 14:173-182.
9
Značení buňek Elektronová mikroskopie
Kolik železa lze do buňky naládovat? Analýza železa (mineralizace + spektrofotometrie, ferrozinový proces atd.) → ∼ 10
– 50 pg železa v jedné buňce (železo internalizováno uvnitř buňky) ∼ 0.5 pg železa navázaného na buněčnou membránu
10
MR vizualizace in vitro Suspense buněk v želatině ve zkumavkách Měření v relaxometru a v MR tomografu
MR vizualizace in vitro 2 000 000 cells per fantom/ 47 cells per image voxel 1 000 000 / 23
800 000 / 19 600 000 / 14
400 000 / 9.4
200 000 / 4.7 Pinkernelle J et al. Magn Reson Med. 2005;53(5):1187-92. Ciobanu L et al. Solid State Nucl Magn Reson 2004;25:138–141. 100 000 cells per fantom/ Dodd SJ et al. Biophys J 1999;76:103–109. 2.3 cells per image voxel Foster-Gareau P et al. Magn Reson Med 2003;49:968–971.
11
MR vizualizace in vitro
MR vizualizace in vivo Implantace buněk • Injekce buněk do kortexu potkana • Potkani v anestézi (inhalace isofluranu ve vzduchu) Imunosuprese: • methylprednisolon acetát • cyclosporin Experimentální MR tomograf 4.7 T, 20 cm Povrchová cívka T2W turbo spin echo sekvence • T2*W gradient echo sekvence
12
MR vizualizace in vivo Implantace 500 000 buňek do mozku potkana
Pozorování migrace buněk do experimentální léze • Fotochemická léze (interakce bengálské
červeně se světlem) v kortexu v levé hemisféře potkana • Značené buňky aplikovány do kortexu kontralaterálně, nebo intravenózně
13
Fotochemická léze MR a histologie (barvení železa)
200µm
Pozorování migrace Potkani s lézí a značenými buňkami • implantovanými kontralaterálně
2 hod.
1 týden po transplantaci
2 týdny
14
Pozorování migrace Potkani s lézí a značenými buňkami • implantovanými intravenózně
před
1 týden po
2 týdny po
Kontrolní pokus Potkani s lézí a aplikovanou čistou kontrastní látkou
Den -1
Den 0
Den 14
Den 21
Den 7
15
Histologické ověření Histologie – nezbytný krok pro ověření MR výsledků Detekce železa/buněk imunohistochemickými metodami po usmrcení zvířete: • Barvení železa (berlínská modř) • BrdU (bromodeoxyuridin) – obarví se fluorescenčním antigenem • GFP (Green Fluorescent Pyridine) • NeuN (neuronální marker) • GFAP (Glial Fibrilar Acidic Protein) • ….
Histologické vyšetření
16
Histologické vyšetření
Histologické vyšetření Ko-lokalizace BrDU + NeuN
BrDU
NeuN
BrDU+NeuN
17
Zobrazení specificky značených buněk Lidské buňky CD34+ cells transplantovány do mozku potkana
T2W
T2*W
Zobrazení specificky značených buněk Histologie
Místo vpichu
Léze
18
Značení nádorových buněk 21 dní po implantaci tumoru
Značení nádorových buněk 7 dní po implantaci tumoru – sferoidy
21 dní po implantaci tumoru
19
Langerhansovy ostrůvky MR zobrazení jednoho ostrůvku in vitro Insulínová granule
Lysosom naplněný železem
Obrázek izolovaného ostrůvku z electronového mikroskopu
Aplikace samotného kontrastu do portální žíly
před
10 minut po
týden po aplikaci
20
Langerhnasovy ostrůvky – výsledky transplantace Značené ostrůvky (2500) transplantovány do jater portální žílou in vivo
Hladina glukózy diabetických potkanů:
1 týden
18 týdnů po Tx
Glykémie před Tx [mmol/l]
3 dny po Tx [mmol/l]
2 týdny po Tx [mmol/l]
22.0 ± 6.0
9.4 ± 3.3
5.1 ± 0.8
Závěr • Magnetická rezonance je užitečný nástroj po detekci vybraných buněk in vivo • Pro detekci buněk je nezbytné magnetické značení pomocí vhodné kontrastní látky • Vhodné kontrastní látky jsou komerčně dostupné • Postupy značení buněk jsou známé, dobře popsané a nepředstavují podstatný problém • Značené buňky jsou životaschopné a kontrastní látku si podrží po dostatečně dlouhou dobu • Buňky je možné značit specificky (je však nutné počítat s tím, že množství kontrastní látky vázané na membránu je nižší)
21
Závěr K čemu je to dobré? Příklad aplikací: • Monitorování úspěšnosti buněčných transplantací • Cílené doručení chemoterapie • Výzkumné projekty (tumory...)
Závěr A co humánní medicína? Klinické testy s buněčnými transplantacemi • kmenové buňky do myokardu • kmenové buňky do míchy po poranění páteře • transplantace Langerhansových ostrůvků
22
