BUKU PANDUAN PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI FITOKIMIA
Disusun oleh : Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. Dr. Erna Tri Wulandari, Apt.
LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2016
0
DAFTAR ISI
Sampul Daftar Isi
1
Kata Pengantar
2
Tata Tertib dan Penilaian
3
Jadwal Praktikum
5
Acara I.
Asistensi
6
Acara II. Pembuatan Simplisia
7
Acara III. Pembuatan Serbuk Simplisia
10
Acara IV. Presentasi dan Diskusi
11
Acara V. Karakterisasi Simplisia dan Pembuatan Ekstrak Acara VI. Identifikasi Kandungan Kimia Simplisia Acara VII. Fraksinasi Ekstrak dan Identifikasi Kandungan Kimia Ekstrak dan Fraksi Acara VIII. Uji Antioksidan Ekstrak dan Fraksi
1
Kata Pengantar
Praktikum Farmakognosi Fitokimia merupakan bagian dari kegiatan matakuliah Farmakognosi Fitokimia yang menyelenggarakan praktik penelitian fitokimia. Kegiatan praktikum dimulai dari melakukan sortasi terhadap tanaman segar, ekstraksi, fraksinasi, uji kualitas dan kandungan kimiawi serta uji aktivitas famakologisnya.
Dengan menempuh praktikum ini
diharapkan mahasiswa peserta kuliah Farmakognosi Fitokimia mampu: 1. menyiapkan simplisia/bahan baku obat ataupun bahan penelitian berupa tanaman, 2. melakukan karekterisasi simplisia, 3. melakukan penyarian (ekstraksi) dari simplisia, dan pemisahan (fraksinasi) kandungan kimia dalam ekstrak tanaman, 4. melakukan uji aktivitas farmakologi dari dengan bahan uji berupa ekstrak dan fraksi tersebut. Bahan yang dipilih dalam praktikum ini berupa rimpang/rhizoma dari tanaman kunyit (Curcuma domestica Val.), karena ketersediaan bahan tersebut berlimpah, mudah tumbuh di Indonesia, banyak digunakan sebagai bahan obat tradisonal baik oleh masyarakat secara mandiri maupun oleh industri obat tradisional. Kurkumin yang merupakan senyawa identitas dari tanaman tersebut memiliki banyak aktivitas farmakologis, pada praktikum ini dipilih uji aktivitas antioksidan sebagai model bagi pembuktian aktivitas farmakologis tanaman dengan metode ilmiah. Panduan ini disusun oleh tim yang terdiri dari dosen dan asisten dosen pendamping praktikum Farmakognosi Fitokimia, untuk itu ucapan trima kasih kepada : Dr. Erna Tri Wulandari, Apt., Anisetus Ratnasari Jebarus, S.Farm., Rafaella Daramika Dwi Esti, Ardini Angelina Papulung, Rianti Putri Kinanti, Eugenia Clarisa Giastini Kerans, Violeta Jesmile, Agatha Herny Sekar Natalia, Yohanes Bintang Pambudi, Deriven Tawang, Edwin Tesalonika, dan Asti Aprilia; atas kerjasama dan kerja kerasnya sehingga panduan praktikum ini terwujud. Semoga panduan ini dapat bermanfaat untuk kelancaran praktikum. Panduan praktikum Farmakognosi Fitokimia ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran demi perbaikan naskah ini sangat kami harapkan.
Yogyakarta, Agustus 2016 Koordinator praktikum, Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.
2
TATA TERTIB DAN PENILAIAN A. Tata Tertib 1. Sebelum melakukan praktikum, praktikan harus sudah mempersiapkan diri untuk memahami materi yang akan dipraktikumkan dan membuat skema kerja pada buku kerja (log book). 2. Praktikan harus sudah hadir paling lambat lima menit sebelum praktikum dimulai dan langsung bon perlengkapan yang diperlukan. Apabila datang terlambat lebih dari 15 menit tidak diperkenankan mengikuti praktikum pada hari itu dan tidak bisa pindah ke kelompok lainnya. 3. Tidak diadakan praktikum susulan ataupun perorangan. Bagi yang tidak dapat mengikuti suatu acara karena alasan harus ada surat keterangan (sakit dari dokter atau tugas dari fakultas ) dan menggantikannya dengan mengikuti praktikum kelompok lain untuk acara yang sama setelah mendapatkan ijin dari koordinator praktikum. 4. Sebelum dan sesudah praktikum, praktikan harus membersihkan meja dan membereskan peralatan praktikum kemudiaan mengembalikan peralatan praktium kepada Laboran . 5. Praktikan yang merusakkan atau menghilangkan inventaris harus menggantinya dengan jenis sama, nilai praktikum tidak akan keluar apabila belum diberesi. 6. Hasil praktikum ditulis dalam log book dan dimintakan pengesahan dosen atau asisten dosen setelah praktikum selesai. 7. Selama praktikum berlangsung, tidak diperkenankan melakukan perbuatan yang dapat mengganggu kelancaran jalannya praktikum dan tidak diperkenankan meninggalkan laboratorium tanpa seijin dosen atau asisten jaga praktikum. 8. Praktikan diwajibkan membawa perlengkapan praktikum yang tidak disediakan oleh labotarium, misalnya: lap, kertas tissue, gunting kecil, dan alat tulis. 9. Laporan awal berupa laporan hasil praktik acara 2 dan 3 disusun dengan format tertentu, dipresentasikan bersama dengan rencana kerja acara 5 sampai 8. 10. Laporan akhir berupa Laporan dari kegiatan praktikum acara 5, 6, 7, dan 8 disusun dengan format tertentu, merupakan sebagai salah satu bahan ujian akhir semester/responsi. Demikian tata tertib ini dibuat untuk ditaati bersama demi kelancaran jalannya praktikum.
B. Penilaian 1. Nilai Praktikum Farmakognosi Fitokimia merupakan 35% dari total nilai Matakuliah Farmakognosi Fitokimia, setelah nilai praktikum digabung dengan nilai kuliah kemudian dikonversi ke nilai huruf.
3
2. Komponen penilaian praktikum adalah sebagai berikut : Komponen
Proporsi
Rentang nilai 0-100
(%) Pre test (acara 2, 3, 5, 6, 7, 8)
5
Aktivitas praktik (acara 2, 3, 5, 6, 7, 8)
5
Diskusi (acara 2, 3, 5, 6, 7, 8)
5
Laporan awal & diskusi (acara 4)
5
Nilai laporan awal & diskusi
Laporan akhir (laporan acara 5,6,7,8)
5
Nilai laporan akhir
Ujian Akhir Semester/Responsi (acara 5-8)
10
Nilai presentasi dan tanya
Jumlah nilai tiap acara dibagi 6
jawab
Yogyakarta,
Agustus 2016
Koordinator Praktikum
4
Jadwal Praktikum Farmakognosi Fitokimia Semester Gasal TA 2016/2017 (22 Agustus – 2 Desember 2016)
mgg ke
KELAS (1 kelas = 2 golongan = 6 kelompok) HARI PRAKTIK WAKTU: Total 330 menit/5,5 jam (6 jp=300 menit/5jam+ istirahat 30 menit)
Materi 1
2
3
4
5 6 7 8 9 10 11 12
Acara 1: Asistensi Tata tertib, penilaian, materi praktik, format log book & laporan, dan pustaka acuan Acara 2: Pembuatan simpisia: sortasi basah, pencucian, perajangan, dan pengeringan Acara 3: Pembuatan serbuk : sortasi kering, penyerbukan, pengayakan, dan penimbangan
1 2 1 2 1 2
A
C
B
SENIN
RABU
KAMIS
JU'MAT
08:00-13:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
22 Agt
24 Agt
25 Agt
26 Agt
09:45-11:45
10:00-12:30
11:00-13:30
11:00-13:30
22 Agt
24 Agt
25 Agt
26 Agt
11:45-13:45
13:00-15:30
14:00-16:30
14:00-16:30
29 Agt
31 Agt
1 Sep
2 Sep
08:00 -10:30
10:00-12:30
11:00-13:30
11:00-13:30
29 Agt
31 Agt
1 Sep
2 Sep
11:00 – 13:30
13:00-15:30
14:00-16:30
14:00-16:30
5 Sep
7 Sep
8 Sep
9 Sep
08:00 -10:30
10:00-12:30
11:00-13:30
11:00-13:30
5 Sep
7 Sep
8 Sep
9 Sep
11:00 – 13:30
13:00-15:30
14:00-16:30
14:00-16:30
Acara 4: Laporan awal & Diskusi Hasil pembuatan simplisia Rencana kerja praktik acara 5 sampai 8
1
libur (ganti hari)
14 Sep
15 Sep
16 Sep
10:00-12:30
11:00-13:30
11:00-13:30
2
libur (ganti hari)
14 Sep
15 Sep
16 Sep
13:00-15:30
14:00-16:30
14:00-16:30
Acara 5: Karakterisasi simplisia Pembuatan ekstrak
1
Acara 6: Identifikasi kandungan kimia simplisia
1
2
2
Acara 7: Fraksinasi ekstrak Identifikasi kandungan kimia ekstrak dan fraksi
1
Acara 8: Uji aktivitas ekstrak dan fraksifraksi
1
13 14
Gol
D
2
2 1
Acara 9: Laporan akhir & UAS/responsi
2
19 Sep
21 Sep
22 Sep
23 Sep
08:00-10:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
26 Sep
28 Sep
11:00-13:30
10:00-15:30
29 Sep
30 Sep
11:00-16:30
11:00-16:30
3 Okt
5 Okt
6 Okt
7 Okt
11:00-16:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
24 Okt
26 Okt
27 Okt
28 Okt
11:00-16:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
31 Okt
2 Nov
3 Nov
4 Nov
11:00-16:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
7 Nov
9 Nov
10 Nov
11 Nov
11:00-16:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
14 Nov
16 Nov
17 Nov
18 Nov
11:00-16:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
21 Nov
23 Nov
24 Nov
25 Nov
11:00-16:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
21 Nov
23 Nov
24 Nov
25 Nov
08:00-13:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
28 Nov
29 Nov
1 Des
2 Des
08:00-13:30
10:00-15:30
11:00-16:30
11:00-16:30
Dosen: Yustina, Erna, Sari Asisten dosen: Rafaella, Rianti, Ardini, Eugenia, Violeta, Agatha, Deriven, Bintang, Edwin, Asti Kelengkapan:
Tempat: ruang diskusi Lab. Farmakognosi Fitokimia Log book: per orang Isi: skema kerja (sebelum praktik) & hasil kerja (setelah praktik) acara praktik minggu ybs Log book Menyerahkan 2 eks. laporan acara 2 & 3 (per 2 kelompok). Log book, tayangan presentasi
Log book
Log book
Log book
Log book Menyerahkan 2 eks. laporan acara 5-8 (per 2 kelompok) seminggu sebelum UAS Log book, tayangan presentasi
5
ACARA I ASISTENSI 1. Setiap praktikan wajib mengikuti asistensi dan mengikuti tata tertib yang ada. 2. Setiap praktikan wajib memiliki buku panduan praktikum. 3. Perkenalan, pengelompokan, koordinasi, dll 4. Penjelasan tata tertib, penilaian, format log book, laporan awal, dan laporan akhir: a. Log book Satu mahasiswa peserta praktikum mempunyai 1 log book Bentuk : buku tulis ukuran A4, sampul hard cover, warna sampul log book tertentu yakni untuk Klas D warna merah, klas A hijau, klas C biru, dan klas B ungu. Pada sampul ditulis identitas mahasiswa yakni nama, NIM, dan golongan praktikum. Sebelum praktikum: log book berisi : Judul Acara, Tujuan, Alat dan Bahan, dan Skema Kerja Setelah praktikum : log book berisi Hasil Praktik b. Laporan awal Laporan praktikum acara 2 dan 3 Dua kelompok praktikum ( 1 meja) menyusun 1 laporan awal Bentuk : ditulis pada kertas HVS A4 dan dijilid, sampul mika bening Halaman pertama berisi : judul praktik yakni : “Pembuatan Simplisia..dst” dan nama (NIM) penyusun Halaman berikutnya berisi : Judul, Tujuan, Tinjauan pustaka, Alat dan bahan, Cara Kerja, Hasil dan Pembahasan, Kesimpulan, Daftar pustaka, dan Lampiran c. Laporan akhir Laporan praktikum acara 5, 6, 7, dan 8 Dua kelompok praktikum ( 1 meja) menyusun 1 laporan awal Bentuk : ditulis pada kertas HVS A4 dan dijilid, sampul mika bening Halaman pertama berisi : judul praktik yakni : “Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas..dst” dan nama (NIM) penyusun Halaman berikutnya berisi : Judul, Tujuan, Tinjauan pustaka, Alat dan bahan, Cara Kerja, Hasil dan Pembahasan, Kesimpulan, Daftar pustaka, dan Lampiran Diserahkan ke laoratorium seminggu setelah praktikum acara 8 5. Pustaka acuan praktikum
6
ACARA II PEMBUATAN SIMPLISIA A. Tujuan Setelah mengikuti praktikum mahasiswa mampu melakukan pembuatan simplisia. B. Tinjauan Pustaka Simplisia adalah bahan alam yang telah dikeringkan yang digunakan untuk pengobatan dan belum mengalami pengolahan, kecuali dinyatakan lain suhu pengeringan tidak lebih dari 60oC (BPOM, 2014). Jenis-jenis simplisia: 1. Simplisia nabati: simplisia yang berupa tumbuhan utuh, bagian tumbuhan atau eksudat tumbuhan. Eksudat tumbuhan adalah isi sel yang secara spontan keluar dari tumbuhan atau isi sel yang dengan cara tertentu dipisahkan dari tumbuhannya dan belum berupa senyawa kimia murni 2. Simplisia hewani 3. Simplisia pelikan (mineral) Simplisia yang aman dan berkhasiat adalah simplisia yang tidak mengandung bahaya kimia, mikrobiologis, dan bahaya fisik, serta mengandung zat aktif yang berkhasiat. Ciri simplisia yang baik adalah dalam kondisi kering (kadar air < 10%), untuk simplisia daun, bila diremas bergemerisik dan berubah menjadi serpihan, simplisia bunga bila diremas bergemerisik dan berubah menjadi serpihan atau mudah dipatahkan, dan simplisia buah dan rimpang (irisan) bila diremas mudah dipatahkan. Ciri lain simplisia yang baik adalah tidak berjamur, dan berbau khas menyerupai bahan segarnya (Herawati, Nuraida, dan Sumarto, 2012). Proses pemanenan dan preparasi simplisia merupakan proses yang menentukan mutu simplisia dalam berbagai artian, yaitu komposisi senyawa kandungan, kontminasi dan stabilitas bahan. Namun demikian simplisia sebagai produk olahan, variasi senyawa kandungan dapat di perkecil, diatur atau dikonstankan (Depkes RI, 2000). Dalam hal simplisia sebagai bahan baku dan produk siap konsumsi langsung dapat dipertimbangkan 3 konsep untuk menyusun parameter standar umum: 1. Simplisia sebagai bahan kefarmasian seharusnya memenuhi 3 parameter mutu umum suatu bahan (material), yaitu kebenaran jenis (identifikasi), kemurnian (bebas dari kontaminasi kimia dan biologis) serta aturan penstabilan (wadah, penyimpanan dan transportasi).
7
2. Simplisia sebagai bahan dan produk konsumsi manusia sebagai obat tetap diupayakan memenuhi 3 paradigma produk kefarmasian, yaitu Quality–Safety-Efficacy (mutuaman-manfaat). 3. Simplisia sebagai bahan dengan kandungan kimia yang bertanggung jawab terhadap respon biologis harus mempunyai spesifikasi kimia, yaitu informasi komposisi (jenis dan kadar ) senyawa kandungan. (Depkes RI, 2000). Standarisasi suatu simplisia tidak lain pemenuhan terhadap persyaratan sebagai bahan dan penetapan nilai berbagai parameter dari produk seperti yang ditetapkan sebelumnya. Standarisasi simplisia mempunyai pengertian bahwa simplisia yang akan digunakan yang tercantum dalam monografi terbitan resmi Departemen Kesehatan (Materia Medika Indonesia). Sedangkan sebagai produk yang langsung dikonsumsi (serbuk jamu dsb.) masih harus memenuhi persyaratan produk kefarmasian sesuai dengan peraturan yang berlaku. (Depkes RI, 2000). Pada umumnya pembuatan simplisia melalui tahapan sebagai berikut: 1. Pengumpulan bahan baku: kualitas bahan baku simplisia sangat dipengaruhi beberapa faktor, seperti : umur tumbuhan atau bagian tumbuhan pada waktu panen, bagian tumbuhan, waktu panen dan lingkungan tempat tumbuh. 2. Sortasi basah: Sortasi basah dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan asing lainnya setelah dilakukan pencucian dan perajangan. 3. Pencucian: dilakukan untuk menghilangkan tanah dan pengotoran lainnya yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian dilakukan dengan air bersih. 4. Perajangan 5. Pengeringan: mendapatkan simplisia yang tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Dengan mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik akan dicegah penurunan mutu atau perusakan simplisia. 6. Sortasi kering: tujuannya untuk memisahkan benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotoran-pengotoran lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering. 7. Pengepakan 8. Penyimpanan dan pemeriksaan mutu (Depkes, 1985).
Rimpang kunyit adalah rimpang Curcuma domestica Val., suku Zingiberaceae, mengandung minyak atsiri tidak kurang dari 3,02% v/b dan kurkuminoid tidak kurang 8
dari 6,60% dihitung kurkumin. Simplisia dari rimpang kunyit memiliki kepingan ringan, rapuhm warna kuning jingga, kuning jingga kemerahan sampai kuning jingga kecokelatan; bau khas, rasa agak pahit, agak pedas, lama kelamaan menimbulkan rasa tebal; bentuk hamper bundar sampai bulat panjang, kadang-kadang bercabang; lebar 0,5-3 cm, panjang 2-6 cm, tebal 1-5 mm; umumnya melengkung tidak beraturan, kadangkadang terdapat pangkal upih daun dan pangkal akar. Batas korteks dan silinder pusat kadang-kadang jelas. Bekas patahan agak rata, berdebu, warna kuning jingga sampai cokelat kemerahan (MenKes, 2009). C. Cara Kerja 1. Pengumpulan rimpang kunyit yang akan dijadikan sebagai bahan baku simplisia 2. Dilakukan sortasi basah untuk memisahkan kotoran dari rimpang 3. Rimpang kunyit dicuci bersih dengan air mengalir 4. Rimpang kunyit yang telah bersih dirajang ± 1mm 5. Setelah dirajang, rimpang dikeringkan menggunakan wadah
D. Pustaka acuan : 1. BPOM, 2014, Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor 12 Tahun 2014 Tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional, Bpom: Jakarta. 2. Depkes RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 9-16. 3. Depkes RI, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, Depkes: Jakarta. 4. Herawati, Nuraida, dan Sumarto, 2012, Cara Produksi Simplisia Yang Baik, Seafast Center, Bogor, 10-11. 5. MenKes, 2009, Keputusan Menteri Kesehatan RI No 261 tentang Farmakope Herbal edisi pertama, Jakarta. Catatan: - Setiap praktikan menyiapkan bahan simplisia dan alat yang akan digunakan. - Simplisia yang telah dirajang dimasukkan ke dalam lemari pengeringan/ruang pengeringan. - Harus melakukan pengecekan terhadap simplisia selama proses pengeringan. - Saat pembuatan simplisia, sebagian simplisia disimpan untuk uji bahan organik asing. - Pustaka lain yang disarankan : World Health Organization, 2003, WHO guidelines on good agricultural and collection practices (GACP) for medicinal plants, Geneva.
9
ACARA III PEMBUATAN SERBUK SIMPLISIA A. Tujuan Setelah mengikuti praktikum
mahasiswa mampu melakukan pembuatan serbuk dari
simplisia. B. Tinjauan Pustaka Simplisia adalah bahan alam yang telah dikeringkan yang digunakan untuk pengobatan dan belum mengalami pengolahan, kecuali dinyatakan lain suhu pengeringan tidak lebih dari 60ᵒC (BPOM, 2014). Serbuk adalah sediaan obat tradisional berupa butiran homogen dengan deraiat halus yang cocok; bahan bakunya berupa simplisia sediaan galenik, atau campurannya (DepKes RI, 1994). Serbuk Simplisia adalah sediaan Obat Tradisional berupa butiran homogen dengan derajat halus yang sesuai, terbuat dari simplisia atau campuran dengan Ekstrak yang cara penggunaannya diseduh dengan air panas (BPOM, 2014). Serbuk dari simplisia memiliki beberapa persyaratan yaitu: 1. Kadar air. Tidak lebih dari 10 %. 2. Angka lempeng total. Tidak lebih dari 10 3. Angka kapang dan khamir. Tidak lebih dari 10 4. Mikroba patogen. Negatif. 5. Aflatoksin. Tidak lebih dari 30 bpj. Untuk penggunaan bahan tambahan seperti pengawet, serbuk dengan bahan baku simplisia dilarang ditambahkan bahan pengawet. Wadah dan penyimpanan untuk serbuk simplisia ialah dalam wadah tertutup baik; disimpan pada suhu kamar, ditempat kering dan terlindung dari sinar matahari (DepKes RI, 1994).
C. Cara Kerja 1. Simplisia yang telah dibuat dipastikan kering, dipastikan dengan hasil rajangan mudah diremah dan mudah patah. 2. Simplisia yang telah kering lalu didisortasi kering untuk menghilangkan kotoran yang masih ada. 3. Simplisia ditimbang kemudian dibuat menjadi serbuk menggunakan alat penyerbukan hingga halus. 3. Serbuk yang telah halus diayak kemudian ditimbang dan dimasukkan dalam wadah, diberi label. 10
D. Pustaka acuan : 1. BPOM, 2014, Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor 12 Tahun 2014 Tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional, BPOM: Jakarta, hal 3,11. 2. DepKes RI, 1994, Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor:661/Menkes/Sk/Vii/1994 Tentang Persyaratan Obat Tradisional, DepKes: Jakarta. Catatan : - Memastikan apakah simplisia yang telah dikeringkan sudah kering. - Sisihkan sebagian simplisia untuk uji bahan organik asing. - Pustaka lain yang disarankan : World Health Organization, 2003, WHO guidelines on good agricultural and collection practices (GACP) for medicinal plants, Geneva.
ACARA IV PRESENTASI DAN DISKUSI A. Tujuan Setelah mengikuti praktikum mahasiswa mampu merencanakan cara dan atau urutan kerja penelitian bidang fitokimia. B. Ketentuan: 1. Bahan diskusi mengacu pada pustaka terkait tema: simplisia, skrining fitokimia, ekstraksi, fraksinasi, isolasi senyawa dari tanaman, serta uji aktivitas antioksidan dari bahan tanaman. 2. Menyerahkan laporan awal. Laporan awal dikumpulkan ke asisten dosen sebanyak 2 eksemplar menjelang acara diskusi. 3. Presentasi hasil pembuatan simplisia. Log book dibawa ke ruang diskusi pada saat presentasi 4. Presentasi rencana kerja (tujuan, alat & bahan, cara kerja) yang akan dilakukan pada acara 5 sampai 8.
Catatan : - viewer siap di ruang diskusi, mahasiswa menyiapkan laptop untuk menayangkan presentasinya. - Presentasi per 2 kelompok (1 meja) bergantian, mahasiswa lain sebagai peserta diskusi 11
ACARA V KARAKTERISASI SIMPLISIA A. Tujuan Setelah mengikuti praktikum mahasiswa mampu melakukan karakterisasi simplisia dan pembuatan ekstrak tanaman. B. Tinjauan Pustaka …….
C. Pustaka acuan : 1. 2. 3. dst
Catatan : -
12
ACARA VI IDENTIFIKASI KANDUNGAN KIMIA A. Tujuan Setelah melakukan praktikum para mahasiswa diharapkan
mampu melakukan
indentifikasi kandungan kimia ekstrak tanaman berupa identifikasi kandungan : 1. Senyawa golongan flavonoida 2. Senyawa golongan antrakinon 3. Senyawa golongan saponin (steroid dan triterpenoid) 4. Senyawa golongan alkaloida 5. Senyawa golongan fenolik dan polifenolik 6. Senyawa Minyak atsiri B. Tinjauan Pustaka …….
C. Pustaka acuan : 1. 2. 3. dst
Catatan : -
13
ACARA VII FRAKSINASI DAN IDENTIFIKASI KANDUNGAN KIMIA A. Tujuan Setelah melakukan praktikum para mahasiswa diharapkan mampu melakukan: 1. melakukan pemisahan/fraksinasi ekstrak tanaman untuk mendapat senyawa aktif 2. melakukan monitoring kandungan kimia ekstrak dan fraksi-fraksi dari ekstrak dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) B. Tinjauan Pustaka Fraksinasi merupakan proses untuk memisahkan komponen campuran dari ekstrak menjadi berbagai kelompok dengan karakteristik fisikokimia yang sama. Pengelompokan dapat berdasarkan kelarutan, ukuran, muatan suatu senyawa dan beberapa fitur lainnya. . Metode fraksinasi dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain presipitasi, ekstraksi pelarut, dialisis, elektroforesis dan menggunakan prosedur kromatografi (Houghton and Raman, 1998). Fraksinasi umumnya dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi seperti Vacuum Liquid Chromatography (VLC), Column Chormatography (CC), dan SizeExclusion Chromatography (SEC) (Sarker, et. al., 2006). Vacuum liquid chromatography (VLC) merupakan metode pemisahan kromatografi yang menggunakan vakum untuk mempercepat kecepatan alir dari fase gerak. Kromatografi vakum cair memiliki beberapa keunggulan, seperti peralatan yang sederhana, waktu pemisahan yang cepat, resolusi yang lebih baik dan kapasitas pemisahan besar. VLC menggunakan kolom berukuran pendek, kolom kromatografi dikemas dengan dry adsorbent. (Xu, et al, 2012). Fase diam yang digunakan dalam VLC pada umumnya menggunakan teknik dry packing. Dry packing merupakan metode yang efektif untuk mengemas fase diam dalam sistem kromatografi dan umumnya digunakan untuk fase diam berupa silica gel. Fase gerak yang dianjurkan adalah kombinasi pelarut dengan polaritas yang berbeda untuk mendapatkan hasil fraksinasi yang lebih baik terutama untuk ekstrak bahan alam (Sarker, et. al., 2006). Kromatografi lapis tipis (KLT) telah banyak digunakan dalam analisis ekstrak suatu bahan
alam
dan
juga
memainkan
bagian
penting
dalam
fraksinasi,
isolasi
dan deteksi senyawa aktif hadir dalam ekstrak tanaman mentah. Dibandingkan dengan metode kromatografi lainnya, KLT merupakan metode sederhana dan murah untuk mendeteksi adanya senyawa aktif dalam suatu tanaman tanaman, sampel dan peralatan yang dibutuhkan juga sedikit dan tidak membutuhkan waktu analisis yang lama. Secara umum, 14
sampel jarang memerlukan persiapan atau derivatisasi sebelum TLC dan bisa langsung ditotolkan atau hanya memerlukan pengenceran sebelum TLC. Hanya nanoliters untuk mikroliter volume standar dan larutan yang harus ditotolkan pada plat KLT kemudian dielusikan (Wagner dan Bladt, 1996). Dalam mengidenfikasi adanya suatu senyawa kimia yang terdapat dalam suatu ekstrak hanya valid bila memenuhi kriteria berikut ini : 1. Senyawa aktif dan senyawa yang berperan sebagai pembanding menunjukkan nilai Rf yang sama di setiap sistem KLT yang dilakukan. 2. Beberapa metode deteksi yang digunakan dan senyawa yang diuji dan senyawa pembanding memiliki reaksi yang sama pada semua metode deteksi yang dilakukan. 3. Sekurang-kurangnya 5 metode fase gerak digunakan untuk menentukan rentang nilai Rf. Reagen semprot dapat digunakan untuk senyawa yang dapat memberikan reaksi berupa perubahan warna dan dapat digunakan setelah senyawa ditotolkan pada plat KLT. Penggunaan marker yang ditotolkan bersama dalam plate KLT perlu untuk dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa, dengan nilai Rf sekitar 0,5, ditotolkan disamping sampel, dan menunjukan nilai Rf pada semua senyawa relatif pada marker. Setelah di running, bila nilai Rf senyawa yang diuji sama dengan marker maka disebut 1. Bila lebih tinggi diatasnya disebut >1 bila kurang dibawahnya disebut <1. Nilai Rf relatif lebih reliabel dibandingkan nilai Rf absolut dalam membandingkan hasil KLT senyawa (Houghton and Rahman, 1998)
C. Cara Kerja 1. Fraksinasi Ekstrak Sintered Glass Buchner dan Erlenmeyer serta vakum yang digunkaan untuk fraksinasi dipasang,. Kertas saring dimasukkan ke dalam kolom sesuai diameter kolom. Sebanyak ± 5 cm Sillica Gel GF 254 dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil di vakum sebagai fase diam. Kemudian Sillica Gel GF 254 disiapkan lagi kemudian dicampurkan dengan ekstrak kering menggunakan mortir dan stamper sambil diaduk perlahan hingga didapatkan campuran homogen dan kering (free flowing). Serbuk ektrak free flowing dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam sintered glass Buchner diatas fase diam dengan permukaan atas diusahakan rata sambil divakum. Dua lembar kertas saring sebesar diameter kolom dimasukkan diatas serbuk ekstrak free flowing. Pelarut dituangkan secara perlahan pada permukaan 15
kertas saring melalui dinding. Proses fraksinasi berlangsung hingga tidak ada lagi larutan yang menetes ke erlenmeyer. Hasil dari fraksinasi dituangkan ke dalam cawan porselen dan diberi label sesuai urutan fraksi. 2. Monitoring Fraksi dan Ekstrak dengan KLT Monitoring KLT untuk mengetahui kandungan senyawa dalam fraksi digunakan standar pembanding senyawa yang bersangkutan kemudian dibandingkan nilai Rf nya. Fraksi dan ekstrak yang telah diperoleh dimonitoring dengan KLT menggunakan sistem yang sama. Setelah dilakukan monitoring dengan KLT fraksi dikeringkan lalu dilakukan penimbangan tiap-tiap fraksi.
D. Pustaka acuan : 1. Houghton P.J., Raman A., 1998, Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extracts, 1st ed., Chapman and hall, pp 54-55,120. 2. Sarker, S.D., et al, 2006, Methods in Biotechnology : Natural Products Isolation, 2nd ed, Humana Press : New Jersey, pp 7-8, 32. 3. Xu, R., Yang, Y., Weimin, Z., 2012, Introduction to Natural Product Chemistry, CRC Press, Taylor and Francis Group, USA, p 15. 4. Wagner H., Sabine, B., 1996, Plant Drug Analysis, Thin Layer Chromatography Atlas, 2nd ed, Springer, New York, pp. 4, 126, 196.
Catatan : -
16
ACARA VIII UJI AKTIVITAS EKSTRAK DAN FRAKSI A. Tujuan Setelah melakukan praktikum mahasiswa diharapkan mampu melakukan uji aktivitas antioksidan dengan bahan uji berupa ekstrak dan fraksi bahan alam, dan menentukan nilai IC50 ekstrak dan fraksi bahan alam.
B. Tinjauan Pustaka Senyawa aktif yang terkandung dalam bahan alam dapat diperoleh dengan cara isolasi yang meliputi tahapan ekstraksi dan fraksinasi. Dengan proses fraksinasi, senyawasenyawa yang ada dalam ekstrak dipisahkan dalam kelompok-kelompok yang kemudian disebut sebagai fraksi. Senyawa yang terkandung dalam ekstrak maupun fraksi tersebut dapat diuji aktivitasnya dengan menggunakan metode tertentu. Salah satu fungsi senyawa aktif yang banyak ditemukan dan diisolasi dari bahan alam adalah antioksidan atau penangkal radikal bebas. Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralisasi atau mencegah kerusakan oksidatif pada molekul target. Antioksidan dapat menetralkan radikal bebas dengan mendonorkan elektronnya. Vitamin A, C, dan E merupakan antioksidan eksogen yang terdapat pada tumbuhan sayur dan buah (Sen, et. al., 2010). Radikal bebas adalah molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya, bersifat sangat reaktif dan tidak stabil. Radikal bebas mencapai kestabilannya melalui reaksi dengan atom atau molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron. Reaksi ini akan menimbulkan reaksi berantai yang mampu merusak struktur sel, bila tidak dihentikan akan menimbulkan berbagai penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini, serta penyakit dengeratif lainnya (Hamid, et al., 2010). Kemampuan senyawa antioksidan dalam bahan alam untuk menangkal radikal bebas dapat diketahui dengan melakukan uji aktivitas antioksidan baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Salah satu uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif adalah dengan melakukan uji penangkapan radikal bebas (radical scavenging test). Pada metode ini dilakukan pengukuran penangkapan radikal bebas sintetik dalampelarut organik polar seperti metanol atau etanol dalam suhu kamar. Sumber radikal bebas yang digunakan dapat berupa senyawa DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil) atau ABTS (2,2-azinobis (3-ethyl benzotiazolin-asamsulfonat)). Prinsip uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah penghilangan warna untuk mengukur kapasitas antioksidan pada panjang 17
gelombang 517 nm menggunakan spektrofotometer UV–Visibel. Radikal DPPH dengan nitrogen organik terpusat adalah radikal bebas stabil dengan warna ungu gelap yang ketika direduksi menjadi bentuk non radikal oleh antioksidan dan berubah menjadi warna kuning (Yu, 2008). DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan sering digunakan untuk menilai aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH yang akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH (Gurav, et. al., 2007).
Aktivitas antioksidan suatu senyawa dapat diketahui dengan adanya penurunan absorbansi DPPH yang terjadi akibat penambahan senyawa tersebut. Parameter yang digunakan untuk pengukuran aktivitas antioksidan pada metode DPPH adalah IC 50, yaitu bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas suatu radikal sebesar 50%. Berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu senyawa, maka semakin rendah nilai IC 50
yang dihasilkan
(Molyneux, 2004).
C. Cara Kerja : 1. Pembuatan larutan DPPH Sebanyak 10 mg DPPH ditimbang dan dilarutkan dengan metanol pa ke dalam labu takar 100,0 mL kemudian ditambahkan hingga batas tanda lalu dikocok sampai homogen hingga didapatkan larutan DPPH 100 µg/mL. Larutan DPPH ini disimpan dalam wadah yang telah dilapisi aluminium foil agar terlindung dari cahaya. Larutan ini dibuat baru setiap kali akan digunakan.
18
2. Pembuatan larutan stok kurkumin 1000µg/mL Sebanyak 10 mg kurkumin ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut p. a dalam labu takar 10,0 mL. Ditambahkan pelarut p a hingga tanda batas, kemudian dikocok sampai homogen. 3. Pembuatan larutan standar kurkumin (seri) Larutan stok konsentrasi 1000µg/mL dipipet sebanyak 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mL, kemudian dimasukkan masing–masing ke dalam labu takar 10 mL. Ditambahkan pelarut hingga tanda batas, kemudian dikocok sampai homogen. Diperoleh larutan seri kurkumin dengan kadar 20; 40; 60; 80; 100 µg/mL. 4. Pembuatan larutan uji Masing-masing ekstrak dan fraksi ditimbang sebanyak 20 mg, ditambahkan pelarut yang sesuai (DMSO) hingga 10,0 mL. Dari larutan tersebut kemudian diambil 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,5 ; 0.7 mL kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL. 5. Optimasi metode a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks.) larutan DPPH Larutan DPPH dengan kadar 100 µg/mL yang telah dibuat sebelumnya diukur serapannya pada panjang gelombang 200–800 nm, kemudian ditentukan panjang gelombang maksimumnya, dengan melihat panjang gelombang dimana terjadinya serapan maksimum. b. Penentuan reaction time Sebanyak 5,0 mL larutan DPPH 100µg/mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup dan telah dilapisi alumunium foil, kemudian ditambahkan larutan stok kurkumin 1000µg/mL sebanyak 5,0 mL. Campuran tersebut dikocok sampai homogen. Campuran tersebut diukur serapannya setiap 5 menit, selama 45 menit. 6. Validasi metode DPPH a. Akurasi Akurasi metode dilakukan dengan mengukur %recovery (perolehan kembali) dari sampel. % recovery dapat diperoleh dengan melakukan adisi larutan standar pada sampel ekstrak. Sebanyak 5 mL ekstrak dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL, kemudian ditambahkan 5 mL larutan seri dengan konsentrasi 20; 60; dan 80 µg/mL. Larutan diukur absorbansinya pada λ maksimum dengan spektrofotometer UV-Visibel.
19
b. Presisi Presisi metode dilakukan dengan menghitung nilai CV. Nilai CV diperoleh dengan cara mengukur absorbansi larutan adisi masing-masing konsentrasi sebanyak tiga kali. Hasil tersebut kemudian dihitung standar deviasinya (SD) dan dibagi dengan rata-rata. c. Linearitas dan Rentang Linearitas dan rentang metode dapat ditentukan dengan melihat persamaan regresi yang diperoleh dari kurva baku hasil pengurkuran serapan larutan seri kurkumin. Nilai r yang diperoleh dari persamaan regresi tersebut menunjukkan linearitas metode. 7. Pengukuran absorbansi larutan uji Sebanyak 5,0 mL larutan DPPH 100µg/mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup dan telah dilapisi aluminium foil, kemudian ditambahkan larutan seri larutan sampel ekstrak dan fraksi masing–masing sebanyak 5,0 mL. Campuran tersebut dikocok sampai homogen, didiamkan selama reaction time. Campuran tersebut diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Visibel pada maksimum. 8. Analisis hasil a. Aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH (%S) dihitung dengan rumus : % aktivitas antioksidan (% S) = Buat hubungan regresi linier antara konsentrasi larutan sampel ekstrak dan fraski dengan nilai % S, yang kemudian digunakan untuk menentukan IC50. b. Akurasi suatu metode dapat dilihat dari % recovery (perolehan kembali) sampel yang digunakan. % recovery dapat dihitung dengan rumus : % recovery = Xn
= Konsentrasi larutan n setelah adisi
Xo
= Konsentrasi tanpa adisi
X’
= Konsentrasi (jumlah) adisi
c. Presisi suatu metode dapat dilihat dari nilai CV. Nilai CV diperoleh dengan membagi nilai Standar Deviasi (SD) dengan rata-rata.
SD
= standar deviasi
x
= kadar sampel = kadar sampel rata-rata
n
= jumlah sampel 20
d. Linearitas suatu metode dapat dilihat dari nilai koefisien korelasinya (r). Nilai r yang baik adalah mendekati 1, hal ini menunjukkan bahwa setiap kenaikan konsentrasi akan selalu diiringi peningkatan absorbansi.
D. Pustaka acuan : 1. Gurav, S., Deshkar, N., Gulkari, V., Duragkar, N., Patil, A., Road, A., and Road, H., 2007. Pharmacologyonline 2: 245-253 (2007), 253, 245–253. 2. Hamid, A.A., Aiyelaagbe, O.O., Usman, L.A., Ameen, O.M., and Lawal, A., 2010. Antioxidants : Its medicinal and pharmacological applications. African Journal of Pure and Applied Chemostry, 4 (8), 142–151. 3. Molyneux, P., 2004. The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin Journal of Science and Technology, 26 (December 2003), 211–219. 4. Sen, S., Chakraborty, R., Sridhar, C., Reddy, Y. S. R., and De, B., 2010, Free Radicals, Antioxidants, Disease and Phytomedicines: Current Status and Future Prospect. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 3 (1), 91-93. 5. Yu, L., 2008. Wheat Antioxidant. Vol.45, John Wiley & Sons, New York, USA, 174. Catatan : -
21
ACARA IX UJIAN AKHIR SEMESTER / RESPONSI A. Tujuan Setelah mengikuti praktikum
mahasiswa mampu melakukan penelitian, menyusun
laporan, dan mempresentasikan hasil penelitian bidang fitokimia. B. Ketentuan: 1. Menyerahkan laporan akhir. Laporan akhir dikumpulkan ke laboratorium sebanyak 2 eksemplar seminggu setelah pelaksanaan praktikum acara 8. 2. Presentasi hasil praktikum acara 5, 6, 7, dan 8; pembahasan; dan kesimpulannya 3. Log book dibawa ke ruang ujian 4. Pustaka yang diacu dibawa (dapat berupa hard atau soft copy).
Catatan : - viewer siap di ruang diskusi, mahasiswa menyiapkan laptop untuk menayangkan presentasinya. - Presentasi per 2 kelompok (1 meja) bergantian, sesuai jadwal yang telah ditentukan
22
