Élelmiszer-biotechnológia I Maráz Anna e. tanár
Budapesti Corvinus Egyetem, ÉTK Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszék 2010 Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszték
A biotechnológia fogalma, értelmezése Biotechnológia: olyan folyamatok, amelyekben élı organizmusokat (baktériumokat, gombákat, növényeket, állatokat, ill. ezek szövettenyészeteit) vagy termékeiket (enzimeket, szerves savakat, antibiotikumokat, stb.) használják fel ipari termelési célra. Új vagy modern biotechnológia: a molekuláris klónozás (génsebészet) alkalmazása törzsnemesítési célra annak érdekében, hogy a klónozó gazda segítségével teljesen új terméket állítsanak elı.
A biotechnológia színei Vörös biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása orvosi (gyógyászati) célra Fehér (szürke) biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása ipari termelésben Zöld biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása mezıgazdasági termelében (Kék biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása tengeri és vízgazdálkodási célra)
Mikrobiális biotechnológia Nagy mennyiségben elıállított mikroorganizmusok alkalmazása értékes termékek elıállítására vagy környezetvédelmi célra. Az elıállítás elsısorban fermentációval történik, melynek során sejteket (általában mikroorganizmusok) szaporítanak el ipari léptékben aerob, ritkábban anaerob körülmények között. Szabályozott elıállítás: fermentorban
Fermentációs ipari biotechnológia • Nagy mennyiségben elıállított mikroorganizmusok alkalmazása értékes termékek elıállítására vagy fontos biokémiai transzformációk megvalósítására. • Az ipari mikrobiális biotechnológiai folyamatokban olyan mikróbákat alkalmaznak, amelyek az adott metabolikus folyamat elvégzésére alkalmasak. • Általában a cél túltermelı törzsek alkalmazása.
Miért hasznosak a mikróbák a biotechnológiában? • A mikróbák gyakorlatilag mindenütt megtalálhatók a földön • Túlélnek és szaporodnak extrém meleg, hideg, sós és savas környezetben, • Jól tőrik a sugárzást, nagy nyomást, nem igényelnek fényt. • Ilyen környezetben általában más élılények nem élnek meg és csak szervetlen tápanyagok állnak rendelkezésre. •Ezeket a mikróbákat extremofil (extrém környezetet kedvelı) mikróbáknak hívjuk. Endolitikus (kı belsejében élı) baktériumok
Miért hasznosak a mikróbák a biotechnológiában? A mikróbák sokfélesége és a környezethez való adaptálódásuk („stressztőrésük”) azt mutatja, hogy a mikróbák már sok olyan kérdést megoldottak, amelyeken most a kutatók dolgoznak.
A kutatások eddig csak a mikróbák sokféleségének („biodiverzitásának”) a felszínét tárták fel. A mikróbák képességeinek, tulajdonságainak, genomjainak megismerése be nem látható lehetıségeket jelent az ipari, egészségügyi, energiatermelési és környezeti területeken.
EZÉRT: „Nem szükséges génsebészeti eszközökkel új tulajdonságokat mutató mikróbákat elıállítani, mert ezeket különbözı élıhelyeken meg lehet találni, csak jó helyen kell keresni !” Probléma: a mikroorganizmusok zöme nem, vagy csak nehezen tenyészthetı, ezért biotechnológiai célra közvetlenül nem alkalmazható. Megoldás: az extrém tulajdonságokért felelıs géneket (pl. termofil enzimek génjei) jól tenyészthetı (fermentálható) mikróbákba kell átvinni génsebészeti eszközökkel, amelyek megtermelik a hasznos fehérjét.
Mikroorganizmusok ipari hasznosítása 1. Sejttömeg (biomassza) termelés - pl. sütıélesztı, takarmányélesztı, mikoprotein, élesztıkivonat, nukleotidok elıállítása 2. Összetett anyagcserefolyamatok hasznosítása - Tejsavasan és alkoholosan erjesztett termékek elıállítása - Biodegradáció, szenyvíztisztítás - Fémkinyerés (biometallurgia) 3. Kis molekulatömegő termékek fermentációs elıállítása - Elsıdleges metabolitok elıállítása - Másodlagos metabolitok elıállítása - Biokémiai (enzimes/sejtes) transzformációk 4. Makromolekulák termelése - Poliszacharidok elıállítása - Lipidek elıállítása - Fehérjék elıállítása
Anyagcsere termékek metabolitok jellemzıi Elsıdleges metabolitok: aktív anyagcseréhez/szaporodáshoz (idiofázishoz) kötötten termelıdnek. 1. A sejtek lebontó (katabolikus) folyamataiban (energianyerés) szükségesek. Pl. polimer szénhidrátokat (keményítı) bontó enzimek, laktózt bontó β–galaktozidáz enzim, citromsav 2. A sejtek felépítı (anabolikus) folyamataiban szükségesek. Pl. aminosavak Másodlagos metabolitok: szaporodás befejezése után (stacioner) fázisban termelıdnek. A sejt számára általában nem szükségesek. Pl. antibiotikumok, mikotoxinok.
Új metabolitot (anyagcsere-terméket) termelı mikróbatörzs és eljárás kifejlesztése Mikróba törzs izolálása ↓ Tenyészet szelektálása ↓ Fermentációs eljárás kidolgozása ↓ Termékek kinyerése
Nyers preparátum
termék screenelése (szőrése)
termék(ek) tisztítása, izolálása, karakterizálása Fermentációs eljárás optimalizálása
Kémiai szerkezet meghatározása (módosítása) ↓ Toxikológiai vizsgálat ↓ Hatósági engedélyeztetés ↓ Piackutatás ↓ TERMELÉS
MIKROORGANIZMUS TÖRZSEK SZŐRÉSE (SCREENING) Szőrés célja: ipari termelésre alkalmas mikroorganizmus törzsek izolálása, más, felesleges mikróbák eltávolítása, illetve gátlása Pl. enzimtermelı vagy antibiotikum termelı mikróbák izolálása talajból
Gátlóanyagot termelı törzs szélesztése
Talajszuszenzió szélesztése táptalajon
Gátlóanyag a táptalajba diffundál
Baktérium telepek kifejlıdése
Antibiotikum termelı mikróbák szelektálása
Törzs kinövése a táptalajon Vizsgálandó törzsek leoltása
Gátlóanyagot termelı telepek Inkubálás Szaporodás
Gátlás
Gátlóanyagot termelı telepek
Streptomyces coelicolor telepek Antibiotikum (aktinorodin, metilenomicin) termelı faj
Biotechnológiai folyamatokban alkalmazható mikroorganizmusok jellemzıi Fı elvárások: 1. Tiszta tenyészet legyen (vírus- és fágmentesség) 2. Jó szaporodási képességgel rendelkezzen 3. Lehetıleg csak a kívánt anyagot termelje 4. Ne termeljen toxikus anyagokat 5. Minél jobban védve legyen a fertızésekkel szemben - pl. savas pH-nál jól szaporodjon, - pl. más mikroorganizmusokat gátló metabolitokat termeljen) 8. Hosszú ideig eltartható legyen.
Törzsek izolálása, beszerzése Izolálás: Közvetlenül a talajból pl. talajszuszpenzió higításával Jellemzı élıhelyekrıl pl. keményítıbontó enzimeket termelı mikróbákat burgonya vagy kukoricafeldolgozó üzemek szennyvízébıl Beszerzés: Törzsgyőjteményekbıl Törzsgyőjtemények: Azonosított és jellemzett mikroorganizmus törzsek fenntartása tartósított tenyészetek formájában (szabadalmaztatáskor is ezekben kell elhelyezni a törzseket). Pl. nemzetközi törzsgyőjtemények: ATCC (USA), DSMZ (Németország), CBS (Hollandia), NCAIM (Budapest)
Mikróba törzsek szelektív feldúsítása • •
•
•
Talaj kezelése (szárítás, hıkezelés, szőrés, detergensekkel, oldószerekkel való kezelés) Szelektív gátlóanyagokkal való kezelés (pl. antibakteriális anyagokkal gombák, antifungális anyagokkal baktériumok feldúsítása) Speciális tápanyagok alkalmazása Pl. keményítı szénforrás esetén keményítıbontó enzimek indukálódnak Hımérséklet, pH, levegıztetés szabályozása (pl. 40 oC felett csak a hıtőrı (termotróf) mikróbák szaporodnak)
Tenyészetek tartósítása 1. 2. 3.
talaj víztelenítése élı (agaros) tenyészetek (4 oC-on) ferdeeagaros tenyészetek paraffin olajjal való leöntése (4 oC-on)
4.
sejtek szuszpendálása steril vízben (4 oC-on) liofilezés fagyasztás (-80 oC-on) folyékony nitrogénben való tárolás (-196 oC)
5. 6. 7.
TÖRZSNEMESÍTÉS és MÓDSZEREI Törzsnemesítés célja: A mikroorganizmus genomjának (DNS-ének, génjeinek) olyan öröklıdı megváltozása, ami az adott biotechnológiai folyamat céljából hasznos (pl. több gátlóanyagot vagy enzimet termel, jobban erjeszt, jobb az aromatermelése). Törzsnemesítés módszerei:
1. Mutáció – biotechnológiában eredményesen alkalmazható 2. Rekombináció A/ Természetes – biotechnológiai alkalmazhatósága csekély - baktériumoknál: konjugáció, transzformáció és transzdukció - gombáknál: szexuális (ivaros) és paraszexuális (ivartalan) keresztezés
B/ Meterséges: biotechnológiai alkalmazhatósága kiváló - protoplaszt fúzió, - rekombináns DNS technika (molekuláris klónozás, génsebészet)
Mutáció, mutagének Mutáció: A genomban (DNS-ben) bekövetkezı öröklıdı bázissorrend (szekvencia) változás Genom: az adott élılény sejtjei (ill. vírusrészecske) által hordozott örökítıanyagok összessége Prokarióta genom alkotói: kromoszómális genom és plazmidok – kettısszálú (ds) DNS Eukarióta genom alkotói: sejtmagi (kromoszómális), mitokondriális, kloroplasztisz genom – dsDNS és plazmidok (dsDNS vagy dsRNS) Vírusgenom alkotói: egyszálú (ss) vagy dsDNS, illetve egyszálú (ss) vagy dsRNS molekulák
A nukleinsavak szerkezete DNS elsıdleges szerkezete DNS másodlagos szerkezete
5’(P) vég
Egyszálú RNS (elsıdleges szerkezet)
Kétszálú RNS (másodlagos szerkezet)
Bázispárok
3’(OH) vég
A kettısszálú (ds)DNS szerkezete 1. A G
T és C bázispárok
2. Foszfát észterkötés 3. Dezoxiribóz
B (jobbmenetes) konformáció
Szabály: A:T=1 és G:C=1
A prokarióta genom szerkezete
Kromoszóma (cirkuláris DNS)
Plazmid
Szuperspirál DNS a kapcsolódó bázikus fehérjékkel
A baktérium genom
Kromoszóma (kettısszálú DNS)
Plazmidok (kettısszálú DNS)
• A DNS-en a nukleotidok meghatározott sorrendben helyezkednek el, és ez a sorrend meghatározza az öröklıdı tulajdonságokat, jellemzıket. •A bázishármasok (tripletek) egy-egy aminosavat kódolnak. • Az egyetlen fehérjét meghatározó (kódoló) DNS szakasz a gén. A kromoszómák több ezer gént hordoznak
Extrakromoszómális elemekPlazmidok
Plazmid: Kör alakú (cirkuláris), önálló, a kromoszómától független replikációra képes duplaszálú DNS molekula Általában több, mint 1 plazmid/sejt (sok-kópiás DNS molekulák) - kivétel az F plazmid Mérete a kromoszóma 1-5%-át teszi ki.
Eukarióta sejtmag elektronmikroszkópos képe
A sejtmag komponensei közül a kettıs sejtmagmembrán, a rajta lévı magpórusok (vastag nyilak), a belsı magmembránhoz kapcsolódó kondenzálódott heterokromatin, valamint a magvacska látható.
Élesztıgomba genom
Kromoszómák 16 kromoszóma (kettısszálú DNS) gélelektroforézissel elválasztva és fluoreszkáló festékkel megfestve
Az öröklıdı tulajdonságok megváltozása: Mutáció Mutáció: a DNS bázissorendjében bekövetkezı öröklıdı változás
Mutánsok típusai 1. A DNS-ben bekövetkezı változás szerint: A/ bázisok kicserélıdése B/ bázisok kiesése (deléció) C/ bázisok betoldása (inzerció) 2. Gyakoriság szerint: A/ spontán mutáció: oka ismeretlen, kis gyakoriságú – 10-6 – 10-11 B/ indukált mutáció: mutagénkezelés hatására jönnek létre, mutánsok gyakoriság megnı (ált. 1-50 % között) 3. Fenotípus szerint: A/ Morfológiai mutánsok: szín, telep-, sejt-morfológia megváltozik. C/ Rezisztens (ellenálló) mutánsok: gátló hatásokkal szemben ellenálló (rezisztens) mutánsok keletkeznek. Pl. antibiotikum-, konzerválószer-, UV-rezisztens mutánsok.
Serratia marcescens
Vad típus-piros
Mutáns - fehér
Mutáns típusok (példa) Vad típus (fekete konídium)
Aspergillus niger penészgomba színmutánsai
Rezisztens mutánsok gátlóanyag
Gátlási zóna Vad típus
Telepmorfológiai mutánsok
Mutánsok típusai (folyt.)
3. Fenotípus szerint (folyt.): C/ Biokémiai mutánsok: lebontó (katabolikus) vagy felépítı (anabolikus) anyagcsere folyamatokban résztvevı egy vagy több gén inaktiválódik vagy szabályozásuk megváltozik. Pl. a lizin aminosav nem termelıdik, a mutáns lizin auxotróf lesz (lizint igényel a növekedéséhez). Vad típus: protoróf jelölés: liz- (auxotróf mutáns), liz+ (vad, prototróf)
Mutagének: A DNS-re hatva kémiai változást idéznek elı
Mutagének csoportosítása hatásmód szerint: A/ Fizikai mutagének 1. Nem ionizáló sugárzások: UV sugárzás (T-T kovalens kötéssel dimerek keletkeznek, replikációkor ez kiesik deléció 2. Ionizáló sugárzások: röntgen sugárzás, γ-sugárzás (pl. 60Co). A cukor-foszfát gerincet eltörik nagy deléciók.
Az UV mutagén hatása
P P
dR
P
dR
P
dR
dR
A DNS-ben a szomszédos timin bázisok között kovalens kötés jön létre. A szerkezet eltorzul, replikáció során a timin dimer kiesik (deléció)
B/ Kémiai mutagének 1. Bázisanalógok: Meghatározott bázisok (A,T,C,G) helyére épülnek be, itt azonban más bázissal párosodnak, mint az eredeti. Replikáció során pontmutáció jön létre. Pl. bróm-uracil (Bu) a timin helyére épül be, de nem az adeninnel, hanem a guaninnel párosodik. Eredmény: T =A
Bu≡G
DNS replikáció
C≡G
2. Alkilezıszerek: A bázisokra alkil (metil-, etil-csoportot) kapcsolnak, ami hibás bázispárosodást okoz. Pl. MNNG (metil-nitro-nitrozo-guanidin) hatására általában A=T
G≡ C
tranzíció jön létre
3. Interkaláló szerek: Beépülnek a DNS két szála közé, eltorzítják a DNS szerkezetét. Ez replikáció során deléciókat okoz. Pl. etidium-bromid, akridin-narancs 4. Dezamináló-szerek: A bázisokban az amino-csoport helyett oxo-csoport lesz, ami hibás bázispárosodást okozhat. Pl. salétromossav/nitritek hatása: C≡G
C
dezaminálás
U
U =A
DNS replikáció
T =A
INTERKALÁLÓ VEGYÜLETEK
Benzo-a-pirén - kipufogógázban (fıként dizelmotoroknál) - cigaretta füstben - faszénen sütött ételekben
• Ames teszt: Mutagén hatás kimutatása Salmonella Typhimurium mutáns törzzsel. • A mutagén hatást az auxotróf (minimálon nem szaporodó) teszt-törzseknek prototróffá történı visszamutációja (backmutációja) jelzi. Ennek következtében a mutánsok minimál táptalajon telepeket képeznek. A megjelenı telepek száma arányos a mutagén hatás erısségével. • A rákos megbetegedések hátterében jelentıs mértékben mutáció húzódik meg, ezért az emberi szervezetet érı mutagén hatásokat minimalizálni kell. • A mutagének a táplálékláncon keresztül, illetve élelmiszer adalékok formájában kerülnek többnyire az élelmiszerbe. • Az elsı szintő mutagén kimutatás az Ames teszt (környezeti mintáknál is).
TÖRZSNEMESÍTÉS MUTÁCIÓVAL 1. Spontán mutánsok izolálása 2. Mutánsok indukálása A/ Kicsi gyakoriságú mutációk indukálása: kis mutagén dózis alkalmazása (> 50% túlélıbıl való izolálás) B/ Nagy gyakoriságú mutációk indukálása nagy mutagén dózis alkalmazása (20% alatti túlélıbıl való izolálás). Dózis: a mutagén hatás erıssége Függ: - mutagén mennyiségétıl (sugárzás erıssége, mutagén anyag koncentrációja) - mutagén hatás idejétıl Túlélés % 100
50 20 dózis
KÜLÖNBÖZİ MUTÁNS TÍPUSOK IPARI MIKROORGANIZMUSOK ESETÉBEN ORGANIZMUS
ALKALMAZOT T MUTAGÉN
MUTÁCIÓ TÍPUSA
TERMÉK
Aspergillus niger
UV- és röntgensugárzás
Regulációs: citromsav termelés növekedése
citromsav
Hansenula anomala
UV-sugárzás
Regulációs: antranilsavrezisztencia
triptofán
Micrococcus glutamicus
MNNG (N-metilN’-nitro-Nnitrozo-guanidin)
Adenin auxotrófia
Inozinmonofoszfát
Brevibacterium flavum
MNNG
Regulációs: 5(aminoetil)-cisztein rezisztencia
lizin
Corynebacterium glutamicum
UV-sugárzás
Homoszerin auxotrófia
lizin
Élesztıgomba hibridek elıállítása protoplaszt fúzióval His -
Ade -
Auxotróf mutáns szülıi törzsek protoplaszt képzés sejtfaloldó enzimmel
Protoplasztok keletkezése izoozmózisos oldatban (pl. 0,6 mol KCl, 1 mol szorbit)
Protoplasztok aggregáltatása (fúziója) PEG+ Ca-oldattal
Fúziós termékek szelektív regenerációja minimál táptalajon Protoplaszt: sejtfalától (álltában enzimes kezeléssel) megfosztott sejt. Protplaszt fúzió: sejtek mesterségesen egyesítése
TÖRZSJAVÍTÁS A REKOMBINÁNS DNS TECHNIKA (MOLEKULÁRIS KLÓNOZÁS) SEGÍTSÉGÉVEL
Molekuláris klónozás (rekombináns DNS technika) = génsebészet
Cél: idegen gén bejuttatása egy új gazdasejtbe, majd a kódolt tulajdonság megjelenése, kifejeztetése, (klónozott géntermék = heterológ fehérje termeltetése)
Molekuláris klónozás (rekombináns DNS technika) Cél: idegen gén bejuttatása új gazdasejtbe, a kódolt tulajdonság megjelenése (géntermék termeltetése=heterológ fehérje)
A molekuláris klónozás lépései 1/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal 2/ A DNS fragmentum beépítése a klónozó vektorba: a rekombináns DNS molekula (rDNS) in vitro elıállítása 3/ A rekombináns (transzformáció)
DNS
bejuttatása
a
gazdasejtbe
4/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón (genetikailag módosított organizmus =GMO) kimutatása, izolálása 5/ A GMO molekuláris és fiziológiai jellemzése
Restrikciós endonukleázok Specifikus felismerési és hasítási hellyel rendelkezı, DNS-t hasító enzimek (pl. HindIII a Haemophylus influenzae d és az EcoRI az Escherichia coli R törzsbıl)
HindIII enzimes hasítás Tompa végek keletkeznek
Eco RI enzimes hasítás Ragadós végek keletkeznek
Restrikciós endonukleázok, specifikus felismerési és hasítási helyeik A restrikciós endonukleáz jelölése
Termelı mikroba
Bam HI
Bacillus amyloliquefaciens H
Eco RI
Escherichia coli R
Hasítási hely ↓ 5,-G-G-A-T-C-C-3, 3,-C-C-T-A-G-G-5, ↑ ↓ 5,-G-A-A-T-T-C-3, 3,-C-T-T-A-A-G-5, ↑
Eco RII
Escherichia coli R
Hae III
Hemophilus aegyptius
↓ 5,-C-C-T-G-G-3, 3,-G-G-A-C-C-5, ↑ ↓ 5,-G-G-C-C-3, 3,-C-C-G-G-5, ↑
Sal I
Streptomyces albus
↓ 5,-G-T-C-G-A-C-3, 3,-C-A-G-C-T-G-5, ↑
A molekuláris klónozás lépései 1/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal 1. 2/ A DNS fragmentum beépítése a klónozó vektorba: a rekombináns DNS molekula (rDNS) in vitro elıállítása
2.
3/ A rekombináns DNS bejuttatása a gazdasejtbe (transzformáció) 4/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón (genetikailag módosított organizmus =GMO) kimutatása, izolálása
3.
5/ A GMO molekuláris és fiziológiai jellemzése 4.
A molekuláris klónozás lépései 2. 1/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal 1.
2/ A vektor hasítása ugyanezzel a restrikciós endonukleázzal 2/ A DNS fragmentum beépítése a klónozó vektorba: a rekombináns DNS molekula (rDNS) in vitro elıállítása
3.
3/ A rekombináns DNS bejuttatása a gazdasejtbe (transzformáció) 5. 4.
4/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón (genetikailag módosított organizmus =GMO) kimutatása, izolálása 5/ A GMO molekuláris és fiziológiai jellemzése
A génsebészet gyakorlati alkalmazása 1. Mikróbás fermentációk • enzimtermelés új gazdasejtben (pl. rekombináns kimozin, β-glükanáz, celluláz) • erjedésipari géntechnológiailag módosított élesztıtörzsek 2. Vírusellenes vakcinák (antigének) termelése •Vírus köpenyfehérjét kódoló gén klónozása, antigen termeltetés baktériummal vagy élesztıgombával (pl. kanyaró, veszettség, hepatitis B vírusok). 3. Emlıs proteinek termelése •vérfehérjék termeltetése (pl. véralvadást elısegítı faktorok, véralvadékot oldó proteinek) •emberi hormonok termelése (sárgatest stimuláló hormon, insulin, méh relaxin) •immunitást növelı fehérjék termelése (interferonok, lizozim, tumor nekrózis factor) 4. Transzgénikus növények elıállítása • Bt. (Bacillus thuringiensis) rovarölı toxint termelı növények elıállítása (pl. gyapot) • vírusellenálló növények elıállítása virus köpenyfehérje gén klónozásával • lassan érı (nem puhuló) Favr savr paradicsom elıállítása
4. Transzgénikus állatok elıállítása Gyógyászati jelentıségő fehérjék termeltetése állatokkal (pl. antitripszin kiválasztása juh tejben, véralvadékot oldó fehérje termeltetése kecskében) 5. Géntechnológiailag módosított mikroorganizmusok felhasználása a környezeti biotechnológiában • klórozott növényvédıszereket (pl. 2,4,5-T) bontó enzimek génjeinek klónozása • halogénezett aromás vegyületek (pl. klórbenzén), egyéb aromas vegyületek (anilinek, toluene), szénhidrátok bontása génklónozással 6. Génterápia Öröklıdı betegségek kezelése génsebészeti eszközökkel
Gyógyászati célra elıállított heterológ humán fehérjék Fehérje
Funkció
Rekombináns gazda
inzulin
diabetes gyógyítása
E. coli és Saccharomyces cerevisae
relaxin
szüléskönnyítı
E. coli
somatotropin
törpeség gyógyítása
E. coli
calcitonin
csontgyengeség gyógyítása
Saccharomyces cerevisae
VIII véralvadási faktor
hemophilia (vérzékenység) gyógyítása
E. coli
plazminogén aktivátor
véralvadás gátló
E. coli
tumor nekrózis faktor
rák gyógyítása
β-interferon
sclerosis multiplex gyógyítása, AIDS ellenes hatás
E. coli
γ- interferon
rákellenes hatás, reuma gyógyítása
E. coli
lizozim
gyulladásgátló
Saccharomyces cerevisae
α-amiláz
keményítı lebontása
Saccharomyces cerevisae
Fehérje mérnökség útján módosított proteinek Fehérje mérnökség: A fehérjét kódoló gén célzott, pontmutációs megváltoztatása génsebészeti eszközökkel. Cél: enzimaktivitás növelése, specifikusság szélesítése, ellenállóság javítása.
A módosított tulajdonság
Eljárás
Glükóz izomeráz hıstabilitásának növelése
Az enzimben a 253-as argininnek lizinre való kicserélése
Biopeszticid hatás kifejtése vedlést szabályozó hormon módosításával
hormon módosítása a LacZ gén inszerciójával
α-antitripszin oxidációval szembeni rezisztenciájának növelése
metioninnak valinra való kicserélése
hirudin hatékonyságának növelése
a 47-es aszparaginnak lizinre vagy argininre való kicserélése
A génsebészet mérföldkövei 1972
•
Az elsı rekombináns DNS molekula létrehozása
1977
•
Humán szomatosztatin hormon elıállítása rekombináns DNS (rDNS) technikával
1979
•
Inzulin elıállítása rDNS technikával
1982
•
Génsebészeti úton (E. coli-val) elıállított humán inzulin kereskedelmi forgalomba hozatala
1985
•
Glifozát gyomírtószerrel szemben toleráns (transzgénikus) dohány elıállítása A polimeráz láncreakció (PCR) technika kidolgozása
• 1988
•
Az elsı genetikailag stabil transzgénikus haszonnövény (Glifozát toleráns szója) elıállítása
1989
•
Genetikailag módosított vírus (baculovirus) szabadföldi kibocsátása a vírusrezisztencia növelése céljából
1991
•
Humán proteineket termelı transzgénikus malacok és kecskék kifejlesztése
1995
•
Elsı teljes baktérium genomok megszekvenálása
1996
• Az elsı eukarióta élılény teljes genomjának megszekvenálása (élesztı genom projekt)
1999
•
2003
•
Az elsı növény (Arabidopsis thaliana) teljes genomjának megszekvenálása Humán genom szekvenálásának befejezése (humán genom projekt)
Enzimek elıállítása és biotechnológiai alkalmazása
Mikróbákkal történı enzimelıállítás elınyei
Gyors növekedés, ipari körülmények között jó tenyészthetıség 2. Olcsó növekedési szubsztrátumok alkalmazása (természetes táptalajok, mezıgazdasági melléktermékek) 3. Nagyszámú mikróbafaj és törzs sokféle enzimet termel, ami törzsjavítással tovább fokozható, illetve növelhetı 4. Nem mikrobiális enzimek génjei mikróbákban klónozhatók, génsebészeti úton expressziójuk javítható 1.
Enzimelıállítás lépései 1. Megfelelı enzimet termelı törzs szelektálása Szelektív táptalaj alkalmazása pl. amiláz - keményítı proteáz - kazein . 2.Izolált mikróba jellemzése, rendszertani besorolása (legalább nemzetség szintig), lehetıleg GRAS - biztonságosnak elfogadott legyen 3. Mikróbák elszaporítása – környezeti feltételek optimalizálása, léptéknövelés 4.
Enzimek kinyerése, tisztítása, minısítése
Enzimek ipari elıállítása mikroorganizmusokkal Enzim neve α amilázok
glükoamilázok
Amilázok
Termelı mikroorganizmus Bacillus subtilis Bac. amyloliquefaciens Bac. licheniformis Aspergillus oryzae Aspergillus niger Asp. awamori Rhizopus niveus
pullulanázok
Aerobacter aerogenes Pseudomonas amylodermatosa
β-amilázok
Bacillus polymixa Bac. cereus Rhizopus japonicus
Élesztıgomba amiláz aktivitásának kimutatása Keményítıs táptalaj – lugollal vagy jódgızben megfestve
Saccharomycopsis fibuligera Feltisztulási zóna (lebontott keményítı) Amiláz aktivitást mutatja
Enzim neve
Bacillus coagulans Streptomyces sp. Arthrobacter sp
glukózizomerázok
Alkalikus proteázok
PROTEÁZOK
Termelı mikroorganizmus
Bac. licheniformis B. amyloliquefaciens Streptococcus fradiae
Neutrális proteázok
Bac. subtilis Pseudomonas aeruginosa Aspergillus oryzae
Savanyú proteázok
Aspergillus niger Asp. awamori
Oltóenzim (rennin)
Mucor miehei Mucor pusillus Endothia parasitica
Pektinázok
Aspergillus niger Asp. wentii Rhizopus sp.
Lipázok
Aspergillus spp. Mucor spp. Rhizopus sp. Candida sp
PROTEOLITIKUS és LIPOLITIKUS aktivitás vizsgálata Proteolitikus aktivitású mikróba telepek Kazeinos táptalajon – részleges fehérje hidrolízis (denaturálás)
Tejporos táptalajon – teljes hidrolízis (feltisztulási zóna)
Lipolitikus aktivitású mikróba telepek TWEEN 80-as táptalajon kicsapódás
PCA-tributirines táptalajon– teljes hidrolízis (feltisztulási zóna)
Proteázkészítmények jellemzıi Mikróba
Enzim
Aspergillus saitoi
Savas proteáz
Asp. oryzae
Optimális Hımérséklet (oC)
Optimális pH
Elhasított kötések száma
45
2,4-4,0
9
Neutrális proteáz
45
4,5-7,0
9
Asp. oryzae
Alkalikus proteáz
45
8,0-9,0
5
Mucor miehei
Tejalvasztó proteáz (rennin)
55
-
2
Bac. subtilis
Neutrális proteáz
50
5,0-7,5
6
Bac. licheniformis
Alkalikus proteáz
55
8,0-9,0
7
Lipázkészítmények jellemzıi Mikróba
Enzim
Optimális Hımérséklet (oC)
Optimális pH
Maximális hidrolízis fok
Asp. niger
Lipáz 1
40
5,0-5,5
90
Asp. niger
Lipáz 2
40
6,5
70
Rhizopus sp.
lipáz
40
6,5-7,0
80
Mucor miehei
lipáz
40
7,8-8,2
94
Candida sp.
lipáz
37
5,5-6,5
90
Enzimek alkalmazása az élelmiszer feldolgozásban Enzim
Termelı mikróba
Alkalmazás
α-amiláz β-amiláz
Bac. subtilis, Bac. amyloliquefaciens Bacillus subtilis
keményítı cukorszirup, detergens Sörgyártás, maltóz szirup
Glükoamiláz
Asp. niger
keményítı cukorszirup
Glülóz izomeráz
Bacillus coagulans
Keményítıbıl invert cukorszirup
Invertáz
Sacch. cerevisiae
Invert cukorszirup
Laktáz (béta-galaktozidáz)
Kluyv. lactis
tejtermékek
Celluláz
Trichoderma viride
Gyümölcslevek, kávé
Pektináz
Asp. niger
Gyümölcslevek
Lipáz
Asp. niger
sajtgyártás
Savas proteáz
Asp. niger
sütıipar
Neutrális proteáz
Bac. Subtilis, Bac. amyloliquefaciens Bac. Subtilis, Bac. amyloliquefaciens Mucor miehei
Sörgyártás
Alkalikus proteáz Rennin
Mosószergyártás, hús puhítása sajtgyártás
ENZIMTERMELİ MIKROORGANIZMUSOK TÖRZSNEMESÍTÉSE . Törzsnemesítés szempontjai: - ne termeljen káros anyagcsere termékeket (pl. antibiotikum, mikotoxin) - ipari szinten gazdaságos legyen - enzim minısége megfelelı legyen (szennyezı enzim minimális legyen) Módszerek: - mutáció - rekombináció - in vitro rekombináns DNS technika
Rekombináns kimozin elıállítása a) Szarvasmarha kimozin génbıl cDNS elıállítása (nem tartalmaz intronokat) b) • A kimozin cDNS beépítése plazmid vektorba Rekombináns DNS elıállítása) • A rekombináns DNS transzformálása E. coli-ba. •Továbbklónozása Aspergillus nigerbe • Továbbklónozása Kluyveromyces lactis-ba. Termelés: USA E. coli és Aspergillus niger Hollandia: Kluyveromyces lactis
E. coli
A. niger
A sajtgyártáshoz használt kimozinnak kb. 80%-a rekombins DNS termék (GMO) Miért nem kell jelölni: Mert mennyisége nem éri el a termékben a 0,9%-ot.
Aminosavak termelésének alapjai Aminosavak ipari fermentációjának kezdete: 1957 – a Corynebacterium glutamicum L-glutaminsav túltermelı törzsének izolálása (Japán).
Aminosavak felhasználása: 1. Élelmiszeripar - glutaminsav- ízfokozó - aszparaginsav, alanin – győmölcslevekben ízjavító - glicin – édesség fokozó - metionin – szójatermékek aminosav kiegészítése - cisztein – kenyér minıségét javítja, antioxidáns - triptofán, hisztidin – tejpor avasodását gátolja 2. Takarmányok kiegészítése - lizin, metionin (treonin, triptofán) – növényi fehérjék komplettálása 3. Gyógyászat - aminosavkeverék infúziós oldatokban - betegség gyógyítására (cisztein, glutamin) 4. Vegyipar - polimerek alapanyagai (pl. polialanin, lizin-izocianát gyanta)
Aminosavak elıállítása mikroorganizmusokkal a/ Glutaminsav elıállítása: Corynebacterium glutamicum-mal vagy Brevibacterium flavum-mal A biotin mennyiség alacsony szinten tartásával, zsírsav származék felhasználásával a termelt glutaminsav kiválasztódik a közegbe. Citrátkörön keresztül keletkezik: → → izocitrát
izocitrát-dehidrogenáz
α-ketoglutarát
glutamát-dehidrogenáz
glutamát
CO2
glutamin-szintetáz
NH3 glutaminsav b/ L-lizin elıállítása: Corynebacterium glutamicum regulációs mutánsaival (pl. homoszerin auxotróf törzs).
Szervessavak elıállítása mikroorganizmusokkal Legnagyobb mennyiségben fermentációval állítják elı. Termék
Termelı mikróba
Felhasználás
Fermentáció körülményei
Ecetsav
Acetobacter fajok
Élelmiszeripar, vegyipar
Etanol szubsztrátum oxidálása 15%-os termék keletkezik 90-95%-os kihozattal
Citromsav
Aspergillus niger
Élelmiszeripar, vegyipar, gyógyszeripar
Melasz alapú tápközeg Fémek mikromenyiségben gátolják 60-80% kihozatal
Tejsav
Homofermentatív tejsavbakt. Lb. delbrueckii
Élelmiszeripar, vegyipar, gyógyszeripar
Tisztított táptalaj (extrakció elısegítése)
Glükonsav
Aspergillus niger
Ca, Na megkötése
Glükóz-sók tápközeg Egylépéses oxidáció Kevertetett fermentáció 95% kihozatal
Fumársav
Rhizopus nigricans
Gyanták készítése
Cukor szénforrás Erıs levegıztetés 60% kihozatal
1. Citromsav Elsısorban az Aspergillus niger túltermelı (mutáns) törzseivel álllítják elı. Citrátkörbıl lép ki. A vas és mangán még nyomokban is gátolja a termelést. Fermentáció típusai: a/ Felületi eljárás, amelynél használnak szilárd táptalajt és folyékony táptalajt (a termelés kb. 20 %-át adja). b/ Szubmerz eljárás (a termelés kb. 80 %-át adja). Legnagyobb felhasználó az élelmiszeripar, de a vegyipar fémipar, gyógyszeripar, mosószergyártás is jelentıs.
2. Ecetsav Étkezési és ipari célra állítják elı fermentációval. Az ecetsavas fermentációt fıként az Acetobacter aceti végzi. Aerob anyagcserefolyamat, az etanol oxidációja. Ecetsav gátló hatású. alkohol-dehidrogenáz
Etanol
acetaldehid-hidrogenáz
acetaldehid NAD(P) NAD(P)H2
3 ATP
ecetsav NAD(P)
NAD(P)H2
3 ATP
a/ Borecet elıállítása: orleansi (francia) eljárással borból. Kádakban felszíni ecetsavbaktérium hártya alakul ki. b/ Étkezési ecet elıállítása: - ecetsav-baktériumok faforgácson történı immobilizálásával. A cefrét a bükkfaforgáccsal megtöltött tartályon áramoltatják át, az ecetet az alsó tartályban győjtik össze (német eljárás). - szubmerz eljárással, kevert-levegıztetett fermentorban (Frings eljárás) - 90%-os kihozatal - automatizált
Antibiotikumok Mikroorganizmusok által termelt olyan másodlagos anyagcsere termékek (szekunder metabolitok), amelyek más mikroorganizmusok szaporodását kis koncentrációban, specifikusan gátolják. Hatás: „sztatikus” – megállítja a szaporodást vagy „cidikus” - megöli a sejteket Legfontosabb antibiotikum termelı mikróbák: 1. Streptomyces genus (pl. S. griseus, S. venezuelae, S. fradiae) 2. Bacilllus genus (pl. B. polymmyxa, B. licheniformis) 3. Fonalasgombák (pl. Penicillum chrysogenum, Cephalosporium acremonium)
Antibiotikumok (és más gátlóanyagok) kimutatása diffúziós gátlózónával
Gátlóanyag (pl. antibiotikum)
Mikróba telep vagy fermentlé
Érzékeny mikróba Diffúziós gátlózóna
A penicillin felfedezése: Flemming 1929, 1942 Penicillium chrysogenum gátló hatásának felfedezése-1929 Ipari gyártás: 1942
A/ Penicillium chrysogenum telep körül kialakult gátlási zóna. Érzékeny baktérium: Staphylococcus aureus B/ Penicillium chrysogenum konidiumtartók mikroszkópos képe
Antibiotikumok jellemzése • Kémiai szerkezet alapján pl. szénhidrát, makrociklusos, peptid, aromás antibiotikumok • Termelı mikróba(k) szerint pl. Streptomyces griseus, Penicillium chrysogenum • Hatásspektrum alapján pl. antibakteriális, antifungális, antivirális • Hatásmechanizmus alapján pl. sejtfalszintézis gátló, fehérjeszintézis gátló
A legfontosabb antibiotikumok (példák) Antibiotikum
Termelı mikróba
Hatásspektrum
Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium
Gram-pozitív baktériumok Sokféle baktérium (széles spektrum)
Streptomyces griseus
Gram-pozitív baktériumok
Streptomyces rimosus Streptomyces aureofaciens
Sokféle baktérium Gram-pozitív baktériumok
Makrolid antibiotikumok eritromicin
Streptomyces erythraeus
Gram-pozitív baktériumok
Polién antibiotikumok amfotericin B
Streptomyces nodosus
Gombák
β-Laktám antibiotikumok penicillin cefalosporin Aminoglükozid antibiotikumok sztreptomicin Tetraciklin antibiotikumok oxitetraciklin klórtetraciklin
Antibiotikumok felhasználása 1. Humán gyógyászat - patogén mikróbák ellen - antitumor antibiotikumok 2. Állatgyógyászat - patogén mikróbák ellen - takarmányadalékok (EU rendelet tiltja) 3. Növényvédelem - patogén mikróbák ellen 4. Kutatás (biokémia, mikrobiológia, molekuláris biológia)
BAKTERIOCINEK • Antibakteriális (bakteriosztatikus vagy baktericid) peptidek és fehérjék, amelyeket Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok termelnek. •
Hatásspektrumuk szők (csak közelrokon fajok ellen hatásosak).
•
A bakteriocin termelés a termelı baktérium számára szelekciós elınyt biztosít.
Bakteriocin gátlási zóna
Nincs bakteriocin termeles
Bakteriocinek jellemzıi •
Extracelluláris fehérjék, peptidek
•
Hıstabilok vagy hıre érzékenyek
•
Már kis koncentrációban is kifejtik hatásukat
•
Az ember emésztıenzimei (proteázok) lebontják
•
Általában plazmid kódolja
Bakteriocinek és hatásuk (példák) Bakteriocin neve
Termelı mikroorganizmus
Gátolt mikroorganizmusok
Colicin
Escherichia coli
Eneterobacteriaceae
Leukocinek
Leuconostoc fajok
Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus
Megacin
Bacillus megaterium
Bacillus törzsek
Nizin (kereskedelmi forgalomban van)
Lactococcus lactis
Lactobacilllus bulgaricus L. monocytogenes Bacillus törzsek Clostridium botulinum
Pediocinek
Pedicoccus acidilactici
L. monocytogenes
Plantanicin
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus
Reuterin
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus törzsek Salmonella, Clostridium
Szakacin
Lactobacillus sake
L. monocytogens Lactobacillus, Pediococcus Leuconostoc
Bakteriocinek felhasználása Ipari fermentációval történı elıállítás, forgalmazás pl. Nizin (kereskedelmi forgalomban van) 2. Természetes élelmiszer fermentációkban (pl. tejtermékek) a starter kultúrának szelekciós elınyt biztosít 3. Természetes élelmiszer fermentációkban (pl. sajtgyártás) a starter kultúra gátolja a patogéneket (pl. Listeria monocytogenes-t) 1.
MIKOCINEK, ZIMOCINEK A mikocinek gombák által termelt kis molekulatömegő, szők hatásspektrumú fehérjék, amelyek más gombákat gátolnak. Az élesztık által termelt mikocint zimocinnek (killer toxinnak) hívják. Érzékeny élesztıgomba metilénkékes táptalajra leoltva
Zimocin termelı (Killer) élesztıgomba
Gátlási zóna kék peremmel
A zimocinek jellemzıi • Extracelluláris fehérjetermészető (protein vagy glikoprotein) molekulák • Hıérzékenyek • pH-érzékenyek (általában 5,5 alatti pH-n inaktiválódnak) • Proteázok lebontják • Gombavírusok (pl. Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum fajoknál) vagy plazmidok (Kluyveromyces lactis faj esetében) kódolják
Killer élesztık gyakorlati jelentısége
1.
Etanolos erjedési folyamatoknál Killer fajélesztık (borélesztık): Szelekciós elıny a must erjesztése során
2. Természetes élesztıközösségekben a killer törzsek gátolják az érzékenyeket (pl. Pichia) 3. Növényvédelemben: patogén gombák gátlása 4. Gyógyászatban: felszíni mikózisoknál (Hansenula mrakii)
