BTK

   

LAPORAN PRAKTIKUM  GENETIKA MOLEKULAR             

HIBRIDISASI SOUTHERN                           

KHAIRUL ANAM  P051090031/BTK                     

BIOTEKNOLOGI  SEKOLAH PASCASARJANA  INSTITUT PERTANIAN BOGOR  2009  0   

   

HIBRIDISASI SOUTHERN      PENDAHULUAN    Hibridisasi  Southern  adalah  proses  perpasangan  antara  DNA  yang  menjadi  sasaran  dan  DNA  pelacak. Hibridisasi southern biasa digunakan untuk melacak adanya DNA yang sesuai dengan pelacak,  misalnya untuk mengetahui integrasi transgen di dalam organisme transgenik. Berdasarkan prinsipnya,  hibridisasi  southern  dapat  dibagi  ke  dalam  4  tahap,  yaitu  :  (1)  fiksasi  DNA  di  membran  (nitroselulosa  atau  nilon);  (2)  pelabelan  pelacak;  (3)  prehibridisasi  dan  hibridisasi;  dan  (4)  deteksi  hasil  hibridisasi.  Fiksasi  DNA  di  membran  dapat  dilakukan  melalui  beberapa  cara,  yaitu  (1)  penetesan  DNA  (dot  blot)  langsung di membran; (2) fiksasi DNA bakteri replika (plasmid rekombinan) di membran; (3) fiksasi DNA  fage  rekombinan  dari  satu  replika  plak  di  membran;  dan  (4)  transfer  DNA  dari  gel  agarose  (yang  sebelumnya telah dimigrasikan dengan elektroforesis) ke membran. Membran yang dipergunakan untuk  memfiksasi  DNA  biasanya  menggunakan  membran  nilon  karena  lebih  kuat  daripada  membran  nitroselulosa. Dot blot dan hibridisasi terhadap DNA replika hanya dapat digunakan untuk mendeteksi  keberadaan  DNA  tetapi  tidak  dapat  mengetahui  ukurannya.  Sebaliknya,  hibridisasi  southern  terhadap  DNA yang difiksasi ke membran dengan cara transfer melalui metode southern (southern blotting) dapat  diketahui ukuran DNA targetnya (Suharsono dan Widyastuti, 2006).   Pelacak  dapat  diperbanyak  melalui  beberapa  metode  sebagai  berikut  :  perbanyakan  plasmid  yang  dilanjutkan  dengan  isolasi  fragment  DNA  yang  diinginkan  melalui  elusi  atau  dengan  PCR  dengan  menggunakan  primer  yang  spesifik.  Berbagai  bahan  dan  cara  telah  dikembangkan  untuk  melabel  pelacak. Pada dasarnya bahan untuk melabel DNA pelacak dapat dibagi ke dalam dua kelompok, yaitu  (1) bahan radioaktif (radioisotop) seperti  32P,  33P,  3H; dan (2) bahan non radioaktif seperti digoxigenin,  biotin,  ECL,  dan  alkalin  fosfatase  (AlkPhos).  Radioisotop  sangat  sensitif  untuk  digunakan  dalam  hibridisasi  southern,  tetapi  membutuhkan  fasilitas  yang  canggih  dan  keamanan  yang  harus  dijaga  dengan ketat. Oleh karena itu pemilihan bahan non‐radioisotop menjadi sangat menarik karena dampak  lingkungannya  lebih  ringan  dibandingkan  dengan  menggunakan  bahan  radioisotop  walaupun  sensitifitasnya lebih rendah dibandingkan dengan bahan radioisotop (Suharsono dan Widyastuti, 2006). 

1   

    ALAT DAN BAHAN    Alat  PCR, Elektroforesis, Gel Dock, Shaker, UV transiluminator, vacuum dan mesin hibridisasi    Bahan  Fage rekombinan, Film, Probe    METODE  Southern Blotting  Dilakukan  elektroforesis  DNA  di  dalam  0,8%  gel  agarose  tanpa  ethidium  bromida  (dengan  penanda berat molekul DNA). Kemudian, DNA diwarnai dengan merendam gel yang mengandung DNA  di  dalam  larutan  ethidium  bromida  (0,5  mg/ml),  pada  wadah  yang  terlindung  cahaya  selama  20‐30  menit.  DNA  divisualisasikan  di  atas  lampu  transiluminator  UV,  dan  dibuat  foto  gel  untuk  mengetahui  posisi penanda ukuran DNA. Kemudian, gel hasil elektroforesis direndam dengan larutan depurinasi 0.25  M HCl selama 10 menit dan digoyang dengan kecepatan 10 rpm, lalu dibilas dengan akuades. Kemudian  gel direndam dalam larutan denaturasi (0.5 M NaOH) sebanyak 500 ml, digoyang selama 20‐25 menit,  pada kecepatan 10 rpm, lalu gel dibilas dengan akuades. Lalu gel direndam dalam larutan netralisasi (1.5  M NaCl; 0.5 M Tris HCl pH 7.2 1 mM EDTA)sebanyak 500 ml digoyang selama 15 menit, lalu gel dibilas  dengan  akuades.  Membran  nylon  Hybon  N+  disiapkan  sesuai  dengan  ukuran  gel  yang  kemudian  membran tersebut dipotong salah satu ujungnya untuk mengetahui orientasi membran dan diberi label  dengan  pensil.  Membran  nylon  dibasahi  dengan  2X  SSC  dan  diletakkan  di  atas  alat  vacuumgene  (Pharmacia).  Gel  diletakkan  di  atas  membran,  ditambahkan  20X  SSC  hingga  tergenang  dan  diatasnya  ditutup dengan plastic. Gel di vakum dengan 60 mBar selama kurang lebih 3 jam. Membran diambil dan  dimasukkan ke dalam alat crosslinker untuk menfiksasi DNA di membran pada 1200 x 100 mJoule/cm2 :  1 menit. Membran siap untuk dilakukan hibridisasi southern blot.    Pelabelan Probe  20 ul cross linker solution diencerkan dengan ditambahkan 80 ul air. DNA (atau RNA) diencerkan  untuk label sampai konsentrasi 10 ng/ul dengan air yang berbeda. Diambil 10 ul sampel DNA (yang telah  diencerkan)  dan  masukkan  ke  eppendorf,  kemudian  didenaturasi  dalam  water  bath  100°C  selama  5  menit. Eppendorf didinginkan di es selama 5 menit,lalu  spin down. 10 ul buffer reaksi ditambahkan ke  dalam ependorf, lalu  di mix. Kemudian ditambahkan 2 ul labeling reagen, lalu di mix. Ditambahkan 10 ul  cross linker solution, lalu di mix, kemudian di spin down.kemudian dilakukan diiInkubasi 37°C selama 30  2   

    menit.  Probe  dapat  digunakan  langsung  atau  dapat  disimpan  di  es  paling  lama  2  jam  (untuk  penyimpanan yang lebih lama, probe yang sudah di label dapat disimpan dalam larutan 50% (v/v) pada ‐ 15°C s.d. ‐30°C sampai 6 bulan.     Prehibridisasi  Larutan  buffer  prehibridisasi  dibuat  dengan  melarutkan  NaCl  0,5  M  dan  5  %  (b/v)  blocking  reagent  ke  dalam  larutan  hibridisasi  dan  dikocok  dengan  magnetic  stearer  selama  1  jam  pada  suhu  ruang.  Membran  dimasukkan  ke  dalam  tabung  hibridisasi  dengan  posisi  yang  mengandung  DNA  pada  bagian  dalam  gulungan  dan  ditambahkan  SSC  3x  sebanyak  5  ml  tanpa  menyebabkan  terbentuknya  gelembung udara antara dinding tabung dengan membran. Larutan SSC 3x dibuang dan ditambahkan 15  – 20 ml larutan buffer prehibridisasi ke dalam tabung. Lakukan prehibridisasi selama 1 jam  pada suhu  42°C.    Hibridisasi   Larutan  buffer  prehibridisasi  di  dalam  tabung  ditambahkan  dengan  DNA  pelacak  yang  sudah  dilabel  dengan  menggunakan  pipet  mikro.  Tabung  eppendorf  tempat  DNA  pelacak  yang  sudah  dilabel  dibilas dengan larutan prehibridisasi supaya seluruh pelacak dapat masuk ke dalam larutan. Hibridisasi  dilakukan pada suhu 42°C.     Washing  Larutan  pembilas  pertama  dipanaskan  pada  suhu  42°C  di  dalam  oven  hibridisasi,  dilakukan  2  kali.  Membran  diambil  dari  dalam  tabung  dan  dimasukkan  dalam  wadah  yang  berisi  larutan  pembilas  kedua menggunakan pinset berujung tumpul. Wadah diletakkan di atas shaker dan digoyang selama 5  menit  pada  suhu  ruang,  dilakukan  2  kali.  Larutan  pembilas  kedua  dalam  wadah  di  ganti  dengan  yang  baru dan diinkubasikan kembali selama 5 menit pada suhu ruang.    Deteksi Sinyal   Larutan deteksi sinyal dibuat dengan mencampurkan detection reagent 1 dan detection reagent  2  (1:1)  sebanyak  0,125  ml/cm2.  Wrapping  plastik  disiapkan  diatas  permukaan  kaca  yang  rata  dan  diteteskan dengan larutan deteksi. Kelebihan larutan pembilas kedua dibuang dan permukaan membran  yang mengandung DNA disentuh (direndam) ke atas tetesan cairan pendeteksi, selanjutnya di inkubasi  selama 1 menit. Kelebihan larutan deteksi dibuang dan membran di bungkus dengan wrapping plastik.  3   

    Membran diletakkan dalam kaset dengan permukaan yang mengandung DNA menghadap atas. Dalam  ruang  gelap  dengan  menggunakan  lampu  bercahaya  merah  (red  safe  light)  film  autoradiografi  ECL  seukuran  membran  diletakkan  di  atas  membran  dan  dipress  di  dalam  Film  Cassette,  dilakukan  dalam  keadaan  gelap  pada  suhu  kamar  selama  4  jam.  Film  diangkat  dari  Film  Cassette  dan  dicuci  dengan  larutan  developer  dalam  keadaan  gelap  pada  suhu  kamar  selama  5  menit.  Film  dicuci  dengan  larutan  fixer dalam keadaan gelap pada suhu kamar selama 5 menit. Film dibilas dengan air pada suhu kamar  selama 5 menit. Film dikeringanginkan pada suhu kamar. Sinyal yang terdapat pada film diobservasi.   HASIL DAN PEMBAHASAN  Hasil  Hibridisasi southern dilakukan pada gen DNA yang terbentuk dalam pita yang terdapat pada gel  agarose  hasil  dari  elektroforesis.  Pada  gambar  1,  terdapat  pita  DNA  dari  gen  hasil  transformasi  yang  telah di amplifikasi yang kemudian DNA dari pita inilah yang akan di hibridisasi.                                     

Gambar 1. Gel agarose hasil elektroforesis pada pemeriksaan gen hasil transformasi 

  4   

    Pada gambar 2, diketahui bahwa pita DNA yang ada pada gel agarose berhasil di hibridisasi yang  kemudian dari hasil ini akan dilakukan deteksi sinyal dengan menggunakan pelacak DNA. Pada deteksi  sinyal tidak terbentuk pita pada film.                           

Gambar 2. Hasil hibridisasi DNA dari gel agarose hasil elektroforesis 

  Pembahasan 

Hibridisasi southern sangat berguna dalam penentuan keberadaan gen. walaupun teknik PCR dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan suatu gen atau DNA, tetapi hibridisasi southern tetap dibutuhkan karena dengan teknik ini dapat diketahui panjang gen yang ada di dalam suatu organisme. Selain itu hibridisasi juga dapat digunakan untuk kajian keragaman molekuler, seperti RLFP dan RAPD. Penapisan terhadap suatu pustaka untuk mengisolasi gen, baik pustaka genom maupun pustaka cDNA, memerlukan teknik hibridisasi southern. Konfirmasi hasil isolasi suatu gen atau DNA juga dilakukan menggunakan teknik hibridisasi southern (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Pada prinsipnya terdapat dua cara pemblotan DNA. Pertama adalah pemblotan dengan sistem kapiler yang sudah dipakai sejak lama. Kedua adalah pemblotan dengan sistem vakum yang banyak dipakai belakangan ini karena relative lebih cepat dan mudah. Terbukti pada percobaan kali ini hibridisasi southern dengan menggunakan vakum berhasil, seperti yang terlihat pada gambar 2,meski lebih cepat. Hibridisasi berhasil dilakukan, ditunjukkan dengan adanya pita yang ada pada membran nylon hybond N+ yang juga telah diberi pelacak (Suharsono dan Widyastuti, 2006).     5   

     

Berdasarkan  informasi  yang  diperoleh,  dari  percobaan  deteksi  sinyal,  tidak  diperoleh  bercak 

hitam  pada  film.  Tidak  adanya  bercak  hitam  pada  film  dikarenakan  tidak  timbulnya  cahaya  dimana  cahaya  tersebut  dapat  timbul  apabila  substrat  yang  berupa  enzim  (alkalin  phosphatase)  yang  telah  diberi  label  (detection  reagent)  berekasi  membentuk  komplemen  dengan  DNA  hasil  hibridisasi  yang  telah diberi pelacak (probe). Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa hibridisasi dari hasil transfeksi  tidak menghasilkan sinyal pada film x‐ray.    

Tidak terdapatnya sinyal (dot) pada film X‐Ray tidak berarti tidak terdapatnya gen target, namun 

perlu  dilakukan  dengan  waktu  yang  lebih  lama  pada  tahap  deteksi  sinyal  ketika  membran  hasil  hibridisasi  ditempelkan  dengan  film  sehingga  memungkinkan  untuk  alkalin  phosphatase  bereaksi  dengan DNA yang ada pada membran.    KESIMPULAN 

1. Hibridisasi southern berhasil dilakukan dengan metode blotting menggunakan vakum. 2. Sinyal DNA hasil hibridisasi tidak dapat dideteksi karena tidak tercetak pada film.   DAFTAR PUSTAKA   

Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI – DIKNAS, Bogor.  

6