BIOTECHNOLOGIE V CHEMICKÉ A FARMACEUTICKÉ VÝROBĚ

BIOTECHNOLOGIE V CHEMICKÉ A FARMACEUTICKÉ VÝROBĚ – sylabus k předmětu

BIOTECHNOLOGIE V CHEMICKÉ A FARMACEUTICKÉ VÝROBĚ Sylabus obsahuje klíčové informace z látky probírané na přednáškách. V žádném případě však uvedený rozsah nestačí pro úspěšné absolvování zkoušky z tohoto předmětu.

Úvod Předmět „Mikrobní technologie II“ je věnován produkci látek s hlavním využitím v medicíně a některým speciálním produktům s uplatněním v průmyslových oblastech (chemický a potravinářský průmysl, zemědělství). Kromě procesů založených na kompletní biosyntéze daných produktů je věnována pozornost biokatalytickým procesům pro specifickou modifikaci čistých chemických sloučenin. Charakteristika produkčního mikroorganismu rozhodující pohledy: a) technologický b) ekonomický c) ekologický Technologické požadavky  snadné uchovávání kmene  stabilita technologických vlastností v průběhu konzervace  vysoká rychlost růstu (menší riziko kontaminace)  možnost kultivace na relativně jednoduchých mediích  snadná regulace (řízení) růstu a produkce  minimální tvorba vedlejších produktů (strukturních analogů)  vysoká koncentrace produktu  snadná izolace produktu (extracelulární vs. intracelulární)  minimální nároky na design, a materiál technologického zařízení Ekonomické požadavky  možnost využití levných a snadno dostupných substrátů  dostatečně vysoká specifická rychlost tvorby produktu po dlouhou část kultivačního procesu  vysoká produktivita procesu vztažená na: spotřebovaný substrát dodanou energii (míchání, aerace, chlazení ap.) dobu kultivace pracovní objem zařízení  minimální náklady na izolaci a purifikaci produktu (povaha mikrobní populace, vedlejší produkty ap.)  celková minimalizace vstupních a provozních nákladů Ekologické požadavky  nepatogenní kmeny (závisí na typu procesu)  možnost využití netoxických substrátů  omezení vzniku toxických meziproduktů a vedlejších produktů 1


 minimalizace aplikace organických rozpouštědel  minimalizace odpadů (plynných, kapalných, pevných)  snadná likvidace vzniklých odpadů  snadná kontrolovatelnost procesu Pojem nadprodukce Schopnost mikroorganismu tvořit v průběhu celého životního cyklu nebo jeho určitého úseku metabolit (produkt) v koncentraci výrazně vyšší, než odpovídá potřebě pro jeho vyrovnaný růst, resp. reprodukci, je popisována jako nadprodukce dané látky. Schopnosti nadprodukce u mikrobního kmene lze dosáhnout fyziologickou adaptací, mutacemi, resp. genovými manipulacemi. Fyziologická adaptace  nalezení (stresových) faktorů posilujících nadprodukci  optimalizace složení medií  optimalizace dalších podmínek vnějšího prostředí  opakovaná selekce kmenů v daných podmínkách Fyziologická adaptace obvykle probíhá trvale paralelně s vlastním technologickým procesem. Mutace, cílené genové manipulace Pro dosažení nadprodukce má význam modifikace jak v oblasti regulačních (začátek a časový rozsah exprese strukturálních genů, imunita producenta vůči produktu, řízení transportu přes membrány, aktivita enzymů obecného metabolismu) tak strukturálních genů (optimalizace struktury proteinů – enzymů). Mutace se provádějí UV zářením, chemickými činidly ap. Možné negativní důsledky tohoto zásahu spočívají v nižší stabilitě mutantů, horších růstových vlastnostech, zhoršení sporulace ap. Principy genových manipulací  poznání genetické regulace biosynthesy produktu  přenos genů do technologicky vhodnějšího mikroorganismu  znásobení počtu kopií genů  změna aktivity regulačních genů  modifikace genu - modifikace struktury produktu  klonování genů Možnosti řízení fyziologického stavu nadprodukce Pro navození a udržení fyziologického stavu nadprodukce u mikroorganismu disponujícího touto schopností se využívá modifikace kultivačních podmínek včetně podmínek vnějšího prostředí. Nadprodukce bývá omezena na určitou etapu růstu buněčné populace. Typickým příkladem je nadprodukce sekundárních metabolitů (např. antibiotika, námelové alkaloidy), která bývá spojena s pozdních fázích exponenciálního růstu a fází stacionární. Tomu se pak přizpůsobuje řízení (regulace) celého kultivačního procesu:  rychlý nárůst biomasy na počátku procesu (kultivace bez limitace nutrientů), využití snadno utilizovatelných substrátů o minimalizace nebezpečí kontaminace o ekonomické výhody  navození nutričního stresu

2


o alespoň jedna ze základních živin je nahrazena pomalu utilizovatelným zdrojem (ne absolutním nedostatku) o navození jiného fyziologického stavu - stavu nadprodukce Živiny vhodné pro navození nutričního stresu mohou být zdroje uhlíku, dusíku, fosforu, respektive jejich vhodná kombinace. Snadno utilizovatelnými substráty (vhodnými pro růstovou fázi) jsou např. glukosa, amonné ionty, některé aminokyseliny, anorganické fosfáty. Mezi pomalu utilizovatelné zdroje, vhodné pro navození stavu nadprodukce lze řadit sacharosu, laktosu, oligosacharidy, škrob, tuky, proteiny, organicky vázaný fosfor ap. Konkrétní kombinace živin a jejich způsob dávkování jsou pro jednotlivé producenty zcela individuální. Kromě nutričního stresu může být fyziologický stav změněn i dalšími faktory vnějšího prostředí (pH, teplota, osmotický tlak), nebo přídavkem speciálních sloučenin (prekurzory syntézy produktu, kovové ionty, ...), které umožní derepresi/indukci enzymů zodpovědných za vysokou syntézu produktu. Další možností navození stavu nadprodukce je eliminace zpětnovazebné regulace syntézy samotným produktem (na genetické úrovni, kontinuální separace produktu z kultivačního media).

Antibiotika β-Laktamová antibiotika Největšího objemu výroby dosahují 2 skupiny těchto antibiotik: peniciliny a cefalosporiny. Penicilin byl objeven Sirem Alexandrem Flemingem v roce 1928. Průmyslová výroba s využitím povrchové kultivace však byla zahájena až v roce 1941 v USA. Jednalo se o první průmyslově vyráběné antibiotikum. V tomto případě byl použit jako produkční mikroorganismus Penicillium notatum, kmen izolovaný již Flemingem. Pro submersní technologii, která následovala krátce poté byl použit nový producent – Penicillium chrysogenum, od něhož jsou odvozeny kmeny, které se používají pro výrobu penicilinových antibiotik i v současnosti. Biosyntéza β-laktamových antibiotik vychází ze 3 aminokyselin – valinu, leucinu a αaminoadipové kyseliny (Obr. P1*). β-laktamová antibiotika působí převážně na G+ bakterie; polosyntetické preparáty mají též účinnost proti některým G- bakteriím. Mechanismus účinku těchto látek spočívá v inhibici syntézy buněčné stěny katalyzované transpeptidasami (Obr. P2). Technologický proces Příprava kultivačních medií, inokula a vlastní kultivační proces mají mnoho společných rysů pro výrobu většiny antibiotik, tedy nejen β-laktamových. Viz následující schéma:

*

Obrázky označené P jsou v Příloze

3


Výroba penicilinu Produkční kmen se uchovává ve formě lyofilizovaných spor, resp. vegetativního mycelia v ochranném mediu (např. glycerol) v hluboko mrazících boxech (- 70 °C). Příprava inokula má několik stupňů a provádí se v nutričně bohatém mediu při teplotách okolo 25 °C. Doba zdvojení buněk se pohybuje okolo 6 hodin. Produkční medium obsahuje pomalu utilizovatelné C-zdroje, např. dextriny, škroby, sacharosu; rostlinné i živočišné oleje, ethanol. N-zdroj může zajišťovat corn-steep, mouka z bavlníkových semen ap. Tyto suroviny obsahují také dostatek síry (Obr. P3). Nezbytná je aplikace prekurzorů, v závislosti na typu produkovaného penicilinu. Penicilin G (benzylpenicilin) vyžaduje fenyloctovou kyselinu v množství cca 0,47 g/g. Dávkování se provádí kontinuálně po celý produkční interval (fenoxyoctová kyselina je toxická). Penicilin V (fenoxypenicilin) vyžaduje fenoxyoctovou kyselinu v množství cca 0,50 g/g. Aplikace se provádí v několika podílech. Technologické zařízení - Průmyslově byly realizovány batch a fed-batch procesy. Objem: 40 až 200 m3; v současnosti i více; fermentory typu air-lift, resp. míchaný turbínový fermentor (materiál antikoro – vyšší koncentrace Fe má inhibiční vliv). Regulace procesu se provádí na základě měřených veličin: teplota (23 až 28 °C), tlak (nárůst parciálního tlaku CO2 na 0,08 atm. může snížit produkci penicilinu až o 50% ), pH (6,5 – 7,0), koncentrace kyslíku (0,4 až 1,0 mmol/l/min), koncentrace biomasy, základní složení media, koncentrace produktu. Dostatečného nárůstu biomasy by mělo být dosaženo během prvních 40 hodin kultivace. Rozhodující podíl penicilinu je produkován ve fázi zpomaleného růstu a fázi stacionární (sekundární metabolit) (Obr. P4, P5). V určitém rozmezí velmi nízké růstové rychlosti populace platí přímá závislost mezi touto rychlostí a rychlostí produkce penicilinu. Konečná koncentrace biomasy je limitována parametry zařízení (kapacita aeračního zařízení, chlazení). Množství penicilinu vyprodukovaného na jednotku objemu závisí na: a) koncentraci biomasy (počtu buněk) - dána typem zařízení b) specifické rychlosti synthesy penicilinu (qpen) c) délce produkční fáze. Množství vyprodukovaného penicilinu v daném procesu lze vyjádřit následujícím vztahem:

 q t 

t2 t1

pen



Xt 

dt

kde t1 je čas inokulace a t2 je čas ukončení produkčního procesu. Regulace produkční fáze: nízké růstové rychlosti je dosahováno primárně limitací dostupnosti Czdroje, případně v kombinaci (kolimitací) s aktuální koncentrací rozpuštěného kyslíku. V tomto případě musí platit vztah : [sacharid]/Ksacharid < [O2]/K O2. Jiným kolimitujícím nutrientem mohou být fosfáty. Fed-batch procesy vyžadují řešení následujících prvků: a) zajistit optimální koncentraci biomasy ve vztahu k rychlosti přenosu kyslíku a odvodu tepla ze systému b) nárůst koncentrace toxických a inhibujících látky s délkou procesu 4


c) minimalizace zpětnovazebné inhibice produktem Semikontinuální (fermentor naplněn před poklesem qpen - odběr media) a kontinuální procesy vyžadují řešení následujících prvků:  - ztráta nespotřebovaných živin  ztráta biomasy  zřeďování produktu  tvorba a nárůst koncentrace toxických metabolitů  nestabilita producenta – růst podílu buněk s nízkou produkcí antibiotika Izolace penicilinu (Obr. P6) Jednotlivé izolační kroky vycházejí z vlastností media v němž je penicilin obsažen a z fyzikálněchemických vlastností samotného produktu. Penicilin (G, V) je silná kyselina, vyrábí se ve formě různých solí. Meziprodukty biosynthesy se snadno rozkládají v kyselém prostředí. Také penicilin G má v kyselém prostředí nižší stabilitu ve srovnání s penicilinem V. Molekula penicilinu může být snadno štěpena β-laktamasami. Vlastní izolační proces se obvykle skládá z následujících kroků:  ochlazení kultivačního media na teplotu 0 až 4 °C (zamezení rozkladu β-laktamasami)  oddělení biomasy (mycelia) ve vakuovém rotačním filtru  snížení pH na hodnoty 3 až 4 (rozklad vedlejších produktů, převedení molekuly na nedisociovanou formu)  extrakce penicilinu do organického rozpouštědla (amylacetát, cyklické ketony ap.)  odstranění barviv a dalších nečistot na koloně s aktivním uhlím  zvýšení pH na 5 až 7 a následná krystalizace v podobě sodné nebo draselné soli  izolace, promytí a sušení krystalů Purifikační kroky zahrnují rekrystalizaci, sterilní filtraci a sterilní azeotropickou vakuovou destilaci (injekční forma – PENICILIN G, tabletová forma – PENICILIN V). Aminoglykosidová antibiotika Jedná se o látky tvořené 2 až 4 (amino)sacharidy, resp. (amino)cyklitoly. První zástupce této velmi široké skupiny antibiotik byl objeven Selmanem A. Waksmanem v roce 1943. Aminoglykosidová antibiotika působí převážně proti G- bakteriím. Streptomycin byl prvním antibiotikem, které účinně inhibovalo růst Mycobacterium tuberculosis, původce do té doby smrtelného onemocnění – tuberkulosy. Hlavními producenty aminoglykosidů jsou aktinomycety. Streptomycinu je produkován Streptomyces griseus (Obr. P7). Producentem neomycinů je Streptomyces fradie Další významnou skupinu – gentamiciny produkuje Micromonospora purpurea nebo M. echinospora. Aminoglykosidy inhibují u citlivých buněk proteosyntézu. Mají mírně zvýšenou toxicitu také pro člověka. Při dlouhodobé aplikaci může být zaznamenána nekrosa ledvinových tubulů, respektive postižení sluchových funkcí. Základní charakteristika technologického procesu

5


Produkt má značnou toxicitu též pro samotného producenta. Tento faktor hraje důležitou roli při šlechtění nových kmenů. V průběhu kultivačního procesu vzniká komplex strukturních analogů požadovaného produktu, což negativně ovlivňuje následný izolační a purifikační proces. Omezení počtu těchto analogů je možné dosáhnout v rámci šlechtění (mutace) kmenů, respektive úpravou kultivačních podmínek. Principy izolace aminoglykosidů Aminoglykosidy jsou bazické sloučeniny, rozpustné ve vodě. Jsou stabilní v poměrně širokém rozsahu pH a teplot. Stupeň čistoty jednotlivých preparátů vychází z požadavků medicínské praxe. Například gentamicin je směsí 3 strukturních analogů a několika dalších minoritních složek. Základními operacemi při izolacích a purifikacích konkrétních produktů jsou:  okyselení nebo alkalizace media (uvolnění antibiotika z mycelia  oddělení biomasy - filtrace  ionexová chromatografie - katexy (hrubé přečištění)  ionexová chromatografie - jemnější zrnitost katexu (jemné přečištění)  izolace jednotlivých analog - chromatografie (alumina, silikagel, celulosa)  konečné přečištění - chromatografie (CM celulosa, CM Sepharosa, CM Sephadex)  krystalizace - organické, anorganické sole (pikráty, p-hydroxybenzensulfonáty)  konečné produkty - hydrochloridy, sulfáty Tetracyklinová antibiotika Zásadní objevy v oblasti tetracyklinových antibiotik spadají do období 1948 až 1954. Postupně se jednalo o chlortetracyklin, oxytetracyklin a tetracyklin. Základní skelet molekuly vzniká v rámci oligoketidové biosyntetické dráhy. Nejvýznamnějšími producenty jsou streptomycety. Streptomyces aureofaciens produkuje převážně chlortetracyklin a minoritně tetracyklin zatímco Streptomyces rimosus produkuje převážně oxytetracyklin a minoritně opět tetracyklin. Rezistenci producentů vůči vlastním produktům lze zvyšovat jejich dlouhodobou kultivací v selekčním tlaku chlortetracyklinu. Tetracyklinová antibiotika se řadí mezi širokospektrální. Jsou aktivní vůči řadě G+ i G- bakteriím, vůči spirochetám, mykoplasmatům, ryketsiím ap. Cílovým místem v citlivých mikroorganismech je proteosyntetický aparát. Základní charakteristika technologického procesu Média připravovaná z komplexních substrátů poskytují obvykle vyšší výtěžky. Mezi uhlíkaté zdroje využívané pro produkci tetracyklinů lze zařadit sacharosu, škrob a jeho hydrolyzáty, tuky. Posledně jmenované současně slouží jako odpěňovadla. Amonné ionty nemají inhibiční vliv na produkci antibiotika. NH4OH je tak možné použít současně jako zdroj dusíku a regulátor pH. Dvojmocné kationty (Ca2+ Mg2+, Sr2+) vyvazují antibiotikum z roztoku a tím snižují inhibiční vliv na producenta. Výroba chlortetracyklinu vyžaduje potřebnou dávku Cl- iontů. Naopak aplikací ostatních halogenidů dochází k blokování vazby chloridového iontu a zvyšuje se podíl vyprodukovaného tetracyklinu na úkor chlortetracyklinu. Stimulátorem tvorby antibiotik u S. aureofaciens je benzylthiokyanát. Dále se podílí na změně morfologie producenta, pigmentaci a průběhu sporulace.

6


Principy izolace tetracyklinů Aplikované operace vycházejí z následujících vlastností tetracyklinů:  látky amfoterní povahy  náchylnost k polymeracím a přeskupování molekuly Po oddělení biomasy a kultivačního media je možné uplatnit následující izolační kroky:  adsorpce (křemelina, aktivní uhlí) s následující chromatografií, resp. selektivní extrakcí  extrakce do n-butanolu (z H+ nebo OH-prostředí), alternativně s podporou vysoké iontové síly (NaCl)  precipitace za vzniku komplexů s aryl azosulfonovými barvivy, kationty kovů alkalických zemin, primárními (sekundárními) alkylaminy Významným krokem při purifikaci je rekrystalizace ve formě jednoduchých solí nebo bazí. Ostatní antibiotika Kromě výše uvedených 3 skupin antibiotik mají v současné farmacii významné zastoupení antibiotika makrolidová, chinolony, peptidová antibiotika a některá další (Obr. 2).

roční obchod [mil US $]

ostatní antibiotika karbapenemy peniciliny makrolidy, ketolidy chinolony, fluorochinolony cefalosporiny

Fyzikálně-chemická charakteristika, biosyntéza a biologická aktivita těchto látek je podrobněji popisována v sylabech k předmětu „Biochemie sekundárních metabolitů“.

Kancerostatika – zásady uzavřených technologií Kancerostatika představují jednu ze skupin biotechnologických produktů, jejichž výroba vyžaduje velmi sofistikované technologické procesy a kvalitativně vyšší stupeň zabezpečení. Patří do skupiny tzv. uzavřených technologií. Reálně to znamená úplné oddělení výrobního procesu od vnějšího prostředí. Hlavní důvody odlišného přístupu jsou:  vysoká toxicita produktů - limitující prvek procesu  velmi nízké koncentrace produktu ve značně komplexních mediích (komplikovaná izolace a purifikace)  požadavek dokonalé ochrany personálu a vnějšího prostředí (typy používaných producentů, vysoká biologická aktivita produktů, vysoká toxicita intermediátů a odpadů) 7


 menší rozměry experimentálních a produkčních zařízení Obecné schéma vývoje a testování nového preparátu (kancerostatika) 1. klíčový prvek – podrobná biologická charakteristika tumoru 2. testy inhibiční aktivity vůči tumorům malých zvířat (myši, morčata) 3. injekční (orální) dávkování velkým zvířatům 4. v případě vyhovujících vlastností (toxicity) následuje fáze I. klinických zkoušek (toxikologie - maximální, člověkem tolerovaná dávka) 5. fáze II. (vztah použitelnosti a dávkování - skupina tumorů vs. maximální dávkování) 6. fáze III. a IV. (bezpečnost a účinnost) Pokud u nového preparátu výsledky prokáží lepší farmakologické parametry, je zařazen do běžné klinické praxe. Délka procesu vývoje se pohybuje v rozmezí 7 až 12 let bez využití počítačové chemie. Paralelně musí probíhat vývoj vlastní technologie výroby preparátu (genetický výzkum, selekce buněčných linií (mikrobních kmenů), optimalizace zařízení, scale-up, izolace, purifikace). Návratnost investic do tohoto vývoje dostává reálnou podobu až po úspěšném uzavření II. fáze klinických zkoušek. V průběhu času stoupá potřeba množství preparátu od řádově gramů na kilogramy. Takové množství již vyžaduje existenci minimálně pilotní technologie. Principiální zásady uzavřených technologií  snadná kontrola procesu  podtlak na pracovních místech  odcházející vzduch - HEPA filtry  doplňková ochrana zařízení produkujících aerosoly (transfery kapalin, přetlakové systémy)  účinná ochrana personálu, lékařský dohled  přístup do jednotlivých sektorů až po vyhodnocení analýz potvrzujících bezpečnost sektoru  úplná (biologická, chemická) dekontaminace odpadů  průběžný monitoring okolního prostředí Charakteristika výrobních prostor a technologických zařízení biologické bariery  primární (vlastní těleso - plášť fermentoru ap.)  sekundární (automatické uzavírací systémy, paralelní HEPA filtry, dvouplášťové autoklávy)  terciální (vzduchové zámky, přestupové komory, sprchy, napojení na smrtící a sterilizační okruhy). izolace, purifikace  sklopná víka (odstředivky, filtry - vznik aerosolů)  automatické zpracování filtrátů, resp. filtr. koláčů transportní systémy - uzavřené kolektory vybavené HEPA filtry ochrana personálu  školení  ochranné prostředky operátorů 8 Obr. 3 Antracyklinová antibiotika


pro odběr vzorků: rukavice, pláště, respirátory v izolační části: nitrilové rukavice, speciální kombinézy, gumová obuv, celoobličejové štíty, respirátory;  maximální využívání zařízení se zabudovanými manipulátory  v aktivním (kontaminovaném) prostoru: kompletní přetlakové obleky

Příklady technologických procesů Významnou skupinou kancerostatik syntetizovaných stejnou metabolickou drahou jako tetracyklinová antibiotika jsou antracykliny produkované Streptomyces peucetius, Streptomyces coeruleorubidus. Tetracyklický skelet je substituován sacharidickou složkou (Obr. 3). Na obr. 4 jsou uvedena převzatá schémata dvou průmyslových procesů.

Obr. 4 Schéma výrobního procesu daunorubicinu a adriamycinu Pro izolaci a purifikaci antracyklinů existuje několik patentovaných postupů (Obr P8, P9). Cancer Reaserch Institute vypracoval následující proces:  acidifikace kultivačního media(H2SO4, pH 1,5)  filtrace (oddělení biomasy)  extrakce (n-butanol, pH 8,6)  okyselení, zahuštění (20x), doplnění heptanu  extrakce (H2SO4, pH 2,0) 2x  alkalizace (pH 8,6) 9


    

extrakce (dichlormethan, n-butanol) hydrolýza baumycinů (HCl, ethanol, 45 °C, 10 min) – vysoce toxických intermediátů rekrystalizace (methanol-chloroform-voda) lyofilizace PRODUKT (čistota 95 %, 4-6 % voda)

Mezi další kancerostatika produkovaná alespoň částečně biotechnologickými procesy (kompletní biosynthesa základních struktur, biotransformace) jsou antimetabolity (analoga nukleosidů, aminokyselin), terapeutické enzymy (L-asparaginasa) (Obr. P10) a řada dalších biofarmak.

Námelové alkaloidy Významnou skupinou sekundárních metabolitů využívaných v medicíně jsou námelové alkaloidy – produkty fytopatogenní houby rodu Claviceps. Námel neboli sušené sklerocium této parazitické houby, napadající žito, znalo lidstvo již ve starověku. Nejprve spíše v souvislosti s jeho toxickými účinky. Obilí obsahující námelová zrna (Obr. P11), bylo původcem rozsáhlých epidemií, které si vyžádali často desetitisíce životů. Ve středověku byly extrakty z námele používány k vyvolání porodů a k regulaci poporodního krvácení. Prví chemicky čistá sloučenina byla z námele izolována v roce 1875 (ergotinin). V roce 1918 byl izolován klinicky využitelný ergotamin. V polovině minulého století byly položeny základy průmyslové produkce námelových alkaloidů. Obr. 5 Žitné klasy Charakteristika námelových alkaloidů obsahující námelová zrna Chemicky patří mezi alkaloidy tryptofanového typu. Základní část molekuly je tvořena tetracyklickou strukturou zvanou ergolin. Existují 4 hlavní strukturální skupiny: klavinové alkaloidy, lysergové kyseliny, jednoduché amidy lysergové kyseliny, peptidy lysergové kyseliny (obr 6). Farmakologické účinky mají levotočivé deriváty kyseliny lysergové. klaviny

D-lysergová kyselina

amidy lyserogové kyseliny

peptidy lysergové kyseliny

Obr. 6 Příklady zástupců jednotlivých skupin námelových alkaloidů Obr. 6 Příklady zástupců jednotlivých skupin námelových alkaloidů Biosynthesa ergolinového cyklického systému vychází z tryptofanu, mevalonové kyseliny a methioninu (Obr. P12). Tripeptid obsažený v peptidových derivátech vzniká samostatnou biosyntetickou drahou, přičemž jednou z aminokyselin je vždy prolin (Obr. P13).

10


Biologická aktivita námelových alkaloidů je spojena s činností neuroreceptorů a neuropřenašečů. Ergolinový skelet má řadu strukturních podobností právě s noradrenalinem, dopaminem nebo serotoninem. Aktivita se projevuje jednak na úrovni modulací psychického stavu, jednak na úrovni činnosti hladkého svalstva. Průmyslová produkce námelových alkaloidů Produkčními mikroorganismy jsou Claviceps purpurea tvořící při patogenním růstu tmavě fialová sklerocia obsahující převážně peptidové deriváty a Claviceps fusiformis - paspali tvořící šedá sférická sklerocia obsahující převážně jednoduché amidy kyseliny lysergové a klaviny. Průmyslově byly alkaloidy vyráběny původně izolací z námele pěstovaného na úmyslně infikovaném obilí (polní produkce), později byly vyvinuty technologické procesy založené na saprofitické (bez hostitele) kultivaci produkčních kmenů v povrchovém, respektive submersním uspořádání. Polní produkce (Obr. P14, P15) Infekce obilí se provádí suspenzí spor. Rod Claviceps produkuje jednak konidie (povrchová nebo submersní kultivace) jednak arthrospory (submersní kultivace). Infekce probíhá v době uvolnění klasu z posledního listu s využitím speciálních strojů. V rozmezí asi 4 týdnů proběhne vegetativní část životního cyklu této fytopatogenní houby. Výsledkem jsou námelová zrna, která se uvolňují z klasů. V tomto období se provádí tzv. sklizeň, pro kterou byly opět vyvinuty speciální zemědělské stroje. Výtěžek bývá asi 200 kg námele/ha. Tento typ produkce lze provádět bez hlubších znalostí regulace syntézy alkaloidů, protože celý proces probíhá v podmínkách přirozených pro patogena. Nevýhodou je vliv podnebí a počasí na výrobní proces. Reaktorové technologie Vzhledem k tomu, že myceliální růst Claviceps probíhá v odlišném fyziologickém stavu mikroorganismu, je nezbytné v průběhu kultivace takovou změnu navodit. Kromě změny a optimalizace zastoupení jednotlivých nutrientů je možné tohoto stavu dosáhnout výrazným zvýšením osmotického tlaku media (Obr. P16). Vhodná hodnota odpovídá cca koncentraci sacharosy 300 g l-1. Až ⅔ sacharosy je možné nahradit např. chloridem sodným. Kultivační proces trvá 2 až 3 týdny. Zařízení musí splňovat parametry pro dlouhodobé udržení sterility. Produkční kmeny snadno ztrácí schopnost hyperprodukce alkaloidů. Jsou citlivé k mechanickému stresu a celkovému designu fermentorů. S popisem zařízení je tedy vhodné získat kompletní „know how“. Alternativně k submersním kultivacím byly vypracovány technologie na bázi imobilizovaného mycelia Claviceps v alginátu, respektive synthesa alkaloidů pomocí hrubého směsného enzymového preparátu (extrakt buněčného obsahu) z tryptofanu, methioninu a isopentenylpyrofosfátu. Poznámka: Existují i technologie polosyntetické (lysergová kyselina se připraví biotechnologicky a její modifikace (substituce) se provádí chemickou synthesou. Byla popsána i úplná chemická synthesa peptidů lysergové kyseliny. Izolace Alkaloidy jsou intracelulární produkty. Peptidové alkaloidy jsou rozpustné v organických rozpouštědlech, paspalová kyselina je rozpustná ve vodě. Výchozí materiál (sklerocium, mycelium) se převede do alkalického vodného roztoku a dále se provádí extrakce organickým rozpouštědlem. Extrakční operace a zahuštění ve vakuové odparce

11


se používají pro další přečištění alkaloidů. Krystalizaci je možné provádět z methanolového roztoku. Paspalová kyselina se transformuje na lysergovou kyselinu v prostředí hydroxidu amonného za zvýšené teploty.

Vitaminy Vitaminy jsou látky, pro které nemá lidský metabolismus biosyntetické dráhy a přitom jsou pro něj nezbytné. Tyto látky musíme přijímat z vnějšího prostředí, nejčastěji potravou. Pro průmyslovou výrobu některých vitaminů jsou využívány mikrobní biotechnologie. Výhradně „biotechnologicky“ je vyráběn vitamin B12 – kyanokobalamin. Mikrobními technologiemi jsou z větší či menší míry připravovány: riboflavin, pantothenová kyselina, pyridoxin, askorbová kyselina, retinol, kalciferol, tokoferol a polynenasycené mastné kyseliny. Riboflavin První hrubý preparát riboflavinu byl izolován z pšenice v roce 1879. Chemická struktura (6,7dimethyl-9-(D-1´-ribityl).isoalloxazin) byla popsána v roce 1934. Fyzikálně-chemické a biologické vlastnosti: amfoterní sloučenina tvořící oranžově-žluté krystaly. Rozpustnost ve vodě 130 mg/l, v roztoku žluto-zeleně fluoreskuje. Je teplotně stabilní (neutrální roztok, 120 °C, 6 hodin), částečně odolný proti oxidaci. Redukuje se na bezbarvou 1,10-dihydrosloučeninu. V živých organismech je převážně ve formě FMN a FAD (60 až 90 %) (Obr. P17). Průmyslová produkce Riboflavin produkuje celá řada mikroorganismů. Jako průmyslové kmeny byly využity askomycety Eremothecium ashbyi a Ashbya gossypii (produkce 10 až 15 g l-1). Dále byl připraven také rekombinantní kmen bakterie Bacillus subtilis. Kultivační media: zdroj uhlíku - glukosa, sacharosa, maltosa, rostlinné oleje; zdroj dusíku peptony, corn-steep, kvasničný extrakt. Jako stimulátor produkce působí glycin (stimulace synthesy GTP); stimulátory růstu jsou biotin, inositol, thiamin. Aerobní kultivační proces (teplota 26 až 29 °C, ca 120 hodin) má následující fáze: - pokles pH z 6,5 na 4,5, tvorba mycelia, ojediněle vznikají sporangia - rychlá spotřeba C-zdroje, tvorba spor, počátek flavigeneze - C-zdroj je spotřebován, vzrůst pH, maximální produkce riboflavinu - lyze populace, tvorba dalšího riboflavinu – objevují se krystalky B2. Kombinovaný proces V 70. letech minulého století byly připraveny mutanty B. subtilis a B. pumilus schopné transformovat glukosu na D-ribosu. Kultivační podmínky: - nutrienty: glukosa (150 g/l); sušené kvasnice, (NH4)2SO4, CaCO3; L-Trp, LTyr, L-Phe

12 Obr. 7 Polosyntetická výroba riboflavinu


- délka kultivace: 60 hodin, 36 °C; výtěžek: 70 g/l D-ribosy. Krystalická D-ribosa je použita jako výchozí surovina následné chemické syntézy (obr. 7). Izolace Pro farmaceutické účely lze zvolit následující postupy: pH kultivačního media se upraví na 4,5 a zahřívá se při 121 °C, 1 hodinu pro dosažení rozpuštění riboflavinu. Následuje centrifugace (oddělení nerozpustného podílu), redukce riboflavinu TiCl3 za vzniku nerozpustné formy, filtrace sraženiny a následná reoxidace vzduchem. Opětné rozpuštění v 10 % HCl, 60 °C. Neutralizace, krystalizace. Zbytkový riboflavin lze z mycelia extrahovat vodní parou. Riboflavin z media lze alternativně extrahovat do butanolu (po převedení na redukovanou formu). Kyanokobalamin Vitamin B12 patří do skupiny korinoidů s komplexně vázaným kobaltem. Poprvé byl izolován z živočišných tkání v roce 1948. Jeho chemická struktura byla popsána v roce 1954. Stabilní kyanidová forma vzniká v průběhu izolačního procesu z jiných biologicky aktivních forem (obr. 8). Velkou část denní potřeby vitaminu pro člověka pokrývá jeho produkce přirozenou střevní mikroflorou. Kynokobalamin je dobře rozpustný ve vodě, tvoří červené jehlicovité krystaly. Společně s folovou kyselinou a methioninem se účastní řady enzymových reakcí (přenos methylové skupiny, vodíku). Biosynthesa vychází ze sukcinyl-CoA a glycinu (Obr. P18). Průmyslové procesy Průmyslově využívanými producenty jsou Pseudomonas denitrificans, Propionibacterium shermanii a P. freudenrechii a dále fúzí protoplastů získaný kmen Rhodopseudomonas protamicus. Jednotliví producenti se liší vlastnostmi, které významnou měrou ovlivňují Obr. 8 Vitamin B12 konkrétní technologický proces. Vlastní kultivace probíhá ve všech případech v submersních dokonale míchaných fermentorech. Výhodným Czdrojem je melasa. Obsahuje betain, který je stimulátorem v metabolické dráze 5-aminolevulové kyseliny. „Pseudomonada“ umožňuje využít aerobních systémů, nicméně nedokáže syntetizovat jeden z klíčových intermediátů – 5,6-dimethylbenzimidazol. Tato látka se tedy musí do media přidávat. Vitamin je produkován současně s růstem populace. Propionibacterium vyžaduje pro produkci vitaminu B12 anaerobní systémy. Na druhé straně však dokáže uvedený 5,6-dimethylbenzimidazol syntetizovat, ale pouze za aerobních podmínek. Kromě toho vitamin B12 je zpětnovazebným inhibitorem počátečních kroků biosyntetické metabolické dráhy. Proces tak musí být rozdělen do dvou stupňů: I. stupeň: anaerobní (80 h, 30 °C, pH 7, přetlak N2, mírné míchání) utilizace C-zdroje, růst populace, produkce kobinamidu II. stupeň: aerobní (88 h) biosynthesa 5,6-dimethylbenzimidazolu tvorba kobalaminu produkce asi 65 mg/l B12 (údaj z roku1983) 13


Rhodopseudomonas protamicus umožňuje jednostupňový aerobní proces bez přídavku 5,6-dimethylbenzimidazolu. Izolace (P. denitrificans) (Obr. P19) Kultivační medium se zahřeje na 120 °C (30 min), po ochlazení se pH upraví na 8,5. Následuje přídavek KCN a míchání media asi 16 hodin. Po přídavku AlCl3 a filtrační hmoty následuje oddělení nerozpustného podílu. Následuje několikanásobná extrakce do kapalin s různou polaritou. Závěrečná fáze je tvořena chromatografií na alumině a následné srážení v etheru. Vitamin C – L-askorbová kyselina Z přírodních materiálů byl vitamin izolován v roce 1928. Je to bílá krystalická látka, dobře rozpustná ve vodě. Má dva symetrické uhlíky. Pro své vlastnosti silného redukčního činidla bývá kosubstrátem monooxygenas. Velmi silná oxidovadla ji převádějí na neaktivní sloučeninu (obr. 9.) Mikroorganismy, které dokáží syntetizovat vitamin C ve vyšších koncentracích jsou v současnosti známé (Ervinia citreus, E. herbicola), nejsou však využívány pro průmyslovou produkci. Průmyslový proces Mikrobní technologie je využívána Obr. 9 Red-ox reakce L-askorbové kyseliny pro biotransformaci D-sorbitolu na L-sorbosu. D-sorbitol se připravuje chemickou redukcí D-glukosy na Raneyově niklu. Čistý roztok D-sorbitolu o koncentraci asi 200 g l-1 je použit pro biotransformaci, nejčastěji pomocí Acetobacter suboxydans, na L-sorbosu (Obr. P20). Výtěžek bývá 180 g l-1. Izolovaná L-sorbosa o

čistotě 99 % je chemicky konvertována na L-askorbovou kyselinu (obr. 10). Obr. 10 Chemická konverze L-sorbosy na L-askorbovou kyselinu Principy izolačních procesů L-sorbosa: filtrace biomasy, zahuštění, purifikace na ionexech, krystalizace Diaceton-L-sorbosa: extrakce do benzenu Monoaceton-L-sorbosa: vrací se do reakce s acetonem 2-KLG-methyl ester: izolace v krystalické formě

14


L-askorbová kyselina:

izolace v krystalické formě

β-KAROTEN (PROVITAMIN A) Karotenoidy jsou nenasycená polyenová barviva tvořená většinou tetraterpenoidy (obr 11). Typickou strukturou je β-iononový kruh. ¨

Jedná se o látky oranžově-červené barvy, dobře rozpustné v tucích (hydrofobních kapalinách). Obr. 11 Struktura β-karotenu Retinol – vlastní vitamin A – se mimo jiné účastní redox reakcí odehrávajících se v oční sítnici. Synthesa probíhá metabolickou dráhu terpenoidů z acetyl-CoA přes kyselinu mevalonovou za vzniku isopentenylpyrofosfátu („isoprenová jednotka“) (Obr. P21). Karoteny produkuje velké množství mikroorganismů. V průmyslových podmínkách se uplatnily zvláště Phycomyces blakesleanus, Blakeslea trispora (Obr. P22) a také mořská řasa Dunaliela salina. Průmyslový proces Uvedené houby se vyskytují ve dvou sexuálních formách. Pro dosažení vysoké nadprodukce βkarotenu je nezbytná oddělená příprava inokula obou těchto forem, které se na počátku produkčního procesu smíchají. Jinou možností je inokulace pouze „minus“ formou za současného přídavku trisporových kyselin (sekundární metabolity produkované těmito houbami). Synthesa βkarotenu je dále stimulována přídavkem látek obsahujících β-iononový kruh (ten se však do molekuly karotenu nezabuduje). Produkční medium vyžaduje vysokou koncentraci živin a vysokou viskozitu (lihové výpalky, škrob, rostlinné oleje ap.). Důležitá je přítomnost antioxidantu, který zabraňuje v průběhu aerobního procesu rozkladu β-karotenu. Po 7 až 8 denní kultivaci je dosahováno výtěžku 2,5 až 3,0 g l-1. Alternativní cestou výroby je syntéza provitaminu A pomocí mořské řasy D. salina, která se kultivuje přímo v uzavřených mořských lagunách. Podmínkou je koncentrace soli as 20-30 % a teplota přes 30 °C. Energie pro růst a C-zdroje, jsou získávány fotosyntézou (Obr. P23). Izolace Výše uváděné mikroorganismy produkují β-karoten jako intracelulární produkt. Izolace produktu pro potravinářské a farmaceutické účely zahrnuje následující operace: permeabilizace buněk (hydrolýza, dehydratace); extrakce lipidického podílu; saponifikace; extrakce (petrolether, hexan ap.); purifikace; krystalizace. Ergosterol (provitamin D2) Ergosterol je převáděn do aktivního stavu zahříváním, resp. UV zářením (Obr. P24). Jedná se opět o terpenickou sloučeninu, rozpustnou v organických rozpouštědlech (Obr. P25). Vitamin D2 se účastní metabolismu resorpci vápníku a fosforu ze střeva a jejich ukládání v živočišných tkáních, zejména kostech. Významnými producenty jsou převážně kvasinky rodů Saccharomyces a Candida.

15


Průmyslová produkce Běžné pekařské droždí obsahuje 1-3 % v sušině. Dále byly připraveny speciální kmeny, případně nalezeny modifikované kultivační podmínky (C-zdroj ethanol ap.), poskytující ještě několikanásobné zvýšení výtěžnosti ergosterolu (Obr. P26). Vlastní produkční proces se realizuje v submersních dokonale míchaných systémech známých například z výroby droždí. Izolace Ergosterol je opět intracelulárním produktem. Jeho izolace probíhá v následujících jednotkových operacích: permeabilizace buněk (roztok amoniaku, dimethylamin); odstranění nečistot, vysušení buněk (methanol); extrakce (ether, ethylacetát); saponifikace; reextrakce etherem; krystalizace.

Extracelulární polysacharidy Polysacharidy se izolují nejčastěji z rostlin (škroby, celulosa, glukany, arabská guma ap.) nebo mořských řas (agar, alginát). Značný význam má dále produkce extracelulárních polysacharidů syntetizovaných mikroorganismy. Vzhledem k možnosti nastavení standardních podmínek procesu a modifikaci vlastního producenta, lze získat látky se specifickými vlastnostmi. Charakteristika průmyslových procesů Výroba jednotlivých produktů byla realizována v široké škále zařízení různé konstrukce – batch, fed-batch, kontinuální a vícestupňové procesy. Obecně platí, že nutriční zastoupení C : N v poměru 10 : 1 a větším podporuje nadprodukci polysacharidů. Se vzrůstající koncentrací produktu vzrůstá viskozita kultivačního media, které se postupně začne chovat jako pseudoplastická kapalina. To klade vysoké nároky na konstrukci míchadel a aeračních zařízení, aby nedocházelo k výrazné limitaci kyslíkem. Také izolační procesy jsou přizpůsobeny fyzikálním vlastnostem kultivačního media. Pokud nejsou buňky producenta příliš malé, resp. polysacharid není na jejich povrchu vázán příliš pevně, lze provést oddělení biomasy od viskózního roztoku polysacharidu vysokoúčinnou filtrací. Organická rozpouštědla jsou využívána ze dvou důvodů. Jednak mohou snižovat viskozitu roztoku, jednak mohou snižovat rozpustnost polysacharidu. Polysacharidy mohou dále poskytovat sraženiny s kvartérními amonnými solemi či kationty některých kovů. Pro sušení polysacharidů se často používají sprayové sušárny. Typy polysacharidů Extracelulární mikrobní polysacharidy se dělí do dvou skupin na polysacharidy neutrální a kyselé. Mezi neutrální polysacharidy patří např. skleroglukan (Obr. P27) (plíseň rodu Sclerotium), pullulan (Obr. P28) (Aureobasidium pullulans), kurdlan (Obr. P29) (Alcaligenes faecalis) a dextran (Leuconostoc mesenteroides). Ke kyselým polysacharidům se řadí např. polysacharidy z Arthrobacter viscosus (Obr. P30), bakteriální algináty (Obr. P31) (Azobacter vinelandii) či xanthan (Obr. P32) (Xantomonas campestris). Výroba dextranu Bakteriální dextran je jedním z prvních polysacharidů vyráběných průmyslově. Roztoky této látky o molekulové hmotnosti okolo 75 000 Da se používají dlouhou dobu jako náhrada krevní plasmy. Dextran má lineární řetězec tvořený molekulami D-glukosy vázanými z 95 % vazbou α-1,6-. Polymer je odolný vůči amylasám.

16


Biosynthesa probíhá na vnější straně cytoplasmatické membrány producenta (Leuconostoc mesenteroides). Zde je lokalizován enzym dextran sacharasa (α-1,6-glukan:D-fruktosa-2glukosyltransferasa, E.C. 2.4.1.5) využívající jako jediný substrát sacharosu. Po rozštěpení sacharosy dochází k vazbě glukosy do dextranového řetězce a uvolňuje se fruktosa, která je dále utilizována. Průmyslový proces Základní složkou media je sacharosa (ca 10 %), dále corn-steep (2 %), anorganické sole, a potřebné množství Fe, Mn. Kultivace probíhá při teplotě 25 °C za přiměřeného míchání a aerace; pH klesá z počátečních 7,0 na 4,0 (vznik mléčné kyseliny). Celý proces trvá 3 až 4 dny. Výsledné kultivační medium má želatinovou konzistenci. Kromě dextranu obsahuje medium malá množství mléčné kyseliny a ethanolu. Pro přípravu dextranu v průmyslovém měřítku je možné použít také hrubý extrakt výše zmiňovaného enzymu. Izolace dextranu farmaceutické kvality Po filtraci biomasy se provádí částečná hydrolýza vysokomolekulárního dextranu (> 106 Da). Používá se roztok kyseliny chlorovodíkové při teplotě 100 až 105 °C. Hydrolýza se ukončí neutralizací po dosažení požadované viskozity. Zbylé nečistoty a barviva se odstraňují adsorpcí na aktivní uhlí ap. Dextran o požadované molekulové hmotnosti (75 000 ± 25 000 Da) se získává frakčním srážením z různě koncentrovaných roztoků methanolu. Roztok se dále zahustí ve vakuové odparce a usuší ve sprayové sušárně. Kromě medicíny se dextran používá také při výrobě gelů pro laboratorní a průmyslovou chromatografii.

Enzymy Využití enzymů člověkem má tisíciletou tradici, i když po většinu času se jednalo o aplikace bez vědomí podstaty procesu (výroba sýrů, koji proces používaný v asijských zemích ap.) Nejprve byly enzymy izolovány z přírodních zdrojů (rostliny, živočišné tkáně) V druhé polovině 20. století, společně s rozvojem ostatních mikrobních technologických procesů, byla realizována průmyslová výroba některých enzymů pomocí mikroorganismů (povrchové i submersní technologie). Podařilo se tak překonat problémy s sezónností (rostliny), resp. množstvím (živočišné tkáně) vstupních surovin. Obrovská diverzita vlastností mikroorganismů, krátká generační doba a možnost využití genových manipulací dále rozšiřují možnosti přípravy enzymů se specifickými vlastnostmi. Například telecí renin používaný pro výrobu sýrů nemá v mikrobní říši plnohodnotný ekvivalent. Proto byly geny pro syntézu tohoto enzymu přeneseny do některých mikroorganismů (E. coli, S. cerevisiae). Velký zájem je o enzymy izolované z extremofilů. Ty mohou poskytovat enzymy umožňující aplikace při teplotách okolo 100 °C ap. Základy průmyslové výroby Pro průmyslovou výrobu byla využita řada kultivačních technik. Nejčastěji se jedná o submersní procesy v běžných míchaných bioreaktorech (asi 90 % vyráběných enzymů). Kultivace na pevných substrátech se mohou uplatnit v případech, kdy produkčním mikroorganismem je vláknitá houba. Kriteria pro výběr a selekci kmenů  intracelulární vs. extracelulární produkce enzymu  toxicita enzymu pro producenta při dosažení vysokých koncentrací

17


     

stabilita enzymu za různých fyzikálně chemických podmínek vnějšího prostředí genetická stabilita požadovaných vlastností požadavky na komplexnost media (substráty, drahé promotory, stimulátory, ap.) náročnost izolace (obtížnost dezintegrace ap.) patogenita kmene, produkce toxinů (tradiční rody Bacillus, Aspergillus ap.) možnost přípravy mutantů nevyžadujících induktor syntézy enzymu

Charakteristika kultivačních medií  u komplexních substrátů potřeba dlouhodobě konstantního složení  optimalizace aplikací stopových prvků (kovy)  přítomnost induktorů syntézy enzymu (maltodextrin, škrob – amylasa, celulosa - celulasa)  aplikace analogů přirozených induktorů  zamezení katabolické represe snadno utilizovatelnými substráty  využití detergentů (permeabilita membrán) Kultivace na pevném substrátu Technologie kultivace na pevných substrátech vycházejí z tradičního „koji procesu“ používaného v asijských oblastech pro přípravu specifických potravin. V systému není volná vodní fáze, vlhkost substrátu se udržuje okolo 60 % (minimum 12 %). To přináší složitější řešení automatizace a řízení systémů. Příklady zařízení:  rotační buben (horizontální, vestavby nebo lopatkové míchání)  ploché misky (lože), děrované lísky (vícestupňové systémy)  skříňové systémy  fluidní lože Charakteristika procesu: substrát: např. obilné otruby, minerálie (modifikace substrátu - extruze ap.), zamezení tvorby aglomerátů sterilizace: parou při nízkém pH, chemicky inokulace: sporami, vegetativními buňkami délka procesu: obvykle 1 až 10 dnů teplota: 25 až 40 °C Kritické prvky: vzájemné řízení teploty a vlhkosti, regulace pH, celkové monitorování procesu. Příklady průmyslově vyráběných enzymů Intracelulární enzymy - jejich přirozenými substráty bývají nízkomolekulární látky - enzymy centrálního metabolismu - produkce ve vysokých koncentracích - enzymy sekundárního metabolismu - vysoká koncentrace pouze v určité fázi životního cyklu Tyto enzymy se často využívají v imobilizovaných systémech.  penicilin acylasa polosyntetické peniciliny  α-galaktosidasa (rafinasa) purifikace cukru  β-galaktosidasa (lactasa) mléčné výrobky  glukosa isomerasa fruktosové sirupy ze škrobových hydrolyzátů

18


 glukosa oxidasa (glukosa - kys. glukonová + H2O2)  pululanasa

stabilizace sušených vajec, zamezení neenzymovému hnědnutí odstranění kyslíku z nápojů modifikace škrobu

Extracelulární enzymy  obvykle hydrolasy vysokomolekulárních substrátů (amylasy, celulasy, glukanasy, proteinasy, lipasy ap.)  bývají produkovány ve velkém množství  vyšší stabilita vůči vnějším podmínkám  dlouhodobá stabilita (více než rok při vhodném skladování)  často komplexní preparáty obsahují více enzymů - pektinasy ap.  hlavní využití je ve výrobě detergentů (prací prášky) a potravinářském průmyslu Enzymy pro diagnostiku a výzkum Tato skupina se velmi rychle rozšiřuje, dostupnost vhodných enzymů představuje klíčový faktor pro současnou molekulární genetiku (restrikční endonukleasy, ap.). Tyto enzymy musí být vyráběny ve vysoké čistotě, na druhé straně ve výrazně menších objemech než např. hydrolasy. Dalšími příklady jsou:  dextran sacharasa klinické dextriny  cyklodextrin-glukosyl-transferasa cyklodextriny ze škrobu  glukosa oxidasa stanovení glukosy v krvi  lipasa stanovení lipidů v krvi

Biotransformace Definice: selektivní enzymová modifikace čistých látek vedoucích ke vzniku definovaných konečných produktů. Biologickým činitelem tohoto procesu může být mikroorganismus, tkáňová kultura, bezbuněčný extrakt, purifikovaný enzym. Dnes již klasickými biotransformacemi je například výroba octové kyseliny z ethanolu (výroba octa), glukonové kyseliny z glukosy, či sorbosy ze sorbitolu (viz výroba vitaminu C). Biotransformace se podílejí zejména na specifické modifikace struktury molekul, částečné degradaci molekul či jejich rozšíření. Biotransformace se uplatňují zejména při přípravě steroidních látek (hormony, léčiva) (Obr. P33), terpenoidů, antibiotik (Obr. P34), alkaloidů (Obr. P35), aminokyselin (Obr. P36), sacharidů, aromátů a heterocyklů. Charakteristika biotransformačních procesů Ve srovnání s organickou syntézou mají biotransformační procesy vysokou reakční specifitu (stereospecifita, specifita místa účinku) a probíhají za mírných reakčních podmínek (< 40 °C; pH ~ 7,0; normální tlak). Umožňují:  specifické zavedení funkční skupiny na chemicky neaktivní místo  modifikaci pouze jediné funkční skupiny (D-sorbitol <> L-sorbosa, Acetobacter suboxydans, oxidace -OH pouze v poloze 2)  modifikace pouze jediného enantiomeru v racemické směsi (D-,L-aminokyseliny)  produkce chirálních produktů z prochirálních substrátů (Escherichia coli: fumarová kyselina + NH3 L-Asp

19


fumarová kyselina + H2O

L-jablečná)

Substráty „Ideální“ substrát je netoxický, snadno procházející cytoplasmatickou membránou. Ve vodě nerozpustné substráty se rozpouštějí v relativně netoxických rozpouštědlech (mísitelných, nemísitelných s vodou – dvoufázové procesy), nebo se používají smáčedla (Tween). Nerozpustné substráty lze převést také na mikročástice (pseudo-krystalický proces). Toxické substráty se musí aplikovat až po ukončení růstu populace potřebné pro biotransformaci. Další možností pro dosažení nízké (netoxické) koncentrace je semi-(kontinuální) dávkování. Substráty neschopné transportu přes cytoplasmatickou membránu se podrobují biotransformaci za použití bezbuněčného enzymového extraktu nebo čistého izolovaného enzymu. Alternativní možností je modifikace substrátu, která poskytne transportovatelnou sloučeninu. Základní typy biotransformačních procesů 1. Biotransformace v rostoucí kultuře substrát se aplikuje společně s inokulem (nesmí inhibovat růst). Proces je vhodný spíše pro screeningové experimenty 2. Biotransformace s předem narostlými buňkami V první fázi se nastolují podmínky pro optimální pro růst (izolace biomasy). Ve druhé fázi procesu je buněčná populace převedena do „optimálního“ biotransformačního media (malé množství C-zdroje). Dosahuje se tak vysoké koncentrace buněk, optimalizace výtěžku, klesá nebezpečí kontaminace a dosahuje se relativně snadné izolace produktu. Alternativou tohoto procesu je využití spor pro biotransformaci - vysoká stabilita. 3. Biotransformace s imobilizovanými buňkami Imobilizace se provádí technikami entrapment, sorpce (ionex, DEAE celulosa), kovalentní vazby, buněčná agregace, ap. Je dosahováno vyšší stability systému. S výhodou lze využít kontinuální kolonové uspořádání. Opět je dosahováno vysoké hustoty buněk (vysoká reakční rychlost). Výhodou imobilizace celých buněk je odpadnutí izolace enzymu, vyšší stabilita enzymu, zachování přirozené dostupnosti kofaktorů. 4. Biotransformace s purifikovanými enzymy Tento postup je výhodný nebo nezbytný kdy:  substrát nepřejde přes membránu intaktní buňky  se nepodařilo v mikroorganismu potlačit tvorbu vedlejších produktů, případně zabránit degradaci produktu  mikroorganismu produkuje daný enzym do prostředí - extracelulární enzym  je nutné použít živočišný nebo rostlinný enzym  vhodný enzym je běžně komerčně dostupný 5. Biotransformace v multifázovém systému Tyto procesy se využívají pro látky s omezenou rozpustností ve vodě - steroidy, terpenoidy ap. Aplikují se s vodou nemísitelná rozpouštědla. Vzniká tak další (organická) fáze, která slouží jako jakýsi substrátu, resp. produktu. Biotransformační reakce probíhají na fázovém rozhraní. Výhodou je vysoká koncentrace substrátu v bioreaktoru, minimální nebezpečí inhibice substrátem, resp. produktem ve vodné fázi, snadná izolace produktu (z organické fáze), možnost vícenásobného použití mikrobní populace ve vodné fázi. 6. Vícestupňové systémy - dvě následné biotransformace

20


Procesy mohou probíhat v jednom zařízení se směsí obou mikroorganismů, resp. v oddělených systémech, které umožňují optimalizaci podmínek pro každý biotransformační stupeň zvlášť (D,L-α-amino-ε-kaprolaktam L-lysin; Cryptococcus laurentii + Achromobacter obae) (Obr. P36).

21


Příloha

22


Obr. P1 Biosynthesa penicilinu

23


Obr. P2 Inhibice enyzmů podílejících se na synthese buněčné stěny působením β-laktamových antibiotik

Obr. P3 Složení průmyslových kultivačních medií pro produkci penicilinu

24


Obr. P4 Změny charakteristických znaků v průběhu fed.batch, resp. semikontinuálního procesu produkce penicilinu

Obr. P5 Časová závislost rychlosti produkce penicilinu

25


amylacetá amylacetát 0 - 4 °C pH 22-3

Obr. P6 Izolace a purifikace penicilinu

Obr. P7 Vegetativní a vzdušné micelium Streptomyces gryseus

26


Obr. P8 Izolace Daunorubicinu. Postup Rhône-Poulenc.

Obr. P9 Izolace Daunorubicinu. Postup podle National Cancer institute

27


Obr. P10 Blokové schema izolace L-asparaginasy z E. coli

Obr. P11 Příklady hostitele a spektra alkaloidů produkovaných Claviceps purpurea

28


Obr. P12 Základní látky biosynthesy ergolinového skeletu

Prolin

Ala Abu Val

Phe Ala Abu Val Ile Leu

Abu - kyselina 22-amino butyrová butyrová Obr. 13 Variantní struktura tripeptidové části derivátů lysergové kyseliny

29


Obr. P14 Speciální stroj umožňující infekci obilí sporami C. purpurea

Obr. P15 Zemědělský stroj pro sklizeň námele

30


Obr. P16 Media vhodná pro sporulaci, prekultivaci a produkci ergotoxinů

FMN

FAD redukovaná forma

Obr. P17 Příklady výskytu riboflavinu v živých organismech

31


Obr. P18 Schematické znázornění biosynthesy koenzymu B12

32


Obr. P19 Schema izolačního procesu vitaminu B12

33


Obr. P20 Technologické schema přípravy L-sorbosy z D-sorbitolu

Obr. P21 Schematické znázornění biosynthesy β-karotenu

34


Celková produkce 2,5 až 3,0 g/l ß-karotenu po 7 - 8 dnech kultivace Obr. P22 Základní charakteristika pilotního kultivačního procesu produkce β-karotenu pomocí B. trispora kombinací (+) a (-) varianty

35


2020-30 % NaCl, 3030-40 °C

Obr. P23 Blokové schema průmyslového kultivačního procesu produkce β-karotenu pomocí mořské řasy Dunaliela salina

36


Aktivní místo

Obr. P24 Aktivace provitaminů (D2, D3) působením UV resp. tepla

37


Obr. P25 Biosynthesa ergosterolu

38


Obr. P26 Laboratorní kultivační proces produkce ergosterolu z S. cerevisiae

Obr. P27 Scleroglukan produkovaný houbou Sclerotium rolfsii

Obr. P28 Pullulan – plymer z Aureobasidium pullulans

Obr. P29 Kurdlan – plymer z Alcaligenes faecalis, var. myxogenes

Obr. P30 Kyselý polysacharid z Arthrobacetr viscosus

39


Obr. P31 Bakteriální alginát z Azobacter vinelandii

Obr. P32 Xanthan z Xanthomonas campestris

40


Obr. P33 Obecné schema mikrobních biotransformací steroidních látek

Obr. P34 Schema biotransformačního procesu pro produkci ampicilinu

41


Obr. 35 Využití biotransformačních procesů pro produkci efedrinu

Obr. P36 Příprava L-Lys z D,L-α-amino-ε-kaprolaktamu ve dvoustupňovém procesu

42

BIOTECHNOLOGIE V CHEMICKÉ A FARMACEUTICKÉ VÝROBĚ

Recommend Documents