BioNexia® Strep A ratio Rychlý test pro kvalitativní stanovení antigenu streptokoka skupiny A POUŽITÍ BioNexia® Strep A ratio je imunologická testovací souprava pro rychlé a kvalitativní stanovení antigenů Streptococcus pyogenes (streptokok skupiny A) přímo z výtěru z krku. ÚVOD Beta-hemolytické streptokoky skupiny A jsou hlavní bakteriální příčinou infekcí horního dýchacího ústrojí, jako jsou angína (akutní tonsilitida), akutní zánět hltanu a spála. Bylo prokázáno, že včasná diagnóza a léčba infekcí způsobených streptokoky skupiny A významně snižují výskyt klinicky závažných příznaků a infekčních komplikací jakými jsou revmatická horečka a poststreptokoková glomerulonefritida. Standardní kultivační diagnostické metody těchto onemocnění jsou založeny na izolaci a následné identifikaci organismů (1,2), které trvají zpravidla 24 - 48 hodin. Vývin nových imunologických technik (3,4) detekce streptokoků skupiny A přímo z výtěrového tampónu umožňují lékaři rychlé stanovení diagnózy a nasazení okamžité cílené léčby. PRINCIP TESTU Diagnostika streptokoků skupiny A v BioNexia® Strep A testu kazetě je na základě imunologické sendvičové eseje. Test obsahuje proužek nitrocelulózové membrány v místě diagnostické linie potažený králičími protilátkami proti streptokoku skupiny A a v oblasti kontrolní linie kozími protilátkami proti králičím protilátkám. Při zpracování výtěrového tampónu dochází použitím extrakčních činidel 1 a 2 k získání antigenů streptokoků skupiny A a jeho následovným aplikováním na testovací proužek dochází k navázání barevně značené zlatem konjugované protilátky na přítomné antigeny streptokoků skupiny A a tvorbě komplexu protilátka - strep A antigen. Kapilárním vzlínáním dochází k pohybu komplexu membránou směrem k testovací linii s vázanými králičími protilátkami anti-Strep A. Jestliže vzorek obsahoval streptokoky skupiny A a došlo tedy k tvorbě komplexu, vzniká v oblasti testovací linie sendvičovou reakcí barevný komplex. Při nepřítomnosti antigenů streptokoka zůstává linie bez zabarvení. Nezávisle na přítomnosti antigenu streptokoků skupiny A vždy dochází k barevné reakci v oblasti kontrolní linie s navázanými kozími protilátkami proti králičím protilátkám. Přítomnost barevné kontrolní linie slouží jako potvrzení 1) aplikace dostatečného množství vzorku 2) dostatečného pohybu vzorku membránou a 3) také jako kontrola použitých reagencií. REAGENCIE A POSKYTOVANÝ MATERIÁL ● ● ● ● ● ●
reagencie A: 1.0 M dusitan sodný (7 ml): T toxický; R25: toxický při požití reagencie B: 0.4 M kyselina octová (7 ml) 5 testovacích proužků 5 extrakčních zkumavek 5 sterilních výtěrových tampónů 1 stojan na zkumavky
POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ KITU ●
stopky
SKLADOVÁNÍ Všechny reagencie, včetně BioNexia® Strep A testovacího použku, mohou být uchovávány při pokojové teplotě nebo v ledničce (2°C - 30°C). BEZPEČNOSTNÍ POKYNY ● Pouze pro in-vitro diagnostiku ● Pouze pro použití v laboratořích a lékařských ordinacích odborným personálem ● Každá testovací kazeta je jen na jedno použití. ● Nekombinujte reagencie a kazety z různých šarží ● Nezaměňujte uzávěry reakčních činidel ● Neužívejte po datu exspirace ● Při provádění testu nekuřte, nejezte a nepijte ● Neprovádějte test, pokud je poškozen obal testu ● Nepoužívejte výtěrové tampony, pokud je poškozen obal tamponu ● Užívejte jen dakronové či tampony z umělého hedvábí s plastovými špejlemi. Neužívejte calciumalginátové a vatové tampony či tampóny s dřevěnými špejlemi. ● Vždy dodržujte aplikaci požadovaného množství vzorku ● Reagencie A je toxická při požití ● Pozitivní a negativní kontroly obsahují azid sodný, který je potenciálně reaktivní s olovem a mědí za tvorby explozivních azidů kovů ● Test provádějte při pokojové teplotě s temperovanou testovací soupravou (na 15- 30°C) ● Neaplikujte vzorky do detekční oblasti (testovací linie) ● Nedotýkejte se detekční oblasti a vyhněte se jejímu znečištění ● Během celého průběhu testu vždy dodržujte bezpečnostní postupy pro manipulaci s infekčním materiálem a chemickými sloučeninami. ● S výtěrovými tampóny, BioNexia® Strep A testovacími proužky a extrakty zacházejte jako s infekčním odpadem a zajistěte i jejich náležitou likvidaci dle platných bezpečnostních předpisů. ● Výsledek testu odečítejte vždy po uplynutí doporučeného času 5 minut ● Skladujte a přepravujte soupravu pouze při uvedených teplotách. ODBĚR VZORKŮ A SKLADOVÁNÍ Výtěr z krku (tonsil) se získává standardním provedením dle doporučených postupů (například jak popsán viz literatura 1, 5). Používejte jen dakronové tampóny či tampóny z umělého hedvábí s plastovými držadly. Neužívejte kalcium alginátové a vatové tampóny či tampóny s dřevěnými špejlemi. Je doporučeno provádět test vzorku co nejrychleji po jeho odběru. Jestliže není toto možné, uchovávejte výtěrový tampón ve sterilní, suché a dobře utěsněné nádobě v chladničce. Pokud je vzorek třeba transportovat v kapalné formě, lze použít upravené Stuartovo transportní médium podle pokynů uvedených výrobcem. Neužívejte žádné přepravní nádoby obsahující agar čí živočišné uhlí. Správně uchované výtěrové tampóny mohou být skladovány v chladničce až 3 dny. Pokud je zároveň prováděno kultivační vyšetření lze po získání vzorku opatrně naočkovat na misku s krevním agarem před použitím pro BioNexia® Strep A test. Extrakční reagencie zabíjí bakterie na tampónu a tudíž je pro kultivační vyšetření po provedení testu nepoužitelný. NÁVOD K PROVEDENÍ TESTU Obecné pokyny: 1) všechny vzorky a reagencie včetně BioNexia® Strep A testovacího proužku je třeba před provedením testu nechat temperovat na pokojovou teplotu 2) je třeba dbát na zamezení kontaktu lahviček s reagenciemi a nádob s výtěrovými tampóny, aby nedošlo ke kontaminaci roztoků
Postup extrakce: 1) do čisté extrakční zkumavky přidejte 4 kapky reagencie A 2) přidejte 4 kapky reagencie B a ponořte tampon se vzorkem do extrakční zkumavky a oválejte ho několikrát po stěně zkumavky. Postup několikrát opakujte, aby se uvolnil vzorek z tamponu do roztoku. Poté ponechte zkumavku při pokojové teplotě a to nejméně 1 minutu, ale ne déle než 15 minut. Postup testu: 1) Namočte testovací proužek do extrakční zkumavky a ponechte jej v ní. Testovací proužek může být alternativně po 1 minutě položen na rovné podložce. 2) Výsledek testu by měl být odečítán po 5 minutách. V závislosti na koncentraci antigenu mohou být pozitivní výsledky čitelné již po 1 minutě. Výsledky by se neměly odečítat po více jak 10 minutách. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Negativní výsledek: Jen jedna růžovočervená linie v kontrolní zóně (C). Žádná zjevná ani slabá růžovočervená linie v testovací zóně (T). Strep A antigen není detekován.
Pozitivní výsledek: Dvě růžovočervené barevné zóny. Jedna se objeví v kontrolní zóně (C) a druhá v zóně testovací (T). Při testování silně pozitivních vzorků se intenzita kontrolní linie může zdát slabší. Tento výsledek dokazuje přítomnost Strep A.
Chybný test: Na testovacím proužku se neobjeví žádná linie nebo se objeví jen linie v testovací zóně. Opakujte test znovu s jiným testovacím proužkem.
KONTROLA JAKOSTI Správná laboratorní praxe vyžaduje však systém externích kontrol, která zaručuje určitou úroveň citlivosti
testu. Tyto kontroly je možné objednat. Pozitivní kontrola obsahuje tepelně inaktivovaný antigen Streptokoka skupiny A. Příprava pozitivní kontroly: Do čisté extrakční zkumavky přidejte 4 kapky reagencie A a 4 kapky reagencie B. Promíchejte pozitivní kontrolu a přidejte 1 kapku do smíchaných reagencií. Tento roztok důkladně promíchejte sterilním tamponem. OMEZENÍ Výsledek je závislý na kvalitě odběru. Falešně negativní výsledky mohou vzniknout nekvalitním odběrem vzorku nebo chybného skladování vzorků. Negativní výsledky byly pozorovány také u počínajícího onemocnění, kdy kolonizace ještě nebyla dostatečná, ve vzorku nebylo přítomno dostatečné množství antigenu. V tomto případě při klinickém podezření na infekční onemocnění streptokokem A je nutné provést jeho kultivační vyšetření. Test vzhledem k detekci antigenu nerozliší bezpříznakové bacilonosiče streptokoka A a pacienty s akutní infekcí. Pokud nesouhlasí klinické příznaky onemocnění s výsledkem testu, je nutné provést klasické kultivační vyšetření. Ve výjimečných případech při výrazném nálezu Staphylococcus aureus může dojít k falešně pozitivním výsledkům. Původci akutní infekce horních cest dýchacích, včetně akutní tonsilitidy mohou být i streptokoky jiných sérologických skupin, stejně jako další mnohé mikrobiálními patogeny. KLINICKÉ POZNÁMKY Je prokázáno, že přibližně 19% všech infekcí horních cest dýchacích je způsobeno streptokoky skupiny A (Streptococcus pyogenes) (6). Výskyt těchto infekcí je sezónní v zimě a na jaře a častější v oblastech s velkou hustotou obyvatelstva. CHARAKTERISTIKY TESTU HODNOCENÍ CITLIVOSTI TESTU Citlivost byla zjišťována na různých ředěních čisté kultury streptokoka skupiny A. Identifikační práh Streptokok B Antigen Testu byl stanoven na 1,5 x105 mikroorganismů na test. HODNOCENÍ SPECIFICITY TESTU Pro stanovení specificity testovací kazety BioNexia® Strep A ke streptokokům skupiny A byly testovány níže uvedené kmeny streptokoků skupiny A o různé koncentraci bakteriálních suspenzí. Test byl u všech kmenů pozitivní (při identifikačním prahu testu 1,5 x105 bakterií), což prokazuje specifickou reakci s antigeny streptokoků skupiny A. Testované kmeny Streptoccoccus pyogenes (skupiny A) SS-091; SS-410; SS-492; SS-496; SS-633; SS-634, SS-635, SS-721; SS-754; SS-799; ATCC-19615; Zkřížená reaktivita Zkřížená reaktivita s ostatními mikroorganismy byly studovaná pomocí bakteriálních suspenzí v koncentraci 108 CFU/ml. Následující mikroorganismy nevykazovaly zkříženou reaktivitu s BioNexia® Strep A detekčním testem: Group B Streptococcus Group G Streptococcus Proteus vulgaris Streptococcus faecium Neisseria gororrhoeae
Group D Streptococcus Streptococcus bovis Staphylococcus epidermidis Corynebacterium diphtheriae Staphylococcus saprophyticus
Streptococcus mutans Neisseria meningitidis Streptococcus mitis Neisseria subflava Group F Streptococcus Pseudomonas aeruginosa Streptococcus faecalis Neisseria lactima Moraxella catarrhalis
Bordetella pertussis Streptococcus salivarius Candida albicans Group C Streptococcus Haemophilus parahaemolyticus Staphylococcus aureus Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Neisseria sicca Streptococcus sanguis
SROVNÁVACÍ STUDIE Srovnávací studie byla provedena z výsledků vyšetření BioNexia® Strep A testovací soupravou a standardními kultivačními metodami, jež byly prováděny v několika různých mikrobiologických laboratořích. Výtěry z krku byly získány od pacientů s příznaky akutní tonsilitidy. Takto získané výtěrové tampony byly použity k inokulaci na krevní agar pro kultivační vyšetření a následně vyšetřeny BioNexia® Strep A testovací soupravou. Beta-hemolytické kolonie kultivované na krevním agaru byly skupinově identifikovány za využití standardní sérologické diagnostiky. Hodnocenými výsledky byla přítomnost či nepřítomnost streptokoka skupiny A. Kvantifikace u jednotlivých vzorků nebyla hodnocena. Získané výsledky:
BioNexia® Strep A
Senzitivita 97.6% (95% CI,93.8% 99.4%) Specificita 97.5% (95% CI,93.7% 99.3%)
Literatura: 1. Facklam,R. R. and Carey, R. B., Streptococci and Aerococci, Manual of Clinical Microbiology, 4 th ed., Lennette, E. H., Balows, A., Hausler, W. J. and Shadomy, H. J. (eds), American Society for Microbiology , 1985, PP154-175. 2. Levinson, M. L. and Frank, P. F., Differentiation of Group A from other Beta Hemolytic Streptococci with Bacitracin, J. Bacteriol., 69,284287(1995). 3. Edwards, e. a., phlillips, i. a., and Suiter, W. C., Diagnosis of Group A Streptococcal Infections Directly from throat secretions, J. Clin.
Micro. 15, 481-483 (1982). 4. Gupta, R., Talwar, G. P. And Gupta, S. K., Rapid Antibody Capture Assay for Detection of Group A Streptococci Using Monoclonal Antibody and Colloidal Gold-Monospecifi c Polyvalent Antibody Conjugate, J. Immunoassay , 13, 441-445 (1992) 5. Ross, P.W., Throat Swabs and Swabbing Technique, The Practitioner, 207,791-796 (1971). 6. Lauer, B. A., Rellar, L. B. and Mirrett, S., Effect of Atmosphere and Duration of Incubation on Primary Isolation of Group A Streptococci from Throat Cultures, J. Clin. Micro.,17,338-340 (1983).
