MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
Biomarkery časného metastazování do lymfatických uzlin u „low grade“ karcinomů prsu
Diplomová práce
Brno 2008
Jarmila Sobotková
Chtěla bych poděkovat vedoucímu mé práce Mgr. Pavlu Bouchalovi Ph.D. za odborné vedení, podnětné připomínky a rady. Dále děkuji pracovníkům Oddělení onkologické a experimentální patologie Masarykova onkologického ústavu za vstřícnost, praktickou pomoc a rady, zejména Mgr. Kristýně Brožkové. Děkuji také doc. Lence Hernychové z Ústavu molekulární patologie Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové za provedení identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií.
Prohlašuji že jsem práci vypracovala samostatně pod odborným vedením Mgr. Pavla Bouchala Ph.D. a za použití odborné literatury jejíž seznam je uveden.
2
Informovaný souhlas pacientů Pacienti Masarykova onkologického ústavu (MOÚ) dávají informovaný souhlas s podstoupením chirurgického zákroku. MOÚ používá celou škálu informovaných souhlasů podle účelu a typu operačního postupu. Souhlas obsahuje také prohlášení, že pacient souhlasí, že „zbytkový biologický materiál, který byl získán z jeho těla v rámci standardního diagnostického postupu, může být použit k výzkumným účelům” a “že údaje z jeho lékařské dokumentace (demografické údaje, informace o jeho zdravotním stavu, informace o poskytnuté zdravotní péči) mohou být použity lékařskými pracovníky MOÚ k výzkumu v oblasti lékařské vědy nebo v podobných oblastech a že kromě lékařských pracovníků MOÚ budou tyto údaje sdělovány zcela anonymně, tedy že z těchto dat nikdo nepozná, že se týkají jeho”.
3
Obsah 1.
ÚVOD ................................................................................................................................ 8
2.
TEORETICKÁ ČÁST ..................................................................................................... 9 2.1
Rakovina prsu............................................................................................................. 9
2.2 Klinickopatologické parametry ................................................................................ 10 2.2.1 Velikost primárního nádoru ............................................................................. 10 2.2.2 Nádorový grade ................................................................................................ 10 2.2.3 Přítomnost metastáz ......................................................................................... 11 2.2.4 HER-2............................................................................................................... 11 2.2.5 Estrogenní receptory ........................................................................................ 12 2.2.6 Protein p53 ....................................................................................................... 13 2.3
Markery pro rakovinu prsu....................................................................................... 14
2.4 Markery metastazování u rakoviny prsu .................................................................. 17 2.4.1 uPA................................................................................................................... 18 2.4.2 PAI-1 ................................................................................................................ 18 2.5 Princip screeningu proteinových profilů metodou SELDI-TOF MS ....................... 20 2.5.1 Příprava vzorku pro SELDI-TOF MS.............................................................. 20 2.5.2 Proteinové čipy................................................................................................. 21 2.5.3 Analyzátor TOF................................................................................................ 22 2.5.4 Zpracování naměřených MS spekter................................................................ 23 2.5.5 Identifikace potenciálních biomarkerů............................................................. 24 2.6 Princip proteomových studií založených na 2-DE-MS............................................ 26 2.6.1 Příprava vzorku pro 2-DE ................................................................................ 27 2.6.2 Isoelektrická fokusace ...................................................................................... 27 2.6.3 SDS-PAGE....................................................................................................... 28 2.6.4 Vizualizace 2-DE map ..................................................................................... 28 2.6.5 Analýza obrazu................................................................................................. 29 2.6.6 Identifikace proteinů v gelech pomocí hmotnostní spektrometrie ................... 29 2.6.7 Princip kvantifikace a identifikace proteinů metodou iTRAQ-2DLC-MS/MS31 3.
CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE ....................................................................................... 33
4.
MATERIÁL A METODY ............................................................................................. 34 4.1
Použité přístroje........................................................................................................ 34
4.2
Použité chemikálie ................................................................................................... 35
4.3 Postup analýzy metodou SELDI-TOF MS............................................................... 36 4.3.1 Zpracovávané vzorky ....................................................................................... 36 4.3.2 Příprava vzorku pro SELDI-TOF MS.............................................................. 36 4.3.3 Příprava čipu .................................................................................................... 37 4.3.4 Analýza čipů..................................................................................................... 37 4.3.5 Vyhodnocení spekter........................................................................................ 38 4.4 Identifikace potenciálních biomarkerů..................................................................... 39 4.4.1 iTRAQ-2DLC-MS/MS..................................................................................... 39 4.4.2 Preseparace na IMAC kolonce......................................................................... 39 4
4.4.3 4.4.4 4.4.5 4.4.6
Frakcionace metodou HPLC – RP ................................................................... 40 Stanovení proteinového profilu frakcí.............................................................. 40 Separace proteinů tricinovou elektroforézou ................................................... 41 Identifikace proteinů pomocí MALDI-MS/MS ............................................... 42
4.5 Postup analýzy metodou 2-DE-MS.......................................................................... 43 4.5.1 Příprava vzorku pro 2-DE analýzu................................................................... 43 4.5.2 Isoelektrická fokusace ...................................................................................... 43 4.5.3 SDS-PAGE....................................................................................................... 44 4.5.4 Barvení 2-DE gelů............................................................................................ 44 4.5.5 Analýza obrazu................................................................................................. 45 5.
VÝSLEDKY.................................................................................................................... 46 5.1
Optimalizace lýze tkáňových vzorků ....................................................................... 46
5.2 Screening proteinových profilů metastazujících a nemetastazujících primárních nádorů prsu metodou SELDI-TOF MS................................................................................ 48 5.3
Analýza proteinových profilů metastází .................................................................. 49
5.4
Identifikace potenciálních markerových proteinů v metastazujících nádorech prsu 50
5.5 Screening proteinových profilů metastazujících a nemetastazujících primárních nádorů prsu metodou 2-DE-MS ........................................................................................... 53 6.
DISKUZE........................................................................................................................ 59
7.
ZÁVĚR............................................................................................................................ 65
8.
LITERATURA ............................................................................................................... 66
5
SEZNAM ZKRATEK 2D
two-dimensional - dvourozměrný
2-DE
two-dimensional electrophoresis - dvourozměrná elektroforéza
BRCA1,2
breast cancer gene 1,2
C7BzO
3-((4-heptyl)fenyl-3-hydroxypropyl)dimethylamoniopropansulfonát
CA15.3
carbohydrate antigen 15.3
CA27.29
carbohydrate antigen 27.29
CBB
Coomassie Briliant Blue
CEA
carcinoembryonic antigen – karcinom embryonální antigen
CHAPS
3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamonio]-propan-1-sulfonát
CHCA
α-kyano-4-hydroxyskořicová kyselina
DTT
dithiothreitol
ECM
extracelulární matrix
ER
estrogenní receptor
ERE
Estrogen-Response-Elements
ESI
electrospray ionization – ionizace elektrosprejem
GADD45
growth arrest and DNA damage 45 protein
HER-2
human epidermal growth factor receptor
hnRNP
heterogeneous ribonucleoprotein – heterogenní nukleopratein
HPLC
high performance liquid chromatography – vysokoúčinná kapalinová chromatografie
IEF
isoelectric focusing - isoelektrická fokusace
IMAC
immobilized metal affinity capture
IPG
immobilised pH gradient – imobilizovaný pH gradient
iTRAQ
isobaric tags for relative and absolute quantitation – isobarické značky pro relativní a absolutní kvantifikaci.
LC
liquid chromatography - kapalinová chromatografie
LDI
laser desorption/ionization – laserová desorpce/ionizace
MALDI
matrix-assisted laser desorption/ionization - laserová desorpce/ionizace za přítomnosti matrice
Mr
relativní molekulová hmotnost
MOÚ
Masarykův onkologický ústav
6
MS
mass spektrometry – hmotnostní spektrometrie
MS/MS
tandemová hmotnostní spektrometrie
NP
normal phase – normální fáze
NTA
nitrilotrioctová kyselina
PAI-1
inhibitor aktivátoru plasminogenu urokinázového typu
qRT-PCR
quantitative real time polymerase chain reaction – polymerázová řetězová reakce
PFS
peptide fragment sequencing
pI
isoelectric point - isoelektrický bod
PMF
peptide mass fingerpriting
PMSF
fenylmethylsulfonylfluorid
Qq
dvojitý kvadrupól
RP
reverse-phase – reverzní fáze
SAX
strong anion exchange
SDS
dodecylsulfát sodný
SDS-PAGE
sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis – polyakrilamidová elektroforéza v přítomnosti dodecylsulfátu sodného
SEC
size-exclusion chromatography – gelová chromatografie
SELDI
Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization“ – Laserová desorpce/ionizace s vylepšeným povrchem
SPA
3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová kyselina
TFA
trifluoroctová kyselina
TRIS
tris(hydroxymethyl)aminomethan
TOF
time of flight – doba letu
UICC
Union International Contre le Cancer – Mezinárodní unie boje proti rakovině
uPA
urokinázový aktivátor plasminogenu
7
1. ÚVOD Rakovina prsu je nejčastěji se vyskytující formou nádorového onemocnění u žen, každoročně je diagnostikována v několika milionech případů na celém světě. I přes výrazné zvýšení úspěšnosti léčby díky screeningovým programům a adjuvantní terapii (chemoterapie a hormonální terapie) stále umírá mnoho pacientek na následky metastatických komplikací. Klíčem k nižší úmrtnosti žen s rakovinou prsu je včasná diagnostika spojená s nalezením nádoru v nejmenší zobrazitelné velikosti, především v nehmatných stadiích. U převážné většiny nádorů totiž platí, že malý nádor znamená dobře léčitelný nádor. Stejně důležité je také sledování odpovědi pacientů na léčbu a včasné zachycení možného opětovného výskytu onemocnění v reálném čase. Proto se usiluje o nalezení vhodných markerů, které by pomohly onemocnění diagnostikovat a také sledovat jeho průběh. V průběhu posledního desetiletí byly použity genomické mikročipy k molekulárnímu profilování nádorů prsu, jejichž výsledkem byla detailnější klasifikace a identifikace potenciálních genů charakteristických pro rakovinu prsu. Tyto genové profily byly aplikovány k určení prognózy a předpovědi léčby s lepšími výsledky než běžná klinická kritéria. Na funkci klíčových proteinů řídících onkogenezi může mít vliv jejich posttranslační modifikace, lokalizace v buňce či interakce s jinými proteiny, jelikož tyto informace nejsou zjistitelné na genomické úrovni, není genomika adekvátní jako jediná prediktivní metoda. K objevení a identifikaci nových biomarkerů se používají proteomické analýzy (pro srovnání například vzorků nemocných a zdravých jedinců). Současným standardem pro separaci a analýzu proteinů je dvourozměrná elektroforéza. Tato technika je však pracná, vyžaduje velké množství vstupního materiálu a je nepraktická pro analýzu velkého množství vzorků pacientů v klinické praxi. To naopak umožňuje analytická technologie SELDI–TOF MS, která je nejaplikovanější proteomickou metodou k charakterizaci nádorů a sér pacientů s rakovinou prsu.
8
2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Rakovina prsu Rakovina prsu je souhrnné označení pro nádorová onemocnění prsních žláz. Jedná se o nejrozšířenější formu rakoviny u žen a druhou nejčastější příčinu úmrtí na nádorové onemocnění žen. Jen v České republice je každoročně evidováno asi 5000 nových případů. Nejčastěji postihuje karcinom prsu ženy starší 50 let, výjimkou však nejsou ani mladé ženy okolo 20 let. Přestože jsou karcinomem prsu ohroženy především ženy, vyskytuje se i u mužů, kteří tvoří 1 % všech případů. I když stoupá počet nově diagnostikovaných případů, díky zavedení pravidelného vyšetřování žen a moderní léčbě, umírá dnes na toto zhoubné onemocnění relativně méně pacientek než v minulosti. K predispozici ženy k nádorovému onemocnění prsu můžou přispět hormonální vlivy, dědičná dispozice, špatná životospráva a riziko výskytu nádoru stoupá také s věkem. Nejčastějším projevem onemocnění je nebolestivé zduření nebo bulka kdekoliv v prsu nebo jeho okolí (podpaží). Prvními příznaky mohou být zarudnutí, otok kůže, vtažení bradavky nebo výtok z ní. K včasnému záchytu onemocnění a úspěšnému vyléčení významně přispívá samovyšetřování prsu a pravidelný mamografický screening, díky němuž lze zachytit časná stadia zhoubných nádorů prsu. V léčbě se uplatňuje několik základních metod – chirurgický zákrok, radioterapie, chemoterapie, hormonální či biologická léčba (1). Problémem zůstává možné šíření onemocnění do celého organismu v podobě metastáz. Předpokladem nádorového rozsevu je schopnost invazivního růstu nádorové buňky a narušování okolní tkáně. Jakmile nádor proroste do cév či lymfatických uzlin, jsou jeho odtržené části, jednotlivé buňky či jejich shluky, roznášeny krevním nebo lymfatickým systémem do celého těla, kde se může uchytit a kde začne růst nový, dceřiný nádor. V případě rakoviny prsu se jedná nejčastěji o metastazování do lymfatických uzlin, kostní dřeně, jater a plic. Pokud nádor metastazuje, je vysoká pravděpodobnost, že během 10 let dojde k návratu onemocnění.
9
2.2 Klinickopatologické parametry K určení co nejpřesnější diagnózy se používá popis nádoru pomocí klinickopatologických parametrů, které popisují velikost primárního nádoru v době chirurgického zákroku, grade nádoru, přítomnost metastáz, status steroidních receptorů (estrogenní, progesteronové) či amplifikaci genu HER-2 (případně mutace p53, hladina cyklinu D1). Zjištěné informace pomáhají předpovědět pravděpodobné chování nádoru a zvolit tak nejlepší léčbu pro konkrétní případy. Reakce pacientů na jednotlivé způsoby léčby se z důvodu značné heterogenity nádorů velmi liší.
2.2.1
Velikost primárního nádoru
Velikost primárního nádoru v době chirurgického zákroku je hodnocena několika stupni podle klasifikace TNM, přičemž s rostoucí velikostí nádoru se zhoršuje prognóza. T1 – nádor s maximální velikostí 2 cm v největším rozměru T2 – velikost nádoru 2-5 cm v největším rozměru T3 – nádor větší než 5 cm v největším rozměru T4 – nádor jakékoliv velikosti s přímým šířením do stěny hrudní nebo do kůže
2.2.2 Nádorový grade Stupeň malignity nádoru neboli grade se používá ke stanovení potenciálu nádoru z hlediska rychlosti růstu, agresivity a šíření. Nádorový grade popisuje stupeň buněčné diferenciace a vyjadřuje, jak moc se nádorové buňky podobají nebo liší od normálních buněk stejného typu tkáně. Ve většině případů má nádor tím malignější charakter, čím víc se jeho tkáňová stavba liší od předpokládané mateřské tkáně. Pro grading jednotlivých nádorů podle úrovně diferenciace existuje celá řada schémat, z nichž je nejpoužívanější Brodersův čtyřstupňový systém přejatý UICC a vycházející ze snahy stanovit poměr diferencovaných a nediferencovaných buněk v mikroskopickém obrazu nádoru (2). Grade 1 (Low grade) – dobře diferencovaný nádor s tendencí k plné diferenciaci (podobnosti s dospělými buňkami výchozí tkáně) ve více než ¾ nádorových buněk Grade 2 (Intermediate grade) – středně diferencovaný nádor ½ až ¾ buněk diferencovaných Grade 3 (High grade) – málo diferencovaný nádor má ¼ až ½ buněk diferencovaných Grade 4 (Anaplastic) – nediferencovaný nádor má méně než ¼ diferencovaných buněk
10
2.2.3
Přítomnost metastáz
V současné době se k vytipování pacientů s pravděpodobným metastazováním používá stav podpažních lymfatických uzlin – nález mikrometastáz (nádorové ložisko velikosti 0,2 – 2 mm v největším průměru). Při nálezu metastáz či mikrometastáz v axilárních lymfatických uzlinách je vysoká pravděpodobnost šíření onemocnění do vzdálených částí organismu. Ke zjištění vzdálených metastáz, přítomných nejčastěji v plicích, játrech a kostech, se provádí vyšetření pomocí rentgenu, ultrazvuku a scintigrafie, nebo se provádí celotělové vyšetření magnetickou rezonancí.
2.2.4
HER-2
HER-2 (human epidermal growth factor receptor) je transmembránový receptor o hmotnosti 185 kDa, který je členem rodiny receptorů s tyrosin kinázovou aktivitou. Ostatními členy této rodiny jsou HER-1, HER-3 a HER-4. Všechny tyto receptory mají podobnou strukturu, skládají se z extracelulární domény vázající ligand, transmembránové části a cytoplasmatické domény s tyrosin kinázovou aktivitou. Tyto receptory jsou zapojeny do procesu signální transdukce, ve kterém externí růstové faktory nebo jiné ligandy ovlivňují transkripci různých genů, a tak působí na buněčnou proliferaci, motilitu a adhezi. Aby mohlo dojít k přenosu signálu, je nutné, aby po navázání ligandu receptor dimerizoval, a to buď s totožným receptorem (homodimerizace), nebo s jiným členem rodiny HER (heterodimerizace). Ačkoliv pro HER-2 receptor nebyl dosud identifikován žádný specifický ligand, je to preferovaný dimerizační partner pro ostatní členy rodiny. HER-2 heterodimery jsou stabilnější a jejich signalizace je účinnější než dimer receptoru složený bez HER-2. Vzniklý komplex iniciuje intracelulární signalizaci prostřednictvím fosfatidylinositol 3-kinázy a fosfolipázy C (3). Bylo prokázáno, že receptor HER-2 má základní roli při regulaci proliferace epiteliálních buněk prsní žlázy a při vzniku a vývoji rakoviny prsu. Navázání růstového faktoru na tento receptor signalizuje buňce, že se má dělit. Pokud je v buňce přítomno více kopií genu HER-2, nalézá se na povrchu buňky příliš mnoho HER-2 receptorů a to způsobí, že buňka roste a dělí se mnohem rychleji. Nadměrná exprese proteinu HER-2 je důležitým prognostickým a prediktivním faktorem invazivního karcinomu prsu a je často spojena se špatnou prognózou, výskytem metastází a agresivním průběhem onemocnění. Amplifikace genu HER-2 je nalézána u 10-35 % invazivních, nádorových onemocnění prsu.
11
Stav HER-2 receptorů je důležitý při volbě vhodné léčby. Při nadměrné expresi tohoto proteinu se volí léčba pomocí látky trastuzumab, známé pod názvem Herceptin. Tato monoklonální protilátka se váže na extracelulární část HER-2 receptoru, zabrání dimerizaci receptoru a je přerušena signalizace růstového podnětu. V buňkách interagujících s touto látkou dochází k zastavení buněčného cyklu v G1 fázi a tím k redukci proliferace. K hormonální léčbě jsou nádory se zvýšenou expresí HER-2 receptoru podle současných dat rezistentní.
2.2.5
Estrogenní receptory
Pro estrogen existují dva typy receptorů, alfa (ERα) a beta (ERβ). Oba receptory jsou kódovány odlišnými geny a jsou exprimovány v různých orgánech. ERα je převážně exprimován v prsu, vaječníku, játrech a centrální nervové soustavě, kdežto ERβ v ostatních tkáních jako jsou kosti, plíce a prostata. Receptory jsou tvořeny jedním polypeptidovým řetězcem, který obsahuje místa pro vazbu hormonu, vazbu na DNA, dimerizaci a aktivaci transkripce. Interakce hormonu s receptorem navodí konformační změny, které vedou k aktivaci receptoru. Aktivovaný receptor dále interaguje s DNA, komplex ligand-receptor se váže
na
oblast
DNA
zvanou
Estrogen-Response-Elements
(ERE),
lokalizovanou
v promotorové oblasti cílového genu, spouští transkripci a syntézu mRNA. Konečný výsledek tohoto procesu, buď indukce nebo inhibice genové transkripce komplexem ligand-ER, záleží na typu buňky, přítomnosti koregulačních proteinů a genového promotoru (4). Nadměrná exprese estrogenních receptorů se vyskytuje asi v 70 % případů rakoviny prsu. Existují dvě teorie vysvětlující spojení vlivu estrogenních receptorů se vznikem nádoru (5) -
vazba estrogenu na receptor stimuluje proliferaci epiteliálních prsních buněk a zvýšená replikace DNA vede k častějším mutacím
-
metabolismus estrogenu produkuje genotoxickou látku vedoucí k poškození DNA
Při nadměrné expresi estrogenních receptorů se volí hormonální léčba, která spočívá v blokování hormonů, které podporují nádorový růst (steroidní hormony), nebo snižuje jejich vlastní produkci. Používaným lékem je např. tamoxifen, což je syntetický nesteroidní antiestrogen, který blokuje vazbu estrogenu na receptor.
12
2.2.6
Protein p53
Protein p53 je negativním regulátorem přechodu G1/S fáze buněčného dělení, který se nachází v nepatrném množství uvnitř většiny buněk, ale pokud dojde k poškození DNA způsobeném různými typy záření, UV světlem nebo mutagenními látkami, jeho exprese se rapidně zvýší. Protein p53 se váže na specifické sekvence DNA a stimuluje expresi celé řady genů, které zprostředkovávají dva důležité efekty p53: -
zástava buněčného cyklu v pozdní G1 fázi
-
programovanou smrt buňky
Přesný počet genů, jejichž transkripce je regulována p53, je stále neznámý. Do skupiny cílových genů patří např. bax (indukuje apoptózu), GADD45 (zástava buněčného růstu), MDM2 (regulátor p53), p21WAF1/CIP1 (inhibitor DNA replikace, regulátor buněčného cyklu) nebo Bcl-2 (inhibitor apoptózy) (6). Při poškození DNA protein p53 aktivuje gen p21WAF1/CIP1, který způsobí zástavu buněčného cyklu před vstupem do S fáze. Dále je indukována transkripce proteinu GADD45, který se podílí na reparaci DNA. Je-li poškozená DNA správně opravena, p53 aktivuje gen MDM2, který je zodpovědný za inhibici transkripční aktivity p53 zablokováním jeho DNA vazebné domény. Pokud je poškození DNA příliš rozsáhlé a není opraveno v průběhu G1 fáze, protein p53 navodí programovanou smrt takto poškozených buněk aktivací genu bax, který indukuje apoptózu. Tím brání dělení malformovaných nádorových buněk a růstu nádorů. Ke změně funkce proteinu p53 v buňkách může dojít několika způsoby: mutace v genu TP53, změna v regulátorech nebo v cílových genech. Pokud dojde k mutaci, protein ztrácí schopnost vázat se na DNA, nevyvolá tak proces reparace či apoptózu a geneticky poškozené buňky se mohou dále dělit. Inaktivace genu TP53 je nalezena více než u 50 % malignit. Jelikož léky proti rakovině působí na útlum nádoru zástavou buněčného cyklu nebo navozením apoptózy, může narušení tohoto procesu např. mutací v genu TP53 snížit odpověď na léčbu nebo způsobit úplnou rezistenci na lék. Souvislost mezi statutem p53 a odpovědí na léčbu je nejasná (3). Důvodem, proč se liší reakce na léčbu u nádorů s mutací v genu TP53 může být: -
schopnost indukovat apoptózu může záviset na kritériích jako jsou mechanismus účinku a dávka léku, typ nádoru
-
apoptotická dráha, důležitá pro navození buněčné smrti v některých nádorech, nesouvisející s p53
13
2.3 Markery pro rakovinu prsu V současné době se k detekci rakoviny prsu používá mamografie. I když tato metoda dokáže detekovat nádory velmi malé, které nelze zjistit lékařským vyšetřením, má několik nedostatků. Denzní tkáň prsu může zamezit rozpoznání nádoru, kalcifikované fibroidní cysty mohou způsobit falešně pozitivní detekci a lobulární karcinomy jsou často nedetekovatelné. Limitace v citlivosti a specifitě mamografie vedly ke snaze identifikovat marker specifický pro rakovinu prsu, který by přispěl k rozpoznání onemocnění dříve než se objeví jasné klinické příznaky (7). Existuje mnoho přístupů, které se snaží nalézt protein nebo gen sloužící jako vhodný marker. Pomocí DNA mikročipů pro analýzu exprese mRNA byly identifikovány konkrétní geny účastnící se procesu onkogeneze, např. TP53, BRCA1 a BRCA2. Proteomika má oproti genomice a transkriptomice potenciál doplnit informace týkající se posttranslačních modifikací proteinů (fosforylace, acetylace, glykosylace), které nejsou zjistitelné na úrovni mRNA a které hrají významnou roli ve stabilitě, lokalizaci, interakci a funkci proteinů. Proteiny také představují dostupnější a významnější terapeutické cíle než nukleové kyseliny. V současné době existuje několik vytipovaných proteinů, které mohou být využity k určení diagnózy či prognózy nebo při volbě vhodné terapie u karcinomu prsu. Doporučení pro použití těchto biomarkerů podle Americké asociace pro klinickou onkologii (8) jsou shrnuta v tabulce 1. Mezi proteiny, které se používají jako pomocné faktory při volbě terapie, patří CA15.3 a CA27.29. CA15.3 má obvykle zvýšenou koncentraci v krevním séru v pokročilých stadiích rakoviny prsu, ale v časných stadiích není zvýšená hladina pozorována. Hladina proteinu CA27.29 je sledována u znovu se objevujícího onemocnění a v pozdějších stadiích. Hlavní nevýhodou těchto proteinů pro klinické využití je malá specifita k rakovině prsu, zvýšená hladina těchto proteinů se objevuje i u rakoviny vaječníku, prostaty a plic. Pomocí qRT-PCR byly v séru nalezeny mRNA mammaglobinu a maspinu, jejichž hladiny specificky korelovaly s velikostí nádoru. Oba nálezy jsou však předběžné a nejsou zatím validovány pro rutinní klinický screening rakoviny prsu (7).
14
CA 15.3 a CA 27.29 Karcinom embryonální antigen (CEA)
-
steroidní receptory
-
Parametry založené na DNA flow cytometrii Proliferační markery založené na imunohistochemii
-
HER2
p53 Urokinázový aktivátor plasminogenu (uPA) a inhibitor aktivátoru plasminogenu urokinázového typu (PAI-1) Katepsin D Fragmenty cyklinu E Proteomické analýzy nádorů prsu Analýza multiparametrové genové exprese Mikrometastáze v kostní dřeni Cirkulující nádorové buňky
-
podle současných dat nejsou vhodné jako markery pro rakovinu prsu ani pro detekci opětovného výskytu možné použití jako pomocný faktor při volbě terapie pro metastazující rakovinu prsu není doporučeno pro sreening, diagnózu nebo rutinní pozorování možné použití jako pomocný faktor při výběru terapie pro metastazující rakovinu prsu doporučeno měřit v každém primárním invazivním onemocnění pro plánování terapie doporučeno měřit k identifikaci pacientů pro endokrinní terapii podle současných dat nejsou vhodné k zařazení pacientů do prognostických skupin podle současných dat nejsou měření Ki67, p27, p21WAF1/CIP1, cyklinu D, cyklinu E a dalších, vhodné k zařazení pacientů do prognostických skupin doporučeno hodnocení exprese nebo amplifikace k výběru pacientů pro léčbu trastuzumabem doporučeno k určení sensitivity k endokrinní terapii nedoporučeno pro určení prognózy nedoporučeno pro předpověď odpovědi na léčbu specifickými chemoterapeutickými látkami podle současných dat nedoporučeno při léčbě
-
mohou být použity k určení prognózy pacientů s nově diagnostikovanou rakovinou prsu s negativním nálezem na lymfatických uzlinách, pouze s použitím ELISA a min. 300 mg tkáně
-
podle současných dat nedoporučeno při léčbě podle současných dat nedoporučeno při léčbě
-
podle současných dat nedoporučeno při léčbě
-
onkotyp DX může být použit k předpovědi rizika návratu onemocnění u pacientů léčených tamoxifenem k vytipování pacientů vhodných pro léčbu tamoxifenem
-
podle současných dat nedoporučeno při léčbě
-
nedoporučeno k určení diagnózy a ovlivnění jakýchkoliv léčebných rozhodnutí
Tab. 1 Doporučení pro použití nádorových markerů
15
BRCA1 a BRCA2 Nádory prsu vznikají v naprosté většině na nedědičném základě. Jen přibližně 5 – 10 % žen s nádory prsu má dědičnou formu onemocnění. Existuje několik genů, jejichž poruchy (mutace) lze v postižených rodinách nalézt. Jedná se o geny MSH2/MLH1, TP53, PTEN, STK11, BRCA1 a BRCA2. Největší klinický význam mají mutace v genech BRCA1 a BRCA2 (9). Tyto geny kódují proteiny exprimované v různých tkáních během S a G2 fáze buněčného cyklu, které se nachází v buněčném jádře. Oba proteiny chrání strukturu chromosomů a jsou zapojeny do oprav zlomů DNA (10). Mechanismus působení těchto proteinů není přesně znám, ale předpokládá se, že jsou zapojeny také do regulace transkripce a kontroly buněčného cyklu. Mutace genů BRCA jsou spojeny s větší pravděpodobností vzniku rakoviny u epiteliálních tkání, jako jsou prs, vaječník, prostata a slinivka. Je možné, že poškození BRCA genů má tkáňově specifické efekty, které napomáhají transformaci buňky v nádorovou. Například buňky vaječníku nebo prsu jsou citlivější na efekty lokálních mutagenů jako jsou metabolity estrogenu. Dědičnost mutantních genů BRCA zvyšuje riziko rakoviny prsu na 5085 %.
16
2.4 Markery metastazování u rakoviny prsu Schopnost detekovat rakovinu dříve než dojde k rozsevu vzdálených metastáz je jedním z klíčů k zajištění nejvyšší pravděpodobnosti kompletního vyléčení. Tradiční prognostické markery (věk v době diagnózy, velikost nádoru, status hormonálních receptorů, nádorový grade) nejsou dostatečné pro přesné rozlišení rizikové skupiny u rakoviny prsu. V současné době se k vytipování pacientů s pravděpodobným metastazováním používá stav podpažních lymfatických uzlin – nález mikrometastáz. Skoro u 65 % pacientů s pozitivním nálezem a 30 % pacientů s negativním nálezem v lymfatických uzlinách se projeví návrat nemoci. Systematická chemoterapie, která se doporučuje pro více jak 90 % všech pacientů s negativním nálezem, vede ke zbytečnému léčení, zvýšení výskytu negativních vedlejších účinků a nákladů na léčbu (11). Z tohoto důvodu se výzkum zabývá identifikací silnějších prognostických markerů, které by pomohly rozhodnout o léčbě vytipováním rizikové skupiny pacientů. Ricolleau et al. (11), analyzovali 60 tkáňových lyzátů nádorů rakoviny prsu bez nálezu metastází v uzlinách, z nichž ve 30 případech došlo k návratu onemocnění (metastáze) s mediánem dalšího sledování 7,8 let. K analýze těchto vzorků byla použita metoda SELDITOF MS, s povrchy IMAC 30-Cu a SAX2. Proteiny vázáné na čipu byly analyzovány na ProteinChip Readeru Model PBS II (Ciphergen Biosystems). Analýzou byly zjištěny dva proteiny, ubikvitin (8560 Da) a lehký řetězec ferritinu (19876 Da), které měly vyšší hladinu v karcinomu prsu bez zasažených mízních uzlin. K identifikaci těchto proteinů byla použita série proteomických metod zahrnující iontoměničovou, gelovou a reverzně-fázovou chromatografii. Během procesu byly nové frakce profilovány na NP20 povrchu čipu pro monitoring přítomnosti či absence biomarkerů. Frakce s hledanými proteiny byly separovány pomocí polyakrylamidové elektroforézy (16% tricine). Takto purifikované biomerkery byly vyříznuty a štěpeny trypsinem, získané fragmenty byly analyzovány PMF použitím SELDI-TOF MS a dále potvrzeny peptidovou sekvenací použitím LDI-Qq-TOF-MS. K verifikaci zvýšené hladiny dvou proteinů v nádorové tkáni prsu byly použity Western blotting a imunohistochemie (IHC). Zvýšenou hladinu ubikvitinu v karcinomu prsu bez zasažených mízních uzlin potvrdil také Nakawaga et al. (12).
17
Rakovinné onemocnění je komplexní proces, ve kterém hraje rozhodující roli degradace extraceluární matrix (ECM), zprostředkovaná zejména rodinou matrix degradujících proteáz. Rodina
těchto
proteinů
zahrnuje
urokinázový
systém
aktivace
plasminogenu,
metaloproteinázy (kolagenázy) a cysteinové proteázy (katepsin B). Vysoká
hladina
urokinázového
aktivátoru
plasminogenu
(uPA)
a
inhibitoru
plasminogenního aktivátoru (PAI-1) v nádoru je asociována se zvýšenou pravděpodobností návratu nemoci a metastazování. uPA a PAI-1 jsou v současnosti zřejmě jedinými potenciálními biomarkery metastazování do lymfatických uzlin. Oba jsou detekovatelné v tkáni pomocí metody ELISA, avšak k detekci je potřeba 300 mg tkáně.
2.4.1
uPA
Urokinázový aktivátor plasminogenu (uPA) je serinová proteáza, účastnící se buněčných procesů např. migrace, invaze a katalýzy přeměny plasminogenu (zymogen) v aktivní plasmin. uPA je syntetizován v neaktivní formě, k jeho aktivaci je zapotřebí proteáz jako je plasmin (tvoří zpětnovazebnou smyčku), katepsin B nebo katepsin L. K proteolýze katalyzované uPA dochází navázáním proteázy na membránový receptor (uPAR). Vazbou uPA na receptor se zvýší proteolýza. Jakmile se naváže na urokinázový receptor (uPAR), uPA aktivuje plasminogen na plasmin, který aktivuje pro-matrix metaloproteázy (MMPs) a degraduje okolní extracelulární matrix (viz obr. 1). Tento proces regulují inhibitory PAI-1 a PAI-2 (13).
2.4.2
PAI-1
PAI-1 je inhibitorem aktivátoru plasminogenu urokinázového typu (inhibuje aktivitu uPA). PAI-1 je syntetizován jako aktivní molekula různými druhy buněk – endoteliální buňky, adipocyty a hepatocyty. Jeho hladina v plasmě je vysoce variabilní. Exprese PAI-1 je ovlivněna množstvím hormonů a růstových faktorů. Očekává se, že vysoká hladina inhibitoru uPA v rakovinné tkáni by měla korelovat s nízkou pravděpodobností metastazování, paradoxně je všek vysoká hladina PAI-1 spojena s agresivní formou nemoci. Důvod, proč vysoká hladina PAI-1 koreluje se špatnou prognózou, není jasný (14). Existuje však několik možných vysvětlení: -
kritická koncentrace PAI-1 může být nezbytná k zabránění nadměrné degradaci ECM
18
-
je důležitý pro angiogenezi, která je nezbytná pro cirkulaci maligních buněk
-
může ovlivňovat buněčnou adhezi a migraci a tím urychlit metastatický proces
-
může inhibovat apoptózu
Obr. 1 Schéma urokinázová dráhy aktivace plasminogenu. uPA: urokinázový aktivátor plasminogenu, uPAR: membránový receptor, PAI-1 a PAI-2: inhibitory aktivátoru plasminogenu urokinázového typu, Plg: plasminogen, Pl: plasmin
19
2.5 Princip screeningu proteinových profilů metodou SELDITOF MS Princip metody SELDI-TOF MS je založen na specifických interakcích (adsorpce, afinitní chromatografie, elektrostatické interakce) proteinů a peptidů z kompletních biologických vzorků s povrchem čipu. Navázané proteiny jsou následně ionizovány laserem za účasti matrice a analyzovány hmotnostním analyzátorem Time of flight (TOF), kde jsou ionty rozděleny na základě jejich měrného náboje (poměr hmotnosti analytu a jeho náboje). Výsledkem měření je hmotnostní spektrum analyzovaných proteinů. Sady spekter proteinových vzorků je možno srovnávat, kvantitativně a statisticky vyhodnocovat a vyvozovat závěry o hladinách proteinů v jednotlivých vzorcích. Předností metody SELDI – TOF MS je schopnost rychle analyzovat velké množství vzorků a také nízká potřeba vzorku. Díky tomu je vhodnou metodou pro použití v klinické praxi. Dalšími výhodami jsou tolerance metody k přítomnosti solí ve vzorku a možnost analýzy vzorku na různých površích čipů zároveň, čímž můžeme rozšířit počet analyzovaných proteinů. Naopak nevýhodou je nízké rozlišení a přesnost, není možná absolutní kvantifikace ani přímá identifikace, a špatné rozlišení signálů proteinů o větší molekulové hmotnosti (nad 20 kDa).
2.5.1
Příprava vzorku pro SELDI-TOF MS
V případě analýzy tkání metodou SELDI-TOF MS je potřeba nejprve tkáň ve vzorku desintegrovat, například pomocí mechanické homogenizace a sonikace a uvolněné proteiny současně solubilizovat a disagregovat. To se provádí chaotropními činidly jako jsou močovina nebo guanidinium chlorid. Rozpustnost hydrofobních částí proteinů zajišťují detergenty, např. CHAPS či TRITON X-100. Dále je možné použít redukční činidla pro redukci disulfidových můstků (DTT).
20
2.5.2
Proteinové čipy
Jádrem technologie SELDI-TOF MS jsou proteinové čipy, které jsou dostupné v široké škále různých chromatografických povrchů (viz obr. 2). Na aluminiové destičce čipu jsou terčíky s chemickými či biochemickými povrchy. Chemické povrchy mohou mít hydrofobní, hydrofilní, kationické nebo anionické vlastnosti. Čipy s povrchem IMAC (Immobilized Metal Affinity Capture) obsahují imobilizovanou kyselinu nitrilotrioctovou (NTA), která umožňuje chelataci dvojmocných (Zn, Co, Ni, Cu, Ca, Mg) a trojmocných (Al, Fe, Ga) iontů kovů. Biochemické povrchy umožňují navázání protilátek, DNA, receptorů či enzymů (15). Nejméně selektivní chromatografický čip je s tzv. normální fází. Existují také čipy s inertními zlatými terčíky, se kterými je možné provést standardní MALDI experiment. Obecně nejvíce používaný typ povrchu je IMAC. Na povrchu každého spotu je raménko s nitriltrioctovou kyselinou (NTA), se kterou chelatují ionty kovů (např. mědi) v průběhu přípravy čipu. S těmito ionty pak v dalším kroku interagují imidazolová jádra histidinů v proteinech (viz obr. 3).
Obr. 2 Možnosti chromatografických povrchů proteinových čipů.
21
Po přípravě povrchu čipu (ekvilibrace pro získání patřičného náboje, navázání kovu apod.) a nanesení vzorku interagují s povrchem čipu proteiny na základě afinity k čipu dané chemismem jeho povrchu. Nenavázané proteiny jsou odmyty, čímž se sníží komplexita vzorku. Poté je na čipy nanesena matrice, která krystalizuje spolu s proteiny. Jako matrice se nejčastěji používá α-kyano-4-hydroxyskořicová (CHCA) – vhodná pro analýzu malých molekul (<15 kDa), a 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová (sinapová, SPA) – doporučuje se pro analýzu větších proteinů, ale je možné ji použít i pro analýzu peptidů (16). Tím je čip připraven k analýze hmotnostní spektrometrií.
Obr. 3 IMAC povrch s navázanou mědí a interakce mědi s histidiny v proteinu.
2.5.3
Analyzátor TOF
Čip s navázanými proteiny je umístěn do SELDI spektrometru, kde je ozářen laserem. Energie laserového pulzu je absorbována matricí, dále dochází k ionizaci molekul analytu a jejich desorpci. Takto vytvořené ionty jsou urychleny elektrickým polem do analyzátoru TOF, kde jsou separovány podle měrného náboje - m/z (viz obr. 4). TOF je nejjednodušším analyzátorem. Skládá se z letové trubice s vakuem, elektrického pole a detektoru. Všechny ionty, urychleny stejnou energií, letí trubicí rozdílnou rychlostí, která je nepřímo úměrná jejich měrnému náboji, tzn. ionty s menší hodnotou m/z se pohybují k detektoru rychleji. Měrné náboje jednotlivých iontů jsou zjištěny měřením doby jejich letu k detektoru (17). Výhodou TOF analyzátoru je jeho vysoká citlivost, krátká doba analýzy a teoreticky neomezená maximální hodnota m/z. Před samotným měřením je nastavena intenzita laseru, citlivost a vlastní měření hmotností analyzovaného vzorku na detektoru. Hranice oblasti měření m/z jsou dány pomocí hodnot High mass a Deflector mass. Hodnota Focus mass definuje hodnotu m/z měřenou s nejvyšší přesností (mass accuracy).
22
Obr. 4 Schéma analýzy vzorku.
2.5.4
Zpracování naměřených MS spekter
Ke zpracování naměřených dat se používá zejména programového vybavení, dodávaného spolu s instrumentací. Prvním krokem je kalibrace, která je provedena externě, pomocí spektra hmotnostních standardů měřených na zvláštním spotu. K jednotlivým píkům tohoto spektra je přidělena daná molekulová hmotnost proteinů. Program pomocí těchto dat sestrojí kalibrační rovnici, podle které je schopen určit měrný náboj proteinů ve vzorcích na základě jejich doby letu. Jelikož jsou proteiny obvykle nabité jen jednou, hodnota měrného náboje se většinou rovná hmotnosti proteinu. Formou interní kalibrace je normalizace na hmotu, která se provádí pomocí hodnoty m/z vybraného píku, vyskytujícího se ve všech analyzovaných spektrech. Normalizací na hmotu se přiblíží hodnoty m/z proteinů ve spektrech před jejich vzájemným srovnáváním. Protože při nanášení vzorku a matrice může dojít k nepřesnostem např. v pipetování, intenzita jednotlivých spekter se může lišit. Druhým krokem je normalizace, která tyto rozdíly minimalizuje. Normalizací na iontový proud se provádí korekce iontového proudu daného spektra na průměrný nebo externě zadaný iontový proud v celém souboru spekter. Při normalizaci externím normalizačním koeficientem se používá hodnota iontového proudu nejslabšího spektra v souboru. Tímto koeficientem jsou násobeny hodnoty iontového proudu všech spekter, aby se docílilo normalizačního faktoru < 1 a tím srovnatelné intenzity spekter. Následuje detekce píků pomocí algoritmu Biomarker Wizard. Tímto algoritmem jsou během dvou kroků vytvořeny klastry píků se stejnými měrnými náboji v celém souboru spekter (vyskytující se alespoň u x % spekter, s tolerancí ± x % hmoty). V prvním kroku je nastavena nižší citlivost – poměr signál/šum je vyšší, a detekují se dobře definované píky. V druhém kroku je citlivost zvýšena, nastavením nižšího poměru signál/šum a dochází
23
k detekci méně zřetelných píků. Plochy jednotlivých píků jsou následně statisticky vyhodnoceny např. pomocí Mann-Whitneyho testu.
2.5.5
Identifikace potenciálních biomarkerů
Identifikace potenciálních biomarkerů zjištěných pomocí SELDI-TOF MS je poměrně obtížné, a to z několika důvodů. 1. Přímá identifikace proteinů ze vzorku pomocí LC-MS/MS není možná, protože SELDITOF MS detekuje píky intaktních proteinů s m/z větším jak 3000 Da, zatímco MS/MS technologie neumožňují fragmentaci polypeptidů větších než 4000 Da. 2. MS/MS identifikace je založena na teoretické hmotnosti proteinu vypočítané z nukleotidové sekvence jeho kódujícího genu, kdežto experimentální data získaná pomocí SELDI jsou založena na skutečné hmotnosti proteinů zahrnující případné posttranslační modifikace. Identifikace na základě prostého srovnání teoretické molekulové hmotnosti a experimentálně zjištěné molekulové hmotnosti proteinu proto nemusí být správná a často ani není možná. 3. Možnou cestou, jak identifikovat potenciální biomarkery, je využití iontové cyklotronové resonance s Fourierovou transformací, která je schopna stanovit celkovou hmotnost intaktního proteinu i jeho sekvenci. Avšak tato metoda je limitována potřebou čistého proteinu. Z výše uvedených důvodů je možné identifikovat proteiny v rámci SELDI studií pouze tzv. klasickým přístupem, založeným na postupné purifikaci a separaci proteinu pomocí elektroforetických a chromatografických metod, potvrzování intaktní hmotnosti proteinu pomocí
SELDI
a
identifikací
pomocí
sekvence
tryptických
fragmentů
z bandu
polyakrylamidové elektroforézy. K používaným postupům patří : - preseparace na IMAC-Cu kolonce – principem je interakce imidazolových jader histidinů s ionty mědi na kolonce. Takto zachycené proteiny jsou eluovány imidazolem. Preseparace snižuje komplexitu vzorku a zaručuje stejné spektrum proteinů jako na IMAC-Cu čipu, ale s použitím většího množství proteinu. - separace použitím kapalinové chromatografie s reverzní fází - princip této chromatografické metody je založen na hydrofobních interakcích vzorku s nepolární stacionární fází, která je tvořena alifatickými řetězci C8 nebo C18 na inertním nosiči (silikagel). K eluci zachycených proteinů na koloně dochází postupným zvyšováním podílu nepolárního rozpouštědla 24
v mobilní fázi. Použitím této separace se sníží komplexita vzorku, zároveň dochází k relativnímu zakoncentrování jednotlivých proteinů. - tricinová elektroforéza – dochází k separaci proteinů v elektrickém poli na základě jejich velikosti. Používá se pro lepší rozlišení proteinů menších jak 30 kDa (18) - identifikace po vyříznutí z gelu pomocí MS/MS (viz kap. 2.6.6)
25
2.6 Princip proteomových studií založených na 2-DE-MS Zatím nejvíce používanou metodou v proteomice je dvourozměrná gelová elektroforéza, která je schopna separovat tisíce proteinů v komplexních směsích. Celý proces se sestává z přípravy vzorku, isoelektrické fokusace (IEF), polyakrylamidové elektroforézy a vizualizace obrazu. Výsledkem je dvourozměrná proteinová mapa se souřadnicemi pI a Mr (viz obr. 5). 2-DE mapy jednotlivých vzorků je možno srovnávat a vyvozovat závěry o hladinách proteinů v jednotlivých vzorcích na základě kvantitativního a statistického vyhodnocení intenzit spotů. Identifikace proteinů z gelu je možná pomocí hmotnostní spektrometrie (viz kap. 2.6.6). Nevýhodou této metody, kromě její časové i manuální náročnosti, je problémová analýza extrémních proteinů - příliš malých (< 7000 Da), velkých, bazických či kyselých. Dalším problémem je analýza membránových a jaderných proteinů, které jsou špatně rozpustné. Poslední problém je spojen s dynamickým rozsahem dvourozměrné elektroforézy, 4
který činí max. 10 . Proteiny s velmi nízkou koncentrací ve vzorku nemusí být po obarvení gelu detekovány, nebo mohou být jejich spoty překryty skvrnami proteinů, které jsou ve vzorku zastoupeny hojněji. Proteiny, jejichž koncentrace ve vzorku je příliš vysoká, sice můžeme ze vzorku odstranit např. afinitní chromatografií, ale tím můžeme odstranit i menší proteiny, které s nimi mohou nekovalentně interagovat (19).
Obr. 5 Proteinová mapa tkáňového lyzátu primárního nádoru rakoviny prsu. 26
2.6.1
Příprava vzorku pro 2-DE
Příprava vzorku má zásadní vliv na obraz 2-DE proteinové mapy. V případě analýzy tkání je vzorek nejprve chemicky či fyzikálně rozbit např. sonikací, mechanickou homogenizací, osmotickou či enzymatickou lyzí podle druhu vzorku. Při rozbíjení a v následných krocích je třeba eliminovat účinky proteolytických enzymů např. pomocí inhibitorů proteáz. Současně je vzorek solubilizován vzorkovým pufrem, jehož účinkem by měly být proteiny solubilizovány a disagregovány. Vysoká koncentrace chaotropních činidel (močovina, thiomočovina) brání asociaci proteinů vodíkovými můstky, detergenty jako např. CHAPS, C7BzO zajišťují rozpustnost hydrofobních částí bílkovin, redukční činidla (DTT) zamezují vzniku disulfidových můstků a amfolyty či TRIS pufrují pH. Dále je vhodné enzymaticky odstranit zbytky DNA a RNA. V případě, že vzorek není dostatečně koncentrovaný, lze jej zahustit lyofilizací či precipitací (acetonem nebo trichloroctovou kyselinou). Precipitací se rovněž odstraní interferující látky (soli aj.) (20).
2.6.2
Isoelektrická fokusace
Isoelektrická fokusace je prvním rozměrem dvourozměrné elektroforézy. Během tohoto kroku jsou jednotlivé proteiny rozděleny podle svých isoelektrických bodů (pI). Po nanesení vzorku na komerční proužek s imobilizovaným pH gradientem (IPG-IEF) se proteiny vlivem elektrického proudu pohybují v gradientu pH do místa odpovídajícího hodnotě jejich pI, kde je jejich náboj nulový. Kromě IPG proužků s lineárním gradientem pH se používají i proužky se sigmoidním gradientem, které mají rozšířenou oblast pI 5-7, kde se obvykle nachází největší množství proteinů. Pro lepší separaci je možné použít IPG proužky s různými rozsahy pH či různé délky. Isoelektrická fokusace probíhá při zvyšujícím se napětí s maximem 8000 V za dodržení proudového limitu. Ukončení fokusace je dáno počtem volthodin (Vh) (1 Vh = působení napětí 1V po dobu 1 hodiny).
27
2.6.3
SDS-PAGE
Druhým rozměrem 2-DE je elektroforéza v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS). Komerční proužek s proteiny rozdělenými podle svých isoelektrických bodů je ekvilibrován nejprve v ekvilibračním roztoku s přídavkem dithiothreitolu (DTT), který redukuje disulfidové můstky v proteinu, a následně v ekvilibračním roztoku s přídavkem jodacetamidu, který alkylací cysteinů zabrání možnému obnovení můstků. Po ekvilibraci je IPG proužek nanesen na vrch deskového gelu a zalit agarózou. Aby byly proteiny separovány podle svých molekulových hmotností, obsahuje gel dodecylsulfát sodný, který proteiny denaturuje a udílí jim uniformní specifický náboj (tj. náboj vztažený na jednotku relativní molekulové hmotnosti). Obvykle se používají gely o koncentraci 10-13% akrylamidu.
2.6.4
Vizualizace 2-DE map
Po proběhnutí elektroforézy se proteinové skvrny zobrazují pomocí různých druhů barvení. Nejjednodušší možností je použití barviva Coomassie Briliant Blue. Toto barvení je navíc kvantitativní a gel je možné použít pro analýzu hmotnostní spektrometrií, ale je nejméně citlivé. Další možností vizualizace je barvení stříbrem, které je 10-100 × citlivější, ale má horší reprodukovatelnost, jelikož vyvíjení obrazu je ukončováno na základě subjektivního rozhodnutí. Tuto metodu dále nelze považovat za plně kvantitativní, protože má úzký lineární dynamický rozsah závislosti intenzity barvení na množství proteinu v gelu. Gely obarvené modifikovanými postupy barvení sice lze použít pro hmotnostní spektrometrii, ovšem často s rozporuplnými výsledky. Nejnovější metodou je použití různých fluorescenčních barvení, které jsou podobně jednoduché a kvantitativní jako barvení Coomassie, svou citlivostí jsou srovnatelné s barvením stříbrem a jsou také kompatibilní s MS charakterizací. Jejich použití je často limitováno vysokou cenou. Nejpoužívanější fluorescenčním barvením je Sypro Ruby (21). Sypro Ruby interaguje s primárními aminy aminokyselin (Lys, Arg, His, méně Tyr a Trp) a používá se pro nespecifické barvení všech proteinů (22) podobně jako další barvičky Sypro Orange nebo Flamingo, kdežto ProQ-Diamond specificky barví fosfoproteiny a ProQEmerald glykoproteiny.
28
2.6.5
Analýza obrazu
K možnému vyhodnocení 2-DE gelů je nutné nejprve nasnímat jejich obrazy pomocí skenerů či densitometrů pro snímání ve viditelném světle, fluoroimagerů v případě fluorescence nebo fosfoimagerů u radioaktivního záření. Nasnímaný obraz je dále zpracováván pomocí speciálních programů, které umožňují odečítat pozadí, detekovat skvrny na 2-DE gelu a přiřazovat k sobě navzájem skvrny na různých 2-DE gelech (matching). Aby bylo možné gely kvantitativně srovnat, je provedena normalizace, která slouží k vyrovnání intenzit jednotlivých gelů. Pomocí analytických setů je možno gely kvalitativně, kvantitativně a statisticky vyhodnocovat. K nejpoužívanějším programům patří PDQUEST, MELANIE II, III, AIDA, Phoretix 2-D a ImageMaster.
2.6.6
Identifikace proteinů v gelech pomocí hmotnostní spektrometrie
Separované proteiny v 2-DE gelu jsou po vyříznutí obvykle štěpeny specifickou proteázou např. trypsinem, který štěpí polypeptidový řetězec na C-straně argininu a lysinu. Výsledné peptidy jsou extrahovány z gelu a analyzovány hmotnostní spektrometrií. Metodou první volby při identifikaci proteinů MS je peptide mass fingerprinting (PMF). Při použití metody PMF je směs peptidů analyzována MALDI-TOF MS. „Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization“ - Laserová desorpce/ionizace za přítomnosti matrice usnadňující desorpci, je ionizační technika používaná v hmotnostní spektrometrii, která využívá matrici schopnou absorbovat světelné záření (17). Matrice je nanášena společně se vzorkem na destičku s inertním povrchem. Destička je následně umístěna do hmotnostního spektrometru, kde je vzorek ionizován laserem a analyzován analyzátorem TOF (viz kap. 2.5.3). Experimentální data – velikost a počet peptidů - jsou porovnávána s teoretickými hodnotami v databázi. K používaným vyhledávacím nástrojům patří algoritmy MASCOT a MSFIT. Modifikace metody PMF zahrnuje použití MALDI-MS/MS, kde kromě souboru hmotností peptidů získáme i částečnou informaci o sekvenci peptidů, což dále zpřesňuje získaná data. V případě neúspěšné identifikace pomocí metody peptide mass fingerprinting se používá on-line spojení kapalinové chromatografie a MS/MS (LC-MS/MS), které se vyznačuje vyšším rozlišením a vyšší kapacitou, ale také větší instrumentální i časovou náročností. K ionizaci peptidů dochází použitím elektrospreje (ESI). Vzorek prochází kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí (3-5 kV). Na výstupu z kapiláry vznikají malé kapičky, které vlivem elektrického pole nesou kladný či záporný náboj. Odpařováním rozpouštědla dochází
29
ke zmenšování kapiček až na ionty, které pokračují do analyzátoru. Jako analyzátor se obvykle používá iontová past, kde jsou v MS běhu zachyceny všechny ionty a změnou napětí jsou postupně podle m/z vypuzeny na detektor. V MS/MS běhu jsou z pasti vypuzeny všechny ionty, mimo iontů s požadovaným m/z, které jsou dále excitovány a fragmentovány. Jednotlivé fragmenty jsou postupně vypuzeny z pasti na detektor podle hodnoty měrného náboje. Jako analyzátory je možno použít také hybridní systémy – kombinace kvadrupólu s iontovou pastí či TOF. Výsledkem je soubor MS spekter celých peptidů a MS/MS spekter jejich fragmentů. Částečná sekvence peptidů je zjištěna porovnáváním velikostí jednotlivých fragmentů, z jejichž rozdílů jsou určeny příslušné aminokyseliny.
30
2.6.7
Princip kvantifikace a identifikace proteinů metodou iTRAQ-2DLC-MS/MS
Identifikovat a kvantifikovat proteiny ve vzorku je možné také proteomickou metodou využívající isobarických značek iTRAQ. Díky isobarickým značkám je možné kvantifikovat proteiny až ve 4 vzorcích v jednom běhu. Tyto značky se skládají z reportérové skupiny, která nese náboj, balanční skupiny, která udržuje celkovou hmotnost značky 145 Da (viz obr. 6) a reaktivní skupiny reagující s aminovou skupinou peptidů vzorku. Součet hmotností reportérové a balanční skupiny zůstává konstantní použitím různého isotopického obohacení atomy
13
C,
15
N a
18
O. To zabrání problémům s mobilitou při chromatografické separaci.
Hmotnost reportérové skupiny nabývá hodnot 114, 115, 116 a 117 Da, podle toho, jaké izotopy uhlíku a dusíku skupina obsahuje, kdežto hmotnost balanční skupiny má hodnoty 28, 29, 30 a 31 Da tak, aby celková hmotnost isobarické značky zůstala konstantní – 145 Da pro každý ze 4 reagentů.
Obr. 6 Isobarická značka iTRAQ.
Proteiny ve vzorcích jsou nejdříve redukovány, alkylovány, štěpeny trypsinem na peptidy a následně označeny isobarickými značkami, které se váží na jakoukoliv aminovou skupinu v peptidu (N-terminální peptidy a aminová skupina lysinu). Vzorky s označenými peptidy
31
jsou smíchány, rozděleny katexovou chromatografií a výsledné frakce jsou po odsolení separovány reverzně-fázovou chromatografií s MS/MS detekcí (23). Během tandemové hmotnostní spektrometrie dochází k fragmentaci značených peptidů, přičemž dojde k odštěpení reportérové a balanční skupiny a dále ke vzniku peptidových fragmentů, z nichž je určena sekvence peptidu. Balanční skupina nenese náboj a ve spektru se proto neobjeví. Naopak reporterová skupina nesoucí náboj se ve spektru objeví ve 4 variantách (114, 115, 116, 117 Da), jejichž relativní zastoupení odpovídá relativnímu zastoupení fragmentovaného peptidu (a následně i mateřského proteinu) ve 4 analyzovaných vzorcích v jednom běhu. Kvantifikace peptidů v daném vzorku se proto provádí porovnáním ploch píků u jednotlivých reportérových skupin.
32
3. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE •
Detekovat proteiny v tkáních low grade karcinomu prsu, jejichž hladiny jsou zvýšeny či sníženy u pacientů s diagnostikovanými metastázemi v lymfatických uzlinách metodou SELDI-TOF MS. Pokusit se tyto proteiny identifikovat.
•
Detekovat proteiny v tkáních low grade karcinomu prsu, jejichž hladiny jsou zvýšeny či sníženy u pacientů s diagnostikovanými metastázemi v lymfatických uzlinách metodou 2-DE - MS.
•
Srovnat výstupní parametry použitých metod (počty detekovaných proteinů, rozlišení, kapacita). Srovnat dosažené výsledky s literárními údaji.
33
4. MATERIÁL A METODY 4.1 Použité přístroje spektrofotometr:
Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech) Ultrospec III (Pharmacia Biotech)
centrifugy:
centrifuga 5415R (Eppendorf) centrifuga Mini Spin plus (Eppendorf) centrifuga 5402 (Eppendorf)
váhy
SPB32 (Scaltec)
ultrazvuk
Sonoplus (Bandelin)
zařízení pro IEF
PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad)
thermocycler
Thermomixer comfort (Eppendorf)
speedvac
SpeedVac 111V (Thermo Savant)
zařízení pro SDS-PAGE
PROTEAN Plus Dodeca Cell (Bio-Rad) PROTEAN II XL Cell (Bio-Rad)
skener
GS-800 (Bio-Rad)
fluoroimager
Pharos FX Plus (Molecular Imager)
software:
PDQUEST 8.0 Quantity One 4.6 Protein Chip Software 3.2.1
34
zařízení pro HPLC
Hewlett Packard 1100 Series
hmotnostní spektrometr
PBS IIc Protein Chip reader (Bio-Rad)
dialýza
Mini Dialysis Kit, 250 µl, cut-off 1 kDa (Amersham Biosciences)
IMAC kolonky
Protein Chip IMAC Spin Columns (Bio-Rad)
4.2 Použité chemikálie Sigma: glutaraldehyd, dithiothreitol, jodacetamid, C7BzO, acetonitril, trifluoroctová kyselina, Benzonase (E1014) Serva: glycin, SDS, TEMED, persíran amonný Fluka: tetrathionát draselný, Pharmalyte Invitrogen: SYPRO Ruby protein gel stain Bio-Rad: SPA, Protein Chip IMAC buffer set, Polypeptide SDS-PAGE molecular weight standards Ostatní běžné chemikálie byly čistoty nejméně p.a.
35
4.3 Postup analýzy metodou SELDI-TOF MS 4.3.1
Zpracovávané vzorky
Tato práce zpracovává soubor low grade mammárních karcinomů, které měly v době diagnózy při poměrně malé velikosti (T1 – průměr do 20mm) metastázy v axillárních lymfatických uzlinách. Jako srovnávací set slouží soubor primárních nádorů s podobnými prognostickými parametry, které v době diagnózy neměly prokazatelné uzlinové metastázy. Byly použity vzorky tkání pacientek z tkáňové banky Masarykova onkologického ústavu (MOÚ), kde byly sbírány od roku 2000. Zpracovávaný soubor obsahuje 37 vzorků (označení M1-M37) primárních nádorů, které měly v době diagnózy metastázy v lymfatických uzlinách, 54 vzorků (označení 1-54) primárních nádorů, které tyto metastázy prokazatelně neměly a 5 vzorků metastáz v lymfatických uzlinách (označení N1-N5).
4.3.2
Příprava vzorku pro SELDI-TOF MS
Z nádorových tkání uskladněných v tkáňové bance MOÚ byly odebrány přibližně stejné části. Odříznutá část tkáně byla co nejvíce rozkrájena skalpelem a k rozkrájenému vzorku tkáně bylo přidáno 200 ul lyzačního pufru (6 M guanidinium chlorid, 100 mM fosfátový pufr pH 6,6 a 1% TRITON X-100). Dále byl vzorek mechanicky homogenizován a podroben sonikaci (Sonoplus, Bandelin, sonda MS 72) za neustálého chlazení. Délka pulzu ultrazvuku byla nastavena na 0,1 s s pauzou mezi jednotlivými pulzy 0,9 s. Celý proces sonikace trval 30 s při výkonu 50 W. Poté byly vzorky inkubovány 1 hod při laboratorní teplotě za neustálého třepání s následnou centrifugací (14 000 g, 20 min). Celková koncentrace proteinů v lyzátu byla stanovena metodou podle Bradfordové (Bio-Rad Protein Assay), lyzáty byly skladovány při -80°C.
36
4.3.3
Příprava čipu
Tkáňové lyzáty primárních nádorů byly analyzovány na čipech IMAC 30. Na každý spot bylo naneseno 5 µl Charging Solution (Protein Chip IMAC buffer set, BioRad), po 10 min inkubace při pokojové teplotě byl roztok odstraněn buničitou vatou. Poté byly čipy umístěny do bioprocesoru a promyty 150 µl deionizované vody při pokojové teplotě po dobu 1 min. Po odstranění vody bylo přidáno 150 µl Neutralization Buffer, inkubováno bylo 5 min. Následovalo promytí 150 µl deionizované vody při třepání po dobu 1 min. Dále bylo napipetováno 150 µl Binding Buffer, inkubace probíhala 5 min s následným opakováním. Poté byl nanesen vzorek v množství obsahující 20 µg celkového proteinu ve 100 µl Binding Buffer, inkubováno bylo 30 min. Po odstranění vzorku byly spoty promyty 150 µl Binding Buffer po dobu 5 min. Promytí bylo dvakrát opakováno. Následovalo 2 × rychlé promytí (napipetovat a ihned odstranit) 150 µl deionizované vody. Celý proces byl prováděn na třepačce za laboratorní teploty. Čipy byly vyjmuty z bioprocesoru a ponechány 10-15 min při laboratorní teplotě, aby došlo k vyschnutí spotů. Dále byla připravena matrice. K dodávanému množství SPA (Bio-Rad) bylo přidáno 200 µl acetonitrilu a 200 µl 1% trifluoroctové kyseliny. Roztok byl 15 min třepán na vortexu a dále centrifugován (6 min, 14 000g). Matrice byla nanesena 2 × 1 µl na každý spot. Mezi opakovaným nanesením matrice byly spoty nechány několik minut na vzduchu k oschnutí spotů. Všechny tkáňové lyzáty primárních nádrorů byly analyzovány ve dvou opakováních, přičemž jejich rozmístění na čipy bylo randomizováno.
4.3.4
Analýza čipů
Čipy byly analyzovány hmotnostním spektrometrem PBS IIc Protein Chip reader (Bio-Rad). Oblast měření byla dána hodnotami High mass (100 kDa) a Deflector mass (2 kDa), Focus mass byla nastavena na hodnotu 10 kDa a optimalizační rozsah byl určen hodnotami 2-30 kDa. Intenzita laseru byla 190 Wcm-2 při 2 pulzech laseru na 1 pozici spotu. Analýza čipů probíhala při citlivosti detektoru 5.
37
4.3.5
Vyhodnocení spekter
Získaná spektra byla nejprve kalibrována pomocí externích hmotnostních standardů „All-inone protein standard (Bio-Rad)“. Normalizace iontového proudu byla provedena pomocí externího normalizačního koeficientu, kterým byla hodnota iontového proudu nejslabšího spektra. Dále byla provedena normalizace na hmotu vybraného píku 15840 Da, vyskytujícího se ve všech spektrech. Pomocí algoritmu Biomarker Wizard byly vytvořeny klastry se stejným měrným nábojem ve spektrech. V prvním kroku byly detekovány signály o poměru S/N (signál/šum) > 5, ve druhém kroku o poměru S/N > 3, vyskytující se alespoň u 5 % spekter s tolerancí 0,3 % hmotnosti, v rozsahu 2 – 100 kDa. Plocha takto detekovaných signálů byla statisticky vyhodnocena pomocí Mann-Whitneyho testu a proteiny s rozdílnou hladinou se statistickou významností p<0,01 byly hodnoceny také vizuálně.
38
4.4 Identifikace potenciálních biomarkerů 4.4.1
iTRAQ-2DLC-MS/MS
K identifikaci proteinů metodou iTRAQ-2DLC-MS/MS byly použity tkáňové lyzáty primárních nádorů s metastázemi M14, bez metastáz 4 a tkáňový lyzát metastáze N5. Identifikace byla provedena v MS laboratoři dr. Spirose Grabise (Academy of Athens, Řecko) a nebyla součástí diplomové práce.
4.4.2 Preseparace na IMAC kolonce Abychom získali stejné spektrum proteinů jako na čipu IMAC 30 při analýze SELDI-TOF MS, byla provedena preseparace tkáňových lyzátů na IMAC kolonce. Na IMAC kolonkách byly preseparovány tkáňové lyzáty primárních nádorů 3, 4, 6, 31, 48 a 50 s celkovým množstvím bílkoviny 4,4 mg (max. 1 mg bílkoviny na kolonku). Kolonka byla nejprve centrifugována (1000 g, 30s, 4°C) a promyta 3 × 50 µl deionizované vody, která byla odstraněna centrifugací po dobu 30 s. Poté bylo napipetováno 200 µl Charging Solution (Protein Chip IMAC buffer set, Bio-Rad) a inkubováno bylo 20 min na třepačce. Po odstranění Charging Solution byla kolonka promyta 200 µl deionizované vody a bylo přidáno 200 µl Neutralization Buffer (inkubace 5 min na třepačce) s opětovným promytím 200 µl deionizované vody. Dále bylo napipetováno 200 µl Binding Buffer a inkubováno bylo 3 × 5 min. Následovalo nanesení vzorku – objem vzorku obsahující 1 mg bílkoviny doplněný Binding Buffer na celkový objem 950 µl. Inkubace se vzorkem probíhala při třepání na třepačce po dobu 30 min. Poté byl vzorek odstraněn a kolonka byla 3 × promyta 200 µl Binding Buffer vždy s inkubací 5 min. Pak probíhala 10 min ekvilibrace 100 µl elučního pufru (250 mM imidazol, Binding Buffer). Následovala centrifugace (1000 g, 30 s, 4°C) při které byl eluát jímán do čisté eppendorfky. Ekvilibrace a eluce byla ještě jednou opakována, eluát byl jímán do stejné eppendorfky. Získaný eluát byl dialyzován (Mini Dialysis Kit, 250 µl, cut-off 1 kDa, Amersham Biosciences) přes noc proti 40 mM Tris/HCl pH 7 při stálém míchání a teplotě 4°C. Jednotlivé dialyzáty byly smíchány dohromady a výsledný dialyzát byl odpařen na SpeedVacu.
39
4.4.3
Frakcionace metodou HPLC – RP
Dialyzát byl po odpaření resuspendován v 80 µl 10% acetonitrilu obsahující 0,1% TFA, třepán 10 min při laboratorní teplotě na třepačce a přefiltrován přes 0,22 µm filtr. Separace kapalinovou chromatografií byla provedena na koloně BIO Wide Pore C18 s délkou 10 cm, průměrem 2,1 mm a velikostí částic 5 µm (Supelco), při použití předkolony BIO Wide Pore C18 s délkou 2 cm, průměrem 2,1 mm a velikostí částic 5 µm (Supelco). Separace byla provedena na přístroji Hewlett Packard 1100 Series. Kolona byla postupně promývána methanolem, mobilní fází B (99,9% acetonitril, 0,1% TFA) a mobilní fází A (0,1% TFA, deionizovaná voda) vždy 1 hodinu. Poté byl spuštěn běh bez vzorku s následným promytím kolony mobilní fází A po dobu 15 min. Vlastní separace vzorku probíhala 25 min při rostoucím gradientu 0-100 % mobilní fáze B a dále 10 min při 100 % mobilní fáze B. Průtok byl nastaven na 0,1 ml za minutu. Signál byl detekován UV – VIS detektorem při 280 nm a 220 nm, při referenční vlnové délce 360 nm. Frakce byly sbírány po 0,6 min kromě první frakce, která byla sbírána po dobu 4 min. Celkem bylo sbíráno 60 frakcí.
4.4.4
Stanovení proteinového profilu frakcí
Jednotlivé frakce z HPLC-RP byly odpařeny na SpeedVacu a resuspendovány v 20 µl 10% acetonitrilu s 0,1% TFA. Frakce byly analyzovány na čipech NP20 pomocí SELDI-TOF MS. Nejprve byly vytvořeny směsné frakce – smícháním 2 µl ze tří frakcí (kromě 1. frakce – nanesena samostatně). Tyto směsné frakce byly naneseny na vodou navlhčené spoty vždy 2 × 2 µl, přičemž před dalším nanesením byly spoty nechány několik minut na vzduchu, aby uschly. Poté byla nanesena matrice 2 × 1 µl na každý spot. Čipy byly analyzovány na SELDITOF MS a na základě analýzy spekter byly vybrány směsné frakce s přítomnými potenciálními markerovými proteiny. Následně byly na čipy NP20 naneseny jednotlivé vybrané frakce s hledanými proteiny 1 × 2 µl na spot a matrice 2 × 1 µl, čipy byly analyzovány metodu SELDI-TOF MS.
40
4.4.5
Separace proteinů tricinovou elektroforézou
Frakce s hledanými proteiny byly nejprve odpařeny na SpeedVacu a resuspendovány ve 20 µl lyzačního pufru A (12% SDS, 6% merkaptoethanol, 30% glycerol, 0,05% Coomassie blue, 150 mM Tris/HCl pH 7,0). Vzorky byly dále inkubovány 3 min v termostatu vyhřátém na 98°C a následně centrifugovány (16 000g, 20 min, 4°C). Tricinová elektroforéza byla provedena podle protokolu Schäggera (18). Vzorky byly naneseny na gel, který se skládal z 16% separačního (bez přídavku močoviny), 10% spacerového a 4% koncentračního gelu. Na gel byla také nanesena směs peptidových standardů obsahující triosafosfát isomerasu, myoglobin, α-lactalbumin, aprotinin, β řetězec insulinu a bacitracin (Polypeptide SDS-PAGE molecular weight standards, Bio-Rad) v množství 10 µl standardu + 3,3 µl pufru A. Dále byla spuštěna elektroforéza na přístroji PROTEAN II XL s tricinovým pufrovým systémem. Elektroforéza probíhala nejprve 2 hod při napětí 50V, dále při napětí 125V, 150V, 180V, 210V, 240V, 270V, 300V, 330V a 360 V vždy po dobu 2 hod, přičemž napětí 360V bylo nastaveno do konce elektroforézy, tzn. než linie Coomassie blue dosáhla spodního okraje gelu.
Barvení koloidní Coomassie Brilliant Blue G-250 Po skončení elektroforézy byl gel nejprve fixován 30 min ve fixačním roztoku (10% kyselina octová, 45% methanol, deionizovaná voda). Následně byl gel barven po dobu 18-24 hodin barvícím roztokem (3,5% kyselina fosforečná, 1,3 M síran amonný, 2% zásobní roztok CBB G-250, 34% methanol, deionizovaná voda). Poté byl gel odbarven deionizovanou vodou ve 45 krocích vždy po dobu 20 min. Gel byl dále naskenován densitometrem GS-800 a vyhodnocen pomocí programu Quantity One 4.6. Bandy na gelu byly srovnány s intenzivními píky v SELDI spektru příslušných frakcí a band odpovídající hledanému proteinu byl vyříznut pro následnou MS analýzu.
41
4.4.6
Identifikace proteinů pomocí MALDI-MS/MS
Identifikace proteinů metodou peptide mass fingerprinting na přístroji MALDI-TOF/TOF byla provedena doc. Lenkou Hernychovou na Ústavu molekulární patologie Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové. Hmotnostní spektra byla získána použitím 4800 MALDI TOF/TOFTM (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) s reflektronem a v MS/MS režimu. Spektrometr byl kalibrován směsí peptidů Mix 4 (LaserBio Labs, Sophia-Antipolis Cedex, Francie) před každou analýzou. Každé hmotnostní spektrum bylo získáno průměrováním 200 laserových pulzů. K prohlížení a zpracování souboru dat byl použit GPS ExplorerTM Software 3.6.
42
4.5 Postup analýzy metodou 2-DE-MS K proteomové analýze metodou 2-DE MS bylo použito 6 vybraných primárních nádorů karcinomu prsu, které měly prokazatelné metastáze v lymfatických uzlinách – M3, M8, M15, M29, M35, M37, a 6 primárních nádorů, které nemetastazovaly – 7, 8, 10, 11, 13, 51.
4.5.1
Příprava vzorku pro 2-DE analýzu
Z tkáně nádorů prsu byly odebrány přibližně stejné části, které byly skalpelem co nejvíce rozkrájeny a k rozkrájenému vzorku bylo přidáno 200 µl lyzačního pufru (7 M močovina, 2 M thiomočovina, 1% C7BzO, 70 mM DTT, 5 mM NaF, 0,2 mM NaVO3, 1 tableta Complete mini na 10 ml pufru, 1mM PMSF). Vzorky byly mechanicky homogenizovány a sonikovány (Sonoplus, Bandelin, sonda MS 72). Délka pulzu ultrazvuku byla nastavena na 0,1 s s pauzou mezi pulzy 0,9 s. Sonikace byla prováděna na ledu po dobu 30 s při výkonu 50 W. Vzorek byl následně nechán 1 hod a 15 min na třepačce za laboratorní teploty. Dále bylo ke vzorku přidáno 58 U benzoázy a po 15 min inkubace za lab. teploty bylo přidáno 4 µl Pharmalyte 310. Poté byl vzorek centrifugován (16 000g, 20 min, 4°C). Následně byl odebrán supernatant a stanovena bílkovina pomocí setu RC DC Protein Assay (Bio-Rad).
4.5.2
Isoelektrická fokusace
Z lyzátů byl odebrán objem obsahující 250 µg bílkoviny, dále byl přidán Pharmalyte 3-10 (dopočítáno na celkovou koncentraci 2%) a tento roztok byl doplněn rehydratačním pufrem o složení 7 M močovina, 2 M thiomočovina, 1% C7BzO, 70 mM DTT, bromfenolová modř na celkový objem 350 µl. Těchto 350 µl bylo naneseno na strip, který byl zalit 3 ml minerálního oleje a rehydratován přibližně 14 hodin. Byly použity stripy 18 cm dlouhé s pH rozmezím 3-10, nelineární (Bio-Rad). Následovala isoelektrická fokusace, která probíhala při maximálním napětí 8000 V a při maximálním proudu 50 µA na strip. Doba fokusace byla určena dosažením 100 kVh, přičemž při 150, 300, 650, 1200 a 1500 Vh byly měněny elektrodové papírky na elektrodách. Na katodách byly elektrodové papírky smáčeny 8 µl 50 mM DTT, kdežto na anodách 8 µl deionizované vody.
43
4.5.3
SDS-PAGE
Stripy byly po skončení fokusace ekvilibrovány, nejprve v ekvilibračním roztoku I (1% DTT, 6 M močovina, 2% SDS, 50 mM TRIS/HCl, pH 8,8, 30% glycerol, bromfenolová modř). Na každý strip bylo nalito 6 ml tohoto roztoku a ekvilibrace probíhala 12 min za neustálého třepání. Po skončení první fáze ekvilibrace byl ekvilibrační roztok I slit a na jednotlivé stripy bylo vždy nalito 6 ml ekvilibračního roztoku II (2,5% jodacetamid, 6 M močovina, 2% SDS, 50 mM TRIS/HCl, pH 8,8, 30% glycerol, bromfenolová modř). Ekvilibrace opět probíhala 12 min při třepání na třepačce. Poté byl ekvilibrační roztok II odstraněn. Na vrch polyakrylamidových gelů (koncentrace celkového monomeru 12%) s rozměry 20 × 20 cm, bylo napipetováno 750 µl agarózy a do ní byly ihned vloženy stripy. Elektroforéza probíhala na přístroji PROTEAN Plus Dodeca Cell s Laemmliho pufrovým systémem (24) nejprve 2 hodiny při napětí 50 V a dále při napětí 100 V, než linie bromfenolové modři dosáhla spodního okraje gelu (cca 22 hodin).
4.5.4
Barvení 2-DE gelů
Barvení stříbrem Po skončení elektroforézy byly gely ihned fixovány 1 hodinu ve fixačním roztoku I (40% ethanol denaturovaný methanolem, 10% kyselina octová, deionizovaná voda). Následovala senzitizace 1 hodinu ve fixačním roztoku II (0,5% glutaraldehyd, 30% ethanol denaturovaný methanolem , 8,2 mM tetrathionát draselný, 30 mM octan sodný, deionizovaná voda). Dále byly gely promývány deionizovanou vodou 4 × 15 minut a impregnovány roztokem AgNO3 (11,7 mM AgNO3, 0,025% formaldehyd, deionizovaná voda) po dobu 30 minut. Poté byly gely krátce (cca 1 min 15 s) promyty deionizovanou vodou. Gely byly vyvíjeny po dobu 1015
min
ve
vyvíjecím
roztoku
(0,21
M
K2CO3,
0,015%
formaldehyd,
47 µM Na2S2O3, deionizovaná voda). Vyvíjení gelů bylo zastaveno stop roztokem (2% octová kyselina, deionizovaná voda), ve kterém byly gely ponechány 10 min. Na 1 gel bylo použito 0,25 l každého roztoku. Všechny kroky, kromě rychlého promytí po impregnaci AgNO3, byly provedeny na třepačce.
44
Barvení Sypro Ruby Gely byly nejprve fixovány (50% ethanol denaturovaný methanolem, 3% kyselina octová, deionizovaná voda) po dobu 30 min. Následovalo barvení (300 ml nové barvičky, 200 ml již jednou použité barvičky, na 2 gely), které trvalo přes noc. Poté byly gely odbarvovány (10% ethanol denaturovaný methanolem, 7% kyselina octová, deionizovaná voda) po dobu 30 min. Gely byly uchovávány v 0,01% NaN3. Všechny kroky byly provedeny na třepačce. Barvený, či již obarvený gel byl uchováván v misce zabalené alobalem.
4.5.5
Analýza obrazu
2-DE gely byly naskenovány densitometrem GS-800 v případě barvení stříbrem a fluoroimagerem Pharos FX Plus v případě barvení Sypro Ruby a poté byly vyhodnoceny programem PDQUEST verze 8.0. Neskenované obrazy gelů byly nejprve manuálně upraveny (otočení, vyrovnání, oříznutí) a byly zadány spoty s nejmenší velikostí a intenzitou a spot s největší velikostí. Program podle těchto parametrů detekoval všechny spoty v gelech a odečetl pozadí. Poté byla provedena normalizace na průměrnou intenzitu spotů a automatické přiřazení spotů, které si odpovídají, na různých gelech (tzv. matching). Dále byla provedena kontrola správného přiřazení spotů a v případě chyby byla provedena manuální oprava. Gely byly dále rozděleny do 2 replikačních skupin podle přítomnosti či absence uzlinových metastáz. Pomocí analytických setů byla provedena kvantitativní a statistická analýza intenzit spotů v těchto replikačních skupinách. Za spoty se změněnou intenzitou byly považovány takové, jejichž integrální absorbance byla alespoň 2x vyšší nebo 2x nižší mezi oběma replikačními skupinami a současně tato změna byla statisticky významná (analýza MannWhitneyho testem, p < 0,05) Změna intenzity těchto spotů byla kontrolována také vizuálně.
45
5. VÝSLEDKY 5.1 Optimalizace lýze tkáňových vzorků Nádorová tkáň byla lyzována pomocí dvou lyzačních pufrů i) 6M guanidinium chlorid, 100 mM fosfátový pufr (pH 6,6), 1% TRITON X-100 ii) 9M močovina, 2% CHAPS. Dále byla provedena lýze za použití ultrazvuku a bez něj. Všechny vzorky byly dále 1 hod inkubovány při laboratorní teplotě za neustálého třepání. Poté byly centrifugovány a v odebraném supernatantu byla stanovena bílkovina metodou dle Bradfordové. Lyzáty pak byly naneseny na čipy s povrchem IMAC-Cu v množství 20 µg bílkoviny. Čipy byly dále analyzovány na SELDI-TOF MS a spektra lyzátů byla porovnána. Pro experiment byla vybrána lýze guanidinovým pufrem se sonikací na základě většího množství bílkoviny v lyzátech (viz tab. 2) a intenzivnějšího spektra (viz obr.7).
Bílkovina mg/ml
guanidinium
guanidinium
chlorid 15,18
chlorid sonikace 16,01
močovina 10,24
močovina sonikace 12,17
Tab. 2 Koncentrace bílkoviny v lyzátech nádorové tkáně, při použití různých lyzačních pufrů a sonikace
46
Obr. 7 Spektra lyzátů nádorové tkáně, při použití různých lyzačních pufrů a sonikace. G – guanidinium chlorid, GU – guanidinium chlorid + sonikace, U – močovina, UU – močovina + sonikace
47
5.2 Screening proteinových profilů metastazujících a nemetastazujících primárních nádorů prsu metodou SELDITOF MS Byl analyzován soubor 37 vzorků low grade nádorů, které měly metastáze v lymfatických uzlinách a jako srovnávací set byl použit soubor 54 vzorků low grade nádorů, které metastáze neměly. Tkáňové lyzáty jednotlivých primárních nádorů byly připraveny působením lyzačního pufru, sonikace a centrifugace. Lyzáty byly naneseny na čipy s povrchem IMACCu v množství obsahujícím 20 µg bílkoviny. Čipy byly analyzovány metodou SELDI-TOF MS. K vyhodnocení byly použity spektra 51 nemetastazujících a 34 metastazujících primárních nádorů. Vyřazeny byly primární nádory 26 a M18, které měly stejné číslo tkáňové banky a vyskytovaly se v obou souborech, stejně tak v případě vzorků 41 a M25, a dále M11 a 40 z důvodu malé intenzity spektra. Spektra (viz obr. 8) byla kalibrována, normalizována a poté byly detekovány píky algoritmem Biomarker Wizard. Celkem bylo v jednotlivých spektrech detekováno 130 píků, jejichž plocha byla statisticky vyhodnocena Mann-Whitneyho testem.
Obr. 8. Typické SELDI-TOF MS spektrum tkáňového lyzátu primárního nádoru prsu. Ze 130 píků byly statisticky významné píky 11046 Da a 11702 Da. Píky těchto proteinů měly 1,3 × větší plochu u nádorů s metastázemi v lymfatických uzlinách (viz obr. 9), na hladině významnosti p = 0,04 pro signál 11046 Da a p = 0,004 pro signál 11702 Da, než u nemetastazujících nádorů (viz obr. 10).
48
Obr. 9 Spektrum vzorku M7 metastazujícího primárního nádoru se zvýšenou hladinou proteinů 11046 Da a 11702 Da.
Obr. 10 Spektrum vzorku 9 nemetastazujícího primárního nádoru se sníženou hladinou proteinů 11046 Da a 11702 Da.
5.3 Analýza proteinových profilů metastází Byly použity tkáňové lyzáty metastází v lymfatických uzlinách N1-N5, které byly lyzovány a analyzovány metodou SELDI-TOF MS postupem popsaným v části Materiál a metody. Spektra metastází byla vizuálně porovnána se spektry metastazujících a nemetastazujících low grade primárních nádorů (viz kap. 5.2). Vizuálním srovnáním jsme zjistili přítomnost píků 11046 Da a 11702 Da také ve spektrech metastází s relativně velkou plochou (viz obr. 11). To potvrdilo přítomnost těchto potenciálních biomarkerů také v tkáni metastáze v lymfatické uzlině.
Obr. 11 Spektrum vzorku N2 metastáze v lymfatické uzlině s proteiny 11702 Da a 11046 Da.
49
5.4 Identifikace potenciálních markerových proteinů v metastazujících nádorech prsu Pro identifikaci dvou proteinů s molekulovými hmotnostmi 11046 Da a 11702 Da byly vybrány tkáňové lyzáty primárních nádorů, které měly ve svých spektrech intenzivní píky pro tyto proteiny. Tyto lyzáty byly nejprve preseparovány na IMAC-Cu kolonkách v celkovém množství 4,4 mg bílkoviny. Eluáty z jednotlivých kolonek byly dialyzovány, po dialýze byly slity dohromady a odpařeny vakuovou centrifugací. Následně byl odpařený dialyzát resuspendován v 10% acetonitrilu obsahující 0,1% TFA a proběhla separace kapalinovou chromatografií s reverzní fází (C18). Malé části sbíraných frakcí byly naneseny na čipy s povrchem NP20 pro zjištění proteinového profilu jednotlivých frakcí (viz obr. 12). Zbylé části frakcí obsahující hledané proteiny byly separovány elektroforézou s tricinovým pufrovým systémem, která se vyznačuje dobrou separací proteinů v oblasti molekulových hmotností 1-30 kDa. Gel byl poté obarven koloidní Coomassie Briliant Blue a vyhodnocen pomocí programu Quantity One 4.6. Elektroforegram byl následně srovnán se SELDI spektrem nanesených frakcí (porovnání intenzivních píků s bandy na gelu). Hledanému proteinu 11702 Da odpovídal band s přibližnou molekulovou hmotností 12,74 kDa (viz obr. 13), který byl vyříznut, odbarven a zaslán na identifikaci metodou peptide mass fingerprinting technologií MALDI-TOF/TOF do Hradce Králové. Protein se ovšem nepodařilo identifikovat z důvodu jeho nedostatečného množství. Protein s molekulovou hmotností 11046 se nepodařilo v elektroforegramu nalézt.
50
Obr. 12 Spektra jednotlivých frakcí z HPLC-RP nanesených na čipy NP20. Vyznačeny jsou hledané píky proteinů pro identifikaci – 11702 Da (nalezeny ve frakcích 35 a 36) a 11046 Da (nalezeny ve frakcích frakce 38+39).
51
Obr. 13 Srovnání intenzivních píků SELDI spektra směsi RP-LC frakcí 35+36 s bandy na gelu tricinové elektroforézy. V dráze 1 byla separována směs frakcí 35+36, na dráze 2 směs frakcí 38+39, na dráze 3 směs peptidových standardů. Označený band byl vyhodnocen jako odpovídající píku 11702 Da v SELDI spektru směsi frakcí 35+36, byl vyříznut z gelu a analyzován metodou peptide mass fingerprinting technologií MALDI-TOF/TOF.
52
5.5 Screening proteinových profilů metastazujících a nemetastazujících primárních nádorů prsu metodou 2-DEMS K analýze pomocí 2-DE-MS bylo vybráno 6 nemetastazujích primárních nádorů a 6 primárních nádorů s metastázemi v lymfatických uzlinách. Vzorky byly lyzovány působením lyzačního pufru a sonikace. Jednotlivé tkáňové lyzáty byly naneseny na stripy v množství 250 µg bílkoviny, v rehydratačním pufru s přídavkem Pharmalyte 3-10. Následovala isoelektrická fokusace a elektroforéza. Gely byly obarveny stříbrem, nasnímány densitometrem a vyhodnoceny pomocí programu PDQUEST 8.0. Dále byla provedena statistická analýza obou souborů a byly automaticky vybrány spoty, které byly minimálně 2 × intenzivnější než ve druhém souboru, na hladině významnosti 0,05. Tyto spoty byly také hodnoceny vizuálně. Pro identifikaci hmotnostní spektrometrií bylo vybráno celkem 6 proteinových spotů, přičemž 3 proteiny měly zvýšenou hladinu ve vzorcích s metastázemi - čísla spotů: 1314, 2513, 7008 (viz obr. 14) a zbylé 3 proteiny měly vyšší hladinu ve vzorcích, které metastáze neměly - čísla spotů: 0026, 9213, 2511 (viz obr. 15). Poté byly vybrány tkáňové lyzáty (M8 a 10), které měly zmíněné spoty nejvíce intenzivní, a s těmito lyzáty byla provedena mikropreparativní 2-DE, ale tentokrát bylo naneseno množství vzorku obsahující 350 µg bílkoviny a gely byly obarveny fluorescenčním barvením Sypro Ruby. K identifikaci MS byly vyříznuty spoty č. 1314, 7008, 9213, 2511. Spoty 2513 a 0026 byly na gelech málo intenzivní a nebylo možné je vyříznout (viz obr.16). Vzorky byly štěpeny v gelu trypsinem a peptidy eluovány, každý vzorek byl poté nanesen na dvě sousední pozice na MALDI destičce a analyzován MS na MALDI TOF/TOF a následně byly 4 nejintenzivnější píky sekvenovány v MS/MS modu. Jednotlivé spoty byly identifikovány (viz tab. 3) jako cytokeratin-19, transgelin – isoforma CRA_c, heterogenní ribonukleoprotein K – isoforma CRA_f a heterogenní ribonukleoprotein A2/B1 isoforma 22.
spot
zvýšená hladina
identifikace acc. number
1314 1,9 × u meta 90111766 7008 6,7 × u meta 115987704 1,1 × u nemeta 2511 119583084 9213 1,5 × u nemeta 73976124 26 jen u nemeta 2513 1,4 × u meta Tab. 3 Spoty se zvýšenou hladinou
název proteinu
Cytokeratin-19 Transgelin – isoforma CRA_c heterogenní ribonukleoprotein K – isoforma heterogenní ribonukleoprotein A2/B1 isoforma 22 nebyly identifikovány
v metastazujících (meta) a nemetastazujících (nemeta)
primárních nádorech. 53
Obr. 14 Proteinová mapa tkáňového lyzátu metastazujícího primárního nádoru M8 s vyznačenými spoty proteinů, které měly zvýšenou hladinu.
Obr. 15 Proteinová mapa tkáňového lyzátu nemetastazujícího primárního nádoru 10 s vyznačenými spoty proteinů, které měly zvýšenou hladinu.
54
Spot č. 1314 u metastazujícího (A) a nemetastazujícího (B) primárního nádoru
Spot č. 0026 u metastazujícího (A) a nemetastazujícího (B) primárního nádoru
Spot č. 7008 u metastazujícího (A) a nemetastazujícího (B) primárního nádoru
55
Spot č. 9213 u metastazujícího (A) a nemetastazujícího (B) primárního nádoru
Spot č. 2511 u metastazujícího (A) a nemetastazujícího (B) primárního nádoru
Spot č. 2513 u metastazujícího (A) a nemetastazujícího (B) primárního nádoru Obr. 16 Přehled spotů proteinů se zvýšenými hladinami v primárních nádorech.
56
Transgelin Transgelin je abundantní protein specifický pro hladkou svalovinu. Jeho fyziologická role zůstává nejasná, ale bylo zjištěno, že se váže na aktinové monomery v molekulárním poměru 1:6 a také na aktinová filamenta in vitro Exprese tohoto proteinu je citlivá na transformaci, u transformovaných buněk je jeho exprese značně redukována. Zvýšená hladina transgelinu ve stárnoucích buňkách a nízká v buňkách transformovaných naznačuje, že transgelin může hrát roli v buněčné diferenciaci stabilizací cytoskeletu skrz vazbu aktinu (25). Bylo také zjištěno, že v primárních nádorech prsu dochází k alelickým imbalancím na lokusu 11q23, na kterém se nachází gen pro transgelin (26). Tyto imbalance mají za následek zvýšenou expresi onkogenů a mají také souvislost s metastazováním do lymfatických uzlin u rakoviny prsu (27).
Cytokeratin-19 Protein cytokeratin 19 je členem rodiny keratinů, které patří mezi intermediární filamenta a jsou zodpovědné za strukturální integritu buněk. Dělí se na cytokeratiny a vlasové keratiny. Exprese cytokeratinů se liší podle typu epiteliálních buněk, rozsahu diferenciace a vývoje tkáně. Cytokeratiny mohou být detekovány v tělních tekutinách např. krev, moč. U zdravých jedinců je hladina cytokeratinů v oběhu nízká, ale podstatně stoupá u pacientů s epiteliálním karcinomem, proto mohou být použity jako nádorové markery. Cytokeratinové markery nejsou orgánově specifické, což limituje jejich diagnostický užitek. Nicméně jsou používány k monitorování pacientů během léčby (28).
Heterogenní ribonukleoprotein K Heterogenní ribonukleoprotein K se nalézá v buněčném jádře, během genové transkripce a následné posttranskripční modifikace nově syntetizované RNA, jako součást komplexu heterogenních ribonukleoprateinů (hnRNP). Komplex hnRNP se váže na pre-mRNA, což signalizuje, že molekula není plně zpracována a připravena k exportu do cytoplasmy. Heterogenní ribonukleoprotein K se může také vázat na jednořetězcovou DNA a také stimulovat aktivitu RNA polymerázy II (29).
57
Heterogenní ribonukleoprotein A2/B1 Heterogenní ribonukleoprotein A2/B1 patří do rodiny hnRNP proteinů, jejichž hlavní funkcí je transport mRNA do cytoplasmy (viz hnRNP K). Dalšími důležitými funkcemi je vazba na telomery a specifické proteiny.
58
6. DISKUZE Karcinom prsu je nejčastějším nádorovým onemocněním u žen. Přestože se v posledních desetiletích významně snížila úmrtnost na tuto diagnózu díky screeningovým programům a systematické adjuvantní terapii, všechny pacientky se vyléčit nedaří. Jedním z problémů je nedostatečný popis primárního nádoru pomocí v současné době standardně používaných klinickopatologických parametrů, který nepostačuje k určení rizika následného metastazování. V této práci jsme se zaměřili na detekci a identifikaci proteinů v primárních nádorech, jejichž hladiny korelují s metastazováním do lymfatických uzlin a které by mohly po patřičné verifikaci a validaci sloužit k další molekulární charakteristice primárního nádoru a určení rizika metastazování. K tomuto účelu jsme využili jednak metodu SELDI-TOF MS, pomocí níž jsme charakterizovali celý soubor celkem 51 nemetastazujících a 34 metastazujících primárních nádorů měřením proteinových profilů (stanovením molekulových hmotností přítomných proteinů a jejich kvantifikací), jednak metodu 2-DE MS, kterou jsme charakterizovali vybraných 6 nemetastazujících a 6 metastazujících primárních nádorů. Výsledky jsme dále srovnali s proteinovými profily vybraného nemetastazujícího a metastazujícího primárního nádoru a metastáze v lymfatické uzlině získanými pomocí metody iTRAQ-2DLC-MS/MS, jejichž získání však nebylo součástí této práce. Výstupní charakteristiky použitých metod Metodou SELDI-TOF MS jsme v naprosté většině nádorových lyzátů detekovali 130 proteinových píků v oblasti molekulových hmotností 2-100 kDa, přičemž většina píků ležela v oblasti 3-20 kDa. Naproti tomu metodou 2-DE MS bylo detekováno cca 800 proteinových spotů v oblasti 10 - 150 kDa. Metodou iTRAQ-2DLC-MS/MS bylo detekováno a identifikováno 605 proteinů v rozmezí molekulových hmotností 5 – 500 kDa. Jak je patrné z těchto údajů, metodou s nejvyšší kapacitou ve srovnatelném čase analýzy je zdaleka metoda SELDI-TOF MS, která však díky slabému rozlišení detekuje nejméně proteinů a neumožňuje jejich přímou identifikaci. Standardní metoda 2-DE MS disponuje dobrým rozlišením i možností identifikace proteinů, díky časové i instrumentální náročnosti však do klinické praxe zdaleka nepronikla. Nejnovější metoda iTRAQ-2DLC-MS/MS umožňuje získat rychleji a s menší náročností než u 2-DE-MS relativně velké množství dat o identitě a kvantitě proteinů
59
ve vzorku, její kapacita však opět neumožňuje v rozumných časových a cenových relacích charakterizovat celý požadovaný soubor nádorů. Získaná data jsou pak pouhou charakteristikou tří konkrétních tkání a neumožňují učinit závěr, hladiny kterých proteinů se mění v přímé souvislosti se sledovaným biologickým jevem (metastazováním) a nikoliv v souvislosti s dalšími nezbytně rozdílnými charakteristikami. Metodický pohled lze tedy uzavřít konstatováním, že metody SELDI-TOF MS, 2-DE MS a iTRAQ-2DLC-MS/MS lze do určité míry považovat za komplementární z hlediska kapacity, rozlišení, spektra detekovaných proteinů i informace o identitě proteinů. Identifikace potenciálních biomarkerů a jejich význam Metodou SELDI-TOF MS byla zjištěna zvýšená hladina proteinů s předpokládanými molekulovými hmotnostmi 11046 Da a 11702 Da u metastazujících primárních nádorů. Protein s předpokládanou molekulovou hmotností 11702 Da byl detekován ve značném množství také v tkáni metastáze a jeho zvýšená hladina u metastazujících primárních nádorů byla potvrzena také v nezávislém testovacím souboru (mimo tuto diplomovou práci). Zvýšení plochy tohoto píku u primárního nádoru tedy můžeme považovat za nejvěrohodnější indikátor metastazování do lymfatických uzlin v rámci této práce. Pokusy o identifikaci těchto píků byly vedeny dvěma odlišnými strategiemi. První byla postavena na srovnání souborů molekulových hmotností proteinů detekovaných pomocí SELDI-TOF MS a proteinů detekovaných metodou iTRAQ-2DLC-MS/MS. Jak však vyplývá z obr. 17, molekulové hmotnosti detekovaných proteinů v obou souborech se neshodují. Prvním možným důvodem je fakt, že proteinový profil získaný SELDI-TOF MS je postaven na molekulových hmotnostech intaktních proteinů, kdežto proteinový profil iTRAQ-2DLCMS/MS je sestaven z teoretických molekulových hmotností proteinů, vypočítaných z nukleotidových sekvencí jejich genů. V důsledku posttranslačních modifikací u intaktních proteinů (fosforylace, glykosylace, proteolýza a jiné) se pak oba profily mohou značně lišit. Další možnou významnou příčinou je přítomnost preseparačního kroku u metody SELDITOF MS (SELDI profil je na rozdíl od profilu získaného metodou iTRAQ-2DLC-MS/MS obohacen o proteiny obsahující histidin). Druhá identifikační strategie postavená na kombinací RP-LC, tricinové elektroforézy a MS/MS (viz kap. 2.5.5) nebyla také doposud úspěšná díky neúspěšné MS/MS analýze. Naše zjištění lze přesto dát do souvislosti s výsledky Ye et al. (30), kteří identifikovali protein s identickou předpokládanou molekulovou hmotností 11702 Da jako haptoglobin α. Tento pík měl zvýšenou hladinu v séru pacientek s karcinomem vaječníků ve srovnání se zdravými ženami. Je však třeba si uvědomit, že 60
hladina proteinu ve tkáňovém lyzátu je výrazně jiná než v séru a proto se přes shodnou molekulovou hmotnost nemusí ani zdaleka jednat o tentýž protein.
SELDI iTRAQ
10000
10500
11000
11500
12000
12500
Obr. 17 Srovnání proteinových profilů (souborů molekulových hmotností proteinů) u primárních nádorů zjištěných metodami SELDI-TOF MS a iTRAQ-2DLC-MS/MS v oblasti 10-12,5 kDa
Analýzou proteinového složení metastazujících a nemetastazujících primárních nádorů metodou 2-DE MS byly zjištěny rozdílné hladiny 6 proteinů, z nichž 4 byly úspěšně identifikovány pomocí MALDI-MS/MS: Jako nejzajímavější se jeví zvýšená hladina transgelinu u metastazujících primárních nádorů. Gen tohoto proteinu se nachází na lokusu 11q23, na němž byly zjištěny alelické imbalance v souvislosti s progresí karcinomu prsu (26) i v souvislosti s metastazováním do lymfatických uzlin u karcinomu prsu (27). Potlačení exprese transgelinu bylo dále popsáno v důsledku účinku aktivovaného onkogenu ras a dále u virově transformovaných buněčných linií (31).
61
Zvýšení hladiny cytokeratinu 19 u metastazujících primárních nádorů může být v souladu se závěry Barakové et al (28), podle nichž je tento protein více exprimován v malignější tkáni. Může se však jednat i o prostý důsledek rozdílů v množství vaziva a tukové tkáně u jednotlivých tkáňových řezů (32). U dvou příbuzných proteinů byly zjištěny naopak snížené hladiny u metastazujících primárních nádorů: Jedná se o heterogenní ribonukleoprotein K (hnRNP K) a hnRNP A2/B1. Proteiny této skupiny jsou odpovědné za zásadní funkce v opravě DNA, buněčné signalizaci a regulaci genové exprese na úrovni transkripce i translace. Kromě toho mají jednotlivé proteiny celou řadu potenciálních úloh ve vývoji a progresi nádorů včetně inhibice apoptózy, angiogeneze a buněčné invaze (33). Vzhledem ke složitosti a vzájemné provázanosti těchto procesů a nedostatku dalších dat je však složité usuzovat na konkrétní biologickou roli identifikovaných proteinů. Je dobré si však uvědomit, že zmíněné rozdíly nalezené pomocí 2-DE MS nemusí být dány jen změnou exprese proteinu, ale může se jednat o změnu posttranslačních modifikací v důsledku biologických rozdílů, které mohou či nemusí souviset s metastazováním nádoru. Rozlišit mezi změnami v hladinách proteinů a v jejich posttranslačních modifikacích však nejsme schopni bez kompletní identifikace všech proteinů ve 2-DE mapě, což přesahuje rámec této diplomové práce. Srovnání s podobně zaměřenými studiemi v literatuře Analýza proteomu tkáňových lyzátů metastazujících a nemetastazujících nádorů rakoviny prsu metodou SELDI-TOF MS byla provedena Ricolleau et al. (11). V této práci byla detekována zvýšená hladina ubikvitinu (8560 Da) a lehkého řetězce ferritinu (19876 Da) v nádorech bez metastáz v lymfatických uzlinách. Zvýšenou hladinu proteinu s molekulovou hmotností 8596 Da v nemetastazujících nádorech potvrdili také Nakawaga et al. (12). V této práci byla detekována také zvýšená hladina proteinu s molekulovou hmotností 4871 Da taktéž v nemetastazujících nádorech. Důvodem rozdílných výsledků těchto prací a této práce je pravděpodobně značná heterogenita nádorů. Literární rešerší zjišťujeme, že proteomovou analýzu zaměřenou na detekci proteinů souvisejících s metastazováním u karcinomu prsu pomocí 2-DE-MS provedli dále Li et al. (34) s použitím dvou variant buněčné linie. V jejich práci byla identifikována zvýšená hladina proteinů HSP60, tropomyosin 4 a peroxiredoxin 6 v buňkách vysoce metastazující varianty buněčné linie a dále protein alfa B-crystalin se zvýšenou úrovní exprese v buňkách nemetastazující varianty buněčné linie. Z obr. 18 jsou patrné pozice proteinových spotů se 62
změněnou hladinou ve 2-DE mapách, jak bylo zjištěno ve studii publikované v rámci této práce (obr. 18A) a ve studii publikované skupinou Li et al. (obr. 18B). Jak je vidět, obě studie došly k rozdílným závěrům. Důvodem, proč se výsledky rozcházejí, může být zásadní biologický rozdíl mezi tkáněmi a buněčnými liniemi: analýza genové exprese v buněčných liniích nepostihuje vlivy dané mikroprostředím v živé tkáni. Proteomová analýza tkání karcinomu prsu pomocí iTRAQ-2DLC-MS/MS nebyla jinou skupinou dosud provedena.
63
Obr. 18 A. 2-DE mapa vytvořená v rámci tohoto experimentu s vyznačenými spoty proteinů se zvýšenou hladinou v metastazujících (1314, 2513, 7008) a nemetastazujících (0026, 2511, 9213) primárních nádorech. B. 2-DE mapa z práce Li et al. (34) s vyznačenými spoty proteinů se zvýšenou hladinou ve vysoce metastazující buněčné kultuře MDA-MB-435HM a v mateřské kultuře MDA-MB435. 64
7. ZÁVĚR Metodou SELDI-TOF MS byla zjištěna zvýšená hladina proteinů s molekulovými hmotnostmi 11046 Da a 11702 Da v tkáňových lyzátech nádorů rakoviny prsu, které metastazovaly do lymfatických uzlin. Protein 11702 Da byl detekován se zvýšenou hladinou i v tkáni metastáz a jeho zvýšená hladina byla také potvrzena v nezávislém testovacím souborem. Proto jej můžeme považovat za významnější potenciální biomarker. Analýzou proteinového složení metastazujících a nemetastazujících nádorů karcinomu prsu metodou 2-DE-MS byla zjištěna zvýšená hladina cytokeratinu 19 a transgelinu v metastazujících
nádorech
a
heterogenního
ribonukleoproteinu
Ka
heterogenního
ribonukleoproteinu A2/B1 v nemetastazujících nádorech. Nejzajímavějším je protein transgelin, v jehož genu byly dříve popsány alelické imbalance v souvislosti s metastazováním do lymfatických uzlin u karcinomu prsu. Aby bylo možno tyto proteiny považovat za biomarkery metastazování karcinomu prsu, je nutné tato data nezávisle validovat podstatně rozsáhlejšími studiemi na větších souborech pacientů se zapojením, dalších laboratoří, lékařů a výzkumných pracovníků.
65
8. LITERATURA 1. http://www.linkos.cz/pacienti/prso_clanek.php?t1=1&t2=1&t3=1&t=1#4 2. Rejthar A., Vojtěšek B., Obecná patologie nádorového růstu, GRADA Publishing, Praha, ČR, 2002 3. Duffy M.J., Predictive Markers in Breast and Other Cancers: A Review, Clin Chem, 2005, 51, 494–503 4. Diez-Perez A., Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMS), Arq Bras Endocrinol Metab, 2006, 50, 720-734 5. http://en.wikipedia.org/wiki/Estrogen_receptor 6. Velculescu V.E., El-Deiry W.S., Biological and clinical importance of the p53 tumor suppressor gene, Clin Chem, 1996, 42, 858-868 7. Ross J.S., Hortobagyi G.N., Molecular oncology of breast cancer, Jones and Bartlett Publishers, Sadbury, Massachusetts, USA, 2005 8. Harris L., Fritsche H., Mennel R., Norton L., Ravdin P., Taube S., Somerfield M. R., Hayes D.F., Bast R.C. Jr, American Society of Clinical Oncology 2007 Update of Recommendations for the Use of Tumor Markers in Breast Cancer, J Clin Oncol, 2007, 25, 5287-5312 9. http://www1.lf1.cuni.cz/~kprok/genetika-prs.html 10. Venkitaraman A.R., Cancer Susceptibility and the Functions of BRCA1 and BRCA2, Cell, 2002, 108, 171–182
66
11. Ricolleau G., Charbonnel C., Lodé L., Loussouarn D., Joalland M.P., Bogumil R., Jourdain S., Minvielle S., Campone M., Déporte-Fety R., Campion L., Jézéquel P., Surfaceenhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry protein profiling identifies ubiquitin and ferritin light chain as prognostic biomarkers in node-negative breast cancer tumors, Proteomics, 2006, 6, 1963–1975 12. Nakawaga T., Huang S.K., Martinez S.R., Tran A.N., Elashoff D., Ye X., Turner R.R., Giuliano A.E., Hoon D.S.B., Proteomic profiling of primary breast cancer predicts axillary lymph node metastasis, Cancer Res, 2006, 66, 11825-30 13. Stephens R.W., Brünner N., Jänicke F., Schmitt M., The urokinase plasminogen activator system as a target for prognostic studies in breast cancer, Breast Cancer Res Tr, 1998, 52, 189-201 14. Duffy M.J., Urokinase-type plasminogen activator: a potent marker of metastatic potential in human cancers, Biochem Soc T, 2002, 30, 207-210 15. Češková P., Brožková K., Hernychová L., Štěrba J., Valík D., Vojtěšek B., Hmotnostní spektrometrie v kvantitativní a diagnostické proteomice: možnosti a limitace, Chem Listy 2006, 100, 974−979 16. http://lpg.nci.nih.gov/lpg_small/protocols/Ciphergen/ciphergen_eam.pdf 17. Cañas B., López-Ferrer D., Ramos-Fermández A., Camafeita E., Calvo E., Mass spectrometry technologies for proteomics, Brief Funct Genomic Proteomic, 2006, 4, 295-320 18. Schägger H., Tricine-SDS-PAGE, Nature protocols, 2006, 1, 16-23 19. Rabilloud T., Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2002, 2, 3-10 20. Bouchal P., Kučera I., Dvourozměrná elektroforéza v proteomice: principy a aplikace. Chem. listy 2003, 97, 29-36
67
21. Hartus L.R., Churchward M.A., Butt R.H., Coorssen J.R., Assessing Detection Methods for Gel-Based Proteomic Analyse, J Proteome Res, 2007, 6, 1418-1425 22. http://www.sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/s4942dat.pdf 23 Ross P.L., Huang Y.N., Marchese J.N., Williamson B., Parker K., Hattan S., Khainovski N., Pillai S., Dey S., Daniels S., Purkyastha S., Juhasz P., Martin S., Bartel-Jones M., He F., Jacobson A., Pappin D.J., Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cel Proteomics, 2004, 3, 11541169 24. Laemmli U.K., Cleavage of structural proteins dutiny the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227, 680-685 25. Camoretti-Mercado B., Forsythe S.M., LeBeau M.M., Espinosa R., Vieira J.E., Halayko A.J., Willadsen S., Kurtz B., Ober C., Evans G.A., Thweatt R., Shapiro S., Niu Q., Qin Y., Padrid P.A., Solway J., Expression and Cytogenetic Localization of the Human SM22 Gene (TAGLN), Genomics, 1998, 49, 452-457 26. Roy D., Capat G.M., Hande M.P., Hei T.K., Allelic imbalance at 11q23-q24 chromosome associated with estrogen and radiation-induced breast cancer progression, Int J Oncol 2006, 28, 667-674 27. Ellswort R.E., Ellsworth D.L., Neatrour D.M., Deyarmin B., Lubert S.M., Sarachine M.J., Brown P., Hooke J.A., Shriver C.D., Allelic imbalance in primary breat carcinomas and metastatic tumors of the axillary lymp nodes, Mol Cancer Res, 2005, 3, 71-77 28. Barak V., Goike H., Panaretakis K.W., Einarsson R., Clinical utility of cytokeratins as tumor markers, Clin Biochem, 2004, 37, 529-540 29. http://en.wikipedia.org/wiki/HnRNP
68
30. Ye B., Cramer D.W., Skates S.J., Gygi S.P., Pratomo V., Fu L., Horick N.K., Lickli der L.J., Schorge J.O., Berkowitz R.S., Mok S.C., Haptoglobin-α Subunit As Potential Serum Biomarker in Ovarian Cancer: Identification and Characterization Using Proteomic Profiling and Mass Spectrometry, Clin Cancer Res, 2003, 9, 2904-2911 31. Shields J.M., Rogers-Graham K., Der Ch. J., Loss of Transgelin in Breast and Colon Tumors and in RIE-1 Cells by Ras Deregulation of Gene Expression through Raf-independent Pathways, J Biol Chem, 2002, 277, 9790–9799 32. Nenutil R., osobní sdělení 33. Carpenter B., MacKay C., Alnabulsi A., MacKay M., Telfer C., Melvin W.T., Murray G.I., The role sof heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in tumour development and prograssion, Biochim Biolhys Acta, 2006, 1765, 85-100 34. Li D.Q., Wang L., Fei F., Hou Y.F., Luo J.M., Chen W., Zeng R., Wu J., Lu J.S., Di G.H., Ou Z.L., Xia Q.CH., Shen Z.Z., Sbal Z.M., Identification of breast cancer metastasisassociated proteins in an isogenic tumor metastasis model using two-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography-ion trap-mass spectrometry, Proteomics, 2006, 6, 3352-3368
69
