Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai orvostudományok, Fogorvosi Kutatások Doktori (Ph.D.) értekezés
Biológiailag aktív fehérjék a nyálban: az alfa-amiláz és az epidermális növekedési faktor funkcionális vizsgálata
Dr. Nagy Ákos Károly
Témavezeto: Dr. Zelles Tivadar
Budapest 2003.
“Ezeket mondván, a földre köpe (Jézus), és az o nyálából sárt csinála, és rákené a sarat a vak szemeire, És monda néki: Menj el, mosakodjál meg a Siloám tavában (a mi azt jelenti Küldött). Elméne azért és megmosakodék, és megjöve látva.” A JÁNOS ÍRÁSA SZERINT VALÓ EVANGYÉLIOM 9. fejezet 6-7. vers
2
Tartalomjegyzék Bevezetés....................................................................................................................4 A nyálmirigyek anatómiája és élettana........................................................................4 A nyál összetétele..................................................................................................…..9 A nyálelválasztás mechanizmusa....................................................................….......13 A kísérleti munka háttere...................................................................................…….19 Kísérleti célkituzések................................................................................................21 Kísérleti módszer I.; A parotisz eredetu amiláz szintjének változása a parotisz szövetben és a szérumban farmakológiai és élettani hatásokat követoen..….............22 Az amilázaktivitás kiszámítása...............…................................................................22 Kísérleti módszer II.; Szájüregi sebgyógyulás az I. típusú diabétesz NOD-egér modelljében.........….............….................................................24 Szájüregi sebzés kivitelezése................................................…....…..........................24 A seb méretének kiszámítása.........….........................................…............................24 RNS izolálás és EGF mRNS detektálás RT-PCR segítségével.......……...................25 Eredmények I............…............................................................................................26 Eredmények II.....................................................................…...............…...............31 Az EGF-szint alapértékének meghatározása...........................….....….......................31 A nyelvsebek gyógyulása..............................................................…..........................33 Megbeszélés................................................................................................................37 Összefoglalás..............................................................................................................40 Köszönetnyilvánítás..................................................................................................42 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények............................…..........................43 Irodalomjegyzék................................................................................…...................44
3
Bevezetés A nyálmirigyek anatómiája és élettana Az emberi szervezet integritásának fenntartása igen összetett feladat. Ennek egy kicsiny, de korántsem elhanyagolható részét képezik a külso elválasztású mirigyek. A külso elválasztású mirigyek által elválasztott anyagok egy része közvetlenül valamely testfelszínre kerül. Külso szekrécióval kerül az emésztotraktusba a pancreas nedv és a nyál, de így termelodik a gyomornedv és a könny is. A mirigyek által kiválasztott anyagok igen bonyolult összetételuek. Azon túl, hogy minden mirigy esetében ki tudunk emelni egy elsodleges fontosságú funkciót, még igen sokrétu szerepet töltenek be. Így például a könnymirigyek által termelt könny elsodleges feladata a cornea nedvesen tartása, ugyanakkor, ha a könnyben nem lennének különbözo antibakteriális hatású anyagok, akkor a szem szabad bejárást biztosítana a kórokozók számára. A szájüreg környékén található nagy nyálmirigyek, a glandula parotis, a glandula submandibularis, a glandula sublingualis és az ajak, a szájpad, a pofa és a nyelv járulékos kis nyálmirigyei által termelt nyál szintén rendkívül összetett szerepet tölt be. A nyálmirigyet felépíto funkcionális egység az acinus, ahol maga a nyál termelodik. A mirigy kivezetocso rendszerét méret és elhelyezkedés szerint ductus intercalaris-ra, ductus striatus-ra és ductus excretorius-ra oszthatjuk fel. Az acinusokat és ductus z kezdeti szakaszát myoepithelialis sejtek veszik körül. Az acinusok szövettanilag kétfélék: szerózusak és mucinózusak lehetnek. A parotiszt szerózus, a kis nyálmirigyeket mucinózus acinusok építik fel, míg a submandibularis és sublingualis mirigyek acinusai keverten tartalmaznak szerózus és mucinózus sejteket. Az acinus sejtek termelik az úgynevezett primer nyálat, ami izozmotikus. Ezek a sejtek piramis alakúak és gömbszeru acinusokba rendezodnek, amelyeknek egyetlen nyílása a kivezetocso rendszer kezdetét képezi. A sejtek luminális felszínén apró nyúlványok (mikrovilli) találhatók. A sejtek között kicsiny sejtközötti csatornák, illetve a sejtek egymáshoz való kapcsolódását elosegíto dezmoszómák vannak. Az acinussejtek a rajtuk keresztül zajló transzportfolyamatoknak megfeleloen polarizáltak. Luminális és bazális membránjaik más-más ioncsatornákat és transzportereket tartalmaznak (93). A kétféle membrán közötti lévo éles határt a luminálisan
4
elhelyezkedo tight junction-ök képezik. Ezek egyeben segítik a luminális iongrádiens fenntartását.
1. ábra A nyálmirigyeket felépíto acinusok és duktuszrendszer sematikus képe A duktuszsejtek építik fel a nyálmirigy kivezetocso rendszerét. A ductus intercalaris összeköti az acinust a fo kivezetocsovel. A duktusz ezen kezdeti szakaszát kuboidalis sejtek alkotják, amelyek jelentos változást nem okoznak a nyál összetételében. Ezek a sejtek pluripotensek, vagyis képesek mind acinus mind duktuszsejtté differenciálódni. A ductus striatus oszlopszeru sejtekbol épül fel. Nevét a bazális régióról kapta, ahol mikroszkópikus képen a vertikális irányban rendezodött mitochondriumok redobe emelik a sejtmembránt. A mitochondriumok szolgáltatják az energiát az aktív transzportfolyamatokhoz. A nátrium jelentos részét ugyanis aktívan visszanyeri a nyálmirigy ezen a szakaszon, ami miatt a nyál ionkoncentrációja a széruménál alcsonyabb értéket vesz fel - hipozmotikussá válik. A ductus excretorius-ban tovább folytatódik az ionok reabszorbciója, de nem olyan intenzíven, mint az elozo szakaszon. A nyál elektrolit összetételére tehát legjelentosebb befolyása a ductus striatus-nak van.
5
Az acinusoktól a ductus striatus-ig terjedo szakaszt hosszú álnyúlványokkal (pseudopodium) rendelkezo, úgynevezett myoepithel sejtek veszik körül. Ezeknek felépítése igen hasonlít a simaizomsejtekre. Szekréció közbeni összehúzódásukkal valószínuleg segítik a nyál elválasztását (102). A nyálmirigyek szekréciós végkészülékeinek finom struktúrája jellegzetes mintáját adja a fehérjéket elválasztó exocrin sejteknek. Rendkívül jól fejlett durva felszínu endoplazmatikus retikulumot (dER), kifejezett Golgi-készüléket találunk a sejtplazmában, illetve a sejt luminális részén számos, a dER-ben termelt, exportra váró fehérjéket tároló szekréciós granulumot. Az acinus sejtek bazolaterális membránján számos behúzódás látszik, ami jelentosen megnöveli a felszínt. Itt zajlik ugyanis a nyáltermeléshez szükséges anyagok felvétele. Az ductus intercalaris-t felépíto sejtekben szintén láthatunk szekréciós granulumokat néhány faj nyálmirigyeiben, viszont a bazolaterális membránon alig látunk behúzódásokat. A ductus striatus-t alkotó sejtek - amelyekrol ez a duktuszrész nevét is kapta bazolaterális membránfelülete a nagyszámú mély behúzódás miatt rendkívüli módon megnövekedett.
A
nagy
felület
és
a
behúzódásokban
helyet
foglaló
mitochondriumokban termelt energia teszi lehetové az erre a duktuszszakaszra jellemzo nagy mértéku, gyors ion- és víztranszportot. A ductus excretorius falát felépíto többrétegu hengerhám, majd el nem szarusodó laphám mutatja, hogy ezen a végso szakaszon nem változik a nyál összetétele. A nyálmirigyek finoman szabályozott muködését jó vérellátás és beidegzés biztosítja. Az erek és idegek a mirigy kötoszövetes tokjában futnak és az egész mirigyet gazdagon behálózzák. A ductus striatus kiemelt szerepét mutatja, hogy a kapillárishálózat itt a legsurubb. A vér az acinusokat nem tartalmazó részekrol úgynevezett portális vénahálózaton keresztül jut az acinális kapillárisokba, ahonnan másodlagos venulák gyujtik össze és juttatják vissza a vénahálózatba a vért. A nyálmirigyszöveteken idoegység alatt átáramlott vér mennyisége mintegy húszszorosa az izomszöveten átáramlotténak (14). Ez megmagyarázza, hogy a nyálmirigyek viszonylag kis méretük és tömegük ellenére hogy képesek olyan nagy mennyiségu nyálat termelni. A legtöbb emlos fajban a nagy nyálmirigyek beidegzése kettos: egyaránt találunk bennük szimpatikus és paraszimpatikus szekretomotoros rostokat. A paraszimpatikus praeganlionaris neuronok a nucleus salivatorius superior-ban, illetve inferior-ban
6
találhatók. Rostjaik a nervus glossopharingeus-szal és a nervus facialis-szal jutnak el a ganglion
pterygopalatinum-ba,
a
ganglion
oticum-ba
illetve
a
ganglion
submandibulare-ba, ahol átkapcsolódnak. A szimpatikus preganglionáris neuronok a thorakális1-3 régióban helyezkednek el és a ganglion cervicale superior-ban kapcsolódnak át, majd a nyálmirigyeket ellátó artériák mentén érik el a mirigyeket. A paraszimpatikus rostok fo ingerületátvivo anyaga az acetilkolin, a szimpatikus rostoké a noradrenalin. Ezen kívül számos más neuropeptid is részt vesz a mirigymuködés szabályozásában. A leggyakoribb ezek közül a vasoactive intestinal polypeptide (VIP), amely foleg a paraszimpatikus rostokban fordul elo. Jelentos szerepe van továbbá a szabályozásban a nitrogén-monoxidnak (NO), illetve a Panyagnak (SP) (15). A nyálmirigyek muködésének szabályozásában tehát mind szimpatikus, mind paraszimpatikus hatások érvényesülnek. Paraszimpatikus hatásra a mirigyek híg, elektrolitban gazdag nyálat termelnek, míg adrenerg stimulus suru, mucinózus nyálat eredményez. A sejten kívüli térbol érkezo, a sejt muködését szabályozó jeleket plazmamembrán receptorok továbbítják a sejt belsejébe. Ezek a protein, illetve glikoprotein molekulákból felépülo receptorok szorosabb vagy lazább kapcsolatban vannak a plazmamembránnal, egy vagy több transzmembrán szakasszal rendelkeznek. Muködési mechanizmusuk alapján a következo csoportokba oszthatóak: a, receptor ioncsatornák, amelyek egy pórus vagy csatorna köré rendezodnek, amelyek ligand kötésük hatására megnyílnak. b, G-protein kapcsolt receptorok, amelyek ligand kötésük esetén szerkezetük megváltoztatásával a G-fehérjék disszociációját okozzák, ami további másodlagos hírvivo (second messenger) molekulákat termelo enzimeket aktivál. A nyálmirigy acinussejteken található receptorok többsége ebbe a családba tartozik. c, egy transzmembrán doménnel rendelkezo receptorok, amelyek nemcsak azonnali, de a sejtmagból kiinduló, hosszú távú hatásokat is eredményeznek. Ide tartoznak pl. a növekedési faktor receptorok. A nyálelválasztás akkor fokozódik a nyálmirigyekben, amikor valamilyen neurohormonális agonista a sejtfelszíni receptorokhoz kapcsolódik. Ugyanakkor számos, szekréciót kiváltó molekuláról bebizonyosodott, hogy az alapszekréció fenntartásában is szerepet játszik. A sejtfelszíni receptorokhoz kötodo specifikus hatású anyagok a sejt belsejében muködo másodlagos hírvivo rendszereket hozzák
7
muködésbe, amelyeknek hatásaként a sejt folyadék (és ion) és/vagy fehérje elválasztása megváltozik. Különbözo fajok nyálmirigysejtjeinek felszínén az alábbi receptorokat sikerült kimutatni: acetilkolin receptorok (M1 , M3 ), norepinephrine (a 1 , a 2 , β1 , β 2 ), VIP, neurotenzin, nukleotid-receptorokat, NK1 típusú substance P receptort, illetve epidermális növekedési faktor (EGF), prosztaglandin és parathormon receptorokat (3). A különbözo típusú receptorok más-más second messenger-t aktiválnak az acinussejtekben. A muszkarinos kolinerg receptorok foszlolipáz C aktiváció útján az intracelluláris Ca2+ koncentrációt növelik meg, illetve az adenil-cikláz gátlásával csökkentik a cAMP szintet. Mindkét hatást egy-egy G-protein közvetíti. Az a1 -adrenerg receptor aktiváció a foszfatidilinozitol-4,5-bifoszfát lebomlásához és így inozitol-trifoszfát (IP3 ) termeléshet vezet, ami által megno a Ca2+ ion koncentráció a sejten belül. Subtance P hatására szintén IP3 felszabadulás útján emelkedik meg a Ca2+ ion koncentráció. A VIP és a β-adrenerg receptorok másodlagos hírvivoje a cAMP molekula. A ligand receptorhoz való kötodése G-protein közvetítésével aktiválja az adenilát-cikláz enzimet, ami az ATP molekulát ciklikus adenilát-monofoszfáttá (cAMP) alakítja. A cAMP szerepe a protein kináz A enzim aktiválása, ami további fehérjéket foszforilál. A külso – stimuláló vagy gátló – jel tehát a fent említett utakon keresztül váltja ki a sejtválaszt, ami lehet ioncsatorna nyitása, különbözo fehérjék szintézise, illetve exportálása, aminek hatására megváltozik a termelt nyál minosége és mennyisége.
8
A nyál összetétele A nyál legfobb összetevoje a víz. Ebben vannak feloldva a szerves és szervetlen összetevok. A nyál a plazmához viszonyítva mindig hipozmotikus, ennek mértéke azonban nagymértékben függ az idoegység alatt elválasztott nyál mennyiségétol. A nyugalmi nyál ozmolaritása tizede, míg a stimulált nyálé háromnegyede a plazmáénak. A nyál legfobb elektrolit komponensei a nátrium, a kálium, a kálcium, a klorid, a bikarbonát és a foszfát ionok. Más ionok, mint a magnézium, szulfát, tiocianát, jodid vagy a fluorid, szintén megtalálhatók a nyálban 1 mM-nál kisebb koncentrációban. Az acinussejtek által a kivezetocso rendszerbe elválasztott nyál Na+ és Cl- ion koncentrációja hasonló a plazmáéhoz. A duktuszrendszeren végighaladva azonban a Na+ dönto többségében visszaszívódik, átadva helyét a K+ és HCO3 - ionoknak. A nyálban nagy mennyiségben található ionok közül a HCO3 - ion pufferoló képességét kell kiemelni, aminek nemcsak a szájüregben a baktériumok által termelt savak semlegesítésében van szerepe, hanem a duktuszsejtek inracelluláris pH-jának szabályozásában is. A nyálban 1 mM-nál kisebb koncentrációban jelen lévo ionok közül a fluorid iont kell kiemelni, ami a fogak keményszöveteibe beépülve fluorapatit kristályokat hoz létre. A fluorapatit savoldékonysága jóval kisebb, mint a hidroxiapatit kristályé, ezáltal növeli a fogaknak a savakkal szembeni ellenállását. Fontos megjegyeznünk, hogy a különbözo nyálmirigyek szövettani felépítése más, így az általuk elválasztott nyál minosége is mirigyenként és fajonként változik. A nyál összetételét jelentosen befolyásolja továbbá az egységnyi ido alatt elválasztott nyál mennyisége (flow rate) is. Míg 0.2 ml/min flow rate esetén a patkány parotis nyál alig 5 mM/l koncentrációban tartalmaz Na+ iont, addig 3 ml/min rátánál ez az érték megközelíti a 100 mM/l értéket. Az elválasztott Mg2+ koncentrációja ugyanakkor csökken a flow rate növekedésével (56). Különbözo technikákat alkalmazva a nyál fehérjéinek szétválasztására, - mint az elektroforézis, vagy az oszlopkromatográfia, - húsznál több protein és glikoprotein molekulát különböztethetünk meg a nyálban. Többségük a nyálmirigyekben termelodik, némelyik pedig a plazmából származik. A nyálmirigyek alapvetoen külso elválasztású mirigyek, de egyes nyálmirigyekben termelt fehérjék kimutathatók a véráramban is (37).
9
A szájüregben található kevert nyál protein koncentrációja 25 és 1000 mg/l között váltakozik nyugalomban és eltéro stimulusok hatására (6). Mind a nyugalmi, mind a stimulált nyál protein koncentrációja napi ritmust mutat (38). A nyálban található emésztoenzimek egyike az alfa-amiláz, ami patkányok esetében kizárólag a parotiszban termelodik. Szerepe a szénhidrátok lebontásában van, mivel az 1-4 a-glikozidos kötéseket bontja, aminek következtében a nagy méretu molekulák kisebb részekre esnek. Ezek emésztését a hasnyálmirigy-amiláz, illetve a vékonybélsejtek által termelt egyéb enzimek fejezik be. A nyál-amiláz patkányban éppúgy, mint emberben, különbözik a hasnyálmirigy eredetu enzimtol. Ez a különbség az enzimek izoelektromos ponjában, pH optimumában és más elektrokémiai tulajdonságaiban is megmutatkozik. Megkülönböztetésük differenciáldiagnosztikai következtetések levonására ad lehetoséget (5). A nyálban található hat izoenzim molekulasúlya megközelítoleg 60000 Da. Megtalálhatóak közöttük glikozilált és nem glikozilált formák is. Az amiláz koncentrációja a szabad nyálban a legnagyobb, csak nyomokban kötodik a szerzett pellikulába vagy a dentális plaque-ba. A fentiek alapján mind caries protektív, mind cariogen hatásáról beszélhetünk (1). A nyálban lévo amilázmolekula hozzátapad a baktériumok sejtfalához, mintegy aggregálva azokat, ezúton csökkentve a szájüregben található baktériumok számát. Ugyanakkor a pellikulában és a plaque-ban a szénhidrát makromolekulák bontásával táplálékot szolgáltat a baktériumok számára. A másik, nyálban található emésztoenzim a lingvális-lipáz, amelynek újszülött és csecsemokorban van nagy szerepe az anyatejben lévo zsírok lebontásában. Sokat kutatott alkotói a nyálnak a prolinban gazdag fehérjék (PRPs), amelyek a fog felszínhez tapadva Ca2+ ionköto és antimikrobiális hatásuk révén caries protektív hatásúak (20). Szintén jól ismert nyálalkotó a 15000 Da molekulasúlyú lizozim, ami az N-acetil glukózamin és N-acetil muraminsav közötti kötést bontja, amelyek a bakteriális sejtfal komponensei. A nyál tartalmaz lizozimgátló-szereket – valószínuleg bakteriális eredetueket – amelyek csökkentik annak aktivitását. Egy másik jól ismert fehérje a nyálban a szekretoros immunglobulin A (sIgA). Felépítése
részben
megegyezik
a
plazma
IgA-éval.
A
szájüregi
védekezo
mechanizmusban fontos szerepet játszik, de ugyanazt kell megjegyeznünk róla, amit az amilázról is: baktérium aggregáló hatása csökkenti a szájüregi baktériumok számát, de a szájüregi felszínekre kitapadva elosegíti a baktériumok megtapadását is.
10
Szintén a baktériumok tapadási képességét befolyásolják a vércsoport faktorok, túl azon, hogy segítséget nyújtanak a genetikai, antropológiai és igazságügyi orvostani vizsgálatokban. A parotisz nyál tartalmaz ezen kívül specifikus lipázt, laktoperoxidázt, kallikreint és bradikinint. A többi enzim, a proteázok, az ureázok, az észterázok és a karboxipeptidázok leukocitákból és a szájflóra baktériumaiból származnak. A mirigyekben hormon (parotin) és növekedési faktorok is termelodnek. A nyálban lévo biológiailag aktív polipeptidek funkciói részben még ismeretlenek, számos tulajdonságuk azonosítása folyamatban van. A növekedési faktorok közül elsoként az epidermális növekedési faktort (EGF) és az idegi növekedési faktort (NGF) mutatták ki a nyálban (11,50). Ezeket a 80-as évek során számos más anyag követte: TGF-α (transforming growth factor-alpha), az inzulin, az inzulin-szeru növekedési faktor I és II, a TGF-β (transforming growth factor-beta) és az FGF (fibroblast growth factor ) (12,28,32). Ezek legtöbbjét emberi, illetve állati eredetu nyálból és nyálmirigybol sikerült izolálni (11,32,42,58,79,98). Azt, hogy ezeket a molekulákat a nyálmirigyek valóban tartalmazzák, in situ hibridizációval, immunohisztokémiai módszerekkel, reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval, radioaktívan jelzett aminosavak beépülésével, biokémiai tisztítással bizonyították (11,32,58,79). A plazmából a nyálba kerülo makromolekulákról pedig feltételezheto, hogy β-adrenerg agonisták hatására kitáguló tight junction-ökön keresztül jutnak át (35). Immunhisztokémiai eljárásokkal sikerült bizonyítani, hogy az EGF, a TGF-α és az inzulin a ductus sejtekben is termelodik (28). A szájüregi hám a különbözo fizikai és kémiai behatásoknak: a rágásnak, a tápanyag kémhatásának, homérsékletének, és különbözo patológiai folyamatoknak gyakran kitett hely. A sérült szájüregi lágyszövetek sebgyógyulási folyamataiban jellegzetes állapotok követik egymást: gyulladásos állapot, sejtburjánzás és szöveti hiány
helyreállítása,
szövetújraformálási
állapot.
A
reparációs
folyamathoz
elengedhetetlenül szükséges a növekedési faktorok jelenléte a gyógyulás megfelelo menetének érdekében. Ez a magyarázata annak a jól ismert ténynek, hogy a szájüregi lágyszövetek gyógyulása sokkal gyorsabb, mint a bor sebeié (61,64,75). A legtöbb részletes vizsgálat, ami a növekedési faktoroknak a sebgyógyulásban betöltött szerepére irányult, az EGF-el foglalkozott (44,61,64,67). A tanulmányok az EGF-nek a szervezetben és a szájüregben az egészséges viszonyok fenntartásában betöltött szerepét is bizonyították (44,61,67).
11
Az EGF volt az elso növekedési faktor, amit egér nyálából sikerült izolálni. Ez volt a submandibularis mirigy extraktumának azon komponense, ami újszülött egerekben korai szemnyitást és korai metszofog áttörést okozott (11). Egerekben az EGF és NGF szint a submandibularis mirigyben a legmagasabb. A szintézis mértéke a mirigyben androgénhormon függo, ezért a hím egerek nyálának növekedési faktor szintje százszorosa a nostényekének. Másrészrol viszont a szérum EGF-szint mindkét nemben azonos és számos más biológiailag aktív molekulához hasonlóan (hormonok, NGF stb.) diurnális változásokat mutat. A szérumban található EGF-nek hozzávetoleg 80%-a a submandibularis mirigy duktuszsejtjeiben termelodik (95). Patkányban alacsonyabb a szintézis mértéke, az EGF-et az állatok a nyálból nyerik vissza. Az emberi nyál EGF forrása a szubmandibuláris nyálmirigy és a parotisz (100). Emberben és patkányban a szexuális dimorfizmus nincs hatással a nyál EGF szintjére (99). Az EGF számos - a szájüregen kívül játszódó - biológiai folyamatot is befolyásol. Így általános hatást fejt ki a bor és a gastrointesztinális sebgyógyulási folyamatokra. Állatkísérletekben a submandibularis nyálmirigy eltávolítása az intesztinális mucosa kifekélyesedéséhez vezetett (44). Nyálmirigyirtott állatban a bor és a szájüregi lágyrészek sérüléseinek gyógyulása éppúgy hosszabb idot vesz igénybe, mint a máj regenerációja (65). Emberben az EGF-elválasztás hirtelen növekedését figyelhetjük meg impaktált moláris sebészeti eltávolítása után (Blazsek, nem publikált adat). A nem a nyálmirigyekben termelodo, de a nyálban jelenlévo kisméretu szerves molekuláknak a nyálba való bejutásáról sokáig úgy vélkedtek, hogy ez csakis a molekula méretétol és lipidoldékonyságától függ. Újabb adatok szerint csak egyes molekulák jutnak a membránon keresztül diffúzióval a sejtekbe, a poláros természetuek vízcsatornákon keresztül molekuláris diffúzióval jutnak a sejtbe, illetve a víz a csatornákon keresztül mintegy magával sodorja a benne oldott anyagokat (87). A nyálban megjeleno két legfontosabb kis molekula a glukóz és az urea. Elobbi a táplálékfelvétel szüneteiben fontos tápanyaga a dentális plaque baktériumainak, míg utóbbi a baktériumok által termelt szerves savak egyik lehetséges semlegesítoje (97).
12
A nyálelválasztás mechanizmusa A nyál elsodleges termelése az acinus sejtekben történik. Az acinusban termelt folyadék az intersticium-ból származó vízbol, ionokból, kis méretu molekulákból (glukóz, urea, aminosavak) és többségükben az acinussejtekben termelt nagy molekulatömegu proteinekbol és glikoproteinekbol áll. Ehhez tevodnek hozzá a kivezetocso szakaszon elválasztott szerves molekulák. A nyálelválasztás a sejtmembránban található iontranszport rendszerek összehangolt muködésének eredménye. Lényegében öt fontos rendszerrol beszélhetünk, úgymint egy Na+ - K+ - 2Cl- kotranszporter (NKCC1), ami az acinus sejt bazolaterális membránjában található és muködésének köszönhetoen három ciklus eredményeként 3 Na+, 3 K+, és 6 darab Cl- iont juttat a sejt belsejébe (i). Szintén a bazolaterális oldalon találhatók a Ca2+ ionok által aktivált K+ - csatorna (ii), ami az elobbi csatorna, illetve a Na+-K + ATP-áz által a sejtbe juttatott K+ ionokat szállítja ki a sejtbol, és a Na+-H+ antiporter (iii), ami nátriumot juttat a sejtbe, miközben hidrogén ionokat távolít el. A Cl- ionok a szintén Ca2+ függo – ám a luminális oldalon elhelyezkedo Cl- csatornákon (iv) keresztül hagyják el a sejtet. A sejtbe diffundált szén-dioxidból a karbo-anhidráz által keletkezo szénsav, illetve hidrogén-karbonát ionokat szállítja ki a bazális oldalon az ötödik ioncsatorna (v).Az acinus sejtekben nyugalmi állapotban tehát magas a K+ és Cl- ion koncentráció a Na+-K + ATP-áz és az NKCC1 muködésének köszönhetoen. A nyálelválasztás a sejtmembránban található iontranszport rendszerek összehangolt muködésének eredménye. Lényegében öt fontos rendszerrol beszélhetünk, úgymint egy Na+ - K+ - 2Cl- kotranszporter (NKCC1), ami az acinus sejt bazolaterális membránjában található és muködésének köszönhetoen három ciklus eredményeként 3 Na+, 3 K+, és 6 darab Cl- iont juttat a sejt belsejébe (i). Szintén a bazolaterális oldalon találhatók a Ca2+ ionok által aktivált K+ - csatorna (ii), ami az elobbi csatorna, illetve a Na+-K + ATP-áz által a sejtbe juttatott K+ ionokat szállítja ki a sejtbol, és a Na+-H+ antiporter (iii), ami nátriumot juttat a sejtbe, miközben hidrogén ionokat távolít el. A Cl- ionok a szintén Ca2+ függo – ám a luminális oldalon elhelyezkedo Cl- csatornákon (iv) keresztül hagyják el a sejtet. A sejtbe diffundált szén-dioxidból a karbo-anhidráz által keletkezo szénsav, illetve hidrogén-karbonát ionokat szállítja ki a bazális oldalon az ötödik ioncsatorna (v).Az acinus sejtekben nyugalmi állapotban tehát magas a K+ és Cl- ion koncentráció a Na+-K + ATP-áz és az NKCC1 muködésének köszönhetoen.
13
Nyálelválasztást kiváltó stimulus hatására megno az intracelluláris Ca2+ koncentráció, ami viszont a Ca2+ függo K+ - és Cl--csatornák megnyílását eredményezi. Ez együttesen KCl-nak a sejtbol való kiáramlását eredményezi és egyben a Cl- ionok - és azoknak negatív töltésének - a lumenben való felszaporodásához vezet. Az elektromos semlegesség megorzésének érdekében Na+ ionok áramlása kezdodik meg a sejtek közötti téren keresztül. A luminális NaCl koncentráció megnövekedése olyan grádienst hoz létre, ami a víznek a sejtmembránon keresztüli aktív és passzív áramlását indítja meg a lumen irányába. A nyálelválasztást kiváltó hatás tartós jelenléte tehát NaCl áramlását eredményezi az intersticium felol a lumen felé. Amennyiben ez a hatás megszunik, a kálcium szint alacsony szintre esik, bezáródnak a Ca2+ függo csatornák, és a szekréció visszatér a nyugalmi szintre.
2.a ábra
14
2. b ábra
2.c ábra 2.a-c ábrák
A luminális oldalon megjeleno iongrádiens a kulcsa a nyálelválasztás megindulásának
15
A 2b, 2c ábrán szemléltetett modellek lényegében az elsonek variációi, de az NKCC1 helyett a Na+-H+ és Cl--HCO3 - ioncserélo mechanizmusokat részesíti elonyben. Ezek az ioncsatornák a sejtbe diffundáló szén-dioxidból a karbo-anhidráz (CA) enzim által termelt szénsav (H2 CO3 ) lebomlásakor keletkezo ionokokat juttatják ki a sejtbol. Ennek következményeképpen kerülnek a sejtbe Cl- ionok, amelyek a már említett úton jutnak a luminális oldalra. Az 1. , 2. modellel szemben, ahol a Cl- a szekretált anion, a 3. modellben a HCO3 -. A modellek energetikai mérlege 6 Cl-, 3 Cl-, illetve 3 HCO3 - ion / lebomlott ATP molekula. Turner és munkatársai kísérleteikkel bizonyították, hogy mindhárom modell elemei alkotórészei a patkány parotisz nyáltermelésének (93). Az elobbiekben részletezett ion- és folyadékelválasztási modellek kolinerg szabályozás alatt állnak. Az NKCC1 csatorna kivétel: nem kolinerg, hanem adrenerg szabályozás alatt áll (25), holott a ß-receptoron való adrenerg hatásról tudott, hogy kis mennyiségu folyadék és nagy mennyiségu fehérje elválasztását eredményezi. Ugyanakkor az adrenerg és a kolinerg szabályozás egyideju jelenléte jó példa arra vonatkozólag, hogy a szimpatikus hatások, mint például a rágás, rárakódhatnak a paraszimpatikus hatásra, és egyfajta szinergizmusuk biztosítja a megfelelo mennyiségu és minoségu nyál elválasztását. Azt, hogy miért van jelen egyszerre mind a három mechanizmus, egyenlore nem tudjuk, mint ahogy arra sem találtak magyarázatot, hogy a 2., 3. modell esetében a hatásfok is sokkal kisebb, mint az elso modell esetében (6, illetve 3-3 anion/ ATP molekula). A fentiekben láthattuk, hogy a folyadékszekréció az anionok elválasztását követoen kialakult NaCl grádiens következménye. Kezdetben a sejtmembránon keresztüli passzív transzporttal magyarázták a víz áramlását, ami nehezen lett tartható, amikor összevetették a luminális membrán felületének méretét és a rajta feltételezetten passzív módon átáramló víz mennyiségét (16). Az aquaporinok (AQP) a különbözo sejtek folyadéktranszportjában résztvevo molekulák. A víztraszportban játszott szerepüknek felismerése a folyadéktovábbító hámszövetekben (44) felvetette a gondolatát annak, hogy a nyálmirigyekben is hasonló módon történik a víz áramlása a bazális oldalról a lumen felé. Mind állati, mind emberi szöveteken végzett vizsgálatok igazolták az aquaporinok jelenlétét a nyálmirigy szövetekben (22)
16
Kiemelendo az AQP3, AQP8 és az AQP5, amelyek az acinussejtek bazális (AQP3, AQP8), illetve luminális (AQP5) oldalán találhatóak meg mind a szerózus, mind a mucinózus nyálat termelo sejtekben, ami valószínusíti ezeknek a vízcsatornáknak a szerepét a nyálelválasztásban (22,96). Az organikus molekulák transzportja exocitózissal történik az acinussejtekben. Maga a szekréció az alábbi lépésekbol áll: az aminosavak felvétele, az exportfehérjék szintézise és glikozilációja, kondenzáció, illetve a fehérjék elválasztása, exocitózisa. Macska submandibularis mirigyében négy aminosav felvételi rendszert ismerünk: egyegy a savas és bázikus aminosavak, ketto pedig a neutrális aminosavak felvételére szolgál (8). A parotis által termelt export fehérjék hasonló módon szintetetizálódnak a dER ciszternáiban, mint a hasnyálmirigyben. Az a-amiláz, pre-amiláz formájában szintetizálódik, majd a Golgi- komplexumban nyeri el végleges, exocitózisra kerülo formáját. Ugyanígy a glikoprotein molekulák polipeptid lánca is a dER-ban szintetizálódik, és a glikozilálódás a Golgi-készülék ciszternáiban zajlik le. A kondenzáció már a transz-Golgi ciszternákban megkezdodik és a kondenzációs vakuolumokban fejezodik be. E folyamat során a vakuolumok minden vizet “kipréselnek” magukból, miáltal rendkívül nagy mennyiségu fehérjét képes a sejt raktározni viszonylag kis helyen. Ez a felhalmozott mennyiség biztosítja, hogy viszonylag hosszú ideig tartó stimuláció idején is biztosított a nyálmirigyek fehérjeelválasztása. Kevésbé ismert a közvetlen ok, amely az exocitózishoz vezet. A megfigyelések alapján elmondhatjuk, hogy a szintézist és szekréciót kiváltó okok egyaránt fehérje foszforiláció vagy intracelluláris Ca2+ ion felszabadulással közvetítodnek. Ugyanakkor, míg a β-adrenerg stimuláció az exocitózissal párhuzamosan a de novo szintézist is serkenti, addig az a-adrenerg és kolinerg stimuláció csak az exocitózist serkentik, de a jelzett aminosavaknak a fehérjékbe történo beépülését gátolják (10). Az ioncsatornák megnyílása komoly K+, Cl- ion és vízvesztést, ezáltal térfogatcsökkenést okoz az acinussejtekben. A stimulációra bekövetkezo válasz tehát jelentos változást hoz létre a sejtekben, amit az úgynevezett késoi sejtválasz hivatott kompenzálni. Ennek során muködésbe lépnek a Na+-H+ és a HCO3 --Cl- antiport rendszerek, amelyek a H+ és HCO3 - ionokat távolítják el a sejtbol, biztosítva a pH
17
állandóságát; a Na+-K +-2Cl- kotranszporter kiegyenlíti a sejt K+ és Cl- ionveszteségét; a Na+-K + pumpa pedig eltávolítja a más pumpák által a sejtbe juttatott Na+-ot. Hogy a primer nyálból végül mi kerül a szájüregbe, azért a ductus striatus területén muködo passzív Na+, K+, Cl-, HCO3 - ion- és víztranszport és aktív Na+-K +, illetve Cltranszport felelos. A duktális elekrolit-visszavétel véges kapacitásával magyarázható az, hogy az elválasztott nyál mennyiségének növekedésével párhuzamosan egyre magasabb a Na+ koncentráció a nyálban. A duktuszsejtek nemcsak a primer nyál elektrolitösszetételét változtatják meg, hanem önálló szekréciós aktivitással is bírnak. Részt vesznek proteineknek és szteroid hormonoknak az intersticiális térbol való transzepitheliális transzportjában. A nyálmirigyek kivezetocso szakaszán további lehetoségként a sejtek közötti tereken keresztül is a nyálba juthatnak nagyméretu molekulák. A duktuszsejtek tehát termelnek, tárolnak és szekretálnak anyagokat. Ezek közé tartoznak némely emésztoenzimek: ribonukleázok, proteázok és némi ductális eredetu amiláz (pl. egér szubmandibuláris mirigyében; 62), illetve növekedési faktorok, mint az EGF, a TGF-a vagy a NGF (95).
18
A kísérleti munka háttere A nyálmirigyek által termelt biológiailag aktív molekulák közül kettot vizsgáltunk: az amilázt és az epidermális növekedési faktort.
Régóta tudott tény, hogy az emésztoenzimek, mint a tripszin, lipáz és amiláz , kimutathatók a szérumban is (37). Általánosan elfogadott nézet volt sokáig, hogy jelenlétük a szérumban valamilyen patológiás jelenségnek (parenchima gyulladás) a következménye, illetve az exokrin szekréció “mellékterméke”. Ezt a nézetet erosíti az emésztoenzimek megemelkedett koncentrációja a szérumban olyan akut gyulladásos folyamatokban, mint az acut pancreatitis vagy a mumpsz (49,51,85). Ezzel szemben az emésztoenzimek megtalálhatóak a szérumban normál körülmények között is (37). Az a-amiláz két fo forrása patkányban és emberben egyaránt a pancreas és a gl. parotis (39). Mindkét mirigy hozzájárul a szérumamiláz-szinthez, ugyanakkor – a várttal ellentétben – fiziológiás körülmények között a parotisz nagyobb mértékben juttat enzimet a szérumba, mint a hasnyálmirigy (70). Szintén kimutatták, hogy pilokarpin stimulációt követoen, illetve a parotiszt beidegzo paraszimpatikus szekretomotoros
ideg
stimulációjának
hatására
a
szérum
amilázaktivitása
megemelkedett (36,72). Éheztetett patkányok táplálékfelvétele szintén a parotisz eredetu izoforma szintjének szérumszint növekedését eredményezi (70). Mindazonáltal a korábbiakban nem volt ismert, hogy a patkányok normál táplálkozási szokásai között milyen hatással van a táplálékfelvétel a szérumamiláz szintre.
Kísérleteinket megelozoen számos tanulmány foglalkozott az epidermális növekedési faktornak a sebgyógyulásban betöltött szerepével (69). A metabolikus betegségek - mint a diabetes mellitus - állatmodelljeiben alacsonyabb növekedési faktor koncentrációkat mérhetünk a nyálban, mint az egészséges populációban. I és II típusú diabéteszben szenvedo páciensek nyálában is jelentosen kisebb az EGF koncentráció (40,83). Kezdodo I. típusú diabéteszes NOD (non-obese diabetic) egerekben szintén megfigyelheto ez a jelenség (43,68). Az inzulin függo diabetes mellitus (IDDM) a ma legelfogadottabb nézet szerint autoimmun betegség. A non-obese diabetic (NOD) egerek szerveinek a diabetesz kialakulása utáni szövettani feldolgozása a szervek B- és T-sejtes infiltrációját mutatja, illetve a hasnyálmirigy Langerhans-szigeteinek elpusztulását. Az IDDM-ban szenvedo emberek között gyakori tünet a szájszárazság.
19
Ennek hátterében a nyálmirigyek
limfocitás infiltrációja, illetve funkciócsökkenése áll. A NOD-egerekben szintén jellemzo a Sjögren-szindrómában megfigyelheto tünetek kialakulása bizonyos életkor elérése után (30). Éppen ezért e törzset a Sjögren-szindróma tanulmányozására is kiterjedten alkalmazzák (31).
20
Kísérleti célkituzések
Elso kísérletsorozatunkban arra kerestük a választ, hogy éheztetett kísérleti állatokon az irodalomban ismert szélsoséges kísérleti körülmények között alkalmazott farmakológiás és fiziológiás ingerek mellett a napi normál táplálkozási ritmus milyen hatással van az állatok parotisz eredetu amilázaktivitására a szérumban.
Második kísérletsorozatunkban vizsgálataink arra irányultak, hogy megállapítsuk, milyen hatással van a diabetes mellitus az EGF expressziójára egér submandibularis nyálmirigyében. Milyen hatással van a nyál EGF szintje a szájüregi sebgyógyulási folyamatra egészséges és diabetes-es egerekben.
21
Kísérleti módszer I. Kísérleteinkben 250-320 g súlyú nostény Wistar (Charles River, Hungary) patkányokat használtunk, amelyeket standard állatházi körülmények között tartottunk: állandó homérsékleten (24 °C) és 12-12 órás fényciklusban: 0700 és 1900 óra közötti teljes megvilágítás váltakozott sötétséggel. A kísérleti állatok standard laboratóriumi tápot és csapvizet fogyasztottak korlátozás nélkül. Állatainkat a körülményekhez való adaptáció miatt 14 nappal a kísérletek kezdete elott helyeztük a fent említett körülmények közé. Elso kísérletünkben 16 órás éheztetés után az állatok egy csoportja (n=10) 5 mg/kg dózisú pilocarpine-HCl intraperitoneális injekciót kapott, míg a másik csoport (n=10) hasonló mennyiségu fiziológiás sóoldatot (kontroll). Második kísérletünkben szintén 16 órás éheztetés után (n=18) az állatok egyik csoportját 1 órán keresztül hagytuk standard laboratóriumi tápot enni, míg a kontrollcsoport továbbra is éhezett. Mind az elso, mind a második kísérletben 1 óra elteltével vért gyujtöttünk a femorális erek átvágásával, és mindkét oldali parotiszt zsírmentesen eltávolítottuk. Harmadik kísérletünkben 16 állatot osztottunk két nyolcas csoportba. Az állatok a kísérlet kezdetéig ad libitum táplálkoztak, de a sötét periódust közvetlenül megelozoen az egyik csoporttól megvontuk a táplálékot, a másik csoport továbbra is ad libitum táplálkozhatott. A sötét periódus kezdetétol számított második órában vért és parotiszmirigy mintákat gyujtöttünk. A kísérleti állatokat Na-thiopental anesztéziában (50 mg/kg) az arteria femoralis átvágásával elvéreztettük, majd pneumothorax-ot alakítottunk ki.
Az amilázaktivitás kiszámítása
Az összegyujtött vért alvadékképzodés után 2500 g-vel centrifugáltuk 4°C-on, majd a szérumot -20°C-on tároltuk további felhasználásig. Patkányban a parotisz és hasnyálmirigy eredetu izoamilázok 8.6 pH-jú környezetben eltéro fiziko-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. Nevezetesen a szérumminta elektroforézise közben a parotisz eredetu izoamiláz az anód, a pankreász eredetu izoamiláz pedig a katód felé vándorol (80). Ezt a tulajdonságot kihasználva a gél közepén alakítottok ki egy vályút,
22
amelybe standard mennyiségu szérummintát vittünk fel, majd elektroforézissel szétválasztottuk a két izoenzimet. A minták elektroforézise 80 V feszültséggel 0.9 %-os agaróz gélen történt. A futtatáshoz 0.1M, 8.6 pH-jú Veronal puffert használtunk. Az amilázaktivitást a megfelelo izoenzim csíkjának kivágása utána gél-homogenizátumból határoztuk meg. A parotiszszövetben található amilázaktivitás meghatározása céljából a mirigyszövetet
lemértük,
majd
Tris-pufferban
(pH
7.4,
10mM)
5
%-os
homogenizátumot készítettünk. A homogenizátumot 4°C-on 2500 g-vel 10 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítottuk, és abból határoztuk meg az amilázaktivitást. Az amiláz aktivitását mind a szérumban, mind a mirigyszövetben keményíto-jód színreakció alapján mértük. A módszer lényege, hogy az amilázt tartalmazó mintákat adott térfogatú és adott koncentrációjú keményítot tartalmazó szubsztrátelegyhez adva, a mintát 37°C-on, folyamatosan rázva inkubáljuk, majd a jódot tartalmazó reakcióeleggyel az amiláz által le nem bontott keményítot megkötjük. A keményítojód komplex kék színu. A módszert standardizálva, megfelelo kalibráció után bizonyos határok között a színintenzitás egyenesen arányos a keményíto-jód komplex mennyiségével, ami viszont annak függvénye, mennyi amiláz volt a mintában, és mennyi keményítot bontott le. Minél magasabb tehát az enzimaktivitás, annál kevésbé lesz intenzív az oldat színe. A szubsztrátelegy összetétele: 4 g/L keményíto, 60 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.001 mM CaCl2 , az elegy pH-ja 7.4 A reakcióelegy összetétele: 0.2 mM I2 , 3 mM KI, 30 mM HCl. A létrejött színreakció után az oldat optikai denzitását 595 nm-en mértük (BIORAD 3550 microplate reader). Az enzimaktivitás mértékét egységekben (U) adtuk meg. 1 egység = 1 gramm lebontott keményíto/1 perc (101).
A kapott eredményeket átlag±S.E.M. értékekben adtuk meg. A változásokat a kontroll értékek százalékában számítottuk ki, statisztikai értékelésre varianciaanalízist használtunk.
23
Kísérleti módszer II.
7-10 hetes hím BALB/cJ és NOD/LtJ egereket használtunk kísérleteinkben. A NOD egerek egyik csoportja diabetes-es, másik csoportja prediabetikus állapotban volt. A cukorbetegség kialakulását az egerek vérének glukózszintjében bekövetkezo változáson mértük le. Amennyiben ennek értéke két egymást követo héten 280 mg/dl fölött volt, az állatot diabéteszesnek nyilvánítottuk. A diabéteszt 12±2 hetes korban hoztuk létre, amikor még nem alakulnak ki a Sjögren-szindrómára jellemzo tünetek. A diabétesz miatt az egerek napi egyszeri intramuszkuláris inzulin injekciót kaptak (1 U Humilin/egér/24 óra) két héten át a kísérlet kezdete elott.
Szájüregi sebzés kivitelezése
Hasonló korú, egészséges, BALB/c egereket, nem diabéteszes NOD, és inzulinkezelt diabéteszes NOD-egereket véletlenszeruen három csoportra osztottunk (n=4-6). Az állatok nyelvén általános pentobarbitál anesztéziában standardizált módon 1 mm átméroju körkörös felületi sebzést ejtettünk egy szövetbiopszia vételére alkalmas eszközzel. A vérzés elállta után a még tartó altatás alatt az állatok nyelvérol 3-3 fotót készítettünk sztereomikroszkópon keresztül. A következo négy napban az állatok nyelvét – mindig azonos körülmények között – lefotóztuk. Mindhárom kísérleti csoportunkban az állatokat további két csoportra osztottuk, az egyik csoportot csapvízzel, a másikat pedig EGF tartalmú (2,5µg/ml) csapvízzel itatva. A sebek meggyógyultak 4 napon belül. A sebek begyógyulása után az állatokat feláldoztuk, nyelvüket, szubmandibuláris mirigyeiket eltávolítottuk.
A seb méretének kiszámítása
Az altatott állatok nyelvét sztereomikroszkóppal szemlélve, kalibrált okulár segítségével a seb legnagyobb hosszát és szélességét lemértük. A sebszélek könnyen felismerhetoek mind in vivo, mind a fotókon. A seb területét az alábbi képlet segítségével számítottuk ki: A=LWp/4 (A: a seb területe; L,W: a seb legnagyobb hosszúsága és szélessége; 64).
24
RNS izolálás és EGF mRNS detektálás RT-PCR segítségével
Az állatok leölése után eltávolítottuk a szubmandibuláris nyálmirigyeket és PBS-ben (nátrium klorid tartalmú foszfát puffer) felaprítottuk, majd lízis-pufferba helyeztük. A feltárt sejtekbol Micro-Fast Track Kit segítségével mRNS-t izoláltunk. Az
mRNS
centrifugálással
mintákat
-70°C-on,
ülepített
etilalkoholban
mRNS-bol
tároltuk
reverz-transzkripciós
felhasználásig. reakcióval
A
cDNS-t
szintetizáltattunk polyo dT primerek és Expand reverse transcriptase (Boehringer Mannheim) felhasználásával. A kapott cDNS-t templátként használtuk fel ß-actin (kontroll) és EGF cDNS meghatározásához. Az amplifikáció körülményei a következok voltak: 94°C 1 perc, 58°C 1 perc, 72°C 3 perc, ciklusszám: 25; Biometra thermocycler, primer szett: ßactin: bal primer 5'-TGAAGGTCGGTGTGAAAACGGATTTGGC-3', jobb primer 5'CATGTAGGCATGAGGTCCACCAC-3'; EGF bal primer 5'-TAAGCCGAGACCGGAAGTACT-3' jobb primer 5'AGTCTGTTCCATCAAATGCA3'.
Az EGF mRNS koncentrációjának az alapállapothoz képest való változását denzitometriás analízis segítségével mértük, amit a lefotózott gél szkennelése után számítógéppel végeztünk el. Az eredményeinket átlag±S.E.M.-ként adtuk meg, statisztikai értékelésre ANOVA tesztet használtunk, szignifikancia szint p<0,05.
25
Eredmények I. Ad libitum táplált patkányok szérumában a parotisz erdetu amiláz aktivitása 5,78 ±0,79 U/L. Amennyiben az állatokat 16 órán át éheztetjük, csökken az aktivitás és 4,10±0,68 U/L értéket vesz fel. Megfigyeléseink szerint az általunk felállított kísérleti körülmények között a parotiszszövet amilázaktivitása nem éheztetett állatokban 100 mg szövetre vonatkoztatva 5,00±0,94 U/100 mg, éheztetés után pedig 7,69±1,52 U/100 mg volt. Elso kísérletünkben a pilokarpinnak a parotiszszövet és a szérum parotisz eredetu izoamiláz szintjére való hatását vizsgáltuk. A pilokarpin egy potenciális paraszimpatikus izgatószer, ami szekréciófokozódást vált ki a nyálmirigyekben. A mirigyszövet enzimaktivitásában 39±9 % csökkenést észleltünk (p<0,01), míg a szérum parotisz eredetu amilázaktivitása 101±39 %-al emelkedett meg (p<0,01) 1 órával a pilokarpin (5 mg/kg) adás után (3. ábra).
26
amiláz aktivitás a kontroll érték %-ában
300 **
250 200 150 ***
100 50 0
fiz.1só
2 pilokarpin
Parotiszszövet
fiz.3 só
4 pilokarpin
szérum
3. ábra
A parotiszszövet és a szérum amilázaktivitása 1 órával 5 mg/kg
dózisú
pilokarpin
intraperitoneális
követoen ( ***p<0,001; **p<0,01)
27
beadását
amiláz aktivitás a kontroll érték %-ában
200
* 150
100
**
50
0 1
2
3
4
éheztetett táplálkozott éheztetett parotiszszövet
táplálkozott
szérum
4. ábra
16 órás éheztetést követo 1 órás táplálékfelvétel hatása a parotiszszövet és a szérum amilázaktivitására (**p<0,01; *p<0,05)
28
Következo
kísérletünkben
16
órás
éhezést
követoen
vizsgáltuk
a
táplálékfelvétel hatását. Az éheztetett állatok szöveti amilázaktivitása egy órás táplálkozását követoen 35±15 %-al csökkent (p<0,01), vele párhuzamosan a szérumban mért parotisz izoamiláz szint 41±17 %-al emelkedett meg (p<0,05) (4. ábra). Harmadik kísérletünkkel arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a korábbi szélsoséges körülmények között észlelt jelenségnek vajon az állatok normál napi tevékenysége során van-e megfeleloje, vagyis a napi normál táplálékfelvételi ritmus hogyan befolyásolja a szérum és a parotisz amiláz koncentrációját. 12-12 órás sötétség-világosság ciklusban tartva az állatokat, táplálékuk 80-90 %-át a sötétség beállta utáni néhány órában veszik magukhoz (76,77). Figyelembevéve a patkányok táplálékfelvételi szokásait, ad libitum táplált patkányokon vizsgáltuk a sötét periódus második órájában a spontán táplálékfelvételnek a szérum, illetve parotisz amilázaktivitásra gyakorolt hatását.
29
amiláz aktivitás a kontroll érték %-ában
**
150 **
100 50 0 1 éhezett
2 táplálkozott
3 éhezett
Parotiszszövet
4 táplálkozott szérum
5. ábra
Spontán táplálékfelvétel hatása a parotiszszövet és a szérum amiláz aktivitására (**p<0,01)
A spontán táplálkozó csoport parotiszszövet amilázaktivitása 27±7 %-al csökkent, ugyanakkok a szérum amilázaktivitása 16±1 %-al emelkedett meg a kontrolcsoportoz képest (5. ábra).
30
Eredmények II.
Az EGF szint alapértékének meghatározása
A diabetes kialakulásának kíséro jelensége a nyál EGF szintjének csökkenése (30,40,83). Nem vizsgálták azonban az eddigiekben az EGF mRNS szintjét szubmandibuláris mirigyszövetben. Reverz-transzkripciós polimeráz láncreakciót (RTPCR) végeztünk egészséges BALB/c, prediabeteszes NOD (NOD/PD)és diabéteszes NOD-egerek (NOD/D) mirigyszövetébol. A denzitometriás elemzés eredményeként elmondhatjuk,
hogy
a
diabéteszes
NOD
egerekben
25-30%-os
csökkenést
tapasztaltunk az EGF mRNS mennyiségében a kontollhoz képest. A prediabéteszes NOD egerek esetén ugyanez az érték alig mutatott csökkenést (6. ábra). Ugyanakkor a prediabéteszes NOD-egerek nyálában magasabb az EGF koncentráció (54 ng/ml), mint a BALB/c-egerekében (34 ng/ml) (30).
31
β-actin
EGF
676 bp
489bp
385 bp
NOD (D)
NOD (PD)
BALB/c
NOD (D)
NOD (PD)
BALB/c
6. ábra
Reverz-transzkripciós polimeráz láncreakcióval nyert DNS molekulák elektroforetikus képe a különbözo vizsgálati csoportokban
32
A nyelvsebek gyógyulása A lyukbiopszia-vevo apparátust használva az egerek nyelvén egy jó közelítéssel kör alakú, felületes sebet hoztunk létre, amelynek gyógyulását négy napon át követtük.
7. ábra
Míg a prediadeteszes NOD-csoportban a gyógyulás 3 napon belül bekövetkezett, addig a BALB/c- és diabeteszes NODegerek nyelvén még a harmadik napon is jól detektálható seb volt
33
Bár azonos módon képeztük mindhárom csoportban a sebeket, mégis eltéro volt a kiindulási érték: 21mm2 a NOD/PD-egerekben, szemben a diabeteszes (NOD/D) csoport 14mm2 -es értékével. A normál sebgyógyulási sebességgel összevetve a NOD/PD-egerek nyelve 4 nap alatt 100%-ban meggyógyult, a BALB/c-csoportban 83%-os volt a seb méretének csökkenése, a diebeteszes NOD-csoportban pedig 58%, annak ellenére, hogy a kiindulási sebméret itt volt a legkisebb. A gyógyulás gyorsaságát összehasonlítva a NOD/PD>BALB/c> NOD/D reláció állítható fel a csoportok között. Az állatok ivóvizéhez EGF-et adva a sebgyógyulási folyamat alig mutatott gyorsulást a NOD/PD- és BALB/c-csoportokban. Ez a jelenség mindvégig megfigyelheto volt, amíg a sebet észlelni lehetett. Ezzel ellentétben a NOD/D-egerek esetében az EGF adagolása jelentosen gyorsította a gyógyulási folyamatot a kontrollcsoporthoz képest. A naponkénti mérérsek alkalmával a seb méretének 25, 38, illetve 72%-os csökkenését regisztráltuk. Bár a NOD/D csoporton belül a seb kiindulási mérete a legkisebb volt, csak az EGF tartalmú vizet kapó állatok esetében gyógyult gyorsabban a seb, mint az EGF-et nem kapott egerek esetében. (8.a-c ábrák)
34
BALB/c
A seb mérete (mm2)
30 25 20 15 10 5 0 0
24
48
72
0
24
48
72
H
EGF (+)
EGF(-)
8.a ábra
NOD /PD
A seb mérete (mm2 )
25 20 15 10 5 0 0
24
48
72
0
24
48
H
EGF (+)
EGF(-)
8.b ábra
35
72
NOD /D
A seb mérete (mm2)
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0
24
48
72
0
24
48
72
H
EGF (+)
EGF(-)
8.c ábra
A nyelven ejtett seb méretének változása a különbözo csoportokban az ido és az ivóvíz EGF tartalmának függvényében; EGF(+): 2,5 µg/ml tartalmú ivóvíz, EGF(-): csapvíz
36
Megbeszélés
Kísérleteink eredményei igazolták, hogy pilokarpin adagolás hatására a parotiszszövet amiláz tartalma jelentosen csökkent, és ezzel párhuzamosan jelentékeny növekedést tapasztaltunk a szérum parotisz eredetu amilázaktivitásában. Hasonló módon, de csekélyebb mértéku változásokat figyeltünk meg mind a szövet, mind a szérum parotisz erdetu izoamiláz szintjében éheztetést követo táplálékfelvétel hatására. Végül az ad libitum táplált állatok esetében a sötét periódus korai szakaszában szintén csökkenést tapasztaltunk a parotiszszövet enzimaktivitásában, és növekedést a szérum parotisz eredetu izoamiláz koncentrációjában. Megfigyeléseink, miszerint a parotisz izoamiláz és a szérum parotisz eredetu izoamiláz
elektroforetikus
tulajdonságai
azonosak,
a
szérummintában
lévo
hasnyálmirigy eredetu amiláz pedig az elobbiekkel ellentétes irányba mozdul el, megegyeznek korábbi vizsgálatok eredményeivel (26,82,85,88). Ezek a tanulmányok szintén kimutatták, hogy patkányban a cirkuláló amiláz dönto hányada parotisz eredetu, a pancreas és a máj kisebb mértékben járul hozzá a szérum amilázaktivitásához (33,71,88). A pilokarpin stimulációra vonatkozó eredményeink szintén megegyeznek korábbi vizsgálatok eredményeivel. Proctor és munkatársai kimutatták, hogy paraszimpatikus idegstimuláció a nagy mennyiségu, de alacsony amiláz koncentrációjú mirigyszekrétum mellett nagyfokú parotisz izoamilázszint emelkedést eredményez a szérumban. Ugyanakkor a szimpatikus ideg stimulációja kis mennyiségu, amilázban gazdag nyál elválasztását eredményezi, és alig, vagy egyáltalán nem változtatja meg a szérum amilázaktivitást (72). Az amiláznak a szekrétumból az intersticiális térbe, majd onnan a keringésbe való jutására végzett, jelzett amilázt retrográd úton a parotis duktusz rendszerébe juttató kísérletek azt mutatták, hogy az amiláz sejtek közötti tereken keresztül jut ki a duktuszból (19,33,35,55). Amikor
éheztetett
állatok
táplálékot
vesznek
magukhoz,
a
parotisz
amilázaktivitása csökken, és ennek megfeleloen a szérumban no a parotisz izoamiláz szint. Ez a hatás gyakorlatilag egyideju paraszimpatikus és szimpatikus ingerületi állapotnak felel meg, amely mind paraszimpatektomiával, mind a szimpatikus ideg átvágásával, illetve propranolollal végrehajtott β-blokáddal kivédheto (72).
37
A mi vizsgálataink mutattak rá azonban eloször, hogy a parotisz eredetu izoamilázszint a napi spontán táplálékfelvétel által is szabályozott. A sötét periódus elso óráiban, amikor a patkányok a napi táplálékuk legnagyobb részét megeszik, a parotisz izoamilázszint jelentosen csökken a nyálmirigyben és növekszik a szérumban. Ez az egyideju, ellentétes irányú változás arra enged következtetni, hogy a táplálékfelvétel olyan neuronális és hormonális szabályozó utakat indít be, amelyek az amiláznak a parotisz duktusz rendszerébol a szérumba való jutását eredményezik.
A szubmandibuláris mirigy a legjelentosebb forrása az epidermális növekedési faktornak egerekben (9,11,50). Számos tanulmány kimutatta, hogy a nyálban található növekedési faktorok milyen fontos szerepet játszanak a szájüregi és szisztémás sebgyógyulásban (44,64,65). Patkányok és egerek esetében a szubmandibuláris mirigy eltávolítása a sebgyógyulási folyamat lelassulását eredményezi, amit azonban kompenzálni lehet exogén EGF-nek a szervezetbe való juttatásával (11). A diabetes mellitus olyan szisztémás betegség, amely csökkenti a nyálmirigyek funkcióját, beleértve a nyálelválasztás mértékét és térfogatát is (2,53). A diabétesz, ami negatívan befolyásolja a nyálmirigyek muködését, drámaian befolyásolja az EGF, NGF, nyálban mérheto koncentrációját (30,40,83). A nyál csökkent EGF tartalmára vonatkozó vizsgálatokat kémiai úton kiváltott, illetve II. típusú (nem inzulin függo, NIDDM) diabeteszben vizsgálták az eddigiekben (40,83).
Vizsgálataink kimutatták, hogy a természetes úton kialakuló autoimmun diabeteszben szintén alacsonyabb a nyálmirigy EGF koncentrációja.
A szubmandibuláris nyálmirigy mRNS analízise megerosíri a korábbi protein analízisek eredményét, miszerint a diabeteszes állatmodellekben mind a nyálban, mind a szérumban csökkent epidermális növekedési-faktor szintet mérhetünk (30,40,83). A növekedési faktorok csökkent koncentrációja a nyálban a szájüregi nyálkahártya csökkent gyógyulási kapacitását eredményezi (64). Vizsgálatunk az elso, ami az epidermális növekedési faktor esetleges szerepét felvetette a diadetes-ben szenvedok szájüregi sebgyógyulási folyamataiban.
38
Korábbi vizsgálatok eredményével megegyezoen az ivóvízzel pótolt EGF az egészséges BALB/c és NOD/PD-egerekben nem gyorsította a sebgyógyulási folyamatot (64). A diabeteszes állatokban azonban – amelyeknek nyálában az EGF szint alacsonyabb volt – a sebgyógyulási folyamatot az egészséges egerekben megfigyelheto szintre emelte. A normál gyógyulási ráta EGF pótlás által való helyreállítása a diabeteszes egerekben alátámasztani látszik azt a feltételezést, hogy a nyál csökkent EGF tartalma az egyik legfontosabb közremuködo patogén faktora a cukorbetegséghez társuló alacsony szájüregi sebgyógyulási rátának. Az EGF közvetlen részvételét a sebgyógyulásban bizonyítja, hogy nyelv epithel sejtjein, amelyek az ízlelobimbókat alkotják, EGF receptorokat találunk, vagyis a nyálEGF szerepet játszik ezeknek a szöveteknek fenntartásában (57). A nyelv felszínén ejtett sebzés területe a diabeteses egerekben konzekvensen kisebb volt, mint a NOD/PD és BALB/c egerekben. Bár a cukorbeteg egerek naponta kaptak inzulint, mégis elképzelheto, hogy diabetesre jellemzo microangiopathia, neuropathia és a desiccatio érintették a nyelv szöveteit. Ez lehet a lehetséges magyarázata annak, hogy a standardizált körülmények között ejtett sebek a diabeteses állatok esetében kiindulási állapotban kisebb méretuek voltak. Valószínuleg ezt a lehetoséget is figyelembe kell venni, mint ami megakadályozta a sebgyógyulás normál szintre való felgyorsulását az EGF ivóvízzel való pótlása ellenére. Kísérleteinkben
humán
rekombináns
EGF-et
használtunk
egerek
receptor
rendszerében, ami nyilvánvalóan nem a legoptimálisabb a receptorok aktiválására. Ugyanakkor összességében elmondhatjuk, hogy a nyállal együtt elválasztott EGF fontos szerepet játszik az orális epitheliumon ejtett sebek gyógyulásában. Továbbá olyan, vagy hasonló anyagcserezavarok, mint amilyenek fennállnak például diabetes mellitus-ban, csökkentik a nyál EGF szintjét, aminek következményeképpen a szájüregi sebgyógyulási folyamatok jelentosen lelassulnak.
39
Összefoglalás Kísérleteinkben mindössze két, a nyálmirigyek által elválasztott fehérjével foglalkoztunk. A nyálban húsznál több fehérjekomponens van, amelyek szerepérol a szájüregi és szisztémás folyamatokban még korán sincs teljes képünk. Megjelenésük, vagy lecsökkent, esetleg megemelkedett koncentrációjuk a nyálban gyakran kíséroje más kórfolyamatoknak. Leírtak korábban, hogy a maxillofaciális területen végrehajtott operációk után megemelkedik a növekedési faktorok koncentrációja a nyálban (85). Szintén a növekedési faktorok jelentos szerepérol számoltak be a károsodott parodontium gyógyulásában, illetve a TGF-β-nak a pulpakamra/dentin regenerációban betöltött szerepérol (29). A csökkent nyálelválasztású páciensek problémái számos olyan terápiás eljárás lehetoségét vetik fel, amelyek során a nyálban található biológiailag aktív fehérjéket úgy
az
orális,
mint
szisztémás
patofiziológiai
folyamatok
befolyásolására
felhasználhatnánk. Sajnos az eddigi próbálkozások alapján el kell mondanunk, hogy a lehetoségek egyelore nagyon limitáltak. A vékonybélben felszívódó növekedési faktorok például a portális keringéssel a májba jutva lebomlanak, és csak elenyészo mennyiség kerül a szisztémás keringésbe. A gasztrointesztinális traktus, a máj és a bor regenerációjában, fekélyek, sebek gyógyulásában nagy szerepet játszó fehérjéknek a szisztémás keringésbe juttatására ígéretes kísérleteket folytattak Purushotham és munkatársai (73). A növekedési faktoroknak a sublingvális érhálózaton keresztül való felszívódását vizsgálták. Az alkalmazott EGF rendkívül gyorsan felszívódott, majd kimutatható volt a szövetekben is a fej-nyaki részektol lefelé haladva egyre csökkeno koncentrációban. A nyálmirigyek által termelt polipeptidek terápiás felhasználásának lehetoségét tehát alapvetoen csökkenti a szisztémás keringésbe való juttatás nehézsége, illetve a portális rendszeren keresztüli felszívódás eredményeként a rendkívül alacsony féléletido a keringésben. Az anyagok bejuttatására tehát parenterális utak jöhetnek szóba. A növekedési faktorok tehát a szérumban is jelen vannak, jelentos hatást gyakorolva az embrionális fejlodés során, illetve a késobbiekben is a köto-, hám-, és csontszövet fel/átépülésére (61,67,73) . Ez szintén megerosíti azt, hogy a mirigyeknek szorosan vett endokrin és exokrin csoportra való felosztása nem teljesen egyértelmu (37), hiszen a növekedési faktorok mellett a nyálmirigy eredetu amiláz is kimutatható fiziológiás
40
körülmények között a szérumban. Az EGF-hez hasonlóan az amiláz koncentrációja is akár tízszeresére emelkedhet egyes szájüregi és állcsontokon végrehajtott mutétek után (24). A nyálmirigyek – azon belül is foleg a parotisz – és a hasnyálmirigy, illetve a nyál- és hasnyál elválasztása, illetve összetétele közötti nagyfokú hasonlóság a gasztrointesztinális traktus alsóbb részeinek megbetegedéseivel foglalkozók figyelmét is magára vonta. Az, hogy a nyál szintén tartalmaz emésztoenzimeket, amelyek a szénhidrátok és zsírok emésztését végzik, felveti annak lehetoségét, hogy a pankreász idült megbetegedésében szenvedok esetében a hasnyálmirigy kieso funkcióit a nyálmirigy által termelt enzimek vehetnék át. Maga a szervezet szolgáltat erre példát, hiszen életünk elso heteiben a hasnyálmirigy alacsony kapacitása miatt mind az anyatejben lévo szénhidrátok, mind a lipidek emésztésében foszerepet játszik a nyál amiláz és a lingvális lipáz. Elmondhatjuk tehát, hogy a nyálmirigyek által elválasztott biológiailag aktív fehérjék esetleges terápiás felhasználása a jövoben hatékony segítség lehet bizonyos betegségek kezelésében.
41
Köszönetnyilvánítás
Köszönettel tartozom témavezetomnek, Dr. Zelles Tivadarnak, aki bevezetett a kísérleti munka szépségeibe és elindított a tudományos pályán. Dr. Varga Gábornak, aki szigorú következetességével oly gyakran segített kiküszöbölni a felmerülo problémákat, és Michael Humphreys-Beher-hez hasonlóan segített a tudományos közlemények megírásában. Illetve mindazoknak, akik munkahelyemen és családomban végtelen türelmükkel segítették ennek a munkának az elkészültét.
42
Az értekezés alapjául szolgáló tudományos közlemények:
Nagy A, Nagashima H, Cha S, Oxford GE, Zelles T, Peck AB, Humphreys-Beher MG, Reduced oral wound healing in the NOD mouse model for type 1 autoimmune diabetes and its reversal by epidermal growth factor supplementation, Diabetes 50(9):21002104, 2001
IF: 7,715
Nagy A, Barta A, Varga G, Zelles T,Changes of salivary amylase in serum and parotid gland during pharmacological and physiological stimulation, J Physiol Paris 95(16):141-145, 2001
IF:1,339
43
Irodalomjegyzék 1. Ahn SJ, Kho HS, Kim KK, Nahm DS, Adhesion of oral Streptococci to experimental bracket pellicles from glandular saliva. Am J Orthod Dentofacial Orthop 124:198-205,2003 2. Anderson LC, Johnson DA, Effects of alloxan diabetes on rat parotid gland and saliva. Comp Biochem Physiol 70B: 725-730, 1984 3. Baum BJ, Ambudkar IS, Regulation of calcium handling by rat parotid acinar cells. Mol Cell Biochem 82:67-73,1988 4. Beck B, Neuropeptides and obesity. Nutrition 16: 916-923, 2000 5. Berk JE, Fridhandler L, Clinical application of amylase isoenzyme analysis. Am J Gastroenterol 63:457-463, 1975 6. Bonilla CA, Human mixed saliva protein concentration. J Dent Res 51:664, 1972 7. Brown RL, Breeden MP, Greenhalgh DG, PDGF and TGF-alpha act sinergistically to improve wound healing in the genetically diabetic mouse. J Surg Res 56: 562570, 1994 8. Bustamante JC, Mann GE, Yudilevich DL, Specificity of neutral amino acid uptake at the basolateral side of epithelium in the cat salivary gland in situ. J Phisiol, 313:65-79, 1981 9. Carpenter G, Cohen S, Epidermal growth factor. Ann Rev Biochem 48: 193-216, 1979 10. Castle JD, Protein secretion by rat parotid acinar cells. Pathways and regulation. Ann N Y Acad Sci, 842:115-124, 1998 11. Cohen S, Isolaion of a mouse submaxillary protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the newborn amimal. J Biol Chem 237: 1556-1562, 1962 12. Costigan DC, Guyda HJ, Posner B, Free insulin-lige growth factor I (IGF-I) and IGF-II in human saliva. J Clin Endocrinol 65:1014-1018, 1988 13. DeBurgh Norman JE, McGurk M, Color atlas and text of the salivary glands. Mobsy-Wolfe 1995 14. Fazekas A, Gazelius B, Edwall B, Theodorsson-Norheim E, Blomquist L, Lundberg JM, VIP and noncholinergic vasodilatation in rebbit submandibular gland. Peptides 8:13-20, 1987 15. Feher E, Zelles T, Nagy G, Immunocytochemical localization of neuropeptide containing nerve fibers in human labial glands. Arch Oral Biol 44:S33-37,1999
44
16. Folkesson HG, Matthay MA, Frigeri A, Verkman AS, Transepithelial water permeability in microperfused distal airways. Evidence for channel-mediated water transport. J Clin Invest 97:664-671, 1996 17. Fox PC, Saliva composition and its importance in dental health. Compend Suppl 13:S457-460, 1989 18. Fukushima M, Lupien J, Bray G A, Interaction of light and corticosterone on food intake and brown adipose tissue of the rat. Am. J. Physiol. 242:R753-R757, 1985 19. Garrett JR, Parons PA, Movement of horseradish peroxidase in rabbit submandibular glands after ductal injection. Histochem J 8:177-189, 1976 20. Gibbons RJ, Bacterial adhesion to oral tissues: a modell for infectious diseases. J Dent Res 68:750-760, 1989. 21. Grenwood K, Armstrong S, Coleman G, Persistance of rat nocturnal feeding and drinking during diurnal presentation of palatable diet. Physiol Behav 24:1119-1123, 1980 22. Gresz V, Kwon TH, Hurley PT, Varga G, Zelles T, Nielsen S, Case RM, Steward MC, Identification and localiyation of aquaporin water channels in human salivary glands. Am J Physiol 281:G247-G254, 2001 23. Gubits RM, Shaw PA, Gresik EW, Onetti-Muda A, Barka T, Epideermal growth factor expression is regulated differently in mouse kidney and submandibular gland. Endocrinology 119:1382-1387, 1986 24. Gyimesi J, Zelles T, Effect of experimental removal of molars on parotid function in the rat. Fogorv Sz 10:289-292, 1974 25. Haas M, Forbush B3rd, The Na-K-Cl cotransporters. J Bioenerg Biomenbr 30:161172, 1998 26. Hammerton K, Messer M, The origin of serum amylase, Electrophoretic studies of isoamylases of the serum, liver and other tissues of adult and infant rats. Biochim Biophys Acta 244:441-451,1977 27. Herrera JL, Lyonns MF, Johnson LF , Saliva: its role in health and disease. J Clin Gastroenterol 10:569-578, 1988 28. Hiraihatsu Y, Kagami H, Kosaki K, Sigetomi T, Ueda M, Kobayashi S, Sakanaka M, The localization of basic fibroblast growth factor in the rat submandibular glands. Nagoya Med Sci 57:143-152, 1994 29. Hu CC , Reparative dentin formation in rat molar after direct pulp capping with growth factors. J Endod 11:744-751, 1998
45
30. Hu Y, Nakagawa Y, Purushotham KR, Humphreys-Beher MG, Functional changes in
salivary glands of autoimmune disease-prone NOD mice. Am J Physiol
263:E607-614, 1992 31. Humphreys-Beher MG, Hu Y, Wang PL, Purushotham KR, Utilization of the NOD mouse as an animal model for the study of the secondary Sjögren's syndrome. Adv Exp Med Biol 250:631-636, 1994 32. Humphreys-Beher MG, Macauley SP, Chengini N, van Setten G, Purushotham KR, Stewart C, Schultz GS, Characterization of the synthesis and secretion of transforrming growth factor alpha from salivary glands and saliva. Endocrinology 134:963-970, 1994 33. Ikeno K, Ikeno T, Effects of prolonged parotid duct ligation, parotidectomy and acute hepatitis of rats on amylase activity. Arch Oral Biol 36:183-188, 1991 34. Ikeno T, Ikeno K, Kuzuya H, Transport to the bloodstream of amylase following retrograde infusion of amylase into the parotid glands in the rat. Arch Oral Biol 29:587-589, 1984 35. Ikeno T, Ikeno K, Uno T, Relationship between serum-amylase activity and intraductal pressures in the rat parotid and submandibular salivary glands after administration of pilocarpine or isoprenaline. Arch Oral Biol 33:403-406, 1988 36. Ikeno T, Nasu J, Kuzuya H, Mechanism of increase in amylase activity in the submandibular and sublingual glands after administration of pilocarpine. Arch Oral Biol 27:597-601, 1982 37. Isenman L, Liebow C, Rothman S, The endocrine secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. Am J Physiol 276:E223-E232, 1999 38. Ishikawa Y, Amano I, Chen C, Ishida H, Diurnal variation of amylasa secretion is coupled with alterations of beta-adrenoceptors in the rat parotid gland. Res Exp Med(Berlin) 192:231-240, 1992 39. Karn RC, Malacinski GM, The comparative biochemistry, physiology, and genetics of animal α-amylases. Adv Comp Physiol Biochem 7:1-103, 1978 40. Kasayama S, Oka T, Impaired production of nerve growth factor in the submandibular gland of diabetic mice. Am J Physiol 257:E400-404, 1989 41. Kennaway DJ, Generation and entrainment of circadian rhythms. Clin Exp Pharmacol Physiol 25:862-865, 1998 42. Kerr M, Lee A, Wang PL, Purushotham KR, Chegini N, Yamamoto H, Humphreys-Beher MG, Detection of insulin, insulin-like growth factors I and II in
46
saliva and potetional synthesis in the salivary glands of mice. Effect of type 1 diabetes mellitus. Biochem Pharmacol 49:1521-1531, 1995 43. Knighton DR, Flegel VD, Growthh factors and comprehensitive surgical care of diabetic wounds. Curr Opin Gen Surg 1:32-39, 1993 44. Konturek SJ, Dembinski A, Warzecha Z, Brzozowski T, Gregory H, Role of epidermal growth factor in healing of chronic gastrointestinal ulcers in rats. Gastroenterology 94:1300-1307, 1986 45. Kraly FS, Cushin BJ, Smith G, Nocturnal hyperphagia in the rat is characterized by decreased postprandial satiety. J Comp Physiol Psyhol 94:375-387, 1980 46. Kumar BA, Papamichael M, Leibowitz SF, Feeding and macronutrient selection patterns in rats: adrenalectomy and chronic corticosterone replacement. Physiol Behav 42:581-589, 1988 47. Kurachi H, Oka T, Changes in epidermal growth factor concentrations of siubmandibular gland, plasma, urine of normal and sialoadenectomised female miceduring various reproductive states. J Endocrinol 106:197-202, 1985 48. Le Mangen J, Body energy balance and food inake: a neuroendocrie regulatory mechanism. Physiol Rev 63:314-386, 1983 49. Leclerc P, Forest JC, Electrophoretic determination of isoamylases in serum with commercially available reagents. Clin Chem 28:37-40, 1982 50. Levi-Morrtalcini R, Cohen S, Effects of the mouse submaxillary glands on the sympathetic system in mammals. Ann N Y Acad Sci 85:324-341, 1960 51. Levitt MD, Eckfeldt JH, Diagnosis of acute pancreatitis, in: Go V. L. W., et al (Eds.) Exocrine pancreas: Biology, Pathology and Diseases. Raven Press, New York 1986 p.481-502 52. Ma, TH, Verkman AS, Aquaporin water channels in gastrointestinal physiology. J Physiol (Lond) 517:317-326, 1999 53. Maeda N, Nakagawa Y, Sakia M, Uno K, Takahashi A, Fujita H, Ishibashi K, Humphreys-Beher MG, Streptozotocin induced dry mouth in IGR mice. In: Sjögren's Syndrome-State of the Art. Homma M, Sugia S, Tojo T, Miyasaka N, Akizuki M,(Eds.) Amsterdam, Kugler Publications, 1993, p. 513-518 54. Massague J, Epidermal growth factor like transforming growth factor II. Interaction with epidermal growth factor receptors in human placenta membranes and A 431 cells. J Biol Chem 258:13614-13620, 1983
47
55. Mazariegos MR, Tice LW, Hand AR, Alteration of thight junctional permeability in the rat parotid gland after isoproterenol stimulation. J Cell Biol 98:1865-1877, 1984 56. McTavish D, Tepleton D, Na+ and K+ concentration of rat parotid saliva. Comparison of carbacol and auriculo-temporal stimulation. Pfügers Arch 391:7477, 1981 57. Morris-Wiman J, Sego R, Brinkley L, Dolce C, The effects of sialoadenectomy and exogenous EGF on tasic bud morphology and maintenance. Chem Senses 25: 9-19, 2000 58. Murikami K, Taniquichi H, Baba S, Presence of insulin-like immunoreactivity and its biosythesis in rat and human parotid gland. Diabetologia 22:358-361, 1982 59. Nagai K, Nishio T, Nakagawa H, Nakamura S, Fukuda Y, Effect of bilateal lesions of the suprachiasmatic nuclei on the circadian rhythm of the food intake. Brain Res 142:384-389, 1978 60. Nagatani S, Guthikondra P, Foster DL, Appearance of a nocturnal peak of leptin secretion in the pubertal rat. Horm Behav 37:345-352, 2000 61. Niall M, Ryan GB, O'Brien BM, The effect of the epidermal growth factor on wound healing in mice. J Surg Res 33:164-169, 1982 62. Nieuw Amerongen AV, Oderkerk CH, Bos-Vreugdenhil AP, Roukema PA, Secretory granules of murine salivary glands. A morphological, biochemical and morphological, biochemical and immunochemical study of submandibular and parotid granules. J Biol Buccale 10(1):11-30, 1982 63. Nishio T, Shiosaka S, Nakagawa H, Sakumoto T, Satoh K, Circadian feeding rhythm after hypothalamic knife-cut isolating suprachiasmatic nucleus. Physiol Behav 23:763-769, 1979 64. Noguchi S, Ohba Y, Oka T, Effect of salivary epidermal growth factor on wound healing of the tongue in mice. Am J Physiol 260:E620-625, 1991 65. Noguchi S, Ohba Y, Oka T, Influence of epidermal growth factor on liver regeneration after partiat hepatectomy in mice. J Endocrinol 128:425-431, 1991 66. O’Donnell MD, Fitzgerald O, McGeeney KF, Differential serum amylase determination by use of an inhibitor, and design of an routine procedure. Clin Chem 23:560-566, 1977 67. Olsen PS, Poulsen SS, Kirkegard P, Nexo E, Role of submandibular saliva and epidermal growth factor in gastric cytoprotection. Gastroenerology 87:103-108, 1984
48
68. Oxford GE, Tayari L, Barfoot MD, Peck AB, Tanaka Y, Humphreys-Beher MG, Salivary EGF levels reduced in diabetic patients. J Diabetes Complcations 14:140145, 2000 69. Pessa ME, Bland KI, Copeland ED, Growth factors and determinants of wound healing. J Surg Res 42:207-217, 1987 70. Proctor GB , Asking B, Garrett JR, Factors influencing the movement of rat parotid amylase into the serum of rats on feeding. Exp Physiol 75:709-712, 1990 71. Proctor GB, Asking B, Garrett JR, Serum amylase of non-parotid and nonpancreatic origin increases on feeding in rats and may originate from the liver. Comp Biochem Physio. 98B:631-635, 1991 72. Proctor GB, Asking B, Garrett JR, Effects of secretory nerve stimulation on the movement of rat parotid amylase into the circulation. Arch Oral Biol 34:609-613, 1989 73. Purushotam KR, Offenmuller K Bui AT, Zelles T, Blazsek J, Schultz GS, Humphreys-Beher MG, Absorption of epidermal growth factor occurs through the gastrointestinal tract and oral cavity in adult rats. Am J Physiol 269:G867-73, 1995 74. Raina S, Preston GM, Guggino WB, Agre P, Molecular cloning and characterisation of an aquqporin cDNA from salivary, lacrimal, and respiratory tissues. J Biol Chem 270:1908-1912, 1995 75. Rall LB, Scott J, Bell GI, Crawford RJ, Penschow JD, Naill HD, Coghlan RD, Mouse prepro-epidermal growth factor synthesis by the kidney and other tissues. Nature 313:228-231, 1985 76. Reidelberger RD, Varga G, Liehr RM, Castellanos DA, Rosenquist GL, Wong HC, Walsh JH, Cholecystokinin suppresses food intake by a nonendocrine mechanism in rats. Am J Physiol 267:R901-R908, 1994 77. Reidelberger R, Varga G, Solomon TE, Effects of selective cholecystokinin antagonists L364,718 and L365,260 on food intake in rats. Peptides 12:215-1221, 1991 78. Robinson CP, Cornellus J, Bounous DI, Yamamoto H, Humphreys-Beher MG, Peck AB, Characterization of the changing lymphocyta populations and cytokine expression in the exocrine tissues of autoimmune NOD mice. Autoimmunity 27:29-44, 1998 79. Ryan J, Mantle T, McQuaid CJ, Costigan DC, Salivary insulin-like growth factor originates from local synthesis. J Endocrinol 135:85-90, 1992
49
80. Saito M, Ibuka N, Decreased food intake of rats kept under adiurnal feeding cycles: effect of suprachiasmatic lesions. Physiol. Behav. 30:87-92, 1983 81. Sakaguchi T, Takahashi M, Bray GA, Diurnal changes in sympathetic activity. Relation to food intake and to insulin injected into the ventromedial or suprachiasmatic nucleus. J Clin Invest 82: 282-286, 1988 82. Sanders TG, Rutter WJ, Molecular properties of rat pancreatic and parotid alphaamylase. Biochemistry 11:130-136, 1972 83. Sarrero G, Leptak NM, Hayasi M, Goodrich SP, Impaired epidermal growth factor productioon in genetically obes ob/ob mice. Am J Physiol 264:E800-803, 1993 84. Schneyer CA, Humphreys-Beher MG, Effects of epidermal growth factor and nerve growth factor for isoproterenol induced DNA synthesis in rat parotid annd pancreas following removal of the submandibular/sublingual glands. J Oral Pathol 17:350-356, 1986 85. Scully C, Eckersall PD, Edmond RT, Boyle P, Beely JA, Serum alpha-amylase isoenzymes in mumps: estimation of salivary and pancreatic isozymes by isoelectric focusing. Clin Chim Acta 113:281-291, 1981 86. Shaw JF, Sweeney RJ, Cappuccino R, MellerF, Textbook of oral biology. WB Saunders Co. 1978 87. Steward MC, Seo Y, Murakami M, Seo JT, Larcombe-McDouall, Case RM, Regulation of cell volume and diffusion of intracellular water in salivary acinar cells. Eur J Morphol 36 Suppl:103-106, 1998 88. Takeuchi T, Matsushima T, Sugimura T, Kozu T, Takeuchi T, Takemoto T, A rapid, new method for quantitative analysis of human amylase isozymes. Clin Chim Acta, 54:137-144, 1974 89. Takeuchi T, Mura M, Sasaki R, Matsushima T, Sugimura T,Comparative studies on electrophoretic mobility and immunogenicity of pancreatic and parotid amylases of rat. Biochim Biophys Acta, 403:456-460, 1975 90. Thesleff I, Viinikka L, Saxen L, Lehtonen E, Perheentupa J, The parotid gland is the main source of human salivary epidermal growth factor. Life Sci 43:13-18, 1988 91. Tsutsumi O, Kurachi H, Oka T, A physsiological role of epidermal growth factor in male reproductive system. Science 233:975-977, 1986
50
92. Tsutsumi O, Taketani Y, Oka T, The urine growth promoting action of epidermal growth factor and its function in the fertility of mice. J Endocrinol 138:437-444, 1993 93. Turner RJ, Paulais M,Manganel M, Syng Lee, Moran A, Melvin JE, Ion and water transport mechanisms in salivary glands. Crit Rev in Oral Biol and Med, 4:385391, 1993 94. Watelet JB, Gevaert P, Bachert C, Holtappels G, van Cauwenberge P, Secretion of TGF-beta, TGF-beta2, EGF and PDGF into nasal fluid after sinus surgery. Eur Arch Otorhinolaryngol 259:234-238, 2002 95. Watson AZ, Anderson JK, Siminoski K, Mole SE, Murphy RA, Cellular and subcellular colonisation of nerv growth factor and epidermal growth factor in mouse submandibular glands. Anat Rec 213:365-376, 1985 96. Wellner R, Hoque AT, Goldsmith CM, Baum BJ, Evidence that aquaporin-8 is located in the basolateral membrane of rat submandibular gland acinar cells. Pfügers Arch, 441:49-56, 2000 97. Wijeyeweera RL, Kleinberg I, Arginolytic and ureolytic activities of pure cultures of human oral bacteria and their effects on the pH response of salivary sediment and dental plaque in vitro. Arch Oral Biol, 34(1):43-53, 1989 98. Yamaguchi R, Yano H, Iemura A, Ogasawara S, Haramaki M, Kojiro M, Expression of vascular endothelial growth factor in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 28:68-77, 1998 99. Yeh YC, Guh SY, Yeh J, Yeh HW, Transforming growth factor type alpha in normal human adult saliva. Molec Cell Endocrinol 67:247-255, 1989 100.
Zelles T, Purushotham KR, Oxford GE, Humphreys-Beher MG, Saliva and
growth factors: the fontain of youth resides in us all. J Dent Res 74:1826-1832, 1995 101.
Zelles T, Blazsek J, Tofalvi A, Effects of suramin a trypanocidal drog on the
rat parotid gland. Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde mit Zentralblatt 74:684-690, 1986 102.
Zelles T, Boros I, Varga G, Membrane srtetch and salivary glands – facts and
theories. Arch Oral Biol 44:S67-71, 1999
51
