Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30) snímek 1-2 prezentace 2 Z minulé přednášky: na konci jsme začali probírat náhradní elektrické schéma biologické membrány jako vodiče. Definovali jsme si membránu jako soubor kondenzátorů a odporů a začali jsme probírat některé její pasivní elektrické vlastnosti.
U
Pokud je v obvodu zapojen kondenzátor i odpor, podobně jako v případě, kdy je Ir zapojen jen kondenzátor, postupně s nabíjením kondenzátoru roste i napětí – napětí je v těchto obvodech také funkcí času. R a C jsou zapojeny paralelně. Ic Počáteční proud nabíjí kondenzátor rychlostí I/C. V okamžiku, kdy proud může projít kondenzátor dál (kondenzátor je nabitý), prochází také odporem. Tím klesá U (t) = I. R (1 – e –t/τ) podíl proudu nabíjejícího kondenzátor a následně všechen proud prochází jen odporem, při čemž je napětí U = I.R, a kondenzátor se nabíjí na tu samou hodnotu potenciálu. Po skončení pulsu náboj kondenzátoru klesá, prou opět protéká odporem a napětí se vrací k nule. Vzestup a pokles napětí zachycený na obrázku lze popsat exponenciální funkcí –t/τ U (t) = I. R (1 – e ), kde t je čas od nástupu (začátku pulsu) a τ je tzv. časová konstanta. Jinak řečeno, na konečnou (maximální) hodnotu napětí roste exponenciálně s časovou konstantou τ = R.C. Časová konstanta τ udává dobu, za kterou potenciál dosáhne 63% své výsledné hodnoty (1 – 1/e). Tak jako napětí roste a klesá exponenciálně, roste a klesá exponenciálně proud na rezistoru, Ir. Při vzestupu začíná na nule a následně dosáhne maximální hodnoty I. Proud na kondenzátoru, IC, začíná na hodnotě I a klesá se stejnou časovou konstantou jako Ir. Po skončení pulsu (když už není dodáván žádný proud zvenčí) jediný proud procházející obvodem pochází z vybíjejícího se kondenzátoru. Proudy Ir a IC musí tedy mít stejnou velikost a opačný časový průběh.
Typická hodnota časové konstanty τ se pohybuje mezi 1-20 ms; není závislá na průměru vlákna (vzrůst kapacity s plochou vyvolá adekvátní vzrůst odporu a celkový RC člen se nezmění). snímek 3 prezentace 2 Registrační
Aplikační
elektroda elektroda Podobně jako v elektrickém kabelu, není-li dokonal izolován, i při průchodu proudu membránou dochází k jeho ztrátám vlivem „netěsností“ (kanály, Axoplasma póry...). Představte si následující situaci: v určitém místě zavedete do vlákna elektrodu, kterou budete aplikovat napěťové pulsy. Jinou elektrodou budete rm rm rm rm v různých vzdálenostech do té první měřit, jak velký je v daném místě puls oproti pulsu U cm cm cm cm aplikovanému, tedy kolik proudu/napětí se při ri ri ri ri ri průchodu do dané vzdálenosti „ztratí“. Zjistíte, že U0 velikost pulsu směrem od aplikační elektrody klesá Um (obrázek vlevo v rohu), a to při ohledávání vlákna v obou směrech od aplikační elektrody. Tomuto x 0 x šíření proudu/napětí se říká šíření s úbytkem vzdálenost (dekrementem). Tento pokles je exponenciální a můžeme jej popsat matematicky – takže můžeme např. zjistit, jak velká bude napěťová změna v tom kterém místě od elektrody či jak daleko se může změna napětí ve vlákně účinně šířit.
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 Pokles napětí (U) v určité vzdálenosti x od aplikační elektrody na hodnotu Ux je dán vztahem , kde U0 je hodnota aplikovaného napěťového pulsu, tedy Ux = U0 (e –x/λ) maximální napěťová změna. Novou veličinou je délková konstanta λ. Délková konstanta λ udává vzdálenost od místa aplikace proudu, kde poklesne napěťová odpověď na 1/e, tj. 37% odpovědi v místě aplikace (U0). Její hodnota závisí na
λ2 =
• odporu vnějšího roztoku ro, • odporu membrány rm a • odporu uvnitř axonu či svalového vlákna ri.
rm ro + ri
snímek 4 prezentace 2 Toto je odvození délkové konstanty, zájemci se jím mohou prokousat sami – zkoušet vás z toho samozřejmě nebudu. Věnujte prosím pozornost poznámce o jednotkách (dole na snímku v rámečku). snímek 5 prezentace 2 Hodnota délkové konstanty závisí na odporu vnějšího roztoku ro, odporu membrány rm a odporu uvnitř axonu či svalového vlákna ri. Odpor vnějšího roztoku ro se běžně ve výpočtech zanedbává (neboť objem tohoto roztoku, ve kterém jsou při experimentech vlákna ponořena, je daleko větší, než objem vlákna určující jeho vnitřní podélný odpor; při měření v CNS je ovšem třeba brát ro na vědomí, protože axony, dendrity neuronů a gliové buňky jsou těsně u sebe a tok proudu v extracelulárním prostředí není tak neomezený), takže pak pro hodnotu délkové konstanty platí vztah
λ2 =
λ2 =
λ=
rm r o + ri rm ri
( ) rm ri
⇒
λ=
√
rm ri
½ [λ] = mm
Maximální napětí U0 je podle Ohmova zákona (U = I.R) úměrné velikosti aplikovaného proudu. Konstantou této úměrnosti je odpor, v případě vlákna tzv. vstupní odpor vlákna rinput. Je to v podstatě průměrná hodnota odporu axoplasmy a odporu povrchové membrány vlákna, naměřená při průtoku elektrického proudu do extracelulárního roztoku. Tento vstupní odpor vlákna tedy závisí na podélném odporu axoplasmy i na odporu membrány: rinput = 0,5 (rm ri) ½
[rinput] = Ω
Konstanta 0,5 je tam proto, že napěťová změna se šíří oběma směry od místa aplikace, obě části vlákna mají vstupní odpor úměrný (rm ri) ½. Vstupní odpor vlákna rinput a délková
2
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 konstatnta λ určují, jak velkou depolarizaci vyvolá dané množství aplikovaného proudu , a jak daleko se bude tato depolarizace vláknem šířit. Platí, že λ bude delší, když bude menší únik proudu přes membránu ven, t.j. čím větší bude rm (ať už zmenšením plochy membrány, nebo vyšším specifickým odporem – např. méně kanálů v membráně) a čím menší odpor proudu bude klást vnitřek axonu ri a okolí ro. Z naměřených hodnot vstupního odporu a délkové konstanty lze snadno vypočítat rm a ri : rm = 2 rinput × λ
a
ri = (2 rinput) / λ
- tedy specifické odporové charakteristiky cylindrického úseku axonu o délce 1 cm. Tato čísla nám ale neposkytnou příliš přesnou informaci o odporových vlastnostech membrány nebo axoplasmy, protože tyto vlastnosti závisí na průměru vlákna. 1 cm úsek membrány vlákna s malým průměrem může mít vyšší odpor membrány než 1 cm úsek vlákna s větším průměrem, protože menší vlákno bude mít menší povrch membrány. A nebo třeba naopak, vlákno menšího průměru může mít membránu hustěji osázenu iontovými kanály a tím stejný odpor membrány na 1 cm jako vlákno průměru většího. Proto se pro srovnání používají tzv. specifické odpory. snímek 6 prezentace 2 (A) Membrány rozdílných vláken lze srovnat pomocí jejich specifického odporu Rm. Tento odpor není závislý na geometrii membrány a umožňuje nám srovnávat membrány buněk různých velikostí a tvarů. U většiny neuronů je jejich Rm určen především jejich klidovou propustností pro sodné a chloridové ionty. Specifický odpor membrány Rm je odpor 1 cm2 membrány vlákna o poloměru a. 1 cm takového vlákna bude mít plochu 2πa cm2: rm = Rm / 2πa ⇒ Rm = 2πarm
[Rm] = Ω cm2
Průměrné hodnoty Rm se pohybují od méně než 1000 Ω cm2 (membrány s velkým množstvím kanálů) po víc než 50 000 Ω cm2 (membrány s málo kanály). (B) Axoplasmy rozdílných vláken lze srovnat pomocí jejich specifického odporu Ri. Je také nezávislý na geometrii (vnitřku) vlákna); je to vlastně měřítko, jak volně se mohou ionty pohybovat intracelulárním prostředím. Specifický odpor axoplasmy Ri je podélný odpor 1 cm délky axonu o poloměru a a o průřezu 1 cm2: ri = Ri / πa2 ⇒ Ri = πa2 ri
[Ri] = Ω cm
Specifický odpor axoplasmy závisí na teplotě a na koncentracích iontů v axoplasmě. Průměrná hodnota Ri axoplasmy obřího vlákna sépie je asi 30 Ωcm při 20°C, což je 107 krát více než u měděného drátu. Savci mají nižší koncentraci iontů v axoplasmě než hlavonožci,
3
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 jejich typický průměrný Ri je asi 125 Ωcm při 37°C. Žáby mají axoplasmatickou koncentraci iontů ještě nižší, jejich průměrný Ri se pohybuje okolo 250 Ωcm při 20°C.
Délková konstanta že λ závisí nejen na rm a ri, ale také na průměru vlákna či výběžku. V savčím nervovém systému se výběžky neuronů svým průměrem značně liší. Nejtenčí výběžky (distální úseky dendritů, krčky některých dendritických trnů nebo cilie některých sensorických buněk) mohou mít průměr 0,1 µm i menší (cca po 0,02 µm), zatímco axony nebo velké dendritické kmeny mohou dosahovat průměru až 20-25 µm – což představuje rozdíl zhruba tří řádů. Závislost délkové konstanty λ na průměru vlákna d udává vztah
λ=
√
Rm . d
d = 4 µm
λ= 1
Ri . 4 d = 16 µm
λ= 1
Vzhledem k tomu, že λ závisí na odmocnině z průměru, desetinásobná změna průměru vede jen k cca trojnásobné změně v hodnotě délkové konstanty.
snímek 7 prezentace 2 Všechny tyto parametry se souhrnně sdružují pod označení pasivní elektrické vlastnosti vláken. Analýzou pasivního toku proudu (v podmořských kabelech) se zabýval prvně lord Kelvin kolem roku 1850. Jeho práci později upravil Oliver Heaviside a byla známa jako kabelová teorie. Na nervová vlákna ji prvně použili Hodgkin a Cole s Rushtonem ve 20. a 30. letech minulého století, když měřili extracelulárně šíření proudu podél humřího axonu. Z čistě matematického hlediska je kabelová teorie poněkud nepraktická, neboť těžce pracuje s komplexitou dendritického stromu neuronu; tyto problémy poněkud odstraňuje tzv. kompartmentový model, stále zpřesňovaný od 60. let minulého století. Dnešní softwarové balíčky už umožňují poměrně přesné modelování elektrotonického šíření vzruchů, ať už přechodných, nebo stále aplikovaných podnětů. šíření napětí
V/V0
Na obrázku vlevo vidíte elektrotonické šíření napěťové změny vyvolané aplikací stálého pulsu v místě I. Na ose y je poměr amplitudy tohoto pulsu oproti maximu v různých místech od místa aplikace (označeno písmenky). Díky rostoucímu větvení v místech C-1 a C-2 dochází k větším kapacitním ztrátám (musí se nabít větší plocha membrány) a tím poklesu amplitudy oproti aplikovanému pulsu.S těle neuronu (soma, S) je pak vyvolaná napěťová změna už velmi malá, zejména díky nízkému vstupnímu odporu somatu a velkým kapacitním ztrátám v dendritických větvích.
vzdálenost x/λ
4
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 K čemu je to dobré? Pro je pro vznik a šíření signálu ve vzrušivé tkáni užitečné znát různé pasivní (elektrické) charakteristiky membrány? 1) Akční potenciál (AP) vzniká jen ve vzrušivé části membrány, ne na membráně vstupní. Na membráně vstupní se akumulují různé vstupní podněty (příspěvky excitačních synapsí na dendritech neuronu, bolestivé podněty na nociceptorech a pod.), které vyvolají drobnou depolarizaci. Ta se elektrotonicky šíří dál až ke vzrušivé membráně. Aby mohl vzniknou AP, musí se tato depolarizace dostat co nejdále s co nejméně zmenšenou amplitudou. Délková konstanta λ udává vzdálenost od místa aplikace proudu, kde poklesne napěťová odpověď na 1/e, tj. na 37% odpovědi v místě aplikace (U0). Jinými slovy, λ určí, v jaké amplitudě se určitý vstup dostane ke vzrušivé membráně. Je tedy žádoucí, aby byla hodnota λ co největší a napěťová změna se dostala v co největší amplitudě co nejdále od místa svého vzniku. Hodnota λ je přímo úměrná „děravosti membrány“, odporu membrány rm, a průměru vlákna a. snímek 8 prezentace 2 2) Určitý neuron má za různých fyziologických situací různé vzorce aktivity; salva AP závisí na velikosti napětí a době trvání napětí. Délková konstanta určí, v jaké amplitudě se určitý vstup dostane ke vzrušivé membráně. Když impuls na dané místo dorazí, nevyvolá AP hned, ale až po době, která závisí na časové konstantě – membrána se musí nejprve nabít jako každý kondenzátor Časová konstanta τ udává dobu, za kterou potenciál dosáhne 63% své výsledné hodnoty (1 – 1/e). Časová konstanta τ je tedy mírou toho, jak velké proudy tekou v daném místě membrány. Se vzdáleností od místa vzniku klesá amplituda podnětu. Příspěvek synapse vzdálenější od iniciálního segmentu je menší než příspěvek synapse ležící blíže, pokud obě produkují podnět stejné maximální amplitudy a pokud má membrána všude stejné elektrické vlastnosti. axon končící excitačními synapsemi
U synapsí na těle neuronu je žádoucí, aby τ byla co nejdelší – jen tak může dojít k časoprostorové sumaci (podnět vyvolá nějakou depolarizaci, která nějakou dobu dosahuje svého maxima a stejně dlouhou dobu odeznívá – tato doba musí být dost dlouhá, aby mohlo docházet k sumaci (vlevo je zjednodušené schéma časové sumace).
akční potenciál akční potenciál neuron
MP (mV)
EPSP
AP
4 EPSP
Při stále aplikaci podnětu o téže síle (velikosti amplitudy) se po době = τ zase opakuje vznik AP. Při aplikaci podnětu o vyšší síle vznikne další AP za zlomek τ. Při stálé aplikaci tohoto silného podnětu zase vznikne další AP za stejný zlomek τ ⇒ frekvence AP závisí na síle podnětu (vzrůst
akční potenciál (AP)
AP
5
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 intenzity podnětu má za následek vzrůst frekvence vzniku AP). snímek 9 prezentace 2 Z potřeby co nejvyšší hodnoty délkové konstanty λ vyplývají dvě strategie pasivního šíření impulsu podél axonu:
⇒ snížení vnitřního odporu axoplasmy ri zvýšením průměru vlákna. Touto cestou se vydali např. hlavonožci: obří vlákno sépie má λ až 13 mm (tj. pokles amplitudy vzruchu na cca 1/3 až ve vzdálenosti 13 mm od místa jeho vzniku). ⇒ nebo zvýšení membránového odporu rm – např. myelinem jako vydatnějším isolantem, než je „jen“ membrána. Výhody myelinizace Myelin je složitá lipidicko-proteinová substance produkovaná gliovými buňkami (termín glie pochází z roku 1859 od Rudolfa Wirchowa, znamená v podstatě „spojovací tkáň“ – nerve glue). Na periferii je myelin syntetizován Schwannovými buňkami, v CNS oligodendrogliemi. Oligodendrocyty (OL, vlevo) obalují svými výběžky více neuronů (uvádí se, že v průměru jeden oligodendrocyt „omotá“ axony až 35 neuronů, jsou ale autoři, kteří uvádějí i vyšší počty). Důvod je prostý: produkce myelinové pochvy jedním OL a následné odstranění cytoplasmy mezi vrstvami membrán pro větší počet neuronů výrazně snižuje prostorové nároky; kdyby jeden OL obaloval jeden neuron, zabraly by oligodendrocyty veliké množství nonneuronálního prostoru, který může být v mozku „obydlen“ např. právě neurony či jinými (trofickými aj.) buňkami. Na periferii je poměr glie/axon jiný: jedna Schvannova buňka obaluje část axonu (vpravo máte schéma „rozbalené“ Sch. b. a obalovaného axonu; všimněte si poměru velikosti axonu a obalující buňky. Kolmé kanály v Sch. b. jsou cytoplasmatické tunýlky, které zůstávají funkční i ve „srolované“ Sch. b. a slouží k výměně materiálu mezi myelinem, cytoplasmou Sch. b. a zřejmě i axonem neuronu).
Proteinové složení myelinu v CNS a PNS se liší, ačkoliv obecně má periferní i centrální myelin vysoký poměr lipidy:proteiny, a lipidy jsou vysoce specializované. 6
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2
• Centrální myelin obsahuje zásaditý myelinový protein (MBP) a proteolipidický protein (PLP). MBP (respektive rodina MBP proteinů) je bohatý na kladně nabité zbytky lysinu a argininu. Tím je přitahován k obecně záporně nabitému P-listu membrány; může do ní i zapouštět N-konec a stabilizovat ji tak. P0 je člen superrodiny zahrnující Ig, CAM aj. Jeho extracelulární doména je podobná Ig a interaguje s toutéž doménou P0 v sousední membráně. • Periferní myelin obsahuje MBP a protein nula (P0). P0 je člen superrodiny zahrnující Ig, CAM aj. Jeho extracelulární doména je podobná Ig a interaguje s toutéž doménou P0 v sousední membráně. P0 má poměrně jednoduchou strukturu jedinou Ig doménou, transmembránovým segmentem a vysoce basicky nabitou cytoplasmatickou doménou. Tvoří až 80% proteinového obsahu periferního myelinu. Interakce mezi extracelulárními Ig doménami jsou velmi pravidelné a dobře patrné ne ultratenkých řezech pod elektronovým mikroskopem – tvoří zónu, které se říká intraperiod line. Nabitá cytoplasmatická doména zřejmě neutralizuje náboje na hlavičkách fosfolipidů membrány, takže jednotlivé vrstvy membrány se mohou přiložit těsně k sobě a neodpuzují se elektrostaticky - P0 působí „zkompaktnění“ membrán. P0 je zajímavě evolučně distribuován – např. ryby ho mají v CNS i PNS, zatímco suchozemští obratlovci jen v PNS. V CNS těchto obratlovců zřejmě jeho funkci „zkompaktňovadla“ přebírá jiná molekula, protein DM-20 a jeho inserční isoforma PLP (myelin proteolipid protein). S mutacemi v genech pro tyto proteiny souvisí skupina velice zajímavých chorob – dědičných periferních neuropatií. Mezi nejznámější patří Charcot-Marie-Toothova choroba (CMT desease) způsobená mutací genu pro protein P0. Dále sem patří různé shaker či trembler mutace – obecně se tyto neuropatie projevují motorickými problémy. Zajímavé jsou rovněž autoimunitní ataky organismu proti těmto proteinům, vedoucí mj. k růxným formám myastenií. Oba myeliny pak obsahují další menší proteiny, nejzajímavější z nich je asi s myelinemasociovaný glykoprotein (MAG). Pamatujte si, že myelin není mrtvá vrstva „sádla“ – je to vysoce dynamická struktura, v níž probíhají poměrně intenzívní metabolické a transportní děje. snímek 10 prezentace 2 Z průřezu obaleného axonu zaujímá myelinová pochva zhruba 20-40%, zbylých 60-80% axon. Je třeba zachovat určitou limitní tloušťku myelinové pochvy, ačkoliv logika napovídá, že čím tlustší vrstva izolantu, tím lepší vedení. Ideální je, když z celkového průměru myelinizovaného vlákna zabírá samotný axon 70%. Kdyby myelinová pochva tvořila např. 95% průřezu vláknem, vzrůst vnitřního podélného odporu axoplasmy tenoučkého axonu by byl tak veliký, že by ve výsledku potlačil výhody myelinizace – rychlost vedení by poklsla, resp. nevzrostla tak výrazně. Pochvy mohou mít různou tloušťku, v průměru od 10 do 160 otáček. Celkově může být axon obalen až 320 membránami, které zvyšují odpor jeho membrány a snižují její kapacitu. Jednotlivé myelinizované segmenty axonu tvoří tzv. internodia o průměrné délce 300-2000 µm. Tato internodia jsou oddělena Ranvierovými zářezy (nody) širokými asi 2 µm. Savčí myelinizované axony se liší strukturou těchto zářezů – v PNS jsou překryty bazální membránou, kdežto v CNS jsou holé a mohou na nich končit např. nožky astrocytů či jiných 7
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 glií. V Ranvierových zářezech jsou velmi hustě natěsnány zejména napěťově ovládané sodíkové kanály(s hustotou až 10 000 na 1 µm2) či Na+-K+ ATPpasa. Mezi hlavní výhody myelinizace patři mj. to, že
• rychleji vedoucí myelinizovaná vlákna umožní vznik složitějších živých organismů schopných rychlejší lokomoce apod.; hlavonožci si mohou dovolit využívat tzv. obří vlákna, u kterých roste rychlost vedení s průměrem, ale např. suchozemských obratlovců už by to byla slepá ulička, protože dostatečný počet takových vláken, aby zajistil naše funkce, by se do nás prostě nevešel; • na nemyelinizovaném vlákně tekou ionty sodíku dovnitř a draslíku ven po celé délce vlákna, což může při dlouhodobější stimulaci vést ke změnám koncentračních poměrů (u myelinizovaných vláken se tak děje jen v Ranvierových zářezech); myelin navíc „drží“ Na+ IKs a pumpu v místě nodu a takto koncentrované kanály vyvolají masivnější lokální změny; • u myelinizovaných vláken netřeba po průchodu akčního potenciálu tolik energie na přečerpávání Na+/K+ vzhledem k původní distribuci (snížení spotřeby ATP) Myelinizace velmi výrazně ovlivňuje rychlost vedení vlákna. V nervovém systému obratlovců jsou periferní myelinizovaná vlákna dělená podle rychlosti vedení a funkce do skupin snímek 11 prezentace 2 Rychlost vedení v myelinizovaných vláknech se pohybuje od několika m/s po víc než 100 m/s. Světový rekord drží myelinizované axony krevet, které vedou rychlostí až 200 m/s. Díky myelinizaci roste membránový odpor a klesá kapacita membrány (čím tenčí vrstva izolantu, tím větší kapacita, neboť jsou větší síly přitahující opačné náboje), čímž se postup vzruchu „nezdržuje“ nabíjením membrány, a navíc je vzruch veden tzv. saltatorně (z latinského saltare, skákat). U nemyelinizovaných vláken je jedinou cestou, jak zvýšit rychlost vedení, zvýšit průměr vlákna, a tím snížit vnitřní odpor axoplasmy ri: ri závisí na průměru vlákna (ri = Ri / πa2). Rychlost vedení RV v nemyelinizovaných vláknech je přímo úměrná druhé odmocnině z axiálního (podélného) odporu vlákna ri a tím i druhé odmocnině z průměru vlákna D (D... diameter), zatímco rychlost vedení RV v myelinizovaných vláknech je přímo úměrná průměru vlákna D: Myelinizovaná vlákna
Nemyelinizovaná vlákna
RV = k . D
RV
RV
RV = k .
ri
resp.
k = 4,5 pro vlákna menší než 11 µm k = 6 pro vlákna větší než 6 µm
RV = k .
D = D½
D
D Rychlost vedení zruchů vs. průměr vlákna
Obě vynesení se protnou v 1 ( 1µm) ⇒ nemyelinizovaná vlákna s průměrem pod 1 µm vedou rychleji, tj. vlákna s průměrem pod 1 µm jsou u obratlovců zásadně nemyelinizovaná.
RV… rychlost vedení D… průměr axonu RV 1 µm D
8
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2
Rychlost vedení ovlivňuje nejen poměr šířky myelinové pochvy axonu (viz výše), ale i optimální délka internodií. Ta by měla být cca 100krát větší než vnější průměr vlákna. teoreticky, čím delší intenodium, tím rychlejší saltatorní vedení; prakticky by ale s neúměrným nárůstem délky internodia značně rostl podélný odpor. Depolarizace vyvolaná aktivitou v předchozím R. zářezu by tak měla menší efekt v zářezu následujícím (její amplituda by byla nižší a rostla by pomaleji), čímž by rychlost vedení klesla a tato výhoda myelinizace by byla ta tam... snímek 12 prezentace 2 Šíření akčního potenciálu tedy probíhá saltatorně podél axonu; AP musí procházet střídavě úseky internodií a (Ranvierových) zářezů. „Zdržení“ AP mezi jednotlivými zářezy (doba, za jak dlouho AP „přeskočí“ přes inernodium od jednoho zářezu k následujícímu) je zhruba 20 µs. Podstatou šíření akčního potenciálu (AP) jsou tzv. lokální proudy. Jde o toky iontu od místa vzruchu. Směr toku může být antidromní (zpáteční) nebo orthodromní (dopředný); na vzrušivých membránách je podstatou propagace AP tok dopředný (membrána je v místech, kudy už AP prošel, dočasně nevzrušivá – viz specifické chování napěťově ovládaných Na+ iontových kanálů, pčředstavované tzv. chain-and-ball modelem). Tyto lokální proudy musí protékat přes membránu. V meylinizovaných vláknech mohou ionty protékat skrze membránu jen v Ranvierových zářezech. Změní se iontové koncentrace sodíku a draslíku. V axoplasmě tedy dojde k přesunu iontů směrem od místa vzruchu, ale extracelulárně se to může projevit jen v neizolované části – zářezu. Tam dojde k odpovídajícímu toku iontů přes membránu, a tedy k depolarizaci membrány. Akční potenciál „přeskočí“ izolovanou oblast a stejným způsobem se šíří k dalšímu zářezu. Není třeba otevírat kanály po celé délce membrány vlákna. Tomuto způsobu propagace AP se říká saltatorní vedení. Můžete namítnout, že lokální proudy se mohou šířit (různými směry) i na +++ +++ --nemyelinizovaých vláknech. To je --+++ --pravda. Výhoda myelinizace je ovšem skryta v délkové konstantě λ: na ní závisí vzdálenost, do které tyto lokální proudy rm ½ λ= „doběhnou“. Čím vyšší odpor membrány, ri tím dále se lokální proudy rozšíří s rozumnou amplitudou. Příčný odpor rm myelinizované membrány je asi o čtyři rády vyšší než příčný odpor neurilemy (membrány obalující holý nemyelinizovaý axon) samotné. Délková konstatnta tedy analogicky s myelinizací roste. Jen znovu připomínám, že i intenzita myelinizace má z určitých důvodů své limity (viz výše), i když nám spolu se vzrůstem rychlosti vedení opravdu ušetří i dost místa:
( )
- největší vlákna v lidském těle mají průměr okolo 20 µm - vlákno hlavonožce o průměru 0,5—1,0 mm – 20 m/s - vlákno obratlovce o průměru 20 µm – 120 m/s ⇒ plocha tohoto vlákna by se vešla do průřezu vlákna hlavonožce 2500x
9
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2
snímek 13 prezentace 2 Souhrnně, myelinizace zvyšuje rychlost vedení myelinizovaných vláken obratlovců několika způsoby:
• prodlužuje délkovou konstantu a tím pasivní elektrotonické šíření lokálních proudů • zvyšuje amplitudy lokálních proudů v místě Ranvierových zářezů • napomáhá pufrování vtoku a výtoku iontů v nodiích a paranodiích (oblastech těsně přiléhajících k zářezům), protože „drží“ na místě Na+-K+ pumpy. Nastavení a udržení klidového membránového potenciálu napomáhají i draslíkové kanály, lokalizované v paranodální oblasti. Při akčním potenciálu šířícím se podél vlákna o průměru 12 µm by dovnitř vlákna vtekla až 3% sodných iontů v blízkosti membrány. Tím by byla neúnosně zatížena Na+/K+ ATPasa, pokud by se tak dělo podél celé délky vlákna. Běžná transportní kapacita Na+/K+ ATPasy je asi 200 iontů Na+ přenesených za sekundu z buňky. Ačkoli tento enzym pracuje za běžných okolností v dolní části svých možností, při rychlé a dlouhé salvě APs by takový tok iontů nezvládl. Proto se tak děje jen na malé ploše membrány v Ranvierových zářezech, kde je Na+/K+ ATPasa silně akumulována. Sodné ionty se také pufrují tím, že jsou transportovány axoplasmou mezi nody. Bezobratlí využívají faktu, že povrch roste s první mocninou poloměru, zatímco objem s druhou. Vlákna s velkým průměrem mají velký objem. Takže ačkoliv axon o průměru 600 µm může mít koncentraci sodíkových kanálů až 500 na 1µm2 sarkolemy, při akčním potenciálu vteče dovnitř vlákna podél celé jeho membrány sice mnoho sodných iontů, ale vzhledem k objemu axoplasmy to představuje zvýšení intracelulární koncentrace Na+ o jen asi 0,01% .
snímek 14 prezentace 2 Dále bychom se měli věnovat membránové teorii bioelektrických jevů. Převážnou část s vámi měl probrat dr. Krůšek, takže jen pár slov k celkovému pozadí: Při přemýšlení o jednotlivých vztazích se vraťte k základům elektrostatiky a k úplným začátkům termodynamiky. Vycházejte zejména z práce vykonané při přenosu náboje do libovolného místa a z parciální Gibbsovy volné energie. Gibbsova (volná) energie G (Josiah Willard Gibbs, 1878) je vlastně termodynamický potenciál, který je funkcí více proměnných: teploty, tlaku a chemického složení soustavy (G = H – TS, kde H je entalpie, T termodynamická teplota a S entropie). Vzhledem k tomu, že jde o funkci více proměnných, hodí se znát definici.e úplného (totálního) diferenciálu: Jestliže funkce f(x1, x2...xn) je funkcí několika nezávisle proměnných veličin (např. v tomto případě teploty T, tlaku p a látkového množství n) x1, x2...xn, je její totální diferenciál definován pomocí parciálních derivací (δf/δxi)i=1,2...n a diferenciálů nezávislých proměnných dx1,dx2,...dxn takto: n
df = Σ ( i=1
δf ) dxi δxi
10
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 kde i = např. 3 koordináty v našem trojrozměrném prostoru nebo tři proměnné u Gibbsovy volné energie (T, p a n). Totální diferenciál Gibbsovy energie G = G(T,p,ni) je podle této rovnice
δG ) dx + ( δG)T,ni dp + Σ ( δG)p,T,nj≠i dni dG = ( p,n δni δT δp j
i=1
(kde i je počet nezávisle proměnných, pořadové číslo, j je uvažovaná chemická látka, třeba iont). Když je p a T konstantní, derivace konstanty je nula. Pro zbylý třetí člen δG/δni při T,p,nj zavedl Gibbs termín chemický potenciál µ. Tato veličina vyjadřuje, jak by se změnila Gibbsova volná energie se změnou látkového složení, jmenovitě s koncentrací jedné z látek v reakci (i) tak, aby přitom T,p,nj zůstaly konstantní. Chemický potenciál iontů, tj. elektricky nabitých částic, se označuje jako potenciál elektrochemický. Situace je podobná jako u chemického potenciálu, ale často složitější, protože elektrochemický potenciál vzniká také v důsledku osmotické a elektrické práce, spojené s přenosem i-tého iontu z prostředí I do prostředí II. (Potenciál nezměříte, ale dá se vyjádřit právě pomocí při přenosu vykonané práce. Pokud bychom chtěli z fáze I vyprostit 1 mol iontů a nekonečně jej naředit -tedy analogie přenosu 1 molu elementárního náboje do nekonečna-, museli bychom vynaložit práci nejen na překonání chemických vazebných sil -tu vyjadřuje chemický potenciál-, ale taky práci na překonání sil elektrických. Celkovou vykonanou práci nazval E.A. Guggenheim elektrochemický potenciál. Ve fyzice tuhého stavu se elektrochemický potenciál elektronu nazývá Fermiho energie.) Obě prostředí jsou oddělena
nějakým rozhraním. Ve fyziologii je nejčastějším rozhraním buněčná membrána. membrána
~ µiI = µ0i + RT ln [xi]I + niFψI
roztok I koncentraci iontů [xi]I ~ µiI
~ µiII = µ0i + RT ln [xi]II + niFψII
~ ∆µ i
roztok II koncentraci iontů [xi]II ~ µiII
~ ∆µiI
je elektrochemický potenciál roztoku I. Analogicky můžeme definovat elektrochemický potenciál iontu xi v prostředí roztoku II. Pokud je soustava ve stavu rovnováhy, platí, že elektrochemické potenciály obou roztoků jsou si rovny (jejich rozdíl je roven nule). Jejich rozdíl pak lze vyjádřit ~ = RT ln [xi]II + nF∆ψ ∆µ i [xi]I
, kde [xi] je koncentrace (obecného) iontu xi v roztocích I a II, F je Faradayova konstanta (náboj jednoho molu elektronů , asi 96 000 coulombů/mol), a n (nebo někdy z) je valence iontu (např. n=+1 pro K+ a -1 pro Cl-). ~ ∆µi
je tedy určen dvěma členy. První, logaritmický člen, je odvozen z difusní (osmotické) práce, druhý představuje práci elektrickou, přesun určitého množství nábojů z jednoho do druhého roztoku. 11
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2
∆Ψ je rozdíl potenciálů na obou stranách membrány ve voltech – tedy membránový potenciál. snímek 15 prezentace 2 Ionty mohou z jedné strany membrány díky klidové propustnosti difundovat na druhou, v závislosti svém na elektrochemickém gradientu. Při dosažení hodnoty klidového membránového potenciálu (nebo rovnovážného potenciálu pro jediný iont v prostředí) je tok iontů nulový. Po ustavení klidového membránového potenciálu je difúze iontů do a ven z buňky v rovnováze, takže elektrogenní tok iontů je (teoreticky) nulový. Tok iontů lze popsat pomocí 1. Fickova zákona, který po zahrnutí elektrické složky přechází v Nernstovu-Planckovu rovnici: dnj dt
= Jj = - SDj
d[j]
Jj = - SDj (
dx
d[j] dx
zjFj [j] RT
dΨ ) dx
Po ustavení klidového membránového potenciálu a za nulového elektrogenního toku iontu přechází Nernstova-Planckova rovnice v rovnici Nernstovu:
∆ψj =
RT nF
ln
[j]out [j]in
∆Ψ je tedy potenciál(ový rozdíl) mezi vnitřkem a vnějškem buňky za stavu, kdy přes membránu neteče žádný difusní proud. Říká se mu též ROVNOVÁŽNÝ POTENCIÁL (s patřičným indexem pro ten který iont: K+ ionty ⇒ EK). EK =
RT nF
ln
[K+]out [K+]in
Pamatujte si, že Nernstova rovnice zohledňuje elektrický potenciál na permeabilní membráně, která odděluje ionty o různých koncentracích na obou stranách. Biologické membrány ovšem volně permeabilní nejsou, takže hodnotu klidového membránového potenciálu přesněji definují jiný/é vztah/y. snímek 16 prezentace 2 Na ionty působí dvě zásadní síly, které ovlivňují jejich distribuci: síly elektrické, které je nutí pohybovat se ve směru jejich elektrického gradientu, a síly chemické, které je nutí pohybovat se ve směru jejich chemického gradientu.
12
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2
chem el.
vně buňky
out
uvnitř buňky
Na+ in
117 Na+ 3
K+
+
12
-
108 out
120 Cl0 A-
+
-
+++
4
x PNa = ---
+++
K+
116
in
-60 mV
tj.
x PK =
--+++
Klidový mem. potenciál je výsledkem vtoku Na+, výtoku K+ a činnosti Na+/K+ ATPAsy.
out
x PCl =
Clin
---
Proč ionty nedifundují přes membránu tak, aby se jejich koncentrace na obou stranách vyrovnaly (pomineme-li s výjimkou K+ nevalnou propustnost membrány)? Např. K+: ven by „chtěl“ po svém koncentračním gradientu. Když ale difunduje ven z buňky, na vnějším povrchu membrány se zvyšuje akumulace kladného náboje a na vnitřní akumulace náboje záporného. Roste transmembránové napětí. Tento elektrický gradient zpomalí výtok kladně nebitých iontů K+ z buňky, a když je gradient dostatečně velký, čistý tok K+ přes membránu se zastaví úplně. Ionty draslíku jdou v rovnováze. Jednotlivé ionty sem a tam občas procházejí, ale čistý tok K+ je nulový. snímek 17 prezentace 2 Hodnota membránového potenciálu je dána transmembránovou distribucí různých iontů. Oproti rovnici Nernstově se při jeho výpočtu uplatňuje další vztah, který zahrnuje konstantu propustnosti pro dané ionty. Účast jednotlivých iontů na výsledném klidovém membránovém potenciálu (Em) je dána nejen poměrem koncentrací, ale poměrem jejich propustností, což vyjadřuje komplexní Goldman-Hodgkin-Katzova rovnice (nazývána také rovnice konstantního pole, neboť předpokládá, že gradient elektrického potenciálu na membráně se nemění), v níž jsou zavzaty poměrné propustnosti P jednotlivých iontů, vztažené k PK = 1: Em =
RT nF
nebo při převodu dekadický Em = 58 log
ln
PNa [Na+]o + PK [K+]o + PCl [Cl-]i PNa [Na+]i + PK [K+]i + PCl [Cl-]o
PNa [Na+]o + PK [K+]o + PCl [Cl-]i
na logaritmus
PNa [Na+]i + PK [K+]i + PCl [Cl-]o
13
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 Např. pro obří vlákna sépie jsou propustnosti pro Na+ (PNa=PNa/PK), K+ (PK=PK/PK) a Cl(PCl=PCl/PK) následující: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,5 Je zřejmé, že klidová propustnost pro Na+ je zpravidla 25× (1:0,04) až 100× (1:0,01) nižší než pro K+ (jen nepatrný počet Na+ kanálů se v klidu náhodně otevírá). Pro Cl- je propustnost membrány obřího vlákna sépie asi poloviční. Tvar GHK rovnice, uvedený výše, je -rigorózně pojato- tvarem zahrnujícím nikoliv relativní (poměrné), ale absolutní propustnosti iontů Px. Uvedla jsem ho tak záměrně, protože jste se s ním setkali přinejmenším na přednášce fyziologie prof. Vyskočila; nevím, jak na neurobiologii. Absolutní propustnosti nejsou bezrozměrná čísla, ale udávají tok určitého iontu přes membránu v jednotkách vzdálenost za čas. Např. pro tok iontů přes membrány neuronů v naší CNS platí zhruba tyto hodnoty absolutní propustnosti: PK = 1 × 10-7 cm.s-1, PNa = 1 × 10-8 cm.s-1, PCl = 1 × 1087 cm.s-1. V praxi se ale častěji počítá právě s propustností relativní, tedy s absolutní propustností pro daný iont vztaženou k absolutní propustnosti pro iont, který nejsnáze prochází přes membránu (draslík). V rovnicích se tyto relativní propustnosti značí různě, často jen různými písmenky (b, c) pro různé ionty. Výše máte ale všechno označeno „Px¨. snímek 18 prezentace 2 Konečné koncentrační složení na obou stranách membrány je řízeno, doladěno tzv. Donannovou rovnováhou. Důležitou roli při ustavení klidového membránového potenciálu hrají chloridové ionty. Hodnotu jejich rovnovážného potenciálu vyjádříme jako
ECl =
RT nF
[Cl-]in
ln
[Cl-]out
, a protože valence chloridových aniontů je záporné číslo (z = -1), do čitatele se dosazují intracelulární koncentrace chloridů, do jmenovatele koncentrace extracelulární. Pro dekadický logaritmus pak platí ECl = -58 log [Cl-]o/[C-]i neboli díky pravidlům logaritmování ECl = +58 log [Cl-]i/[Cl-]o. Při srovnatelně stejně vysokých propustnostech klidové membrány pro Cl- a K+ platí v ekvilibriu rovnost příspěvku obou iontů (EK = ECl): RT F
ln
[K+]out [K+]in
=
-
RT F
ln
[Cl-]in [Cl-]out
Tato rovnice vyjadřuje rozdíl (membránových) potenciálů obou iontů, který je důsledkem vzniku elektrické dvojvrstvy na rozhraní obou roztoků s rozdílnými koncentracemi iontů. Z této rovnice vyplývá základní podmínka membránové rovnováhy: po zjednodušení dostáváme vztah známý jako Donnanova rovnováha [K+]o × [Cl-]o = [K+]i × [Cl-]i
14
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 Úlohu Donnanovy rovnováhy si rozebereme na modelové buňce. snímek 19 prezentace 2 Koncentrace iontů v okolí buňky se mohou velmi snadno měnit (vzpomeňte si třeba na šířící se kaliovou depresi v mozkové kůře). Jak to ovlivní hodnotu membránového potenciálu? Uvažujme modelovou buňku, obsahující ionty sodíku, draslíku, chloridy a velké záporně nabité částice (budeme igrnorovat vápník, hořčík a všechno ostatní). Membrána této buňky je propustná pro draslík a chloridy, ne však pro sodík a záporně nabité částice. Aby taková buňka byla ve stabilním stavu, -
její vnitřní i vnější prostředí musí být elektricky neutrální (stejný počet kladně i záporně nabitých částic v obou prostředích) musí být v osmotické rovnováze (stejný počet osmoticky aktivních částic na obou stranách membrány) v klidu neexistuje žádný (čistý) pohyb žádného iontu na různé strany membrány.
vně buňky
117 Na+ 3 K+ 120 Cl0 A-
uvnitř buňky
+
30
-
+
90
-
4 116
-85 mV
Koncentrace jednotlivých iontů naší modelové buňkyjsou v mM a dávají výsledný membránový potenciál –85 mV. Rovnovážné potenciály K+ i Cljsou shodné (poměr koncentrací na extra/intracelulární straně membrány je pro oba ionty 1:30). U neuronů a mnoha jiných typů buněk je klidový membránový potenciál citlivý na změny extracelulární koncentrace draselných iontů, ale ne chloridů. Proč?
snímek 20 prezentace 2 Využijeme opět naši modelovou buňku. Předpokládejme také, že objem extracelulárního roztoku je nekonečně velký, takže pohyby iontů i vody z buňky a do buňky složení extracelulárního prostředí v podstatě neovlivní. vně buňky
114 Na+
Co se stane, když v extracelulárním prostředí zvedneme koncentraci draslíku na dvojnásobek?
uvnitř buňky
+
-
29
dvojnásobná [K+]out
3 mM NaCl byly nahrazeny 3 mM KCl (nezmění se celková osmolarita ani 7,9 120 Clkoncentrace chloridů). Vzrůst [K+]out + 0 A112,1 sníží koncentrační gradient zodpovědný za výtok draslíku (černá šipka), ale -68 mV; rel. obj. 1,035 elektrický gradient je zpočátku nezměněný. Dovnitř buňky začne vtékat draslík a snižovat záporný náboj na vnitřní straně membrány. Ta se depolarizuje a tím se změní rovnovážný potenciál pro chloridy. Chloridy začnou také vtékat do buňky. Tento vtok 6
K+
91
15
[email protected]
Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30), prezentace 2 trvá až do doby, než se ustanoví nová rovnováha iontů a nový membránový potenciál –68 mV. Výsledná intracelulární koncentrace draslíku pak bude 91 mM a chloridů 11,1 mM. Díky vtoku vody se zvětší objem buňky o 3,5%. K+ i Cl- vyteče stejné množství, ale výsledná změna koncentrace vypadá vyšší pro chloridy. Není to tak. Trik je ve změně objemu buňky. Kdyby zůstal stejný, byla by konečná koncentrace Cl- 8,2 (ne 7,9) mM, ale K+ 94,2 (ne 91,0) mM. Obě tyto změny by při stejném objemu buňky představovaly shodnou změnu 4,2 mM oproti původním stavu.
vně buňky
114 Na+
uvnitř buňky
Co se dále stane, když v extracelulárním prostředí snížíme koncentraci chloridů o polovinu?
30,5
60 mM chloridů bylo nahrazeno 60 mM membránou neprocházejícího aniontu (nezmění se osmolarita ani koncentrace draselných iontů). Pokles [Cl-]out zvýší koncentrační gradient zodpovědný za výtok draslíku, ale 2,0 60 Cl+ elektrický gradient je zpočátku nezměněný. Chloridy 118,0 60 A vytékají z buňky a membrána se depolarizuje. Draselné ionty tím už také nejsou v rovnováze a začnou rovněž -85 mV; rel. obj. 0,98 opouštět buňku. Chloridy a draslík opouští buňku v doprovodu vody, takže její relativní objem klesne na cca 98% původní hodnoty. Draslíku i chloridů vyteče z buňky opět stejné množství, ale vzhledem k původní vysoké [K+]in je koncentrační změna draslíku vcelku zanedbatelná. Chloridů ovšem vyteče vzhledem k jejich původní koncentraci takové množství, že je změna jejich intracelulární koncentrace výrazná. Nakonec se poměr jejich extra- a intracelulární koncentrace ustaví opět na hodnotě cca 1:30, podobně jako u draslíku, kde v podstatě ke změně nedošlo. Proto se membránový potenciál vrátí víceméně zase ke své původní hodnotě. 3 K+
+
-
89,5
Co si pamatovat z této přednášky ⇒ délková konstanta (definice) ⇒ vstupní odpor membrány, specifický odpor membrány a axoplasmy ⇒ význam časové a délkové konstanty ⇒ myelinizace: stavba myelinu, k čemu to je ⇒ rychlost vedení v ne- a myelinizovaných vláknech ⇒ lokální proudy a saltatorní vedení ⇒ Nernstův potenciál a (klidový) membránový potenciál ⇒ propustnosti iontů ⇒ Donnanova rovnováha ⇒ změny extracelulárních koncentrací iontů a membránový potenciál
16
[email protected]
