Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István

Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István

Pharmacokinetics and Metabolism • Study of the fate of the drugs  Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion ABSORPTION: reaching the circulation after oral, transdermal, intramuscular, rectal, etc. administration

DISTRIBUTION: reaching organs, tissues, binding to proteins

Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

METABOLISM: change of the chemical structure by liver enzymes mainly

ELIMINATION: clearing the body from xenobiotics through kidney or bile

2

Új gyógyszerek kutatása

Késői fázis

Korai fázis A biológiai célpont azonosítása

A biológiai célpont validálása

1 év

2 év

165 M$

205 M$

A “LEAD” molekula azonosítása

A “LEAD” molekula optimalizálás a

0.4 év

2.7 év

40 M$

120 M$

Preklinikai fejlesztés

1.6 év 90 M$

Klinikai fejlesztés

PIA C

7 év 260 M$

~ 15 év és ~ 1000 M$


3

Gyógyszerdiszpozíció • Végső soron az a célunk, hogy emberek számára hatásos és biztonságos gyógyszert fejlesszünk. Ehhez – a fejlesztés előrehaladtával  In silico módszerekkel becsüljük meg a gyógyszerjelöltek sajátságait  In vitro vizsgálatokból vett adatokból következtetünk  In vivo állatkísérletekkel modellezünk  In vivo humán klinikai vizsgálatokból megerősítjük az ismereteinket  Matematikai módszerekkel modellezzük a szervezetben lezajló folyamatokat Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

4

Gyógyszerdiszpozíció • Az ADME vizsgálatok segítik a hatásossági vizsgálatok értelmezését, mivel  A biokémiai (in vitro receptorkötési-, enzimgátlási-, ioncsatorna-) teszteken hatásosnak talált vegyületek várhatóan akkor lesznek hatásosak emberben, ha  Felszívódnak, áthaladnak különböző szöveti membránokon és elérik a receptort, enzimet, ioncsatornát, stb.  Kellő koncentrációban és kellő ideig jelen tudnak maradni a molekuláris hatáshelyen

 A farmakológiai (in vivo állatkísérletek) teszteken hatásosnak talált vegyületek várhatóan akkor lesznek hatásosak emberben, ha  A vegyület sorsa a szervezetben jelentős hasonlóságot mutat a vizsgált állatfajban és az emberben Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

5

Gyógyszerdiszpozíció • Az ADME vizsgálatok segítik a biztonsági vizsgálatok értelmezését is, mivel  A biztonsági (toxikológiai és biztonság-farmakológiai) állatkísérletes teszteken biztonságosnak talált vegyületek várhatóan akkor lesznek biztonságosak emberben, ha  A vegyület sorsa a szervezetben, de elsőképpen a vegyület biotranszformációja, jelentős hasonlóságot mutat a vizsgált állatfajban és az emberben


6

Gyógyszerdiszpozíció • A gyógyszerdiszpozició a gyógyszerek élő szervezetbeni sorsát vizsgáló tudomány, szokták ADME mozaikszóval is rövidíteni  A – Felszívódás (Absorption)  D – Megoszlás (Distribution)  M – Biotranszformáció (Metabolism)  E – Kiürülés (Excretion)

• Farmakokinetika a mennyiségi (sebességi és koncentráció) kérdéseket vizsgálja • Metabolizmus a szervezetben lezajló kémiai átalakulásokat Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

7

Felszívódás • A gyógyszereknél ugyan leggyakrabban a szájon át történő (orális, vagy per os) adagolást alkalmazzák, de számos más adagolási módszer is ismert. Lehet közvetlenül a keringésbe (intravénásan) adni, izomba (intramuszkulárisan), vagy bőr alá (szubkután) fecskendezni, lehet a bőr felületére (dermálisan) kenni vagy tapasztani, vagy kúp formájában (rektálisan, vagy vaginálisan) felhelyezni. Adható egy hatóanyag a hasüregbe (intraperitoneálisan), de cseppenthető a szembe vagy orrba is. • A lényeg, hogy a gyógyszernek, ha nem lokális hatást akarunk kifejteni, el kell érnie a szisztémás keringést. Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

8

Felszívódás • Felszívottnak tekintjük azt a szert, mely változatlan formában éri el a szisztémás keringést. Ehhez számos membránon át kell jutnia, vagyis kellő permeábilitást és metabolikus stabilitást kell mutatnia. • A felszívódás vizsgálatára számos in vitro (Sartorius, PAMPA, egyszeres sejtrétegek), in situ (perfúziós modell), ex vivo (bélzsák és transzdermális modell) és in vivo (bélzsák modell) technika létezik, a „gold standard”-nak azonban a CaCo-2 modell számít.


9

Ca-Co-2 modell CaCo-2 egy humán vastagbél karcinóma sejtvonal, mely képes meghatározott körülmények között szorosan illeszkedő sejtekből egy egyrétegű, zárt, membránt képezni, miközben rendelkezik a vékonybélbél-sejtekre jellemző enzimrendszerrel, mikrobolyhokkal, aktív transzporterekkel (pl. Pglikoprotein). Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

10

In vivo felszívódás [%]

Caco-2 modell

100

50

0 0,1

1

10

100

1000

Log Papp [*10-7 cm/s] Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

11

Felszívódás • A felszívódást jól lehet jellemezni a vérszintek alakulásának nyomon követésével is.


12

Megoszlás • A szervezetbe került anyag többé, vagy kevésbé megoszlik a szervezet szervei, szövetei között. • A szervi-szöveti eloszlás legelterjedtebb vizsgáló módszere az un. teljes-test autoradiográfia, mely a korábbi szemi-kvantitatív technikából napjainkra kvantitatív módszerré vált. • A teljes-test autoradiogramok információt adnak arra, hogy mely szövetek és szervek vannak leginkább kitéve az anyag hatásának, de következtethetünk arra is, hogy kiürül-e az anyag az állatból, vagy esetleg kumulálódik. Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

13

Teljes-test autoradiográfia

0,5 óra

SZÍV

MÁJ

AGY


MELLÉKVESE

VESE

HERE

14

Megoszlás • A megoszlás egy új, modernebb vizsgálati módszere, bár bonyolultabb is, a Positron Emission Tomography, azaz a PET  Elsősorban diagnosztikai célból (daganatok helyének és típusának megállapítása, központi idegrendszeri folyamatok vizsgálata – Alzheimer betegség)  Pozitron = az elektron antirészecskéje  Legfontosabb pozitron sugárzók: 11C, 13N, 15O és 18F  Jellemző rájuk a nagyon rövid felezési idő (néhány perc)


15

PET • A diagnosztikum (pl. 18F-FDG) előállítása ciklotronban történik


16

Fehérjekötődés • A megoszlás során az anyagok nem csak áthaladnak membránokon, hanem kötődhetnek is hozzájuk. Bejuthatnak a sejtekbe, s kötődhetnek a szöveti fehérjékhez is. • A megoszlást leginkább befolyásoló „kötődés” az anyagok szérumfehérjékhez (elsősorban az albuminhoz és az alfa-1 savas glikoproteinhez) kötődése. Ennek mértékét in vitro technikákkal (egyensúlyi dialízis, ultraszűrés, ultracentrifugálás) vizsgáljuk. • A megoszlást sokszor jól lehet számítani a vérszintek alakulásának nyomon követésével is. Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

17

Fehérjekötődés • Albumin és alfa-1 savas glikoprotein


18

Vér-agy gát modell • Egy gyógyszermolekula fontos sajátossága az, hogy bejut-e a központi idegrendszerbe, vagyis átjut-e az un. vér-agy gáton.  CNS-re ható szerek esetén a hatás kifejtéséhez kell  Nem CNS-re ható szerek esetén a mellékhatás-profil miatt fontos tudni  A folyamat modellezhető


19

Átjutás a placentán • A placenta nem csak a magzat vérellátását, s ezen keresztül az oxigén- és tápanyag ellátását biztosítja, nem csak a terhesség fenntartását elősegítő hormonokat termel, hanem fontos szerepe van abban is, hogy a káros anyagok, vagy akár a mikroorganizmusok egy részét kiszűrje a vérből magzat védelme érdekében • Hogy szedhet-e egy kismama egy gyógyszert, részben attól függ, hogy a méhlepényen át tud-e jutni az adott szer


20

Biotranszformáció - metabolizmus • A szervezetbe kerülő testidegen anyagokat a szervezet enzimrendszere rendszerint átalakítja polárosabb molekulákká, az un. metabolitokká, hogy minél hamarabb meg tudjon szabadulni tőlük. • Az első fázisú metabolizmust (pl. oxidáció, hidroxiláció, dealkilezés, dehidrogénezés, stb.) gyakran második fázisú metabolizmus követi, vagyis a molekula endogén molekulákhoz kapcsolódik (glükuronsav, acetil-csoport, szulfát-csoport, glutation, glicin, stb.)


21

Biotranszformáció - metabolizmus • Fázis I. Metabolikus reakciók - oxidáció


22

Biotranszformáció - metabolizmus • Fázis I. Metabolikus reakciók - dealkiláció


23

Biotranszformáció - metabolizmus • Fázis I. Metabolikus reakciók – N-oxidáció


24

Biotranszformáció - metabolizmus • Fázis II. Metabolikus reakciók – glükuronidáció


25

Biotranszformáció - metabolizmus • Fázis II. Metabolikus reakciók – szulfatálás, N-acetilálás


26

Biotranszformáció - metabolizmus • A metabolizáló enzimek szinte minden szervben szövetben megtalálhatók. • A fő metabolizáló szerv a máj, de jelentős metabolizáló kapacitással rendelkezik a vese, tüdő, bél, a vér és az agy is.


27

Plazma stabilitás in vitro

100

C [Kiindulási koncentráció %-ban]

90 80 70 60 50 40

Egér plazma Kutya plazma Humán plazma Hörcsög plazma Patkány plazma

30 20 10 0 0


20

40

Idő [perc]

60 28

Biotranszformáció - metabolizmus • A gyógyszerek és egyéb testidegen anyagok (de egyes endogén anyagok is) metabolizmusában a szervezet számos enzime részt vesz, de a legfontosabbak a CYP, UGT, észterázok, FMO, NAT és MAO

CYP UGT esterase FMO NAT MAO Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

29

Cytochrom P450 enzimcsalád • Eredetileg egy enzimnek gondolták, mely a nevét onnan kapta, hogy 450 nm-en egy jelentős abszorbanciát mutatott, ha CO-val reagáltatták • Ma több mint 11500 CYP450 izoenzim ismert


30

Cytochrom P450 enzimcsalád


31

Cytochrom P450 enzimcsalád • Az egyes CYP450 izoenzimek nem azonos mértékben vesznek részt a gyógyszerek metabolizmusában • A legtöbb gyógyszermolekulát a 3A4, a 2D6 és a 2C9 izoenzim módosítja, de a legtöbb esetben egy molekula több enzimnek is szubsztrátja 2A6 2C19

2C8

2C9


3A4

2D6

1A2

2E1 2B6

32

Cytochrom P450 enzimcsalád

A Human CYP1A2 enzim két nézetből, középen látható a vastartalmú hem makromolekula, mely minden CYP enzimre jellemző Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

33

HEM


34

Biotranszformáció - metabolizmus • A biotranszformációt első lépésben in vitro módszerekkel vizsgáljuk.  A máj különböző preparátumai    

S9 frakció Mikroszómális frakció Májsejt preparátumok (primer kultúra, cry-preserved kultúra) Májszeletek

 Máj-perfúziós modell

 Genetikailag módosított élesztőgomba-, rovar-, vagy emlőssejtekkel, de főleg bakteriális sejtekkel  Az Escherichia coli-t és a Salmonella typhimurium-ot elterjedten használják  Minden lényeges humán CYP izoenzim már kifejezhető bakteriális sejtekkel (1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2A13, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5, 3A7, 3A43 35


Biotranszformáció - metabolizmus

• Escherichia coli

• Salmonella typhimurium Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

36

Metabolit profil • A metabolitok megjelenése és egymáshoz viszonyított arányuk meghatározása különböző fajokban, nemekben, biológiai mátrixokban SAR154025 (O-demetyl) (M21) SAR167112 (amine) (M28) SAR154025-sulphate (M31)

SAR137272-OH (M18) SAR107017 (N-demetyl) (M12)

Typical plasma profiles

SAR137272 (UD) SAR154025-glucuronide (M34)

SAR166310 (N-oxide) (M10)

400.00 350.00

Male rat plasma AUC pool

300.00

cpm

250.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 700.00 600.00

cpm

500.00 400.00

Female rat plasma AUC pool

300.00 200.00 100.00 0.00

1600.00 1400.00 1200.00


37

Metabolit profil


38

In vitro metabolizmus máj mikroszóma preparátummal

C [Kezdeti koncentráció %-ban]

100

80

60

Kutya Nyúl

40

Egér Humán Patkány

20

Hörcsög

0 0 Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

20

40

Idő [perc]

60 39

Metabolitok szerkezetazonosítása CH3CH3 CH2CH N CH3

CH2C

CH2CH N

CH

CH2C

CH3CH3

CH3CH3 CH2CH N

CH2C

CH

CH3CH3

Deprenyl

NH2

CH2CH N

CH3CH3

Metamfetamin

CH3

CH CH NH

CH2CH NH CH2C

CH2C

Efedrin Pszeudoefedrin

Demetil-deprenyl

CH

CH3

OH

CH

CH CH3

N-[(1-metil-2-fenil)etil]etánimin N-oxid

CH

Propargilamin

CH C

O CH3

OH

N-OH-metamfetamin

CH2CH NH

CH2

N-[(1-metil-2-fenil)etil]metánimin N-oxid

N-OH-demetil-deprenyl

CH2 CH N

O

CH2CH N CH

CH

N-metil-propargilamin

CH2C

OH

CH2C

Deprenyl-N-oxid

NH

O CH3

CH3

O

N

OH

Fenilaceton-oxim

CH3

Propiolaldehid HO

HO

CH2CH NH CH2C

CH3CH3

CH2CH NH2

CH3

CH3

CH2CH NH

Amfetamin

CH

CH2CH OH

p-OH-metamfetamin

p-OH-demetil-deprenyl

Konjugátum CH3

Konjugátum

1-Fenil-2-propanol

CH2CH NH OH CH3

CH3 HO

N-OH-amfetamin

CH2CH NH2

CH3CH3

CH3 HO

CH CH NH2

p-OH-amfetamin

CH CH NH OH

OH

p-OH-efedrin p-OH-pszeudoefedrin

Norefedrin Nor-pszeudoefedrin CH3 HO

CH CH NH2 OH

p-OH-norefedrin p-OH-norpszeudoefedrin


CH3

O

O

CH2CH NH C

CH3

N-acetil-amfetamin

C

O OH

Benzoésav

CH2C

O NH COOH

Hippursav

O

Fenilaceton

OH C

CH2C

CH2C

NH COOH

Fenilecetsav

Fenilecetsavglicin konjugátum

40

O

Ürülés • A szervezetből a testidegen anyagok leginkább a vizelettel és az epével választódnak ki.  Vizelet - vesében glomeruláris szűrés és/vagy tubuláris kiválasztás (fontos a tubuláris visszaszívás)  Epe – májban a poláros, nagy molekula tömegű (300-500 Da) anyagok választódnak ki (enterohepatikus körfolyamat)  Nyál – jód, kokain megtalálható a nyálban (gyomor-nyál körfolyamat  Kilégzés – a tüdőn át illékony anyagok tudnak távozni (alkohol, dietil-éter, stb.)  Anyatej – a gyógyszerek többsége nem választódik ki  Verejték – leginkább ionokat választ ki, de az orálisan adott metamfetamin és amfetamin is megjelenik a verítékben  Könny – fenobarbitál, carbamazepine, methotrexate, ampicillin, rifamycine, acetil-szalicilát megjelenik a könnyben Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

41

Klinikai vizsgálatok • Fázis I vizsgálatok egészséges önkénteseken    

Egyszeri, emelkedő dózisú tolerancia vizsgálat farmakokinetikával Ismételt, emelkedő dózisú tolerancia vizsgálat farmakokinetikával Étel-interakciós vizsgálat Egyes esetekben bioequivalencia vizsgálat

• Fázis II vizsgálatok néhány tucat betegen  Hatékonysági és mellékhatás felderítési vizsgálatok  Humán metabolizmus vizsgálatok  Interakciós vizsgálatok (enzim-induktorok, inhibitorok, fogamzásgátlók, stb.)  Új terápiás alkalmazások  Gyógyszerformák fejlesztése


42

Klinikai vizsgálatok • Fázis III vizsgálatok több ezer betegen  Hatékonysági és mellékhatás felderítési vizsgálatok  Új indikációk vizsgálata  Speciális betegcsoportok (vesebeteg, májbeteg, idős, gyerek, rasszok, stb.)  Bioequivalencia vizsgálatok

• Fázis IV vizsgálatok a már forgalomban lévő gyógyszerrel  Új gyógyszerformák (once-a-day, controlled release, szirup, kúp, stb.)  Fix kombinációk (pl.: Algoflex-M, Quarelin)  Generikus készítmények fejlesztése  Új indikációk vizsgálata


43

Predikció, modellezés • Az ADME vizsgálatok alapja a hatóanyagok és metabolitok koncentrációjának meghatározása a különböző biológiai folyadékokban, mint a vér (plazma), a szervek-szövetek, a vizelet, széklet, epe, de esetenként más mátrixok is (nyál, broncho-alveoláris váladék, stb.). • A bioanalitikai méréseket napjainkban leginkább LC-MS/MS technikával végzik, mely módszerrel akár néhány pg/mL méréshatár is elérhető. Korábban a egyéb kromatográfiás (HPLC, GC, GC-MSD, TLC, Elektroforézis, SC-kromatográfia, stb.) és spektroszkópiás (UV-VIS, FD) módszerek is elterjedtek voltak.


44

Predikció, modellezés • A koncentrációk alapján un. farmakokinetikai paramétereket határozunk meg. Ezek teszik számszerűen is összehasonlíthatóvá a készítményeket, s ezek alapján lehet meghatározni a gyógyszerek alkalmazási módját is (dózis, dózis-intervallum, éhgyomri szedés, interakció, ellenjavallat, stb.) • A leggyakrabban meghatározott farmakokinetikai paraméterek:      

Maximális koncentráció (Cmax) A maximális koncentráció eléréséhez szükséges idő (T max) A koncentráció-idő görbe alatti terület (AUC) A (terminális) látszólagos felezési idő (T1/2) A felszívódási állandó (ke) Biohasznosíthatóság (F)


45

Modellezés 

Egyszeri dózis után mért koncentráció adatokból lehet következtetni az ismételt dózisú kezelésre


46

Az ADME biobiztonsági vonatkozásai • In vitro vizsgálatok  CaCo-2 humán karcinóma sejtvonal felszívódás és transzporter vizsgálatokhoz  MDCK (kutya vese) sejtvonal transzporter vizsgálatokhoz  Endothel sejt co-kultúra (patkány) a BBB vizsgálatokhoz  Sejtes és szubcelluláris preparátumok emberből és állatfajokból származó májból, metabolizmus vizsgálathoz  Humán és majom különös elbírálást igényel

 Génmódosított bakteriális sejtek metabolizmus vizsgálathoz  Vér- és véralkotók emberből és állatfajokból, stabilitás vizsgálathoz Biobiztonság 6. – Dr. Szatmári István

47

Az ADME biobiztonsági vonatkozásai • In vivo vizsgálatok  Toxikológiai és farmakológiai állatok (egér, patkány, kutya, nyúl, majom, hörcsög, tengerimalac, sertés, stb.)  Génmódosított laboratóriumi állatok  Farmakológiai cél (diabetesz)  ADME cél (transzporter knock-out egér)

 Szervek, szövetek, vér- és véralkotók, exkrétumok a fenti állatfajokból  Vér- és véralkotók, exkrétumok emberből  Egészséges önkéntesek  Betegek


48

Biobiztonság és Szellemi tulajdon védelme Nem kockázat, mert biztosan bekövetkezik:

A jövő héten vizsga Ugyanitt és szintén 17.15-kor kezdünk


49

Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István

Recommend Documents