Tes antibodi dilakukan untuk mendeteksi keberadaan antibodi tertentu yang menyerang sel darah merah. Antibodi adalah protein yang dibuat oleh sistem kekebalan tubuh yang berfungsi untuk melawan zat-zat asing yang masuk ke dalam tubuh dan kemudian memusnahkannya, seperti bakteri dan virus. Beberapa kondisi di bawah ini dapat menyebabkan pembentukkan antibodi dalam tubuh: Reaksi Transfusi : Darah manusia mempunyai tanda sendiri (disebut antigen) pada permukaan sel darah merah. Dalam proses transfusi darah, darah yang ditransfusikan harus cocok dengan tipe darah si penerima. Itu berarti darah yang ditransfusikan harus memiliki antigen yang sama seperti sel darah merah pasien. Jika dilakukan transfusi darah dengan antigen yang berbeda (darah yang tidak cocok), maka sistem kekebalan tubuh akan menghancurkan sel-sel darah yang ditransfusikan. Ini disebut reaksi transfusi dan dapat menyebabkan komplikasi yang serius atau bahkan kematian. Inilah sebabnya mengapa pencocokan golongan darah sangat penting. Rh sensitisasi : Rh adalah antigen. Nama lengkap untuk antigen ini Rhesus faktor. Jika seorang wanita Rh- hamil dengan Rh bayi (janin) positif, sensitisasi Rh mungkin terjadi. Bayi mungkin memiliki darah Rh+ jika ayah memiliki darah Rh+. Sensitisasi Rh terjadi ketika darah bayi bercampur dengan darah ibu selama kehamilan atau proses persalinan. Hal ini menyebabkan sistem kekebalan tubuh ibu membuat antibodi terhadap sel darah merah bayi darah di kehamilan berikutnya. Respon antibodi ini disebut sensitisasi Rh dan bisa menghancurkan sel-sel darah merah bayi sebelum atau setelah lahir. Jika sensitisasi terjadi, janin atau bayi yang baru lahir dapat mengembangkan ringan sampai masalah berat (disebut Rh disease atau erythroblastosis fetalis). Jika Rh disease ini tidak diobati, akan menyebabkan kematian janin atau bayi yang baru dilahirkan. Seorang wanita dengan Rh- dianjurkan untuk mendapatkan suntikan Immunoglobulin anti RhD untuk mencegah sensitisasi. Masalah sensitisasi Rh (Rh disease) mengalami penurunan drastis dan menjadi sangat langka setelah Immunoglobulin anti RhD ditemukan. Anemia Hemolitik Autoimun : Anemia hemolitik autoimun atau yang biasa disebut anemia hemolitik adalah penyakit langka yang menyebabkan antibodi dalam tubuh menyerang sel darah merahnya sendiri Pemeriksaan Coomb’st test adalah pemeriksaan yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibody pada permukaan eritrosit dan anti-ab eritrosit dalam serum. Anti body ini menyelimuti permukaan sel eritrosit yang meyebabkan umur eritrosit menjadi lebih pendek dan sering menyebabkan reaksi inkompetibel pada transfuse darah. Ada 2 jenis Tes Antibodi: 1. Direct Coombs’ test (langsung) : pemeriksaan dilakukan pada sel darah merah 2. Indirect Coombs’ test (tidak langsung) : pemeriksaan dilakukan pada serum darah Direct Coombs’ Test juga dapat dilakukan pada bayi yang baru lahir dengan darah Rh+ yang ibunya memiliki Rh-. Hasil pengujianakan menunjukkan apakah darah ibu telah membuat antibodi dan apakah antibodi tersebut telah pindah kepada bayi melalui plasenta. Indirect Coombs’ Test umumnya dilakukan sebelum transfusi darah dan dapat juga untuk menentukan titer antibodi Rh+ pada darah seorang wanita Rh-. TUJUAN PEMERIKSAAN Untuk mendeteksi adanya ab pada permukaan eritrosit dan anti-ab eritrosit pada serum
PRINSIP PEMERIKSAAN Eritrosit yang telah dicuci dan yang diselubungi oleh globulin manusia akan diaglutinasi oleh Anti Human Globulin yang ditambahkan ke dalam tabung pemeriksaan REAGENSIA • •
Sel golongan darah O normal 2-5 % Coomb’s control cell positif (CCCP)
•
Bovin albumin 22% (BA)
•
Coomb’s Serum ( AHG) yaitu anti human globulin antibody yang dihasilkan oleh binatang yang disuntikkan serum atau protein manusia untuk mendeteksi Ab yang melekat pada permukaan eritrosit dan menyingkirkan Ab lain yang tidak diinginkan.
•
Saline
PERALATAN • •
Incubator suhu 37 0 c Centrifuge
•
Mikroskop
•
Timer
•
Rak tabung
•
Tabung reaksi ukuran 12 x75 mm
•
Pipet tetes
•
Botol semprot
•
Slide test
•
Beaker glass
•
Wadah limbah
CARA KERJA •
Aglutinasi Langsung (direct Coomb’s test) o Siapkan alat dan bahan o
Tambahkan 2 tetes suspense eritrosit 2-5 % ke dalam tabung I dan II
•
o
Cuci suspense eritrosit 2-5 % 3-4 kali dengan saline
o
Tambahkan kedalam sedimen sel ( tabung I 2 tetes AHG dan tabung II, 2 tetes saline sebagai negative control)
o
Putar 1000 rpm selama 1 menit atau 3500 rpm selam 15 detik
o
Amati ada tidakny aglutina
o
Apabila negative tambahkan 1 tetes cccp dan diputar kembali selama 1 menit kecepatan 1000 rpm
o
Apabila positif berarti pekerjaan benar dan apabila negative pemeriksaan harus diulang kembali.
Aglutinasi Tidak Langsung o Masukkan 2 tetes serum atau plasma yang akan dipriksa ke dalam tabung reaksi o
Tambahkan 1 tetes suspense eritrosit 2-5 % kedalam tabung tersebut
o
Inkubasi pada suhu 370 C selam 15-60 menit
o
Tambahkan BA 22% kemudian diputar 1 menit pada 1000 rpm dan baca hasil reaksinya. Setelah itu inkubasi selam 15 menit
o
Cuci suspense eritrosit 2- 5% 3-4 x dengan salin. Salin pencucian terakhir dibuang sebanyak-banyaknya untuk mencegah pengenceran serum coomb’s
o
Kemudian tambahkan 2 tetes serum coomb’s dan kemudianputar selam 1 menit 1000 rpm
o
Baca hasil reaksinya
o
Apabila hasil negative tambahkan 1 tetes CCCP dan diputar kembali 1000 rpm selam 1 menit
o
Apabila positif berarti pekerjaan benar dan apabila negative pemeriksaan harus diulang kembali
HASIL •
Normal •
Tidak ditemukan antibodi (hasil test negatif)
•
Direct Coombs’ Test negatif berarti tidak ada antibodi dalam sel darah merah
•
Indirect Coombs’ Test negatif berarti darah pendonor dan darah penerima kompatibel (cocok)
• •
Indirect Coombs’ Test negatif pada wanita Rh- yang hamil berarti tidak ada antibodi anti Rh+ dalam darah dan belum terjadi sensitisasi
Abnormal •
Direct Coombs’ Test positif berarti ada antibodi yang akan melawan dan menghancurkan sel darah merah. Hal ini dapat disebabkan oleh transfusi darah yang tidak cocok atau penyakit anemia hemolitik
•
Indirect Coombs’ Test positif berarti darah pendonor tidak cocok dengan darah si penerima
•
Indirect Coombs’ Test positif pada wanita Rh- yang hamil atau berencana untuk hamil berarti dia memiliki antibodi terhadap darah Rh+ (sensitisasi Rh). Saat awal kehamilan jenis darah bayi akan diperiksa, jika darah bayi Rh+ maka ibu harus mendapat pengawasan ketat selama kehamilan untuk mencegah masalah dengan sel darah merah bayi. Jika sensitisasi belum terjadi maka dapat dicegah dengan suntikan Immunoglobulin anti RhD.
•
Faktor yang mempengaruhi perlekatan Ab pada sdm invitro : 1. Temperatur : Ab yang menyeubungi eritrosit dan serum breaksi oftimal pada suhu 37 0 C. suhu yang terlalu rendah akan mempengaruhi kecepatan asosiasi Ag dan Ab. Sebaliknya suhu yang terlalu tinggi akan merusak eritrosit dan molekul Ab.
2. Ionic Strength. : Eritrosit dapat disuspensikan kedalam berbagai media misal dalam lar saline fisiologis, lar albumin, LISS dan reag additive seperti polyethylene glycol (PEG)/hexadimethrine bromide (polybrene). Dalam cairan isotonik, Na ion dan Cl ion bergerombol sekeliling sel dan sebagian menetralisir muatan yang berseberangan pada Ag dan molekul Ab. Effek penyelubungan ini yang merintangi assosiasi Ab dengan Ag dan dapat dikurangi dengan cara mengurangi ionic strength dari media reaksi. Konsekuensi menurunkan konsentrasi garam dari media reaksi meningkatkan Ab yang melekat pada eritrosit. Penggunaan albumin kec bila digunakan dibawah kondisi ion yang rendah juga dapat melakukan perlekatan molekul Ab. 3. Proporsi Serum Terhadap Sel : Suspense eritrosit yangterlalu tinggi atau terlalu rendah dapat mempengaruhi drajat Ab yang menyelimuti eritrosit. Dengan meningkatkan ratio serum terhadap sel dapat mendeteksi Ab yang bereaksi lemah yang tidak terdeteksi dibawah suspensi normal eritrosit. 4. WaktuInkubasi : Tehnik albumin waktu inkubasi 15 – 30 menit suhu 370 C ® waktu yang adekwat untuk mendeteksi Ab yang menyelimuti sdm yang secara klinis berarti. Ab yang bereaksi lemah, reaksi Ag Ab tidak dapat mencapai keseimbangan dalam waktu inkubasi selama 30 menit dan dengan memperpanjang waktu inkubasi dapat membuktikan keberadaannya.
Hasil Negatif Palsu pada Pemeriksaan disebabkan oleh
Tidak mencuci sdm dengan bersih dan baik, karena globulin yang bebas yang tidak berikatan dengan sel akan menetralisir AHG. pemeriksaan terganggu atau tertunda. •
Pelaksanaan proses pencucian harus dilakukan secepat mungkin untuk mengurangi kehilangan Ab yang terlepas dari sel.
•
AHG harus ditambahkan segera setelah proses pencucian selesai karena Ab yang telah mengadakan ikatan akan terlepas kembali.
•
Setelah AHG ditambahkan harus segera diputar dan dibaca, karena reaksi IgG yang menyelimuti sdm akan melemah setelah inkubasi.
•
Reagen kehilangan reaktivitas yang disebabkan oleh penyimpanan yang tidak baik, kontaminasi bakteri / serum manusia. Penyimpanan AHG dianjurkan pada 2 – 80 C, jangan dibekukan, bila warna berubah tidak digunakan lagi. AHG mengalami netralisasi bila terkontaminasi dengan serum manusia / anti–D sera. Hal ini tidak terlihat dengan mata (makroskopis) tetapi terlihat bila diperiksa dengan CCC, hasil reaksi yang seharusnya pos menjadi neg.
•
Tidak ada AHG pada pemeriksaan, atau lupa menambahkan AHG. Hal ini dapat dicegah dengan memakai AHG yang berwarna.
•
Penggunaan centrifugasi yang tidak baik Centrifugasi yang lambat keadaan menjadi tidak optimal untuk aglutinasi, sebaliknya centrifugasi yang terlalu kuat memadatkan sel, sehingga sel sukar untuk terurai.
•
Jumlah eritrosit yang ada pada pemeriksaan mempengaruhi reaktivitas. Reaksi yang lemah karena terlalu banyak eritrosit, sebaliknya eritrosit yang terlalu sedikit menyulitkan pembacaan aglutinasi dengan baik.
•
Reaksi prozone sebagai kemungkinan penyebab pemeriksaan antiglobulin tidak reaktif.
Hasil Positif palsu pada pemeriksaan disebabkan oleh
• •
Sdm sudah dicentrifugasi sebelum dilakukan pencucian. Apabila tidak terlihat aglutinasi yang tampak setelah penambahan AHG dapat disalah interpretasikan pembacaannya sebagai akibat perselubungan IgG / komplemen. eritrosit penderita cold react auto Ab yang kuat beraglutinasi pada contoh darah yang disimpan pada suhu kamar atau dibawah suhu kamar. Tabulasi gelas yang tidak bersih terkontaminasi dengan debu, detergent / material lain yang menyebabkan sdm menggumpal / aggregasi. Over centrifugation dapat memadatkan eritrosir yaitu agregasi disalah artikan dengan aglutinasi.
•
Reagen yang dibuat tidak baik dan dapat mengandung Ab yang mengakibatkan aglutinasi pada sel yang tidak diselubungi. Enzyme treated red blood cells dapat meningkatkan reaktivitas dengan antispecies Ab dan dapat bereaksi langsung dengan reag AHG yang mengandung kontaminasi aktivitas.
