BALATONI ÉS KIS-BALATONI KÉKALGÁK TOXIKUSSÁGÁNAK VIZSGÁLATA Farkas Anna, Kovács W. Attila, Paulovits Gábor, Vehovszky Ágnes MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, Tihany Összefoglalás. A 2006. július – októberi időszakban 11 alkalommal észleltünk lokális fitoplankton tömegprodukciót a Balaton, valamint a Kis-Balaton Vízvédelmi Rendszer területén. A sórák (Artemia salina) akut toxicitási teszt alkalmazásával a Siófoki-medencében Tihanynál 2006.07.04-én észlelt Microcystis virágzás bizonyult számottevően toxikusnak, míg a Kis-Balaton területén két fitoplankton tömegprodukciót jellemzett toxikusság (2006.08.22; 2006.10.08). A toxintermelő képességet 3 Anabaena, 4 Aphanizomenon, és 4 Cylindrospermopsis raciborskii izolált törzsnél is ellenőriztük, melyeket az elmúlt évek során izoláltak a Balaton, valamint a Kis-Balaton területén. Az akut toxicitási teszt a Kis-Balatonból izolált Anabaena spiroides (ACT 9607), valamint a Balatonból izolált két Aphanizomenon flos-aquae (vegyes állomány, ACT 9605) és a Cylindrospermopsis raciborskii ACT 9504 tenyészetek esetében mutatott erőteljes toxikusságot. Mérsékelten toxikusnak bizonyult még az Anabaena aphanizomenoides (ACT 9601) és a Cylindrospermopsis raciborskii ACT 9503 törzs. A toxikus cianobaktérium törzsek hatóanyag vizsgálata egyedül az anatoxin-a(s) kimutatására alkalmazott in vitro acetilkolineszteráz gátlás vizsgálatban jelzett szignifikáns pozitív hatást. Az eredmények az Anabaena spiroides ACT 9607, valamint az ACT 9504 és ACT 9503 Cylindrospermopsis raciborskii törzsek esetén anatoxin-a(s) típusú alkaloida termelését valószínűsíti.
Bevezetés A felszíni vizek eutrofizálódásának egyik feltűnő kísérő jelensége a fonalas nitrogénkötő cianobaktériumok tömeges elszaporodása (Carmichael 1997, Pitois és mtsai 2001). Az esetek mintegy 25%-ról bebizonyosodott, hogy a “vízvirágzást” toxintermelő kékalgák alkották, akár tömeges elhullást okozva, mind a háziállatok, mind vadon élő állatok között (Carmichael 1997, Codd és mtsai 2005). Így a hazai vizeinken is a cianobakteriális tömegprodukció mind gyakoribb előfordulása indokolttá tette a vízvirágzást okozó algafajok toxicitásának vizsgálatát. A Balatonban, ill. elsősorban a Kis-Balaton területén esetenként tömegesen elszaporodó Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena aphanizomenoides, Cylindrospermopsis raciborskii, valamint Microcystis aeruginosa fajok tömegtenyészetéből készített kivonatok toxicitását különböző halfajokon, vándorsáskán, valamint egértesztben mutatták ki (Hiripi és mtsai 1998, Bernard és mtsai, 2003). Az egyes algatörzsek által termelt toxikus hatóanyagok pontos kémiai azonosítása ugyanakkor mind a
mai napig nem történt meg. Így, az előzményekből kiindulva vizsgálataink egyik célja a Balaton, valamint a Kis-Balaton tározón 2006 év során észlelt cianobaktérium tömegprodukció általános toxicitásának vizsgálata. Továbbá, a Balatonból, valamint a Kis-Balaton területéről a korábbi évek során izolált algatörzsek toxin termelő képességének vizsgálata, és a hatóanyagok azonosítása. Anyag és módszer A cianobaktériumok toxikusságának és toxikus jellegének becslésére a leggyakrabban alkalmazott szabvány eljárás az egérteszt, napjainkban azonban, főként etikai szempontok miatt mind elterjedtebb a sórák (Artemia salina L.) akut toxicitási teszt alkalmazása (Metcalf és mtsai 2002; Beattie és mtsai 2003; Lindsay és mtsai 2006). Az egynapos sórák naupliákra kifejlesztett akut toxicitási tesztben a toxikus anyag 24 órás LC50 értékét határozzuk meg. A teszt alapján az a fitoplankton minta minősül toxikusnak, amelynél a 24 órás LC50 érték 20 mg ml-1 alatt adódik (Metcalf és mtsai 2002). A 2006. július – október közötti időszakban 5 balatoni és 6 kis-balatoni lokális algavirágzás toxikusságát vizsgáltuk (1. táblázat). A begyűjtött fitoplanktonból, egy részmintán meghatároztuk a számottevő tömegarányban előforduló fajokat, majd a sórák teszttel ellenőriztük a minta liofilizátumok toxicitását. 1. táblázat. A Balatonból és a Kis-Balatonból gyűjtött szeszton minták domináns algafajai Gyűjtés időpont
Gyűjtési hely
Domináns fajok
2006.07.04.
Siófoki-medence (Tihany, MTA BLKI Kisöböl)
Microcystis sp.
2006.07.10.
Keszthelyi-medence (Máriafürdő)
Aphanizomenon sp., Cyl. raciborskii, Anabaena sp.
2006.08.11.
Keszthelyi-medence (tóközép)
Aphanizomenon sp., Cyl. raciborskii, Oscillatoria sp.
2006.08.24.
Szigligeti-medence (Fonyód)
Aphanizomenon sp., Cyl. raciborskii
2006.09.11.
Keszthelyi-medence (Máriafürdő)
Anabaena sp., Aphanizomenon sp., Cyl. raciborskii
2006.08.22.
Kis-Balaton (Kazetta)
Microcystis sp., Aphanizomenon sp.
2006.08.22.
Kis-Balaton (Kányavár)
Aphanizomenon sp., Microcystis sp.
2006.08.22.
Kis-Balaton (Pogányvár)
Aphanizomenon sp., Microcystis sp.
2006.09.22.
Kis-Balaton (Kazetta)
Microcystis sp., Aphanizomenon sp.
2006.10.08.
Kis-Balaton (Kazetta)
Microcystis sp.,
Az MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet cianobaktérium gyűjteményéből a Kis-Balatonból, ill. a Balatonból izolált 3 Anabaena, 4 Aphanizomenon, és 4 Cylindrospermopsis raciborskii törzs toxikusságát vizsgáltuk (2. táblázat). 2. táblázat. A Kis-Balatonból, valamint a Balatonból izolált algatörzsek Törzs ACT 9502 ACT 9503 ACT 9504 ACT 9505 ACT 9510 ACT 9601 ACT 9605 vegyes ACT 9607 ACT 9608 ACT 9609
Cianobaktérium faj Cylindrospermopsis raciborskii Cylindrospermopsis raciborskii Cylindrospermopsis raciborskii Cylindrospermopsis raciborskii Anabaena compacta Anabaena aphanizomenoides Aphanizomenon flos-aquae Aphanizomenon flos-aquae Anabaena spiroides Aphanizomenon issatschenkoi Aphanizomenon gracile
A terepminták és algatörzsek toxikusságát tisztított cylindrospermopsin, és microcystin-LR, valamint a cylindrospermopsint termelő ausztrál Cylindrospermopsis raciborskii (AQS más néven CR3) törzs (Valério és mtsai 2005) toxikusságának összehasonlításával minősítettük. A tisztított toxinok, valamint az algakivonatok 24 órás LC50 értékét Finney (1971) probit analízise alapján határoztuk meg. A toxikusnak bizonyuló cianobaktérium törzsek esetében, a hatóanyagok jelenlétét a rendelkezésünkre álló analitikai ill. immunkémiai eljárásokkal saxitoxinok (Gerdts és mtsai 2002), anatoxinok (Vasas és mtsai 2006), valamint anatoxin-a(s) (Henriksen és mtsai 1997) azonosítására alkalmazott specifikus eljárásokkal is ellenőriztük. Eredmények és értékelésük A sórák akut toxicitási teszt pontosságának ellenőrzése során, a referencia anyagok általunk meghatározott 24 órás LC50 értékei közel azonosak voltak az irodalomban Artemia salina teszt esetén közölt toxicitási értékekkel (3. táblázat) (Metcalf és mtsai 2002).
3. táblázat. Tisztított algatoxinok, valamint a AQS (CR3) Cylindrospermopsis raciborskii törzs 24 órás LC50 értékei Minta
LC50 érték (24 h) Metcalf és mts. (2002)
Jelen vizsgálat
-1
Tisztított toxinok (µg ml ) Cylindrospermopsin
4,48
4,35
Microcystin-LR
4,58
5,21
Cylindrospermopsint termelő Cyl. raciborskii törzs* (mg ml-1 liofilizátum) *
3,24
AQS (CR3) CSIRO gyűjtemény, 2004
3,52
A Balaton, valamint Kis-Balaton tározón mindösszesen 11 alkalommal gyűjtött fitoplankton minták közül három minta esetében észleltünk számottevő toxikus hatást. Az első toxikus fitoplankton virágzást 2006. július 4-én észleltük a Siófoki-medencében Tihanynál. A vízfelszínt, viszonylag kis területen (kb. 10 m2) Microcystis sp. kolóniák borították. A minta 24 órás LC50 értéke 6,15 mg ml-1 volt (1. ábra). cilindrosperm opsin
m ikrocisztin LR
M cyst. A pha. 8
M cyst. A pha.
M cyst. 6
6
4
4
2
2
0
-1 ug toxin ml
mg liofilizátum ml
-1
8
0 MT
A K is
K is öb
ö l,
'0 6
.0 7
.0 4
-B a
K is la t
on
(K
az
e tt
a),
'0 6
-B a
.0 8
AQ la t
on
.2 2
(K
az
e tt
a),
'0 6
S
.1 0
.0 8
1. ábra. Toxikus fitoplankton minták 24 órás LC50 értéke, összehasonlításban a pozitív AQS kontroll, valamint a tisztított toxinok toxicitási értékeivel
Újabb lokális toxikus fitoplankton tömegprodukciót a Kis-Balaton Vízvédelmi Rendszer területén (Kazetta) 2006. augusztus 22-én találtunk. A döntően Microcystis kolóniák (kb. 80%) és kisebb mértékben
Aphanizomenon sp. fonalak, viszonylag homogén eloszlásban voltak jelen a felső 20 cm-es vízrétegben. A begyűjtött fitoplankton minta erőteljesen toxikusnak bizonyult (24h LC50 = 5,35 mg ml-1). A tározó területén 2006. október 8-án megismételtük a gyűjtést, ekkor azonban a cianobaktérium fonalak inkább a vízfelszínen lebegtek csomóba halmozódva. A cianobaktérium réteg kb. 5 – 6 m2-en terült el egy szélvédett vízterületen. A minta fajösszetétele nem különbözött számottevően az augusztusban gyűjtött anyagtól, ennek ellenére toxicitása már lényegesen kisebbnek bizonyult (24 h LC50 = 8,43 mg ml-1) (1. ábra). A cianobaktérium törzsek általános toxicitásának vizsgálata, hat minta esetében mutatott számottevő toxikusságot. A sórák akut toxicitási teszt alapján, a Kis-Balatonból izolált Anabaena spiroides ACT 9607, valamint a Balatonból izolált Aphanizomenon flos-aquae vegyes tenyészet, az Aphanizomenon flos-aquae ACT 9605 és a Cylindrospermopsis raciborskii ACT 9504 tenyészetek bizonyultak erőteljesen toxikusnak (2. ábra). A törzsek toxikussága közel azonos volt a pozitív kontrollként alkalmazott ausztrál Cylindrospermopsis raciborskii cianobaktérium (AQS) toxikusságával.
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
-1
mikrocisztin LR
ug toxin ml
mg liofilizátum ml -1
cilindroszpermopszin
0 AC
T9 6 07
AC
T9 60 1
AC T9 605
Ap
ha
veg yes
AC
T9 5 04
AC
T9 50 3
AQ S
3. ábra. Toxikus cianobaktérium törzsek 24 órás LC50 értéke, összehasonlításban a pozitív AQS kontroll, valamint a tisztított toxinok toxicitási értékeivel
Az általunk vizsgált törzsek közül az Anabaena aphanizomenoides ACT 9601, valamint az Aphanizomenon flos-aquae ACT 9605 toxicitását korábban Hiripi és munkatársai is tesztelték (1998) a szabvány egérteszttel és az afrikai vándorsáskán (4. táblázat). A toxicitási adatok összevetése során kitűnt, hogy a sórák teszttel meghatározott 24 órás LC50 értékek az afrikai vándorsáska teszttel megegyező különbségeket mutatnak a két törzs toxikusságában, és mindkét gerinctelen ellentétesen reagált a kivonatokra, mint az egér, ami részben a kivonatok különböző jellegű toxintartalmát feltételezi, és amelyekre a gerinces, ill., gerinctelen szervezetek specifikus érzékenységet mutatnak (4. táblázat). 4. táblázat. A sórák-, valamint egyéb toxicitási tesztek érzékenységének összehasonlítása Törzs
Faj
Algakivonat toxikussága Afrikai Sórák Egérteszt vándorsáska* LD50 LC50 -1 -1 LD (mg kg ) 50 (mg kg ) (mg ml-1) 150 170,2 ± 14,7 10,30 320 60,0 ± 4,4 6,15 *
ACT 9601 Anab. aph. ACT 9605 Aph. flos-a. * Hiripi és mts.(1998)
A sórák toxicitási teszt alapján a vizsgálatba vont törzsek közül, az Anabaena spiroides ACT 9607, az Anabaena aphanizomenoides ACT 9601, az Aphanizomenon flos-aquae vegyes állomány, az Aphanizomenon flos-aquae ACT 9605, valamint a Cylindrospermopsis raciborskii ACT 9504 és ACT 9503 törzsek esetében valószínűsíthető cianotoxin termelése szignifikáns mennyiségben. A hatóanyagok azonosítására alkalmazott eljárások kiválasztása irodalmi ismeretek alapján történt, figyelembe véve az összes potenciális toxint, amelyet az általunk vizsgált fajok esetében európai édesvizekben már kimutattak. Így az esetünkben toxikusnak bizonyult cianobaktérium törzsek főként neurotoxinokat, valamint cilindrospermopszint termelhetnek. Korábbi molekuláris és egyéb toxikológiai vizsgálatokban azonban már kimutatták, hogy sem a két Aphanizomenon flos aque, sem a két Cylindrospermopsis raciborskii törzs nem termel (Hiripi és mtsai 1998, Kiss és mtsai 2002), ill. nem képes cilindrospermopszint termelni, mivel a cilindrospermopszin termelésében kulcsszerepet játszó PS és PKS gének jelenlétét bizonyító PCR termékeket nem találtak e törzsekben
(Kovács és mts., in press). Az előzményeknek megfelelően tehát a hat toxikus törzset csak a szaxitoxinok, anatoxinok, valamint anatoxin-a(s) tartalomra vizsgáltuk. Szaxitoxinok jelenlétét egyetlen mintában sem észleltük, ellenben a két Aphanizomenon flos aquae törzs kapilláris elektroforézis vizsgálata anatoxin-a bomlástermékére utaló eredményt adott. Az eredmények tisztázására, újból elindítottuk a két törzs tömegtenyésztését, és az analitikai vizsgálatokat megismételjük. Az anatoxin-a(s) kimutatására alkalmazott in vitro acetilkolineszteráz gátlás vizsgálat három törzs esetében pozitív anatoxin-a(s) jelenlétét valószínűsítette (3. ábra).
ACT 9607 (Anabaena sp.)
ACT 9504 (Cyl. racib.)
ACT 9503 (Cyl. racib.)
100 90
AChE gátlás [%]
80 70 60 50 40 30 20 0,25
0,50
0,75
1,00
mg liofilizátum
3. ábra. Cianobaktérium törzsek acetilkolineszteráz gátló hatása
A 0,25 mg Anabaena spiroides (ACT 9607) liofilizátum 60%-os enzimatikus gátlást eredményezett. Kisebb mértékű 35- ill. 40%-os gátlást mértünk még a Cylindrospermopsis raciborskii ACT 9504, valamint ACT 9503 törzsek, és minden mintánál szignifikáns dózisfüggést találtunk. Mivel az anatoxin-a(s) pontos azonosítása csak HPLC-MS technikával valósítható meg, így az eredmények értékelésénél csak azt
állíthatjuk biztonsággal, hogy a cianobaktérium minták anatoxin-a(s) típusú antikolineszteráz alkaloidát tartalmaztak. Referencia toxin hiányában, a törzsek hatóanyag tartalmát a meghatározott enzimatikus gátlás mértékéből kiindulva, valamint a Villatte és mtsai (2002) által közölt autentikus anatoxin-a(s) felhasználásával készített kalibrációs görbe alapján becsültük. A szerzők az acetilkolineszteráz gátlás tesztet ugyancsak cianobaktérium minták anatoxin-a(s) tartalmának meghatározására alkalmazták. Az adatok alapján a 0,25 mg Anabaena spiroides liofilizátum 60%os enzimatikus gátlása megegyezik a 6 µg l-1 anatoxin-a(s) vizes oldatának hatásával, ami 240 µg g-1 anatoxin-a(s) tartalmat valószínűsít a liofilizátumban. A számításokat azonos módon elvégezve a másik két törzs esetében a következő toxintartalmat kaptuk: az ACT 9504 sz. törzsnél 168 mg g-1, az ACT 9503-as törzsnél 140 µg g-1. Az eredmények viszonylag kis mennyiségű toxin jelenlétét mutatják, amennyiben figyelembe vesszük az 1995 során dán tavakban vizsgált fitoplankton tömegprodukció 2300 – 3300 µg g-1 toxin tartalmát (Henriksen és mtsai 1997), az anatoxin-a(s) toxicitása azonban 1000 szer meghaladja, pl. a paraoxon rovarirtó szer hatását, és az LD50 értéke egértesztben 50 µg kg-1 adódik. A 2006-ban észlelt lokális fitoplankton tömegprodukció gyakorisága és általános toxicitásának mértéke mindenképpen indokolja a jövőben is a toxikus fitoplankton tömegprodukciók kiszűrését a Balaton és a KisBalaton területén, a vizsgálatokat egyben kiterjesztve a hatóanyagok azonosítására is. A toxikus cianobaktérium törzsek részleges analitikai és immunkémiai vizsgálata nem magyarázza meg minden esetben a törzsek általános toxicitásának mértékét, ezáltal e területen is a törzsek toxicitásának további vizsgálata mindenképpen indokolt. Köszönetnyilvánítás A kutatómunka az Önkormányzati és Területfejlesztési Minisztérium, valamint az OTKA K63451 anyagi támogatásával készült. A szerzők köszönetüket fejezik ki Dr. Borbély György és Dr. Vasas Gábornak a kutatás során nyújtott szakmai segítségért. A toxin standardokat a CETOX Analitikai és Toxikológiai kutató, szolgáltató és szaktanácsadó Kft. bocsátotta rendelkezésünkre.
Irodalom Beattie K. A., Ressler J., Wiegand C., Krause E., Codd G. A., Steinberg C. E. W., Pflugmacher S. (2003) Comparative effects and metabolims of two microcystins and nodularin in the brine shrimp Artemia salina. Aquat. Toxicol. 62: 219-226. Bernard C., Harvey M., Briand J.F., Biré R., Krys S., Fontaine J.J. (2003) Toxicological comparison of diverse Cylindrospermopsis raciborskii strains: evidence of liver damage caused by a french C. raciborskii strain. Environ. Toxicol. 18(3): 176-186. Carmichael W.W., Evans W.R., Yin Q.Q., Bell P., Moczydlowski E. (1997) Evidence for paralytic shellfish poisons int he freshwater cyanobacterium Lyngbya wollei (Farlow ex Gomont) comb. nov. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3104–3110. Codd G.A., Morrison L.F., Metcalf J.S. (2005) Cyanobacterial toxins: risk management for health protection. Toxicol. Appl. Pharm. 203: 264-272 Finney, D.J., 1971. Probit Analysis. Hutchinson, T.H., Manning (eds.), M.J.Cambridge University Press, New York, p. 337. Gerdts G., Hummert C., Donner G., Luckas B., Schütt C. (2002) A fast fluorimetric assay (FFA) for the detection of saxitoxin in natural phytoplankton samples. Mar. Ecol. Prog. Ser. 230: 29-34. Henriksen P., Carmichael W. W., An J., Mostrup Ø. (1997) Detection of an anatoxina(s)-like anticholinesterase in natural blooms and cultures of cyanobacteria/bluegreen algae from Danish lakes and in the stomach contents of poisoned birds. Toxicon 35: 901-913. Hiripi L., Nagy L., Kalmár T., Kovács A., Vörös L. (1998) Insect (Locusta migratoria migratorioides) test monitoring the toxicity of cyanobacteria. Neurotoxicology 19: 605-608. Kiss T., Vehovszky Á., Hiripi L., Kovács A., Vörös L. (2002) Membrane effects of toxins isolated from a cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, on identified molluscan neurones. – Comp. Biochem. Physiol. C 131: 167-176. Lindsay J., Metcalf J. S., Codd G. A. (2006) Protection against the toxicity of microcystin-LR and cylindrospermopsin in Artemia salina and Daphnia spp. By pre-treatment with cyanobacterial lipopolysaccharide (LPS). Toxicon 48: 9951001. Metcalf J. S., Lindsay J., Beattie K. A., Birmingham S., Saker M. L., Törökné A. K., Codd G. A. (2002) Toxicity of cylindrospermopsin to the brine shrimp Artemia salina: comparisons with protein synthesis inhibitors and microcystins. Toxicon 40: 1115-1120. Pitois S., Jackson M.H., Wood B.J.B. (2001) Sources of the eutrophication problems associated with toxic algae: an overview. J. Environ. Health 64: 25– 32. Valério E., Pereira P., Saker M.L., Franca S., Tenreiro R. (2005) Molecular characterization of Cylindrospermopsis raciborskii strains isolated from Portuguese freshwaters. Harmful Algae 4: 1044–1052. Vasas G., Szydlowska D., Gáspár A., Welker M., Trojanowicz M., Borbély G. (2006) Determination of micorcystins in environmental samples using capillary electrophoresis. J. Biochem. Bioph. Meth. 66: 87-97. Villatte F., Schulze H., Schmid R.D., Bachmann T.T. (2002) A disposable acetylcholinesterase-based electrode biosensor to detect anatoxin-a(s) in water. Anal. Bioanal. Chem. 372 (2): 322-326.
