BAHAN DAN NIETODE
Bahan dan Alat Bahan Pernilahan isolat Mikroorganisme. Enam isolat yang mampu tumbuh pada suhu 60°C
dan bersifat proteolitik dipilih dari 121 isolat yang diisolasi dari tanah di sekitar
kawah Domas, Tangkuban Perahu, Jawa
pendahuluan
dilakukan
oleh
Kusumadi
(1998)
Barat. di
lsolasi
Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas, lnstitut Pertanian Bogor. Bogor. Kode enam isolat yang dimaksud adalah 03, 05. 7-2,SA11, TPS-2, dan TPS-7 yang semuanya menunjukkan aktivitas proteolitik
yang nyata pada media padat yang mengandung skimmed milk.
Media
pertumbuhan
dan
produksi
protease.
Media
yang
digunakan untuk penapisan mikroba proteolitik merupakan media untuk mikroba Themus thermophillus (Baker ef at, 1999) dimodifikasi dengan penambahkan CaC12,
susu skim dan gum gellan "Gelrite" serta agar
sebagai pengental. Sedangkan susunan media untuk uji pertumbuhan dan produksi enzim berkomposisi sama kecuali tanpa penambahan susu skim, agar dan gum gellan. Adapun komposisi medium tersebut adalah ekstrak khamir 0,4%(btv); polipepton 0,8%( blv); NaCl 0,2%(blv); CaCI2
0, I %(b/v); gum gellan 0,5%(b/v), agar 1 ,O%(b/v) dan susu bubuk skim 2%(blv).
tdentifikasi isolat.
Bahan kimia untuk pewarnaan gram dan spora,
ekstraksi DNA genom isolat, analisis reaksi biokirnia dan bahan penyangga serta bahan kimia lainnya merupakan bahan kimia untuk analisis. Untuk analisis 16s rRNA menggunakan bahan-bahan kit : Gene clean (Bio 101, La Jolla, California, USA), Ready To ~o~~ PCR beads (Arnersham,
Pharmacia-Biotech, Uppsala,
Sweden),
primer
untuk
amplifikasi gen penyandi 16s rRNA 63f : 5'-CGA GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3' dan 1387r :5'-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3' (Marches; et a/,1998). agarose, film polaroid dan bahan-bahan larutan penyangga dengan standar untuk analisis.
Pemurnian
protease.
Bahan kimia untuk pemurnian adalah
amon~urnsulfat. DEAE Sephadex A50 (Sigma, Saint Louis, MO, USA), DEAE sepharose Fast Flow, Superdex 75, kofom P I 0 yang berisi matriks Sephadex G 25 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) dan SDSIPAGE-kasein.
Karakterisasi protease. Bahan kimia untuk mengukur kadar protein, aktivitas protease dan uji sifat-sifat enzim adalah sebagai berikut: serum albumin bovin fraksi V (Sigma, Saint Louis, MO, USA). Etanol absolut,
H3P04, Comrnassie Brilliant Blue G-250 dan R-250. Folin C~ocalteu. tirosin, kasein Hammarstein, Trisma baze, HCI, fenil rnetil sulfonil flourid (PMSF), etilen diarnin tetra asetat (EDTA), CaCi2, CoC12, MgC12, MnC12, NiC12. ZnClz,NaCl dan KC1 (Merck, Germany). Bahan kimia untuk SDSIPAGE: Sodium dodesil sulfat (SDS), Triton X100, amoniurn persuffat, TEMED, akrilamida, N, N'-metilen bisakrilamida, P-merkaptoetanol,
ditiotreitol,
metano(,
asam
asetat
glutaraldehida, formaldehida, AgN03 dan asam sitrat.
glasial,
Bahan substrat:
kolagen, gelatin, elastin bovin dan N-[3-(2-Furyl)acryfoyl]-Gly-L-Leu Amide (FAGLA). Sernua bahan kimia untuk PAGE dan substrat adalah dari Sigma (Saint Louis, MO, USA).
Penanda protein Low Molecular
Weight (LMW) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) yang terdiri atas fosforilase b otot kelinci (94kD), serum albumin bovin (67kD). ovalburnin putih telur ayarn (43kD). karbonik anhidrase eritrosit bovin (30kD). inhibitor tripsin kedele (20,lkD) dan a-laktalburnin susu bovin (14,2kD). yang
Penanda protein Dalton Mark VII-L (Sigma. St. Louis, USA)
terdiri
dari
albumin
bovin
(66kD),
albumin
telur
(45kD),
gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase otot kelinci (29kD), tripsinogen pankreas bovin (24kD). inhibitor tripsin kedele (20,7kD) dan a-laktalbumin susu bovin (14.2kDf.
Alat Pernilahan isofat.
Peralatan yang digunakan adalah otoklaf.
inkubator "Memrnert", shaking waterbath btterman, spektrofotorneter =Milton-Roy401" (Vis), dan "Milton-Roy 1000" (UVNis), pipet mikro, dan pH meter.
ldentifikasi isotat.
Piranti elektorforesis "MINI Gel" (BioRad MINI-
S U B ~CELL GT), mesin PCR (Gene ~
m PCR ~ "System 2400, Perkin
Elmer, Branchburg, New Jersey), UV transiluminator, mesin sequencer DNA: ABI PRISM-
377 (Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey) dan
mikroskop.
Pernumian dan karakterisasi protease. Peralatan yang digunakan dalam
percobaan
antara
lain,
shaking
waterbath
btterman,
spektrofotometer "Milton-Roy 401" (Vis), dan "Milton-Roy 1000" (UVNis) (USA), piranti elektroforesis gel vertikal "Biometra" (Germany), pemusing mikro 8 pemusing berpendingin "Sorvall" dan piranti kromatografi kolorn Aktaexplorer
100 (Amersham Pharmacia Biotech. Buckinghamshire,
England) yang dilengkapi dengan monitor spektrofotometer UV-900, monitor
pH/C-900
dan
fraction-collector
Pharmacia Biotech, England).
(Amersham
Sistem Aktaexplorer 100 dilengkapi
dengan perangkat lunak UNICORNcontoh dan jenis gradien
FRAC-901
untuk mengatur laju alir, pemuatan
Metodologi Penelitian pendahuluan Pemilahan dan identifikasi isolat Pemilahan isolat.
Percobaan dilakukan dengan menumbuhkan
mikroba dalam media cair dan padat dengan komposisi seperti yang disebutkan dalam bahan yang digunakan untuk penelitian (halaman 3839) dan diinkubasikan pada suhu 70°C, mikroba yang mampu tumbuh
dengan baik, kemudian ditumbuhkan pada suhu 75OC.
Adanya
pertumbuhan mikroba ditandai dengan meningkatnya absorbans larutan fermentasi
pada
media
cair
pada
panjang
gelombang
660nm.
Sedangkan kemampuan rnenghasilkan protease ekstraseluler ditandai dengan terbentuknya koloni dengan zona bening yang sangat nyata pada media padat yang ditambah skimmed milk. Laju
pertumbuhan
isolat dan
produksi
protease.
Setelah
didapatkan isolat yang mampu tumbuh pada suhu tertinggi dibanding isolat-isolat yang ditapis dan rnenunjukkan aktivitas proteolitik yang nyata pada media padat dan cair dilanjutkan dengan pengamatan laju pertumbuhan dan produksi protease untuk mengetahui waktu yang optimal untuk memproduksi enzim yang digunakan dalam penelitian ini. Untuk mengetahui waktu produksi optimal dilakukan pengamatan laju perturnbuhan dan laju produksi protease secara fermentasi kocok. Seratus ml media cair dalam 500 ml erlenmeyer diinkubasikan dalam shaking
waterbath
oftermann
pada suhu pertumbuhan dari
hasil
pengarnatan pemilahan isolat. Aktivitas proteolitik diukur rnenurut metode Walter (1984) yang dirnodifikasi (Lampiran 1: 1.2.1) dan kadar protein diukur dengan rnetode Bradford (7986) (Lampiran 1: 1:1).
Sedangkan
laju pertumbuhan diarnati dengan mengukur absorbans iarutan ferrnentasi menggunakan Milton-Roy spectronic 401 pada panjang gelombang 660 nm.
Pengambilan
contoh
untuk
percobaan
pengarnatan
laju
perturnbuhan dan produksi protease dilakukan tiap 4 jam sekali pada 12 jam pertama kemudian 6 jam sekali hingga waktu fermentasi jam ke 36. Percobaan fermentasi dilakukan dengan dua kati ulangan.
ldentifikasi isolat
Untuk
mengidentifikasi
isolat
yang
terpilih
dilakukan
analisis
rnorfologis dan reaksi biokimia isolat serta sekuen gen penyandi 16s rRNA.
Pengamatan Morfologi. Morfologi isolat yang diamati meliputi bentuk
koloni tunggal, warna dan elevasi koloni serta bentuk sel. Bentuk sel dan hasil pewarnaan gram sel vegetatif dan spora diarnati dibawah mikroskop cahaya. Reaksi pewarnaan gram dilakukan menurut metoda Cappuccino & Sherman (1983) (Lampiran 1: 1.4)
Pengamatan reaksi biokimia.
Reaksi biokirnia yang diuji adalah
dekarboksilasi lisin dan ornitin, pernbentukan HzS, hidrolisis glukosa,
43
rnanitoi dan xilosa, hidrolisis o-nitrofenil p-d-galaktosida (ONPG) oleh
p-
galaktosidase, produksi indol dari triptofan, hidrolisis urea, prodrrksi aseton, penggunaan sitrat sebagai sumber karbon tunggal, produksi indol piruvat dari deaminasi triptofan, pencairan gelatin, penghambatan rnalonat,
fermentasi
inositol,
sorbitol,
ramnosa,
sukrosa,
laktosa,
arabinosa, adonitol, rafinosa, salicin, hidrolisis arg~ninmenjadi ornitin. Pengamatan dilakukan dengan dua kali ulangan.
lsolasi dan pemurnian DNA.
lsolasi DNA genom isolat yang
ditumbuhkan dalam medium Thermus spp pada suhu pertumbuhan isolat (70%) selama f12 jam dilakukan menurut metode Anonymous (2000) (Lampiran 1: 1.5).
Verifikasi suspensi DNA yang diperoleh dilakukan
dengan melarikan pada efektroforesis gel agarose 1%.
DNA yang
diperoleh dimurnikan menggunakan kit "Gene Clean" (Bio 101, La Jolla, CA, USA). Besarnya gen penyandi 16s rRNA adalah *1542 nukleotida (Watson et a/,1987).
Amplifikasi dan analisis sekuen DNA penyandi 16s rRNA. DNA yang
yang
telah
dimurnikan
digunakan
sebagai
templat
untuk
penggandaan gen penyandi 16s rRNA menggunakan mesin PCR dengan primer spesifik prokariot (Marchesi et a/,1998) yaitu forward primer 63f (5'-CGA GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3') dan reverse primer 1387r (5'GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3').
Protokol PCR yang dilakukan
adalah, pre staff 94OC, 2 menit, denaturasi 92OC, 30 detik, annealing 55°C 30 detik, elongation 75OC, 1 menit, Post
PCR 75OC,20 menit dan Stop
PCR 4% dengan jumlah siklus 30 (Anonymous, 2000).
Produk PCR
kemudian dimurnikan lagi dengan kit "Gene Clean" dan dianalisa sekuen DNA nya menggunakan mesin DNA squencer.
Persentase kemiripan
sekuen gen penyandi 16s rRNA isolat yang dianalisa dengan sekuen 16s rRNA bank data dianalisa menggunakan program "FASTA3" (Pearson & Lipman, 1988, European Bioinformatics Institute, http//:wwwlebi.ac.uk). Data yang diperoleh dari "FASTAB" adalah sekelompok mikroba yang diperkirakan mempunyai kemiripan sekuen gen penyandi 16s-rRNA. Sekuen gen penyandi 16s-rRNA kelompok mikroba tersebut di-copy dari database 16s-rRNA dan menggunakan program "ClustalW lalu dicari "Multiple sequence alignment" diantara sekuen gen penyandi 16s-rRNA tersebut, kemudian dilanjutkan dengan analisa
"phylogenetic tree"
menggunakan program "Tree-con" (Van de Peer dan Wahter, 1993).
Pemurnian dan karakterisasi protease Untuk keperluan karakterisasi sifat biokimia tertentu seperti antara lain, jenis protease, spesifisitas substrat, bobot molekul dan kestabilan panas serta memantau tahapan permurnian dan menentukan bahan matriks yang akan digunakan dalam kromatografi kolom dilakukan karakterisasi enzim dengan menggunakan larutan enzim kasar. Larutan enzim kasar yaitu beningan bebas sef diperoleh dengan cara pemusingan
larutan fermentasi dengan kecepatan 3500 rpm selarna 30 menit. Faktorfaktor yang rnempengaruhi aktivitas enzirn yang diarnati adalah suhu, pH, ion logarn, senyawa pendenaturasi, senyawa penghambat protease spesifik, bahan detejen ionik dan nonionik. Selain itu juga diamati perkiraan bobot molekul protein yang merniliki aktivitas proteolitik Serta kadar protein enzirn.
Pemurnian protease Tahap awal pemurnian untuk memekatkan konsentrasi protein dalarn larutan fermentasi dilakukan dengan cara pengendapan dengan garam amonium sulfat atau aseton.
Kadar amonium sulfat ditentukan dengan
serangkaian percobaan pengendapan dengan berbagai konsentrasi amonium sulfat yaitu 30% (b/v) sampai dengan 70% (b/v) dengan selang konsentrasi 5%.
Parameter yang diukur untuk menentukan kadar
amonium sulfat yang ditarnbahkan adalah kadar protein dan aktivitas protease endapan yang dihasilkan. digunakan
untuk
pengendapan
Konsentrasi amonium sulfat yang protein
selanjutnya
adalah
yang
menghasilkan endapan protein terbanyak dan aktivitas protease tertinggi. Setiap endapan protein diperoleh dari 500 ml larutan ferrnentasi kemudian dilarutkan lagi dengan 10 ml larutan penyangga TrisICI pH 7,O. Tahap
selanjutnya
adalah
pemisahan
fraksi-fraksi
protein
rnenggunakan kromatografi kdom penukar anion DEAE-Sepharose fast flow menggunakan piranti Aktaexptorer 100. Sebagai fase mobil adalah
larutan penyangga 50 mM Tris-CI pH 9.01 5mM CaC12 dengan gradien bertingkat NaCl 0,O-0,25-0,5M. ?2o0c.
Semua prosedur dilakukan pada suhu
Garam NaCl dihilangkan dengan melewatkan fraksi yang
memiliki aktivitas proteolitik dalam kolom P I 0 yang berisi matriks Sephadex G 25. Untuk mendapatkan enzim murni, enzim yang telah dipisahkan dengan kolom penukar ion di elusikan lagi pada kromatografi kolom filtrasi gel menggunakan Superdex 75 dengan fase mobil larutan penyangga TrisICI pH 7.5. CaC12 5 mM. Pengecekan perlakuan pemurnian, menentukan jumlah pita serta perkiraan bobot molekul pita protein enzim yang memiliki aktivitas proteolitik dilakukan dengan metode zimografik (Lampiran 1: 1.7).
Uji protein
Untuk mengukur kadar protein beningan bebas sel dan enzim kasar hasil presipitasi garam arnonium atau aseton dingin dan hasil pemekatan menggunakan membran uitrafiltrasi dilakukan menurut metode Bradford (1976) (Lampiran 1: 1.1) menggunakan spektrofotorneter Milton-Roy model spectronic 401. membuat
kurva
Serum albumin bovin fraksi V digunakan untuk
standar
dengan
konsentrasi
400-1400
~glml.
Sedangkan untuk mengukur kadar protein contoh hasil pemisahan kolom kromatografi penukar ion dilakukan dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 280 nm yang merupakan fasilitas pada piranti kromatografi kolom Aktaexplorer 100.
Uji aktivitas protease Aktivitas
proteolitik
diukur
berdasarkan metode
Walter
(1984)
(Lampiran 1: 1.2.1) atau Kunitz (1947) (Lampiran 1: 1.2.2) yang
-
.
dirnodifikasi dengan menggunakan substrat kasein.
Aktivitas protease menurut metode Walter (1984) dihjtung menurut persamaan 1 dibawah ini. Satu unit (U) aktivitas protease didefinisikan sebagai banyaknya enzirn yang menghasilkan 1 pmol tirosin per rnenit.
Aktivjtas
=
(Acontoh-Ablangko)
-------------------
X
(faktor pengenceran enzim)
.....................................
(AstandarAblangko)
(I)
(waktu reaksi)
Aktivitas enzim dalam U/ml A = absorbans pada 578 nm
Pengaruh suhu dan p H pada aktivitas proteolitik Untuk mengarnati pengaruh suhu terhadap aktivitas
proteolitik,
digunakan larutan penyangga TrisICI 50 mM pada nilai pH setara dengan pH media pertumbuhan yaitu pH 7,O. Kisaran suhu yang diamati adalah 60°C sampai dengan 100°C dengan rentang 5OC. dalam shaking waferbafh Offermann.
Reaksi dilakukan
Sedangkan pengaruh pH pada
aktivitas protease ditentukan dengan menginkubasikan enzim dalarn larutan penyangga universal (Lampiran 1: 1.3) dengan rentang pH 6 sampai dengan 1Ipada suhu optimum hasil pengamatan sebelumnya.
Pengaruh penghambat protease spesifik,
kation, deterjen dan
pereaksi denaturasi
Untuk mengetahui jenis protease, larutan enzim diinkubasikan dengan beberapa inhibitor protease spesifik menurut metode Klingeberg
ef a1
(1995) yang dimodifikasi. Larutan enzim ditambah senyawa penghambat protease spesifik dengan
konsentrasi akhir 2mM dan 5mM dan
diinkubasikan selama satu jam pada suhu ruang (E25OC) sebelum diukur sisa aktivitas proteolitiknya.
Inhibitor protease yang dicoba adalah
penghambat spesifik protease serin fenil metil sulfonil florida (PMSF) yang dilarutkan dalam pelarut dimetil formamida dan penghambat spesifik protease logam etilen diamin tetra asam asetat (EDTA). Untuk mengetahui pengaruh kation bivalen dan monovalen dilakukan menurut metode Ktingeberg et a1 (1995) yang dimodifikasi. Larutan enzim ditambah dengan larutan garam logam khlorida dengan konsentrasi akhir kation 2mM dan 5mM dan diinkubasikan selama 30 menit pada suhu ruang (E25OC) kemudian diukur aktivitas proteasenya. Adapun larutan garam logam yang digunakan adalah CaC12, CoC12, MgC12, MnC12, NiC12, ZnC12,NaCl dan KCI. Pengaruh bahan deterjen terhadap ketahanan protease juga diamati rnenurut metode Cowan et a1 (1987) yang dimodifikasi. Bahan deterjen yang digunakan adalah Triton X-100 2,5% dan 5.0% (vlv) serta sodium dodesil sulfat (SDS) 0.7% dan 1.0% (blv). Setelah inkubasi pada suhu
ruang (+25OC) selama satu jam, kemudian ditentukan sisa aktivitas proteasenya. Pereaksi denaturasi yang digunakan untuk mengetahui pengaruhnya terhadap aktivitas fraksi enzim adalah p-merkaptoetanol 2,5%(v/v), ditiotreitol 5 0 8 (blv) dan urea l%(b/v).
Pengujian dilakukan dengan
metode zimografik (Lampiran 1:I .7). Aktivitas
enzim
setelah
perlakuan
diamati
dengan
mengukur
aktivitasnya secara kuantitatif menurut metode Walter (1984) (Lampiran 1: 1.2.1) atau kualitatif menggunakan metode zimografik (Lampiran 1:
1.7).Aktivitas protease enzim tanpa perlakuan dihitung sebagai aktivitas 100%.
Analisis elektroforesis gel dan zirnografik
Analisis gel elektroforesis dilakukan dengan menggunakan piranti elektroforesis gef poiiakrilamida (PAGE) "Biometra" dengan plat gel vertikal (ukuran gel 88mm x 148mm x lmm).
Voltage yang digunakan
untuk proses elektroforesis adalah 100 Volt selama 1,5 jam. PAGE digunakan untuk menentukan bobot molekul dan melihat aktivitas enzim terhadap beberapajenis substrat protein. Untuk visualisasi pita protein dilakukan pewarnaan menggunakan Commassie
Brilliant
blue R-250 danlatau perak nitrat menurut Walker (1998) (Lampiran 1:
Untuk mengarnati adanya pita
protein yang
rnemiliki aktivitas
proteolitik dalam larutan enzirn ekstraseluler kasar, dan rnernantau larutan enzim hasil pernurnian dilakukan dengan metode zirnografik. Metode zirnografik yang digunakan adalah rnodifikasi rnetode Freidrich & Antranikian (1996) (Lampiran 1: 1.7). Sela~nitu metode zirnografik juga
digunakan untuk rnengarnati pengaruh beberapa pengharnbat protease spesifik, pereaksi denaturasi dan bahan deterjen terhadap aktivitas pita protein yang memiliki aktivitas proteolitik secara kualitatif.
Matriks gel
untuk analisis zimogram adalah kasein 0.1 % (blv) yang dikopolirnerisasi dengan akrilamid 8%(b/v). Pengujian dilakukan dengan cara rnencampur enzim dengan larutan penyangga contoh berisi 1% SDS tanpa
13-
merkaptoetanol, setelah dilarikan dalarn 8% SDSIPAGE-O,1% kasein, gel dipotong-potong masing-masing satu sumur gel dan direndam dalam penyangga TrislCl50 mM dengan tambahan CaC12 5rnM dan bahan yang diuji. Konsentrasi akhir bahan yang diuji dalam larutan penyangga TrislCl untuk inkubasi reaksi enzirn adalah sebagai berikut: PMSF 2rnM (blv). EDTA 2rnM (blv), SDS I%(b/v), Triton X-100 5Oh(v/v), p-rnerkaptoetanol
2,5%(v/v), ditiotreitot 0,5O/bo (b/v) dan urea l%(b/v). dalam inkubator "Mernmert" pada 70°C
lnkubasi dilakukan
selarna 30 menit.
Reaksi
dihentikan dengan rnernbuang larutan penyangga dan mengganti dengan larutan TCA 10% dingin (5OC) selama 15 menit. Untuk penarnpakan pita gel diwarnai dengan larutan pewarna Cornrnassie Brilliant Blue R-250. Setelah direndarn dalam larutan pewarna selama 30 rnenit-60 men~t,gel
direndam dalam larutan peluntur warna dan larutan peluntur berkali-kali diganti hingga pita-pita proteolitik terlihat jelas. Untuk mengamati pengaruh suhu terhadap pita protein yang rnemiliki aktivitas proteolitik, sebelum larutan enzim dalam larutan penyangga TrislCl50 mM + CaC12 5 rnM, p H 7,O dicarnpur dengan larutan penyangga contoh
elektroforesis
yang
mengandung
1%
SDS
tanpa
P-
rnerkaptoetanol, larutan enzim diinkubasikan pada suhu 75OC selama 30', 60' dan
go',
pada 85OC selama
10' dan 15'.
lo',
20'dan 30' dan pada 95OC selama 5',
Setelah proses elektroforesis, gel diinkubasikan dalam
TrislCl 50 mM, 5 mM CaC12, pH 7,O pada 70°C selama 30 menit. Perlakuan penghentian reaksi, pewarnaan dan pelunturan warna selanjutnya sama dengan penjelasan diatas.
Hidrolisis protein Aktivitas hidrolisis enzim terhadap beberapa jenis substrat protein seperti albumin, gelatin, kolagen dan elastin bovin juga diamati. Masingmasing protein dilarutkan atau disuspensikan dengan konsentrasi 0,1% dalam larutan penyangga TrislCI pada pH 8.0. Delapan ratus WIsuspensi protein ditarnbah 200 p1 larutan protease ekstraseluler diinkubasikan pada suhu aktivitas optimum enzim selama 10 menit kemudian segera dimasukkan kedalam nitrogen cair untuk menghentikan reaksi yang selanjutnya dikeringkan secara pengeringan beku.
Untuk mengetahui
apakah enzim aktif pada suhu 37OC, digunakan substrat serum albumin
bovin 0,1%, pengambilan contoh protein terhidrolisis dilakukan dengan rentang waktu 30', 60'. 120', 180', 240' dan 300'. Pengamatan aktivitas protease terhadap serum albumin bovin juga dilakukan pada suhu optimum enzim dengan rentang waktu 2'. 4'. 6', lo', 15' dan 30'. Pengarnatan hasil aktivitas enzirn terhadap substrat protein dilakukan dengan
cara
elektroforesis
gel
(SDS-PAGE)
dengan
pewarnaan
Coomassie blue R250. (Lampiran 1: 1.7).
Hidrolisis peptida Percobaan ini untuk mengetahui spesifitas enzim tehadap suatu peptida khromogenik sintetis spesifik untuk jenis protease tertentu dengan metode yang digunakan oleh Klingeberg et al (1991). Jenis peptida yang digunakan sebagai substrat hidrolisis dalam percobaan ini adalah kromogenik sintetik asam amino p-nitroanifin (pNA).
Pembebasan p-
nitroanalin dipantau secara spektrofotometri pada panjang gelombang 405 nm dibandingkan dengan blangko (tanpa enzim). Adanya aktivitas enzim ditandai dengan peningkatan nilai absorbans..
Larutan enzim
dalam penyangga TrisICI 50 mM yang mengandung 5 mM CaClzpada pH 7,5 diinkubasikan pada 60°C dan diamati setiap 5 menit. Substrat yang
digunakan adalah substrat khromogenik spesifik untuk protease logam netraf termolisin: N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Gly-L-Leu Amide (FAGLA).
Kestabilan panas protease
Pengamatan pengaruh suhu terhadap stabilitas aktivitas protease dilakukan pada suhu dan diatas suhu aktivitas optimal. aktivitas enzim dilakukan tiap 10 menit.
Pengamatan
Stabilitas enzim dinyatakan
dalam nilai D, z dan t ~ .Nilai D didefinisikan sebagai ketahanan enzim terhadap panas pada suhu tertentu hingga aktivitas enzim tinggal 10% dari aktivitas semula (Silliker et a/,1980) atau menurut Toledo (1991) nilai D adalah waktu yang dibutuhkan untuk menurunkan aktivitas enzim pada suhu tertentu dengan faktor 10.
Nilai D dapat dihitung sebagai nilai
kebalikan negatif dari kemiringan grafik hubungan logaritma aktivitas enzim terhadap waktu (persamaan 2)(Toledo, 1991). Nilai z merupakan perubahan suhu yang diperlukan untuk mengubah laju inaktivasi enzim dengan faktor 10 Toledo (1991) atau dapat juga dihitung dari persamaan grafik hubungan antara logaritma nilai D pada berbagai suhu pemaparan terhadap suhu pemaparannya (Silliker et
a/,
7 980). Sedangkan nilai t . ~suatu enzim adalah waktu inkubasi pada suhu tertentu yang menyebabkan aktivitas enzim tinggal 50% dari aktivitas semula. Log (A) AO : t :
= (tlD) + Log (Ao) aktivitas enzim pada awal inkubasi. waktu inkubasi.
