BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di laboratorium kultur jaringan Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB Darmaga. Penelitian berlangsung dari bulan April sampai dengan September 2009.
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi beberapa jenis media yaitu media MS (Murashige and Skoog), media B5 (Gamborg B5), dan media WPM (Woody Plant Medium). Zat pengatur tumbuh yang digunakan meliputi jenis auksin (2.4 D, picloram, dan NAA) dan jenis sitokinin berupa BAP. Sumber eksplan menggunakan melon H7 koleksi Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika Institut Pertanian Bogor. Eksplan yang digunakan berupa biji muda yang berasal dari buah berumur 15 hari setelah penyerbukan dan hipokotil yang berasal dari biji tua yang telah dikecambahkan. Bahan lain yang digunakan meliputi agar, gula, bakterisida, fungisida, aquades steril, karet, plastik, alkohol 70%, alkohol 96%, klorox, betadin dan deterjen. Alat yang digunakan adalah autoclave, botol kultur, gelas piala, erlemeyer, timbangan, cawan petri, gelas ukur, corong plastik, pH meter, laminar air flow cabinet, pinset, gunting, scalpel, lampu spirtus, botol sprayer, dan rak kultur.
Metode Penelitian Penelitian dilaksanakan dengan 2 percobaan. Masing-masing percobaan dilakukan terpisah. Percobaan I Penelitian dilaksanakan dengan menggunakan Rancangan faktorial yang disusun dalam Rancangan Acak Kelompok (RAK). Penelitian terdiri dari dua faktor yaitu faktor pertama media tanam terdiri dari tiga taraf yaitu MS, WPM, dan B5. Konsentrasi picloram sebagai faktor kedua terdiri dari empat taraf yaitu 0, 0.5, 1.0, 1.5 mg/L. Percobaan dilakukan dengan 3 ulangan dan setiap ulangan
15
terdapat 5 botol. Setiap botol terdapat 5 eksplan. Penanaman dilakukan selama 3 hari. Kombinasi media dan picloram yang digunakan adalah sebagai berikut:
Tabel 1. Kombinasi Media dan Konsentrasi Picloram Media
Konsentrasi Picloram (mg/L) 0
0.5
1.0
1.5
MS
M1
M2
M3
M4
B5
B1
B2
B3
B4
WPM
W1
W2
W3
W4
Model rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah
Yijk = μ + α i + β j + (αβ )ij + δ k + ε ijk i = perlakuan media tanam j = perlakuan taraf konsentrasi picloram k = 1, 2, 3 (ulangan) Dimana : = respon perlakuan = nilai tengah = pengaruh perlakuan media tanam = pengaruh perlakuan taraf konsentrasi picloram
(αβ )ij δk
= interaksi antara dua faktor perlakuan = pengaruh ulangan ke-k = pengaruh galat percobaan
Data hasil pengamatan dianalisis dengan uji-F. Jika uji-F nyata dilanjutkan dengan uji DMRT pada taraf 5%.
Percobaan II Penelitian dilaksanakan dengan menggunakan Rancangan faktorial yang disusun dalam Rancangan Acak Kelompok (RAK). Penelitian terdiri dari dua faktor yaitu faktor pertama taraf konsentrasi auksin (2.4 D dan NAA) masingmasing terdiri dari enam taraf yaitu 0, 1, 2, 3, 4, 5 mg/L. Konsentrasi BAP sebagai faktor kedua terdiri dari dua taraf yaitu 0 dan 0.1 mg/L. Percobaan dilakukan
16
dengan 3 ulangan dan setiap ulangan terdapat 3 botol. Setiap botol terdapat 5 eksplan. Penanaman dilakukan selama 3 hari. Kombinasi perlakuan adalah sebagai berikut:
Tabel 2. Kombinasi Auksin (2.4 D dan NAA) dan BAP Auksin (mg/L) Tanpa auksin 2.4 D
NAA
0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
BAP (mg/L) 0 A0B0 A1B0 A2B0 A3B0 A4B0 A5B0 A6B0 A7B0 A8B0 A9B0 A10B0
0.1 A0B1 A1B1 A2B1 A3B1 A4B1 A5B1 A6B1 A7B1 A8B1 A9B1 A10B1
Model rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah
Yijk = μ + α i + β j + (αβ )ij + δ k + ε ijk i = perlakuan taraf konsentrasi 2.4 D dan NAA j = perlakuan taraf konsentrasi BAP k = 1, 2, 3 (ulangan) Dimana : = respon perlakuan = nilai tengah = pengaruh perlakuan taraf konsentrasi 2.4 D dan NAA = pengaruh perlakuan taraf konsentrasi BAP
(αβ )ij δk
= interaksi antara dua faktor perlakuan = pengaruh ulangan ke-k = pengaruh galat percobaan
Data hasil pengamatan dianalisis dengan uji-F. Jika uji-F nyata dilanjutkan dengan uji DMRT pada taraf 5%.
17
Pelaksanaan Penelitian Sterilisasi Alat Alat yang digunakan dalam penelitian berupa botol kultur, pinset, scalpel, cawan petri, dan pisau. Alat dicuci menggunakan sabun sampai bersih lalu dikeringkan. Setelah itu alat diautoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 1.1 kgcm2 selama 1 jam.
Pembuatan Larutan Stok Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan dalam pembuatan media. Larutan stok dibuat berdasarkan komposisi pada masing-masing media. Komposisi media MS (lampiran 1), Woody Plant Medium (WPM) (lampiran 2), dan media B5 (lampiran 3). Pembuatan larutan stok selain Fe dimulai dengan penimbangan bahan kimia sesuai dengan bobot per liter larutan stok yang akan dibuat. Setelah itu bahan kimia dilarutkan dengan aquades steril sampai larut. Setelah larut, larutan dimasukkan ke dalam labu takar lalu ditera sampai tanda tera. Sedangkan pembuatan larutan stok Fe dimulai dengan penimbangan lalu FeSO4.7H2O dan Na2EDTA dilarutkan masing-masing dengan aquades steril. Setelah larut, Na2EDTA dipanaskan di atas panci yang berisi air sampai berubah warna menjadi kuning dan semua bahan larut. Setelah berubah warna, larutan FeSO4.7H2O dimasukkan ke dalam larutan Na2EDTA sampai tercampur. Pemanasan hanya dilakukan sampai terjadi perubahan warna menjadi kuning namun tidak sampai mendidih. Penyimpanan larutan stok dimasukkan ke dalam botol reagen dan disimpan pada suhu kamar atau suhu ruang kultur. Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh tergantung dari sifat zat pengatur tumbuh tersebut. Golongan auksin (picloram, 2.4 D dan NAA) merupakan zat pengatur tumbuh yang memiliki sifat asam sehingga perlu dilarutkan terlebih dahulu dengan KOH atau NaOH 1 N. Sedangkan sitokinin (BAP) memiliki sifat basa sehingga perlu ditambahkan HCl untuk melarutkannya. Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh tergantung dari konsentrasi yang akan dibuat. Setelah bahan kimia ditimbang ditambahkan KOH atau HCl beberapa tetes untuk melarutkan. Setelah larut, larutan dimasukkan ke dalam labu takar dan
18
ditera dengan aquades steril sampai tanda tera. Penyimpanan larutan stok zat pengatur tumbuh disimpan di dalam lemari es untuk menjaga agar tidak rusak.
Pembuatan Media Pembuatan media dilakukan dengan mengambil larutan dari setiap larutan stok media yang telah dibuat sesuai dengan volume yang diambil. Setelah semua larutan dimasukkan ke dalam labu takar ditambahkan gula yang telah dilarutkan dengan konsentrasi 30 g/L. Lalu ditera sampai tanda tera dengan aquades. Setelah itu dilakukan pengukuran pH dengan kertas pH indikator sampai pH media 6. Larutan media yang telah diukur pH dimasukkan kedalam panci lalu ditambahkan agar dengan konsentrasi 7 g/L dan dimasak sampai mendidih agar semua bahan tercampur. Larutan media lalu dimasukkan ke dalam botol kultur sekitar 25 ml per botol. Lalu botol ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet gelang. Semua media diautoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1.1 kgcm2 selama 25 - 30 menit. Media yang telah dibuat disimpan didalam ruang kultur.
Penanaman Percobaan I Bahan tanam yang digunakan dalam percobaan I yaitu biji muda melon hibrida H7 koleksi Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika IPB. Biji berasal dari buah muda berumur 15 hari setelah penyerbukan. Buah (Gambar 4A) dicuci bersih dengan sikat dibawah air mengalir lalu direndam dengan larutan fungisida dan bakterisida dengan konsentrasi masing-masing 2 g/L selama 12 jam. Buah dibilas dengan air steril lalu direndam dengan larutan klorox 25% selama 20 menit. Buah dibilas dengan air steril lalu dibelah dan dipisahkan biji dari daging buah. Biji (Gambar 4B) disterilisasi dengan klorox 10% selama 15 menit. Biji dibilas dengan air steril sebanyak dua kali yang dicampur dengan 5 tetes betadin pada bilasan terakhir. Setelah itu biji ditanam dalam media kultur. Biji yang telah ditanam disimpam dalam ruang gelap dengan suhu 200C. Pengamatan dilakukan 4 hari sekali agar tidak tertinggal fase perkembangan embrio dari globular, hati, torpedo dan kotiledon.
19
A
B
Gambar 4. (A) Buah Muda Berumur ±15 Hari Setelah Penyerbukan. (B) Biji Muda yang Telah Dibersihkan Penanaman Percobaan II Bahan tanam yang digunakan dalam percobaan II yaitu biji tua yang berasal dari melon hibrida H7 koleksi Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika IPB. Sumber eksplan yang digunakan yaitu hipokotil yang berasal dari biji yang dikecambahkan secara in vitro. Biji melon direndam dengan air steril selama 12 jam. Biji yang telah direndam dimasukkan kedalam larutan klorox 10% selama 10 menit lalu dibilas 2 kali menggunakan air steril. Setelah itu biji direndam dengan larutan klorox 5% selama 5 menit dan dibilas dengan air steril sebanyak 2 kali. Lalu biji melon dikecambahkan dengan media MS selama 15 hari di dalam ruang gelap. Biji yang telah berkecambah (Gambar 5), hipokotil dipotong sepanjang ±1 cm lalu ditanam di dalam media perlakuan. Hipokotil yang telah ditanam disimpan dalam ruang gelap dengan suhu 200C dan dilakukan pengamatan 3 hari sekali.
Gambar 5. Biji yang Berkecambah Setelah Berumur 15 HST (Hari Setelah Tanam)
20
Pengamatan Metode pengamatan yang dilakukan yaitu pengamatan langsung terhadap kultur. Faktor-faktor yang diamati dalam penelitian meliputi: 1.
Persentase kultur yang kontaminasi
2.
Persentase kultur yang membentuk embrio somatik
3.
Persentase kultur yang membentuk kalus
4.
Waktu munculnya embrio somatik
5.
Persentase kultur berakar dan bertunas Pengamatan dilakukan terhadap semua eksplan. Eksplan diamati satu per
satu dan dicatat sesuai dengan respon yang muncul. Data setiap perlakuan diperoleh dari data rata-rata tiap botol. Rata-rata tiap botol diperoleh dengan cara membagi eksplan yang memberikan respon dengan jumlah total eksplan per botol. Data setiap ulangan diperoleh dengan menambahkan hasil rata-rata tiap botol dibagi dengan jumlah total botol tiap ulangan. Jika terdapat botol hilang disebabkan kontaminasi ataupun hal lain maka data ulangan diperoleh dengan menambahkan hasil rata-rata tiap botol dibagi dengan jumlah botol yang masih ada. Hasil semua data disajikan dalam persentase.
