BAGIAN II YUNIKA MAYANGSARI, S.Si., M.Biotech
Prinsip
dasar HPLC - Fase gerak? - Fase diam? Bagian-bagian dari HPLC? Home work nya??
Sebuah standar sampel Aspartam di ukur dengan HPLC, peak muncul pada menit ke 12.5, maka peak tersebut adalah peak dari Aspartam tersebut. Selanjutnya, suatu sampel minuman dalam kemasan, dilakukan preparasi yang sesuai untuk analisa aspartame, pelarut dan kondisi HPLC sama seperti standarnya (berada pada satu sistim running) . Setelah diukur dengan HPLC, muncul beberapa buah peak. Peak yang manakah merupakan aspartame??
Tinggi dan area dari peak ekuivalen/proporsional dengan konsentrasi dari komponen tersebut. Oleh karena itu untuk mengetahui konsentrasi sampel, maka terlebih dahulu dibuat suatu kurva standar. Dari kurva standar yang diperoleh dari beberapa tingkatan titik konsentrasi, diperoleh sebuah garis regresi linear, dengan rumus y= ax + b
Kemudian sampel di aplikasikan pada HPLC dengan kondisi sistim HPLC yang sama dengan standardnya (apa sajakah ??) Setelah diperoleh peak dari sampel, selanjutnya dapat dihitung konsentrasi sampel tersebut dengan cara memasukkan area (y) pada rumus regresi kurva standar, sehingga diperoleh konsentrasi (x) Kurva standar dinyatakan linier apabila R2 ≥ 0,990 ; nb: linearitas relative utk beberapa analisa kimia
Soal
1: Berapa konsentrasi sampel. Konsentrasi (ppb) 2 4 10 25 50 100
Area 70614 158262 423667 1048964 2163630 4257217
Hasil area sampel (duplo) kopi instan 1 kopi instan 2
Dilution factor: 2.5
919932 1022359
Jawaban:
Kurva standar OTA
sampel
X
x/2.5
Y (area)
kopi instan 1
919932
21.69542
8.67817
kopi instan 2
1022359
24.08919
9.635677
Kondisi
alat, metode dan kondisi analisa tidak selalu konstan dan mampu menghasilkan akurasi yang sama baiknya. Oleh karena itu diperlukan suatu factor koreksi untuk mengetahui keakurasian nilai analisa factor rekoveri
%
rekoveri = Nilai terukur pada sampel Nilai yang ditambahkan (spiked) pada sampel
Soal 2: Dari soal no 1. dilakukan spike pada sampel sebesar 25 ppb. Berapakah nilai rekoveri dan berapa nilai kadar OTA setelah dikoreksi dengan persen rekoveri??
Jawab:
Sampel kopi instan 1
Y 919932
X 21.69542
X/2.5 8.67817
kopi instan 2
1022359
24.08919
9.635677
80.15145
32.06058
kopi instan 3 3421207 (spiked 25 ng/g) ave 9.15692351 blank spiked 22.9036575 recov
nilai
92%
sampel terkoreksi 9.95 ppb
resolusi Pemilihan dan pengaturan solvent Metode preparasi yang kurang/tidak sesuai Nilai akurasi yang tidak memenuhi standar (ref: table Horwitz) Peak yang tidak optimal Tidak muncul peak sama sekali Dan lain-lain….semakin bnyak persoalan yang Anda temui, semakin bnyak skill Anda menghadapi HPLC ☺ Pemisahan
Pemilihan
kolom (fasa diam) yang tepat Pemilihan solvent yang tepat Pemilihan detector yang tepat Pemilihan panjang gelombang Pemilihan metoda preparasi sampel Pemurnian sampel
N
value merupakan bilangan yang menggambarkan kinerja dan efektifitas kolom, kaitannya dengan resolusinya
where tr: retention time, and W: peak width
N value A >B
Separation methods are classified into the four modes:
adsorption
partition
ion exchange, and
size exclusion
+ hydrophilic interaction
Berdasarkan selektivitasnya, kolom silica gel digunakan untuk memisahkan beberapa isomer, dll. Filler polar seperti silica gel yang bersifat mengadsorbsi kurang tepat untuk diaplikasikan pada HPLC karena apabila digunakan berulang menjadi bekurang kinerjanya dan reprodusibilitasnya rendah. karena ….???
ODS (Octadesylsilane) atau "C18" atau "reversed phase" or "partisi" seringkali dikenal sebagai nama kolom dan metode separasi/pemisahan. 18 carbon atoms Apabila dibandingkan dengan metode pendahulunya / silica gel/ Normal phase maka metode ini lebih stabil dan reprodusibel The filler can be regarded as a silica gel coated with ODS. It can be said that the development of this filler caused the progress of chromatography to today's HPLC.
A
sample is separated between an ODS phase and an elute phase
Suatu
sampel yang ditambahkan pada eluen/solven maka komponen-komponen didalamnya akan ada yang bersifat lebih polar dan lebih tidak polar. Komponen yang lebih larut dalam eluen (biasanya bersifat polar) akan terbawa keluar dari kolom terlebih dahulu bersama eluennya. There are many other Chemically-treated fillers, C8 (octyl, -C8H17), Ph(phenyl, -C6H5 ), -CN(cyano), -NH2(amino), and Diol, and each fillers has different separation properties.
Ionic substances, including amino acids and inorganic ions pass through an ODS column without being separated by ODS. Such substances can be separated with an ion exchange resin. Negative ions such as chloride (Cl-) and sulfide (SO42-) ions, and positive ions such as Na+ and Ca2+ are separated with anion- and cationexchange resins, respectively. Despite having both -NH2 (amino, cationic) and COOH (carboxyl, anionic) groups, amino acids can be separated with cation-exchange resins using an acidic eluent to suppress the dissociation of -COOH.
The
speed at which a component migrates in the ion exchange column depends on the tendency to become the ion and the tendency to bind to the ion exchange resin for stabilization.
Macromolecular
components such as synthetic resins and proteins can be separated according to their size, with sievelike fillers The filler is spherical and contains many holes like a mesh. Small molecules can pass through the filler via these holes, but spend much time running through mazes in the fillers. Meanwhile, large molecules unable to enter the holes migrate among the fillers, arriving earlier at the outlet of the column.
This separation mode is referred to as size exclusion (SEC:Size Exclusion Chromatography) or gel permeation (GPC: Gel Permeation Chromatography). Unlike separation of low-molecular weight components, SEC/GPC separates molecules according to their size. Thus, it is difficult to separate multiple polymer mixtures having a similar molecular size.
HILIC is short for Hydrophilic Interaction Chromatography, and is a separation mode based on hydrophilic interaction. If ODS is considered a reverse-phase partition mode, HILIC can be considered a normal-phase partition mode. a mixture of organic solvent and water is used as eluent at a high ratio of the organic solvent. For example, sugar analysis with an NH2 column is performed by HILIC mode. This mode is of advantage especially for separation with LC-MS because of its ability to perform separation at a high ratio of organic solvent.
HILIC phases can be grouped into five categories of neutral polar or ionic surfaces: Simple unbonded silica silanol or diol bonded phases Amino or anionic bonded phases Amide bonded phases Cationic bonded phases Zwitterionic bonded phases
separation
by chromatography is very dependent on the selection of eluent. The eluent should be selected to suit the types of targeted and other components in a sample.
A
mixed solution of organic solvents and aqueous solvents is often used as the mobile phase. The way that they are mixed can cause large differences in analysis results.
