BAB IV METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian Observasional analitik (Cross-sectional analitik) untuk menilai hubungan antara ekspresi protein Ki-67 dan ekspresi reseptor hormon HER-2/neu dengan derajat diferensiasi pada karsinoma payudara dengan tipe histopatologi duktal invasif tipe tidak spesifik.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar dan Laboratorium Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sardjito Jogyakarta. Sampel diambil dari seluruh blok paraffin penderita karsinoma payudara yang telah dilakukan biopsi serta data klinis dari status pasien. Waktu penelitian dimulai pada 01 Januari 2013- 30 September 2013.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1
Populasi Target
Populasi penelitian ini adalah semua sediaan blok parafin dari bahan biopsi maupun operasi penderita karsinoma payudara dengan tipe histopatologi karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik yang telah terdiagnosis setelah melakukan pemeriksaan histopatologi di Laboratorium Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar Bali. Didapatkan sebanyak 212 sampel dengan diagnosis histopatologi karsinoma payudara duktal invasif.
26
27
Dari jumlah tersebut, 110 sampel merupakan karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik sedangkan 102 sampel lainnya merupakan karsinoma payudara invasif tipe tertentu. Dari 110 sampel karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik tersebut, 20 sampel telah mendapat kemoterapi dan 9 sampel blok parafinya jaringan tumornya telah habis. Sehingga yang memenuhi kreteria inklusi dan eklusi sebanyak 81 sampel blok parafin karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik. 4.3.2
Sampel
Sampel penelitian adalah sediaan blok parafin dari penderita karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik yang telah terdiagnosis setelah melakukan pemeriksaan histopatologi di Laboratorium Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar Bali yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi yang ditetapkan peneliti.
28
4.3.3
Perhitungan Besar Sampel
Besar sampel pada penelitian ini dihitung dengan menggunakan rumus besar sampel penelitian analisis kategorik dua sampel tidak berpasangan sebagai berikut (Madiyono, 2011). Za2 x P x Q n= D2 Keterangan : n = besar sampel Zα = deviat baku alfa (1,96 ) P = Proporsi kategori variable 20% (Lukashina et al., 2011) Q = 1- P = 0,8 d = 5% Dari hasil perhitungan berdasarkan rumus diatas didapatkan n = sebesar 60. Jadi minimal sampel yang diperlukan pada penelitian ini adalah sebesar 60 buah blok parafin karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik yang memenuhi kriteria inklusi.
29
4.4 Kriteria Inklusi dan Eksklusi 4.4.1 Kriteria Inklusi 1. Sediaan blok parafin pasien dari biopsi atau mastektomi karsinoma payudara dengan diagnosis histopatologi karsinoma duktal invasif tipe tidak spesifik dari tanggal 01 Januari 2012 – 31 Desember 2012. 4.4.2 Kriteria Eksklusi 1 Sediaan blok parafin pasien dari biopsi atau mastektomi primer karsinoma duktal invasif tipe tidak spesifik dari pasien yang pernah menjalani pembedahan, mendapatkan pengobatan dengan kemoterapi atau radioterapi, atau pemberian terapi hormonal sebelumnya. 2 Blok parafin yang rusak, jamuran dan jaringan tumornya habis.
4.5 Cara Pengambilan Sampel Blok parafin dari semua pasien karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik yang telah menjalani pembedahan di RSUP Sanglah dari 01 Januari 2012 sampai 31 Desember 2012 serta telah memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi, kemudian dipilih secara consecutive sampling sebanyak 60 buah blok parafin.
4.6 Identifikasi Variabel Penelitian 4.6.1
Variabel bebas
: Ekspresi Ki-67 dan HER-2/neu.
4.6.2
Variabel tergantung
: Derajat diferensiasi histopatologi.
30
4.7 Definisi Operasional Variabel Adapun definisi operasional variabel penelitian adalah sebagai berikut : 1.
Sediaan blok parafin dari penderita karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik adalah sediaan blok parafin penderita dengan karsinoma yang terjadi pada sel-sel epitelial duktal ganas payudara yang ditandai dengan adanya invasi ke jaringan sekitar dan tumor tidak membentuk suatu pola tipe histologis tertentu.
2.
Ekspresi Ki-67 adalah : Protein Ki-67 secara IHK menggunakan monoklonal antibody liquid mouse (NCL-L-KI-67-MM) menunjukkan ekspresi pada inti sel tumor terpulas berwarna coklat. Interpretasi ekspresi Ki-67 dilakukan oleh dua orang pengamat (peneliti dan pembimbing) secara bersamaan. Sel yang mengekspresikan Ki-67 akan tampak berwarna coklat pada inti sel. Penilaian ekspresi Ki-67 dibuat berdasarkan analisis persentase sel tumor yang terpulas positif dihitung pada 5 lapangan pandang dengan pembesaran 400x. Dari 5 lapangan pandang dihitung jumlah seluruh sel tumor yang terpulas positif pada inti sel tumor yang berwarna coklat. Penilaian dihitung secara semikuantitatif pada seluruh sel-sel tumor diamati dengan mikroskop elektrik binokolar merk Olympus tipe CX 31 dengan pembesaran 400 kali (HPF: field diameter, 0.50mm, field area 0,274mm2) . Ekspresi Ki-67 diberi skor : nilai 0(bila ≤10%),nilai+1(bila 10-14%),nilai +2(bila ≥14%) dari seluruh sel tumor yang terekspresi positif pada inti sel tumor dengan pewarnaan berwarna coklat. Ekspresi Ki-67 dihitung berdasarkan inti sel tumor yang tercat positif berwarna coklat dari 5 lapangan pandang besar, 400x.
31
a. Kontrol positif adalah : Sediaan pemeriksaan IHK pasien karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik dengan hasil pulasan IHK Ki-67 terekspresi pada inti sel tumor dengan pewarnaan berwarna coklat. b. Kontrol negatif adalah : Sediaan pemeriksaan IHK pasien karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik dengan hasil pulasan IHK Ki-67 tidak terekspresi pada inti sel tumor dengan perwarnaan berwarna coklat. 3.
Ekspresi HER-2/neu adalah : Penilaian protein HER-2/neu secara IHK menggunakan antibodi monoklonal kelinci c-erbB-2/HER-2/neu (Clone SP3) dar Labvision dengan pengenceran 1:100 dan menggunakan metode ABC(Avidin Biotin Complex) menunjukkan ekspresi membran sel tumor terpulas berwarna coklat. Interpretasi ekspresi HER-2/neu dilakukan oleh dua orang pengamat (peneliti dan pembimbing) secara bersamaan. Penghitungan dilakukan pada seluruh sel tumor dimulai dari bagian tumor dengan ekspresi HER-2/neu terkuat ke bagian yang lebih lemah dengan menghitung persentase sel epitel ganas yang terpulas positif atau sel yang mengekspresikan HER-2/neu akan tampak berwarna coklat pada membran sel tumor. Penilaian dihitung secara semikuantitatif dari seluruh sel tumor, diamati dengan mikroskop elektrik binokuler merk Olympus CX31 dengan pembesaran 400 kali (HPF: field diameter, 0.50 mm, field area 0.274mm2. Penilaian ekspresi HER-2/neu dibuat berdasarkan analisis persentase sel tumor yang positif dan intensitas pewarnaan..
32
Tabel 2. Skor dan Kategori Ekspresi HER-2/neu pada karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik. PENILAIAN POLA PENGECATAN
SKOR OVEREKSPRESI PROTEIN HER-2/neu
Tidak tercat atau membran tercat <10% dari
0
Negatif
1+
Negatif
2+
Positif lemah
3+
Positif kuat
sel tumor. Membran tercat ringan pada >10% sel tumor. Sel hanya tercat pada sebagian membran (inkomplit). Membran tercat lemah sampai sedang (komplit) >10% sel tumor. Membran tercat kuat komplit >10% sel tumor.
a. Kontrol positif adalah : Sediaan pemeriksaan IHK pasien karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik dengan hasil pulasan
IHK
HER-2/neu terekspresi pada membran sel tumor dengan pewarnaan berwarna coklat. b. Kontrol negatif adalah : Sediaan pemeriksaan IHK pasien karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik dengan hasil pulasan
IHK
HER-2/neu tidak terekspresi pada membran sel tumor berwarna coklat.
33
4.
Derajat diferensiasi histologi adalah tingkat diferensiasi tumor payudara yang dinilai berdasarkan
sistem Nottingham modification of the Bloom and
Richardson grading system. Sistem ini menilai tumor payudara berdasarkan tiga karakteristik tumor yaitu formasi tubulus, pleomorfisme inti sel dan mitosis. Skor sistem memakai 1-3 yang dinilai secara individual pada tiap faktor. Formasi tubulus dinilai dari jumlah persentase bentukan glandular yang jelas menunjukkan adanya lumen dengan pembesaran 40x. Ambang batas yang dipakai adalah 10% dan 75%. Pleomorfisme inti sel dinilai dari regularitas ukuran inti dan bentuk sel epitel, dimana peningkatan iregularitas membran inti dan N/C Ratio menjadi tanda bertambahnya skor pleomorfisme inti sel. Hitung mitosis dihitung per 10 lapangan pandang/per- high power field (HPF: field diameter 0.50, field area 0.274 mm2) dengan pembesaran 400x. Penghitungan mitosis dilakukan dari bagian tepi/daerah yang banyak mengandung mitosis. Derajat 1 dan derajat 2 kemudian digolongkan menjadi kelompok low grade dan derajat 3 digolongkan menjadi kelompok high grade.
34
Tabel 1. Metode semi-kuantitatif penilaian derajat diferensiasi karsinoma payudara duktal invasif: GAMBARAN
SKOR
Formasi tubulus & kelenjar Mayoritas tumor (>75%)
1
Derajat sedang (10-75%)
2
Sedikit atau tidak ada (<10%)
3
Pleomorfisme inti sel Kecil, bentuk uniform reguler
1
Peningkatan sedang ukuran dan variabilitas
2
Variasi jelas
3
Hitung mitosis / 10 HPF (luas lapangan pandang 0,274mm2) Jumlah mitosis 0-9 1 Jumlah mitosis 10-19 2 Jumlah mitosis >20 3
35
4.8 Prosedur Penelitian 1. Sediaan penderita karsinoma duktal invasif tipe tidak spesifik yang melakukan pemeriksaan histopatologi dari 01 Januari 2012 sampai 31 Desember 2012 dikumpulkan dan dilihat apakah memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. 2. Preparat hasil pulasan HE sesuai nomor-nomor diatas dikumpulkan dan dievaluasi ulang. Yang dinilai adalah parameter derajat diferensiasi. Langkah pewarnaan Meyer’s hematoksilin dan eosin adalah : a. Deparafinisasi dengan dicelupkan pada xilol sebanyak 4 kali masingmasing celupan selama 5 menit. b. Hidrasi dengan alkohol 95% sebanyak 4 kali, masing-masing celupan selama 2 menit. c.
Masukkan ke air selama 10 menit.
d. Celupkan ke cat utama yaitu Meyer’s hematoksilin selama 15 menit. e. Cuci dengan air mengalir selama 20 menit. f.
Lihat dibawah mikroskop, inti sel akan terlihat biru terang sedangkan sitoplasma tidak berwarna.
g. Celupkan pada cat pembanding eosin 1% selama 0,5-1 menit. h. Dehidrasi dengan alkohol 95% sebanyak 3 kali, masing-masing celupan selama 2 menit, selanjutnya menggunakan alkohol absolut selama 2 menit. i. Penjernihan dengan xylol sebanyak 4 kali celupan, lama masing-masing celupan selama 5 menit.
36
j. Tutup dengan cover glass. k. Memilih preparat yang akan dipulas IHK Ki-67 dan HER-2/neu. Preparat yang dipilih untuk pemeriksaan IHK Ki-67 dan HER-2/neu adalah preparat yang paling banyak mengandung bagian tumor dengan area nekrosis yang sedikit atau tidak ada. Jika satu kasus mempunyai lebih dari satu sediaan yang mengandung tumor, maka dipilih sediaan yang mengandung bagian tumor dengan diferensiasi yang lebih jelek. l. Preparat yang terpilih kemudian dicari blok parafinnya. m. Blok
parafin
yang memenuhi
kreteria inklusi dipotong
setebal 4
mikrometer dengan mikrotom untuk pulasan IHK Ki-67 dan HER-2/neu. n. Pulasan IHK untuk Ki-67 dan HER-2/neu menggunakan antibodi monoklonal Ki-67 dan antibodi monoklonal HER-2/neu dari Dako. o. Pemeriksaan pulasan IHK Ki-67 dan HER-2/neu.
37
4.9 Prosedur Pulasan IHK Ki-67 Antigen Background : CLONE: Code
Name
Configuration
Uce
PA0230
7 ml Ki67 (K2)
Bond ready to use reagent
P(HIER)
I ml Anti-Ki67 –IVT
Liquid Concentrated Monok-
P(HIER)
Clone K-2
lonal Antibody
Bond RTU Primary AK02
CLONE : MM1 Code
Name
Configuration
Pa0118
7 ml Ki67 bond RTU Bond ready to use reagent
Uce P(HIER)
Primary KI67-MM 1- 1 ml NCL-L-Ki67-
Liquid Concentrated Mono-
L-CE
MM1
clonel Antibody
KI67-MM1-
1 ml NCL-Ki67-MM1 Lyophilised Concentrated
CE
P(HIER)
P(HIER)
Monoclonal Antibody
KI67-MM 1- 0.1ml NCL-Ki67-MM1Lyophilised Concentrated CE-S
P(HIER)
Monoclonal Antibody
KI67-MM 1- 7ml RTU-Ki67-MM1 Ready to Use Monoclonal R-7-CE
P(HIER)
Antibody
CLONE Code
Name
Configuration
Uce
Deteah
KI67P-CE
0.2 ml NCL-Ki67 p
Lyophilised Polyclonel
P(HIER) Info
38
1. MATERIAL YANG DIPERLUKAN 1.1. Epitop Retrieval – Larutan ER pH 6 (x10) – 1L , Cat . RE 7113 1.1.1. ER solution
5 ml
1.1.2. Distilled water
45 ml
1.2. Lartan pencuci TBS / PBS 1.2.1. Tablet
1 tablet
1.2.2. Aquabides
100 ml
1.3. PrimaryAntibodi First Dilution
Second Dilution Vol
Antibody
Vol
Dilution
Vol
Vol
Antibody
Diluent
Dilution Antibody
Diluent
CD3-565
1/100
10ul
990ul
1/200
5ul
995ul
CD20-7D1
1/100
10ul
990ul
1/200
5ul
995ul
CD5-4 C7
1/200
5ul
995ul
1/400
2.5ul
997.5ul
CD10-270
1/50
20ul
980ul
1/100
10ul
990ul
Bcl-2-486
1/200
5ul
995ul
1/400
2.5ul
997.5ul
Bcl-6-564
1/50
20ul
980ul
1/100
10ul
990ul
CK7-560
1/100
10ul
990ul
1/200
5ul
995ul
CK20-561
1/100
10ul
990ul
1/200
5ul
995ul
1.4. IHC – Pelarut untuk Antibodi, Cat. RE 7133 1.5. Protein Blocking reagen , Cat. RE 7102 1.6. Peroxidase block, Cat. RE 7101
39
1.7. Post primary Antibody - Rabbit anti mouse IgG & IgM, Cat. RE 7111 1.8. Compact Polymer - Anti rabbit IgG & IgM, Cat. RE 7112 1.9. DAB 1.9.1. DAB Substrate, Cat . RE 7143
20 part
1.9.2. DAB Chromogen, Cat. RE 7105
1 part
1.10.
Hematoxylin, Cat. RE 7107
1.11.
Staining jar
1.12.
Rack slide
1.13.
Humid chamber
1.14.
Pipettor
1.15.
Pipette tip
1.16.
Distilled water
1.17.
Kontrol slide positif
1.18.
Kontrol slide Negatif
1.19.
Spesimen slide dari pasien
Langkah- langkah kerja: a. Potong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan ketebalam 3 µm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lysine, merk Sigma, dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm. b. Inkubasi dalam incubator dengan suhu 37o C selama 1 malam. c. Deparafinisasi dengan xylene I,II dan III dan masing-masing rangkaian selama 2 menit.
40
d. Rehidrasi dengan memasukkan slide ke dalam rangkaian etanol 100%, 90%, dan 70% dan masing-masing rangkaian selama 2 menit. e. Decloaking chamber : isi dengan aquades (ddH2O) 500-600 ml, atur suhu 120125 derajat C dengan waktu 2 menit, masukkan slide ke epitop retrieval yang sudah didilusi 1:10, dinginkan di suhu ruang 40- 60 menit, keringkan, batasi jaringandengan novopen. f. Microwave : atur suhu 90 derajat C- 4 menit, panaskan epitop retrieval, masukkan spesimen slide, panaskan 80 derajat C -2 menit, diamkan di suhu ruang 40- 60 menit, keringkan, batasi jaringan dengan novopen. g. Blocking reagent : teteskan 3 tetes reagen perixodase block reagent (cat RE 7101) ke atas jaringan, inkubasi 5 menit, cuci slide ( 2x5 min) dengan buffer pencuci untuk menghilangkan protein block reagent. h. Blocking reagen protein block ( cat RE 7102) : teteskan 3 tetes peroxidase block ke atas jaringan slide, inkubasi 5 menit, cuci slide (2x5 min) dengan buffer pencuci untuk menghilangkan peroxidase block reagen. i. Primary antibody : teteskan primari antibody ke setiap slide dengan 150 ul yang sudah diencerkan, masukkan slide dalam wadah yang bawahnya di alas tower paper dengan dibasahi dan inkubasi 60 menit didalam inkubator, cuci slide (2x5 min) dengan buffer pencuci untuk menghilangkan primari antibodi. j. Post primary antibodi- Rabbit anti mouse IgM dan IgG (Cat RE 7111) : teteskan 3 tetes primari antibodi on to tissue slide, inkubasi 30-40 menit, cuci slide (2x5 min) dengan buffer pencuci untuk menghilangkan post primary.
41
k. Compact Polymer- Anti rabbit IgG & IgM (Cat RE 7112) : teteskan 3 tetes ke atas slide jaringan (Cat RE 7112), inkubasi 30- 40 menit, cuci slide (2x5 min) dengan buffer pencuci untuk menghilangkan compact polymer. l. DAB : teteskan DAB reagen secukupnya ke atas slide jaringan, inkubasi 5-10 menit, cuci slide (2x5 min) dengan air aquades, teteskan haemaxtoxilin reagent (Cat RE 7107), inkubasi selama 5 menit. m. Tahap akhir slide : cuci slide dengan air aquades, keringkan slide dengan ethanol, bersihkan slide dengan xylenes, teteskan entelan ke atas jaringan dan tutup spesimen dengan coverslip. Ekspresi Ki-67 diberi skor : nilai 0(bila ≤10%),nilai +1(bila 10-14%),nilai +2(bila ≥14%) dari seluruh sel tumor yang terekspresi positif pada inti sel tumor dengan pewarnaan berwarna coklat. Ekspresi Ki-67 dihitung berdasarkan inti sel tumor yang tercat positif berwarna coklat dari 5 lapangan pandang besar, 400x.
42
4.10 Prosedur Pulasan imunohistokimia untuk HER-2/neu Antigen Backgound: CLONE : CB 11 Code
Nam
Configuration
CB11-L-CE 1ml NCL-L-CB11 Liguid concentrated monoclonal antibodi CB11-CE
1ml NCL-CB11
Use P
Lyophillised concentrated monoclonal anibodi P
CB11-CE-S 0,1ml NCL-CB11 Lyophillised concentrated monoclonal antibodi P CB 11-CE
1ml NCL-CB11
Lyophillised concentrated monoclonalantibodi P
Dengan menggunakan antibodi monoklonal kelinci c-erbB-2/HER-2/neu (Clone SP3) dari Labvision, dengan pengenceran 1 : 100 dan menggunakan metode ABC. Adapun langkah-langkah pulasan imunohistokimia HER-2/neu adalah sebagai berikut : a.
Potong jaringan 4 mikrometer, ditempelkan pada gelas objek yang telah dilapisi poly-L-lysine.
b.
Inkubasi dalam oven suhu 37 derajat Celcius selama 1 malam.
c.
Deparafinisasi dengan xylene.
d.
Dehidrasi dengan alkohol.
e.
Cuci dengan PBS 2x5 menit.
f.
Rendam dengan buffer sitrat pH 6,0. Kemudian panaskan di dalam mikrowave oven selama 10 menit, mula-mula dengan pemanasan tinggi selama 5 menit kemudian dengan pemanasan sedang selama 5 menit.
g.
Dinginkan pada suhu kamar.
h.
Cuci dengan PBS 2x5 menit.
43
i.
Tetesi H2O2 0,3% selama 30 menit.
j.
Cuci dengan aquadest 1x5 menit.
k.
Cuci dengan PBS 2x5 menit.
l.
Tetesi 100 ul blocking solution (normal serum dengan pengenceran 100x) selama 20 menit.
m. Tetesi 100 ul antibodi primer menggunakan antibodi monoklonal Her-2/neu Labvision yang telah diencerkan (pengenceran 1 : 100). Diinkubasi selama 1 malam pada suhu 4 derajat Celcius. n.
Cuci dengan PBS 2x5 menit.
o.
Tetesi 100 ul antibodi sekunder (pengenceran 100x) selama 30 menit.
p.
Cuci dengan PBS 2x5 menit.
q.
Tetesi 100 ul SBC selama 30 menit.
r.
Cuci dengan PBS 2x5 menit.
s.
Tetesi dengan reagen DAB 10 menit.
t.
Cuci dengan air.
u.
Counterstain dengan Hematoksilin Meyer”s selama 1 menit.
v.
Dehidrasi dengan alkohol.
w. Tutup dengan cover glass (Novocastra, HER-2/neu c- erbB-2 Oncoprotein). Penilaian ekspresi HER-2/neu dibuat berdasarkan analisis persentase sel tumor yang positif dan intensitas pewarnaan (Tabel 2).
44
4.11 Cara kerja Penelitian Mencari nomor sediaan dengan diagnosis karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik mulai 1 Januari 2012- 31 Desember 2012 yang memenuhi kriteria inklusi Pengumpulan sediaan pulasan Hematoksilin Eosin
Seleksi, re-diagnosis dan re-grading kasus karsinoma duktal invasif tipe tidak spesifik yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi
Pengumpulan blok parafin yang memenuhi kriteria inklusi Blok parafin dipotong 4 mikron
Pemeriksaan imunohistokimia Ki-67 dan HER2/neu
Penilaian pulasan ekspresi Ki-67 dan HER2/neu (pencatatan dan pengumpulan data )
Analisis statistik
4.12 Analisis data. Data pada formulir penelitian karsinoma duktal invasif tipe tidak spesifik menggunakan SPSS 19.0 for window. Kemudian dilakukan beberapa tes atau uji, antara lain adalah sebagai berikut : a. Karakteristik sampel disajikan secara deskriptif, dengan menggunakan grafik dan tabel. b. Untuk mengetahui normalitas data dilakukan uji Spearman Correlation.
