BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental dengan metode post test only control group design. Pengukuran awal tidak dilakukan karena dianggap sama untuk semua kelompok yang berasal dari satu populasi, sehingga dapat dikembangkan rancangan eksperimental tanpa adanya pengukuran awal tetapi hanya pengukuran akhir. B. Tempat Penelitian Tempat pemeliharaan dan induksi hewan dilakukan di Unit Pemeliharaan Hewan Coba Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. Pemeriksaan imunohistokimia dan darah dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. C. Sampel Penelitian Mencit betina sub spesies Mus musculus galur Balb/C, umur 3-4 bulan, berat badan 20–30 gram, diperoleh dari Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada. Bahan makanan mencit digunakan pakan mencit standar BR I. Pemilihan hewan coba mencit berdasarkan pertimbangan bahwa mencit Mus musculus paling sering dipakai pada penelitian biomedik, karena secara genetik mempunyai kemiripan dengan manusia dan mempunyai kemampuan beradaptasi dalam lingkungan laboratorium. Mencit sehat adalah mencit dengan kondisi mata bersinar, bulu tidak kusam, aktif, nafsu makan baik. D. Besar Sampel Penelitian eksperimental ini dilakukan pada populasi (N) tidak diketahui. Rumus yang dipakai untuk menentukan besar sampel (n) adalah: (
n=[
)
]
(Steel dan Torrie, 1980)
2
Karena
sulit ditaksir dari literatur, studi yang sama sebelumnya atau studi
pendahuluan oleh peneliti, maka diasumsikan
2
2
, sehingga hasilnya n= (Z½ +
Z )2 n = (1,645 + 0,842)2 = 6,185 dibulatkan menjadi 7 Keterangan: n
= besar sampel masing-masing kelompok
Z½= nilai standar normal, yang besarnya tergantung Bila = 0,05 Z½ = 1,645 Z = nilainya tergantung yang ditentukan (berdasarkan tabel) = error untuk menerima H0, bila H0 salah Bila = 0,08 Z = 0,842 = selisih antara rerata variabel terapi dan kontrol yang diharapkan oleh peneliti σ
= standar deviasi Berdasar rumus didapatkan jumlah sampel minimal adalah tujuh ekor. Dalam
penelitian ini digunakan 7 ekor mencit untuk setiap kelompok observasinya, sehingga telah memenuhi batas minimal sampel. E. Identifikasi Variabel 1. Variabel tergantung a. IL-10 b. hsCRP 2. Variabel bebas: Secretome F. Definisi Operasional Tabel 1. Definisi Operasional Variabel
Parameter
IL-10
Definisi
Alat
Satuan
Skala
Ukur
Data
Data
IL-10 adalah sitokin pleiotropik yang
Skor
Jumlah sel
Rasio
diproduksi oleh sel Th2, monosit, sel
histo-
reaktif/100
T reg, dan sel B. Ekspresi IL-10
logis
sel
didapatkan
dari
preparat
imu
limfosit
nohistokimia sampel ginjal mencit secara kuantitatif, dimana jumlah area positif pewarnaan dan intensitas pewarnaannya pada lima lapang pandang dihitung rata-ratanya. hsCRP
hsCRP
adalah
pengukuran
ELISA
ng/ml
Rasio
ml
Nomi
konsentrasi CRP secara kuantitatif dimana
dapat
mengukur
kadar
sampai <0,2-0,3 mg/L dari sampel serum darah mencit yang diambil dari vena orbitae. Secretome
Adalah hasil sekresi sel punca Pipet mesenkimal yang berasal dari cairan mililiter
nal
amnion manusia yang dilakukan kultur
dalam
diperoleh
dari
kondisi
hipoksia,
PT
Dermama
Bioteknologi Surakarta dan diberikan dalam dosis tunggal 0,45 ml secara intraperitoneal.
G. Waktu Waktu yang diperlukan dalam penelitian ini selama 5 bulan dengan jadwal penelitian sebagai berikut. Tabel 2. Jadwal penelitian Jenis Kegiatan
Bulan ke-
1
2
3
4
5
1) Persiapan : memesan bahan-bahan, mengumpulkan kepustakaan, diskusi, membuat log book. 2) Pelaksanaan Penelitian: Induksi hewan coba model lupus, pemeriksaan IL-10, pemeriksaan
hsCRP,
pembuatan
preparat imunohistokimia, interpretasi dan analisis data. 3) Penyusunan Laporan Penelitian
H. Cara kerja Sampel 21 ekor mencit Balb/c betina usia 3-4 bulan berat badan 20-30 gram diambil sebanyak 7 ekor secara acak dengan metode simple random sampling kemudian dibagi menjadi tiga kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok pristan dan kelompok pristan + secretome. Perlakuan yang diberikan : 1. Kelompok kontrol: injeksi NaCl 0,9% 0,5 ml intraperitoneal. 2. Kelompok pristan : injeksi pristan 0,5 ml intraperitoneal 3. Kelompok pristan + secretome : injeksi intraperitoneal pristan 0,5 ml dan secretome sel punca mesenkimal 0,45 ml dosis tunggal secara intraperitoneal. Perlakuan pada hewan coba dilakukan sesuai dengan ethical clearance. Tata cara menyebabkan lupus pada mencit dilakukan dengan injeksi pristan 0,5 ml secara intraperitoneal sesuai dengan beberapa penelitian dan jurnal terdahulu. Teknik pengambilan sampel dan penanganan spesimen: pada akhir minggu ketiga penelitian, dilakukan injeksi secretome 0,45 ml intraperitoneal dosis tunggal pada kelompok terapi dan injeksi intraperitoneal NaCl 0,9% 0,45 ml pada kedua kelompok kontrol dan perlakuan. Pada hari ke 24 penelitian dilakukan pengorbanan mencit untuk diambil darah dan
jaringan ginjal dilakukan secara syariat Islam tanpa menyiksa mencit dijelaskan pada lampiran. Pemeriksaan hsCRP dilakukan pada ketiga kelompok hewan coba pada hari ke 24 penelitian. Pemeriksaan hsCRP dilakukan dengan mengambil darah mencit melalui vena orbita. Berikut tatacara pemeriksaan hsCRP dengan metode ELISA: 1.
Bawa semua reagen dan sampel ke suhu ruangan sebelum digunakan. Sampel dilakukan sentifuge lagi setelah pencairan sebelum dilakukan pengujian. semua reagen harus dicampur menyeluruh dengan lembut dan diputar sebelum dipipet, hindari berbusa. Sebaiknya semua sampel dan standar diuji rangkap dua.
2.
Tambahkan 100 μl sampel, standar, atau dikosongkan pada masing-masing cekungan. Cekungan yang dikosongkan ditambah referensi standar dan pengencer sampel. Larutan ditambahkan ke bagian bawah lempeng ELISA mikro, hindari menyentuh dinding dan berbusa. Campur dengan lembut. Tutup lempeng dengan sealer dan diinkubasi selama 90 menit pada suhu 370C.
3.
Hapus cairan setiap cekungan, jangan dicuci. Segera tambahkan 100 μl larutan Biotinylated Detection Ab ke setiap cekungan. Tutup dengan sealer. Tekan lembut lempeng untuk memastikan pencampuran menyeluruh. Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C.
4.
Aspirasi dan cuci masing-masing cekungan 3 kali. Isi masing-masing cekungan dengan wash buffer 350 μl. Hapus wash buffer, balikkan lempengan dan tepuk ringan dengan kertas penyerap di bawahnya.
5.
Tambahkan 100 μl HRP conjugate ke setiap cekungan. Tutup lempeng dengan sealer dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 370C.
6.
Ulangi proses pencucian 5 kali kemudian tambahkan larutan substrate 90 μl ke setiap cekungan. Tutup lempeng dengan sealer dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 370C. Hindari kontak cahaya. Waktu reaksi dapat dikurangi atau ditambah tergantung perubahan warna namun tidak lebih dari 30 menit. Ketika muncul gradient warna pada cekungan standar, hentikan reaksi.
7.
Tentukan OD value pada setiap cekungan sekaligus menggunakan microplate reader 450 nm.
Pemeriksaan IL-10 secara imunohistokimia merupakan metode pemeriksaan pewarnaan jaringan berdasarkan kerja imunoenzim untuk memeriksa adanya antigen atau mencari lokasi antigen dalam spesimen. Imunohistokimia dilakukan berdasarkan interaksi antigen antibodi antara marker IL-10 dengan antibodi primer. Dilakukan deteksi kromogenik berdasarkan warna yang timbul. Tingkat ekspresi dinilai secara kuantitatif dan dihitung sebagai nilai skor histologi. Teknik pewarnaan imunohistokimia adalah pewarnaan imuno-peroksidase indirek dengan metode avidin biotin complex tiga fase dengan tahapan sebagai berikut: 1. Jaringan yang telah dibiopsi eksisi sehingga menjadi blok parafin kemudian dilakukan deparafinisasi sayatan jaringan untuk menghilangkan parafin dari jaringan. Deparafinisasi dilakukan dengan cara standar baku laboratorium, yaitu secara bertahap dengan waktu tertentu memasukkan preparat kedalam cairan aseton, xylol, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70% dan air. 2. Cuci jaringan dengan PBS pH 7,4 kemudian inkubasi jaringan dengan tripsin 0,125 % pada temperatur 37 0C selama 5-10 menit, untuk membuka masking antigen.Jaringan diinkubasikan dengan H202 0,5% dalam metanol selama 30 menit untuk menghilangkan pewarnaan endogen, dibiarkan pada temperatur ruangan.
3. Cuci dengan air mengalir selama 1 menit, diikuti pencucian dengan akuadestilata. Tandai jaringan dan cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit kemudian inkubasi dengan 3% serum yang dilarutkan dalam BSA 1% selama 20 menit kemudian cuci dengan PBS pH 7,4 sebanyak dua kali, masing-masing selama 3 menit. 4. Jaringan diinkubasi dengan monoklonal antibodi primer. Antibodi monoklonal dilarutkan dengan TRIS-PBS 1:200. Untuk jaringan seluas 1 cm2 diperlukan 100 L antibodi monoklonal. Inkubasi dilakukan selama 30 menit dalam ruang lembab kemudian cuci jaringan dengan PBS pH 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. 5.
Inkubasi jaringan dengan antibodi primer yaitu antibodi anti murine yang telah dibiotinilisasi (Dako Kit). Lama inkubasi 30 menit selanjutnya cuci jaringan dengan PBS pH 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit.
6. Inkubasi jaringan dengan streptavidin-biotin peroksidase (Dako Kit) selama 30 menit kemudian cuci jaringan dengan PBS pH 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. 7. Inkubasi jaringan dengan substrat (Dako Kit) sampai timbul warna coklat pada jaringan, selama ± 15 menit kemudian cuci jaringan dengan PBS pH 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. Warnai jaringan dengan Hematoksilin lalu cuci dengan air mengalir. 8. Tutup jaringan dengan kaca penutup dan lem dengan entelan. Ekspresi molekul yang positip dengan antibodi monoklonal primer akan terlihat berwarna coklat dibawah mikroskop cahaya dalam skala pembesaran 400x. Dipilih lapang pandang yang paling banyak area positif selanjutnya dihitung jumlah area positif pada lima lapang pandang searah jarum jam. Tingkat ekspresi IL-10 dinilai secara kuantitatif
dan dihitung sebagai nilai skor histologi. Setiap pelaksanaan pewarnaan dibuat kontrol positif dan kontrol negatif. I. Teknik Analisis Data Data disajikan dalam bentuk mean ± SD kemudian dianalisis menggunakan SPSS 22 for windows dengan nilai p <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Untuk mengetahui beda rata-rata antara kelompok kontrol, pristan, pristan + secretome sel punca mesenkimal, digunakan uji F Anova bila distribusi data normal dan bila signifikan akan dilanjutkan dengan LSD Post Hoc Test. Sedangkan bila datanya tidak normal digunakan uji KruskalWallis yang akan dilanjutkan dengan Mann-whitney U test. J. Alur Penelitian 21 ekor mencit Balb/C betina Umur 3-4 bulan, Berat badan ± 20-30 gr Randomisasi
Kelompok kontrol 7 ekor
Injeksi Nacl 0,9% 0,5 ml
Kelompok pristan 7 ekor
Kelompok pristan+secretome 7 ekor
Single injeksi Pristan 0,5 intraperitoneal 3 minggu
Injeksi Nacl 0,9% 0,45 ml i.p 3 hari Sampel ginjal dan darah Pemeriksaan IL-10 dan hsCRP Analisis data
Injeksi Secretome 0,45 ml ip
Gambar 8. Alur penelitian
