20
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menggunakan rancangan pre-post-test control group design. 3.1.1 Rancangan Penelitian Ekstrak Etanol 96% Kulit Buah Manggis terhadap Hidrasi dan pH Kulit
S
R
O1
P0
O2
O3
P1
O4
O5
P2
O6
Gambar 3.1 Bagan Rancangan Penelitian Hidrasi dan pH Kulit Keterangan: S = Sampel; R= Random; P0 = Kelompok kontrol; P1 = Kelompok perlakuan I; P2 = Kelompok perlakukan II; O1 = Observasi (pre-test) hidrasi dan pH kulit kelompok kontrol; O2 = Observasi (post-test) hidrasi dan pH kulit kelompok kontrol; O3 = Observasi (pre-test) hidrasi dan pH kulit kelompok perlakuan I; O4 = Observasi (post-test) hidrasi dan pH kulit kelompok perlakuan I; O5 = Observasi (pre-test) hidrasi dan pH kulit kelompok perlakuan II; O6 = Observasi (post-test) hidrasi dan pH kulit kelompok perlakuan II.
21
3.1.2 Penentuan Subjek Uji Sampel yang digunakan adalah tikus sebanyak 30 ekor yang dipilih berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi. Sampel terpilih dibagi ke dalam tiga kelompok dan diletakkan dalam kandang di ruangan yang tidak terang dengan suhu ruang berkisar antara 25oC dan kelembaban 70%. Masing-masing kandang berisi 5 ekor tikus. a. Jumlah Sampel Penentuan besar sampel minimal subjek penelitian dengan menggunakan rumus Federer (Federer, 2008) : (n - 1) (t - 1) ≥ 15 t
= jumlah perlakuan
n
= jumlah replikasi
Penelitian ini menggunakan 3 kelompok maka sesuai dengan rumus Federer : (n – 1) (t – 1) ≥ 15 (n – 1) (3 – 1) ≥ 15 2 (n – 1) ≥ 15 2n – 2 ≥ 15 2n ≥ 15 + 2 n≥9 Tiap kelompok ditambah 10% yang digunakan sebagai cadangan (10% x 9 = 0,9 ≈ 1).
22
Berdasarkan rumus diatas maka jumlah tikus pada tiap kelompok adalah 10 ekor. Dengan demikian, total tikus yang dibutuhkan untuk tiga kelompok adalah 30 ekor. b. Kriteria Inklusi -
Tikus wistar, jantan sehat
-
Umur 10-12 minggu
-
Berat badan 200-250 gram
-
Aktivitas aktif
c. Kriteria Eksklusi Tikus mati saat penelitian berlangsung. Penentuan kelompok dilakukan secara acak (random). Random adalah teknik samping yang dilakukan secara acak. Dalam penelitian ini tikus yang mudah diambil mendapat peluang terlebih dulu untuk terambil. Setelah dibagi ke dalam tiga kelompok, tikus di masing-masing kelompok lalu diberi nomor dari satu hingga sepuluh. Penelitian dilakukan selama 28 hari untuk melihat efek jangka pendek atau akut dari paparan radiasi sinar UV-B terhadap penuaan kulit dini. Tikus diberi makanan standar berupa jenis pakan ayam petelur dengan komposisi KLK super 35%, ditambah dedak padi 15% dan jagung 50% dan diberikan sebanyak satu gelas 200 mL dua kali sehari selama 28 hari, dan diberi minum secara ad libitum juga. 3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Lokasi penelitian dilakukan di beberapa tempat di antaranya, identifikasi tumbuhan manggis dilakukan di Kebun Raya Eka Karya Bedugul, pengolahan
23
simplisia kulit buah manggis dan ekstraksi kulit buah manggis dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Farmakognosi Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, formulasi masker gel peel off ekstrak etanol kulit buah manggis dilakukan di Laboratorium Farmaserika dan Teknologi Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, pengujian karakteristik ekstrak dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Farmakognosi Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, dan pengujian hidrasi dan pH kulit dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Waktu penelitian dilakukan dari bulan Desember 2015 higga bulan Maret 2016. 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, timbangan analitik (Adam AFP-360L), pengayak mesh 20, desikator, heater (Corning PC420D), blender (Philips), rotary evapoator (Eyela), waterbath (Memmert), oven (Binder), pH meter (Oakton pH 510 series), viskometer Brookfield DV-E, kandang tikus dengan kelengkapan tempat makanan dan minuman, alat pencukur, lampu broadband Ultraviolet buatan tipe KN-4003 B, pengukur dosis radiasi (Dosimetri), skin hydration analyzer, pH meter kulit. 3.3.2 Bahan Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah manggis, bahan kimia derajat teknis seperti Polyvinyl Alcohol (Bratachem), HPMC (Bratachem), gliserin (Bratachem), metil paraben (Bratachem), propil
24
paraben (Bratachem), akuades, etanol 96% (Bratachem), 30 ekor tikus wistar jantan umur 10-12 minggu berat badan 200-250 gram. 3.4 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 3.4.1 Variabel Penelitian a. Variabel Prakondisi Variabel prakondisi adalah variabel yang merupakan prasyarat bekerjanya variabel bebas dan variabel terikat, yaitu: paparan sinar UVB. b. Variabel Bebas Variabel bebas adalah variabel yang mempengaruhi secara langsung penelitian ini berlangsung, yaitu: basis masker gel peel off dan masker gel peel off ekstrak etanol 96% kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) c. Variabel Terikat Variabel terikat adalah variabel yang merupakan hasil perlakuan variabel bebas yaitu: nilai hidrasi dan pH. 3.4.2 Definisi Operasional a. Sampel merupakan subjek uji yang dipilih berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi. b. Random adalah teknik samping yang dilakukan secara acak. Dalam penelitian ini tikus yang mudah diambil mendapat peluang terlebih dulu untuk terambil. c. Sinar Ultraviolet adalah paparan sinar UV-B dari solar simulator yang diberikan 3 kali perminggu dengan total dosis 840 mJ/cm2 selama 4
25
minggu. Dosis sinar UV-B diberikan 50 mJ/cm2, 70 mJ/cm2, 80 mJ/cm2, 80 mJ/cm2 setiap minggu berturut-turut dengan jarak paparan 1 cm. d. Simplisia kulit buah manggis adalah bagian kulit buah manggis yang dikeringkan pada suhu 65oC hingga memenuhi persyaratan kadar air simplisia yakni kurang dari 10% kemudian diblender dan diayak. e. Ekstrak etanol kulit buah manggis merupakan sediaan pekat hasil maserasi dari serbuk kulit buah manggis dengan menggunakan etanol 96%, kemudian pelarut diuapkan dan dikeringkan dengan freeze drying sehingga diperoleh ekstrak kering. f. Masker gel peel off ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.): adalah masker gel semi transparan yang terbuat dari PVA, HPMC, ekstrak etanol 96% kulit buah manggis sebanyak 0,5%, Gliserin, metil paraben, propil paraben dan akuades yang telah optimasi oleh Adhiningrat (2015). g. Kelompok kontrol adalah kelompok subjek yang tidak dioleskan dengan basis masker maupun masker gel peel off dan tidak tiberi paparan sinar UV-B. h. Kelompok perlakuan I adalah kelompok subjek yang diolesi basis masker gel peel off (placebo) dan diberi paparan sinar UV-B i. Kelompok perlakuan II adalah kelompok subjek yang diolesi masker gel peel off ekstrak etanol 96% kulit buah manggis dengan konsentrasi 0,5% dan diberi paparan sinar UV-B j. Masker wajah gel peel off ekstrak kulit buah buah manggis merupakan masker gel semi transparan dengan formula Polivinyl Alcohol (PVA),
26
Hidroxy Propyl Methyl Cellulose (HPMC), ekstrak kental kulit buah manggis, gliserin, metil paraben, propil paraben dan akuades yang telah diformulasikan oleh Adhiningrat (2015). k. Radiasi sinar UV adalah paparan sinar UV-B dipaparkan pada kelompok perlakuan I dan kelompok perlakuan II. Sumber UV-B yang digunakan adalah UV-B buatan China, tipe KN-4003 B. Alat ini dapat memancarkan sinar UV-B dengan besar dosis radiasi yang dapat diukur dengan UV Light Meter UV-340 B. l. Hidrasi kulit: tingkat kelembaban kulit yang diukur dengan menganalisis konduktivitasnya dengan alat skin hydration analyzer. m. pH kulit: kadar pH kulit yang diukur dengan alat surface pH meter. 3.5 Prosedur Penelitian Pertama-tama diajukan permohonan ethical clearance di Unit Penelitian dan Pengembangan (Litbang) Fakultas Kedokteran hewan Universitas Udayana sebagai persyaratan agar penelitian ini dinyataan layak etik dan dapat dilaksanakan. 3.5.1 Pengumpulan Sampel Sampel kulit buah manggis diperoleh dari Desa Luwus, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan, Bali. 3.5.2 Identifikasi Tumbuhan Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian Determinasi Kebun Raya Eka Karya Bedugul, Tabanan, Bali.
27
3.5.3 Pengolahan Simplisia Pertama-tama buah manggis yang diperoleh dicuci lalu dipisahkan kulit dengan daging buahnya. Kulit buah kemudian diiris tipis dan dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 65oC. Kulit buah yang telah kering lalu diserbuk menggunakan blender dan diayak dengan pengayak mesh 20. Serbuk kering yang diperoleh disimpan di dalam wadah kering dan tertutup rapat (Utami, 2014). 3.5.4 Penetapan Kadar Air Simplisia Penetapan kadar air dilakukan dengan metode gravimetri. Botol timbang beserta tutup dikeringkan pada suhu 105oC selama 30 menit, didinginkan dalam desikator lalu ditimbang (A). Kemudian simplisia ditimbang sebanyak 1 gram dalam botol timbang (B). Simplisia diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol, hingga membentuk lapisan setebal lebih kurang sampai 10 mm dan dikeringkan pada suhu 105oC selama 30 menit dengan tutup terbuka. Kemudian didinginkan dalam keadaan tertutup dalam desikator suhu kamar dan selanjutnya ditimbang kembali C. Penetapan kadar air dilakukan hingga diperoleh perbedaan berat di antara 2 penimbangan tidak lebih dari 0,25%. Kadar air dihitung dengan persamaan berikut: Kadar Air =
B - (C - A) x 100% ………………………....………(1) B (DepKes RI, 1986)
3.5.5 Proses Maserasi Serbuk Simplisia
28
Serbuk kulit buah manggis didefating dengan n-heksan selama 1 hari, kemudian diekstraksi dengan cara dimaserasi menggunakan etanol 96% dengan perbandingan 1:10 b/v dan disertai pengadukan selama 3 hari pada suhu ruang. Ampas diremaserasi 1 kali dengan perbandingan serbuk dan etanol 96% 1:4 b/v selama 1 hari dalam suhu ruang. Maserat yang diperoleh diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator pada suhu 50oC hingga dapat dituang kemudian diuapkan menggunakan oven pada suhu 50oC hingga diperoleh ekstrak kental (Utami, 2014). Selanjutnya Ekstrak kental yang diperoleh di keringkan dengan freeze drying. 3.5.6 Penetapan Kadar Air Ekstrak Penetapan kadar air ekstrak dilakukan dengan metode gravimetri. Botol timbang beserta tutup dikeringkan pada suhu 105oC selama 30 menit, didinginkan dalam desikator lalu ditimbang (A). Satu gram ekstrak kulit buah manggis ditimbang dalam botol timbang (B), dioven selama 30 menit pada suhu 105oC dengan tutup terbuka. Didinginkan dalam desikator dan ditimbang kembali (C). Penetapan kadar air dilakukan hingga diperoleh perbedaan sampai selisih dua penimbangan kadar air tidak lebih dari 0,25% (DepKes RI, 1986). Kadar air dihitung dengan persamaan berikut. Kadar Air =
B - (C - A) x 100% ………………………....………(1) B (DepKes RI, 1986)
3.5.7 Pembuatan Sediaan Masker Gel Peel Off Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)
29
Bahan yang digunakan dalam formulasi masker gel peel off ekstrak kulit buah manggis adalah PVA, HPMC, gliserin, ekstrak kental kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.), metil paraben, propil paraben, dan air. Pertama-tama PVA didispersikan dalam akuades dengan pengadukan konstan dan didiamkan pada suhu 90ºC (campuran 1). HPMC dikembangkan dalam akuades dengan suhu 90oC, kemudian diaduk konstan dan dibiarkan selama 10 menit (campuran 2). Ekstrak dicampurkan ke dalam gliserin (campuran 3). Metil paraben dan propil paraben dilarutkan dalam akuades (campuan 4). Campuran 1, 2, 3 dan 4 dicampurkan dan diaduk hingga homogen (Adhiningrat, 2015). 3.5.8 Evaluasi Masker Gel Peel Off Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) a. Pengujian Viskositas Pengukuran viskositas dilakukan dengan menempatkan sejumlah sampel dalam viskosimeter Brookfield. Ukuran spindle dan kecepatan putaran yang akan digunakan diatur terlebih dahulu untuk menghasilkan nilai torsi 10100%. Selanjutnya alat dinyalakan, dan viskositas dari masker gel akan terbaca (Septiani dkk., 2011). Nilai viskositas yang diinginkan sebesar 2000-4000 cps (Adhiningrat, 2015). b. Pengujian Daya Sebar Sebanyak 1 gram sediaan gel diletakan dengan hati-hati diatas kaca berukuran 20 x 20 cm yang diletakkan di atas sebuah kertas grafik. Kaca yang telah berisi sediaan gel tersebut selanjutnya ditutupi dengan kaca yang lain dan digunakan pemberat diatasnya hingga bobot mencapai 125 gram.
30
Diameter yang terbentuk diukur setelah 1 menit (Garg et al., 2012). Daya sebar sediaan yang diinginkan yaitu 5-7 cm (Adhiningrat, 2015). c. Pengujian Waktu Mengering Jumlah masker yang dioleskan sebanyak 0,7 gram dan disebar di atas permukaan kaca dengan area seluas 5,0 x 2,5 cm hingga membentuk lapisan tipis seragam dengan tebal kira-kira 1 mm, hal ini sesuai dengan pengaplikasian masker pada wajah. Kaca yang telah diolesi masker dimasukkan ke dalam oven pada suhu 36,5 ± 2oC. Sediaan dimonitor sampai proses pengeringan selesai dan memungkinkan untuk mengelupas semua lapisan film dari kaca (Vieira et al., 2009). Waktu mengering sediaan yang diingkan yaitu 15-30 menit (Adhiningrat, 2015). d. Pengujian pH Dilakukan dengan mencelupkan elektroda pH meter ke dalam setiap sediaan masker yang telah dilarutkan dalam aquades. Setelah elektroda tercelup, pH meter dinyalakan kemudian didiamkan hingga layar pada pH meter menunjukan angka yang stabil (Septiani dkk., 2011). pH sediaan yang diinginkan yaitu 4-8 (Adhiningrat, 2015). 3.5.9 Pengujian Hidrasi dan pH Kulit Terhadap Paparan Sinar UV-B Rambut tikus dicukur dengan ukuran minimal 2 x 2 cm, kemudian diberikan paparan sinar UV-B dengan total dosis 840 mJ/cm2 selama 4 minggu, dengan rincian pada tabel 3.1 Masker gel peel off dioleskan setiap pada seluruh punggung tikus bagian. Hidrasi kulit diukur dengan skin hydration analyzer dan pH kulit diukur dengan surface pH meter. Alat
31
skin hydration analyzer bekerja dengan mengukur kadar air yang terdapat di lapisan kulit dan surface. Alat ini digunakan dengan cara ditempelkan pada permukaan kulit hewan uji lalu ditunggu beberapa saat hingga muncul nilai hidrasi dalam bentuk prosentase pada layar yang terdapat pada alat. pH meter bekerja dengan cara mengukur ion H+ pada permukaan kulit. Alat ini digunakan dengan cara bagian bawah alat yang terdapat elektroda ditempelkan pada permukaan kulit hewan uji dan ditunggu hingga nilai pH yang ditampilkan pada layar yang terdapat pada alat berhenti berubah. Tabel 3.1. Jadwal paparan, dosis dan lama penyinaran UV-B Jadwal Paparan
Dosis Sinar UV
Lama Paparan
Minggu I (Senin, Rabu, Jumat)
50 mJ/cm2
50 detik
Minggu II (Senin, Rabu, jumat)
70 mJ/cm2
70 detik
Minggu III dan IV (Senin, Rabu, Jumat)
80 mJ/cm2
80 detik (Wahyuningsih, 2010)
3.5.10 Pengolahan dan Analisis Data Langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut: a. Analisis Deskriptif Merupakan dasar uji hipotesis untuk mengetahui karakteristik data yang dimiliki dan dilakukan dengan program SPSS 17.0. b. Uji Normalitas Data Normalitas data diuji dengan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui rerata data sampel berdistribusi normal atau tidak. Jika dihasilkan
32
p>0,05, maka data dinyatakan terdistribusi normal dan dapat dilnjutkan pengujian selanjutnya. Jika dihasilkan p<0,05 maka data dinyatakan tidak normal sehingga perlu dilakukan transformasi data. Penentuan bentuk transformasi data dilakukan dengan mencari Power Estimation terlebih dahulu, sehingga diperoleh nilai slope dan power. Tabel 3.2 bentuk Trasformasi Data Slope
Power
Bentuk Transformasi
-1
2
Square (kuadrat)
0
1
Tidak perlu transformasi
0,5
0,5
Square root (akar)
1
0
Logaritma
1,5
-0,5
1/square root
2
-1
Reciprocal (1/n) (Dahlan, 2011)
Setelah diperoleh data yang terdistribusi normal, maka dapat dilakukan uji varians untuk variabel hasil transformasi, sehingga dapat diperoleh data yang terdistribusi normal dan homogen. c. Uji Homogenitas Selanjutnya dilakukan uji homogenitas dengan Levene’s test. Jika dihasilkan p<0,05, maka dinyatakan data tidak homogen. Jika dihasilkan p>0,05, maka dinyatakan data homogen. d. Analisis Data Pre dan Data Post
33
Untuk membandingkan kondisi masing-masing kelompok, jika sebaran data normal, data nilai hidrasi dan pH ketiga kelompok uji sebelum penelitian (hari ke-1) dan setelah penelitian (hari ke-28) dianalisis menggunakan Uji ANOVA One Way dan dilanjutkan dengan Uji Least Significant Difference (LSD) dengan taraf kepercayaan 95% untuk melihat kelompok mana yang berbeda secara statistik dengan kelompok lainnya. Hipotesisnya adalah sebagai berikut: H0 : tidak ada perbedaan antara hidrasi dan pH kulit hewan uji pada kelompok kontrol, perlakuan I dan perlakuan II (p > 0,05). H1 : ada perbedaan antara hidrasi dan pH kulit hewan uji pada kelompok kontrol, perlakuan I dan perlakuan II (p < 0,05). e. Analisis Data Pre-Post Untuk membandingkan kondisi masing-masing kelompok sebelum penelitian (hari ke-1) dengan kondisi setelah penelitian (hari ke-28), jika sebaran data normal, data hidrasi dan pH dari masing-masing kelompok dianalisis menggunakan Uji T Berpasangan menggunakan taraf kepercayaan 95% dengan hipotesis sebagai berikut: H0 : tidak ada perbedaan antara hidrasi dan pH kulit hewan uji sebelum dan sesudah penelitian (p > 0,05). H1 : ada perbedaan antara hidrasi dan pH kulit hewan uji sebelum dan
sesudah
penelitian
(p
<
0,05).
34
3.5.11 Skema Umum Penelitian Pengumpulan dan Identifikasi Tumbuhan Manggis (Garcinia mangostana L.) Preparasi Simplisia Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Uji Kadar Air Simplisia
Simplisia Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Ekstraksi Serbuk Simplisia Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)
Uji Kadar Air Ekstrak
Ekstrak Kental Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Formulasi Sediaan Masker Gel Peel Off Ekstrak Etanol 96% Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L) Subyek Uji Tikus Wistar Jantan (n=30) Kelompok Kontrol (n = 10)
Kelompok Perlakuan I (n=10)
Evaluasi Fisika Kimia Sediaan Masker Gel Peel Off
Kelompok Perlakuan II (n=10)
Pengujian Hidrasi dan pH Kulit Terhadap Paparan Sinar UV-B
Pre Test
Perlakuan
Post Test
Analisis Data
Analisis Data
Analisis Data
Uji One Way ANOVA
Uji T Berpasangan
Uji One Way ANOVA
Uji LSD
Uji LSD
