BAB III METODA PENELITIAN
A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah jenis penelitian deskriptif.
B. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium mikrobiologi program studi DIII Analis Kesehatan fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang di Jalan Wonodri Sendang Raya 2A Semarang. Waktu penelitian dimulai dari bulan Oktober 2009 sampai bulan Juni 2010.
C. Populasi Sampel dan Sampel Penelitian Populasi sampel dalam penelitian ini adalah pasien rawat inap penderita demam tipoid di Rumah Sakit Islam Sultan Agung Semarang dengan titer Widal ≥ 1/160 pada bulan November 2009 sampai bulan Januari 2010. Sampel penelitian ini adalah darah, urin dan feses pasien rawat inap penderita demam tipoid di Rumah Sakit Islam Sultan Agung Semarang. D. Jenis Data Data yang digunakan adalah data primer yang diperoleh selama penelitian di laboratorium yang meliputi data hasil isolasi dan identifikasi 13
dari sample feses, urin, dan darah penderita demam tipoid yang diperoleh di Rumah Sakit Islam Sultan Agung.
E. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, cawan petri, mikropipet, beaker glass, ose tusuk, ose mata, rak tabung reaksi, lampu spirtus, autoclave dan inkubator. 2. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah a. media isolasi bakteri yaitu Buffer Pepton Water (Merek), Braint Heart Infusion (Oxoid) dan selenit. b. media kultur bakteri yaitu Salmonella Shigella Agar (Oxoid), Mac Concey (Merck), Hert Infusion Agar (Oxoid). c. media uji biokimia yaitu Indol, Methyl Red (Merek), Voges Paskeaur (Merek), Simon Citrat (Merek), motilitas (Merek), urea Broth (Merek), Tripel Sugar Iron Agar (Merek), glukosa (Merek), laktosa (Merek) dan sukrosa (Merek), α Naptol, KOH 40%, Reagen Kovac’s. F. Prosedur Kerja 1. Persiapan alat Semua alat yang digunakan dan yang memungkinkan untuk disterilkan, maka disterilkan dengan cara diautoclave pada suhu 121˚C tekanan 2 atm, kemudian dipanaskan dengan oven pada suhu 60˚C.
14
2. Isolasi dan identifikasi strain bakteri S. typhi, S. paratyphi A, B dan C pada sampel darah. isolasi dan identifkasi strain bakteri S. typhi, S. paratyphi A, B dan C pada sample darah penderita demam tipoid yang ditunjukkan dengan diagnosa klinis serta dikuatkan dengan hasil pemeriksaan Widal di Rumah Sakit Islam Sultan Agung Semarang. 5 mililiter darah vena tanpa antikoagulan diambil, kemudian dimasukkan kedalam 5 ml media BHI, diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Pada hari berikutnya ditanam pada media SSA dan MC dengan metode gores, kemudian diinkubasi 37˚C selama 24 jam, tersangka koloni S. typhi, S. paratyphi A, B dan C pada media SSA / MC memiliki elevesi cembung, warna koloni transparan, tepi rata, konsistensi smooth, diameter 2-3mm. Setelah itu koloni tersangka S. typhi, S. paratyphi A, B dan C ditanam pada media uji biokimia (Indol, MR, Vp, Citrat, Motilitas, Urea, TSIA, Glukosa, Laktosa dan Sukrosa) diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam, setelah itu diamati hasil uji biokimianya (WHO, 2003).
15
Skema 1.1. Penanganan Sampel Pada Darah Sebanyak 5 ml darah + 5 ml BHI Diinkubasi, 37˚C selama 24 jam
Kultur pada MC dan SSA Inkubasi, 37˚C selama 24 jam
Pengamatan hasil kultur (koloni berbentuk bulat, warna koloni transparan, tepi rata, elevasi cembung, Konsistensi smooth, diameter 2-4mm)
Koloni ditanam pada media uji biokimia (Indol, MR, Vp, Citrat, Motilitas, Urea, TSIA, Glukosa, Laktosa dan Sukrosa) Inkubasi, 37˚C selama 24 jam
Amati hasil biokimia, dan lakukan identifikasi kuman Spesies S. typhi S. paratyphi A S. paratyphi B S. paratyphi C
I -
MR + + + +
Vp -
C + -
M + + + +
U -
TSIA K/A,G(-), H2S(+) K/A,G(+), H2S(-) K/A, G(+),H2S(+) K/A, G(+),H2S(+)
G G(-), + G(+), + G(+), + G(+), +
L -
S -
16
3. Isolasi dan identifkasi strain bakteri Salmonella typhi, paratyphi A, B dan C pada sampel urin. Isolasi dan identifkasi strain bakteri Salmonella typhi, paratyphi A, B dan C pada sampel urin penderita demam tipoid yang ditunjukkan pada diagnosa klinisnya dan dikuatkan dengan hasil pemeriksaan Widal di Rumah Sakit Islam Sultan Agung Semarang. Lima gram feses diambil, kemudian dimasukkan kedalam 5 ml media BHI, kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Hari berikutnya diambil sebanyak 1000 µl sampel dari media BHI, kemudian dimasukkan kedalam media selenit, inkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam, kemudian hari berikutnya ditanam pada media SSA dan MC dengan metode gores, kemudian di inkubasi 37˚C selama 24 jam, tersangka koloni S. typhi, S. paratyphi A, B dan C pada media SSA / MC memiliki elevesi cembung, warna koloni transparan, tepi rata, konsistensi smooth, diameter 2-3mm. kemudian koloni tersangka S. typhi, S. paratyphi A, B dan C ditanam pada media uji biokimia (Indol, MR, Vp, C, M, U, TSIA, G, L, S) diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam, hari berikutnya lakukan pengamatan uji biokimia (WHO, 2003).
17
Skema 1.2. Penanganan Sample Pada Urin Sebanyak 5 ml urin, centrifuge selama 5 menit, 3000rpm Pisahkan antara supernatant dengan presipitat Presipitat + 5 ml BHI Inkubasi, suhu 37˚C selama 24 jam
diambil 1000 µl dari media BHI, masukkan kedalam 5ml Selenit Inkubasi pada suhu 37˚C, selama 24 jam
Tanam pada media SSA dan MC Inkubasi, suhu 37˚C selama 24 jam
Amati koloni Hasil kultur , diamati koloni (koloni berbentuk bulat, warna koloni transparan, tepi rata, elevasi cembung, Konsistensi smooth, diameter 2-4mm)
Koloni ditanam pada media uji biokimia (Indol, MR, Vp, Citrat, Motilitas, Urea, TSIA, Glukosa, Laktosa, Sukrosa), Inkubasi, 37˚C selama 24 jam
Amati hasil biokimia, dan lakukan identifikasi kuman Spesies S. typhi S. paratyphi A S. paratyphi B S. paratyphi C
I -
MR + + + +
Vp -
C + -
M + + + +
U -
TSIA K/A,G(-), H2S(+) K/A,G(+), H2S(-) K/A, G(+),H2S(+) K/A, G(+),H2S(+)
G G(-), + G(+), + G(+), + G(+), +
L -
S -
18
4. isolasi dan identifkasi strain bakteri S. typhi, S. paratyphi A, B dan C pada sampel feses. isolasi dan identifkasi strain bakteri S. typhi, S. paratyphi A, B dan C pada sample feses penderita demam tipoid yang ditunjukkan pada diagnosa klinisnya dan dikuatkan dengan hasil pemeriksaan Widal di Rumah Sakit Islam Sultan Agung Semarang. Lima gram feses diambil, kemudian masukan kedalam 5 milliliter BPW, kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Hari berikutnya diambil sebanyak 500 µl sample dari media BHI dan dimasukan kedalam media selenit, inkubasi pada suhu37˚C selama 24 jam, kemudian hari berikutnya dikultur pada media SSA dan MC dengan metode gores, diinkubasi 37˚C selama 24 jam, tersangka koloni S. typhi, S. paratyphi A, B dan C pada media SSA / MC memiliki elevesi cembung, warna koloni transparan, tepi rata, konsistensi smooth, diameter 2-3mm, Setelah itu koloni tersangka S. typhi, S. paratyphi A, B dan C ditanam pada media uji biokimia (Indol, MR, Vp, C, M, U, TSIA, G, L, S) diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam, hari berikutnya lakukan pengamatan hasil uji biokimia (Chotiah, dkk., 2006).
19
Skema 1.3. Penanganan Sampel Pada Feses Sebanyak 5 gram feses + 5 ml BPW Inkubasi, suhu 37ºC selama 24 jam
Diambil 500 µl + 5 ml media Selenit Inkubasi, suhu 37ºC selama 24 jam
Tanam pada media SSA da MC Inkubasi, 37ºC selama 24 jam
Amati morfologi koloni pada media MC/SSA (koloni berbentuk bulat, warna koloni transparan, tepi rata, elevasi cembung, Konsistensi, smooth, diameter 2-4mm)
Koloni ditanam pada media uji biokimia (Indol, MR, Vp, Citrat, Motilitas, Urea, TSIA, Glukosa, Laktosa dan Sukrosa) Inkubasi, 37ºC selama 24 jam
Amati hasil biokimia, dan lakukan identifikasi kuman Spesies S. typhi S. paratyphi A S. paratyphi B S. paratyphi C
I -
MR + + + +
Vp -
C + -
M + + + +
U -
TSIA K/A,G(-), H2S(+) K/A,G(+), H2S(-) K/A, G(+),H2S(+) K/A, G(+),H2S(+)
G G(-), + G(+), + G(+), + G(+), +
L -
S -
20
G. Interpretasi Hasil Uji Biokimia 1. Indol Media yang digunakan adalah media Tryptofan Broth, media ini digunakan untuk mengetahui adanya produksi enzim triptofanase dari bakteri yang memecah triptofan menjadi asam piruvat dan hasil sampingnya berupa amoniak dan indol, untuk itu media dilengkapi dengan asam amino triptofan, Jika bakteri mampu memecah asam amino triptofan dan menghasilkan indol maka dapat diditeksi dengan meneteskan reagen Kovac’s atau reagen Erlich yang mengandung Para Amino Benzoic Acid (PABA) melalui dinding tabung, dan akan terjadi ikatan antara indol dengan PABA yang membentuk cincin merah. 2. Methyl Red dan Voges Proskauer Media uji untuk MR-Vp mengandung glukosa sebagai bahan uji kemampuan bakteri dalam mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkohol. Untuk uji MR jika bakteri mampu mengubah glukosa manjadi asam organik dan alkohol, maka setelah ditambahkan dengan reagen MR maka media akan berubah menjadi merah, tapi jika bakteri tidak mampu mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkohol maka media tetap berwarna kuning. Untuk uji Voges Proskauer jika bakteri mampu mengubah glukosa manjadi asam organik dan alkohol, maka setelah ditambahkan dengan 21
alfa nafthol dan KOH 40% maka media akan berubah menjadi merah, tapi jika bakteri tidak mampu mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkohol maka media tetap berwarna kuning. 3. Simon Citrat Media simon citrat digunakan untuk menguji kemampuan bakteri didalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon utama bagi bakteri. Jika sitrat digunakan atau difermentasi, maka akan mengubah indikator Bromo Thymol Blue yang semula hijau menjadi biru. 4. Motilitas Media yang digunakan untuk uji motilitas adalah media uji semisolid, uji ini digunakan untuk melihat pergerakan bakteri. Bakteri yang memiliki flagel sebagai alat gerak, akan bergerak menuju makanan atau oksigen yang gerakannya dapat dilihat membekas pada media semisolid berupa tanda guratan, atau gambaran putih disekitar tusukan. 5. Urea Broth Media ini digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan urea ( oleh enzim urease yang dihasilkan bakteri). Dalam penguraian urea ini akan menghasilkan residu berupa amoniak, sehingga akan mengubah warna indikator neutral red menjadi lebih ungu. 6. Tripel Sugar Iron Agar Media TSIA mengandung 3 macam gula yaitu laktosa dan sukrosa pada lereng media, dan glukosa pada dasar media, hal ini
22
disebabkan oleh berat molekul glukosa lebih rendah dari laktosa dan sukrosa. Media tersebut digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam memfermentasi karbohidrat (gula) menjadi asam organik, dengan disertai pembentukan gas maupun tidak. Selain itu media TSIA juga mengandung logam berat Fe (besi) yang dapat digunakan untuk uji kemampuan bakteri dalam memproduksi H2S. Jika bakteri tidak mampu memfermentasi laktosa dan sukrosa dan memfermentasikan glukosa maka pada lereng media akan berwarna kuning dan pada dasar media berwarna merah (K/A). Jika bakteri memfermentasi glukosa maupun laktosa dan sukrosa maka pada lereng dan dasar media akan berwarna kuning (terbentuk asam) dan jika bakteri tidak mampu memfermentasikan glukosa maupun laktosa dan sukrosa maka lereng maupun dasar media akan berwarna merah (tidak terbentuk asam). 7. Gula-gula (Glukosa, Laktosa, dan Sukrosa) Media uji gula-gula ini digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa menjadi asam. Pada media gula-gula dilengkapi dengan indikator phenol red, jika bakteri memfermantasi glukosa, laktosa dan sukrosa menjadi asam maka media akan berubah dari merah menjadi kuning, khusus pada media glukosa dilengkapi dengan tabung durham yang berfungsi untuk
23
menampung gas CO2 sebagai hasil samping dari fermentasi gula menjadi asam.
H. Analisis Data Semua data yang terkumpul diedit, ditabulasikan, kemudian diolah secara manual dan hasilnya disajikan dalam bentuk table, kemudian diuraikan secara diskriptif.
