BAB III BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu Percobaan Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Teknologi Benih, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, Jatinangor. Penelitian dilakukan selama 3 bulan mulai dari bulan akhir Januari 2012 sampai dengan akhir April 2012.
3.2. Bahan dan Alat Percobaan 3.2.1. Bahan Bahan tanaman (eksplan) yang digunakan dalam percobaan ini adalah tunas
mikro
anggrek
asal
protocorm
hasil
selfing
Cattleya
‘Blc. Mount Hood Mary’ dalam kondisi aseptik yang dihasilkan dari perkecambahan secara in vitro yang berumur 10 bulan.
Bahan-bahan yang
digunakan dalam media kultur antara lain pupuk daun merek dagang Growmore sebagai media dasar (Lampiran 2), senyawa organik kompleks yakni ekstrak wortel impor Cina (Lampiran 3) sebagai sumber auksin dengan alur pembuatan ekstrak (Lampiran 6) dan air kelapa muda (Lampiran 4) sebagai sumber sitokinin dengan alur pembuatan stok air kelapa (Lampiran 7). Bahan-bahan tambahan lainnya yang digunakan dalam media antara lain agar, gula, aquades, NaOH 0.1 N dan HCl 0.1 N. Bahan-bahan yang digunakan untuk sterilisasi antara lain alkohol 95%, alumunium foil, tissue, spirtus, dan aquades. Bahan-bahan tambahan lainnya yang digunakan yakni karet gelang dan label. 31
32 3.2.2. Alat Alat-alat yang digunakan pada tahap pembuatan media adalah timbangan analitik, erlenmeyer, beaker glass, pipet dan volume pipet, hot plate magnetic stirer, botol kultur ukuran 30 mL, alat suntik 25 mL, pH meter, oven, autoclave, kertas saring Whatman No. 93, saringan, gelas ukur, pisau, dan lemari es. Alat-alat yang digunakan pada tahap penanaman adalah Laminar Air Flow (LAF), petridish, pinset, scalpel, dan lampu spiritus. Alat-alat yang digunakan pada tahapan inkubasi adalah rak kultur, air conditioner (AC), lampu TL, timer dan termohigrometer. Alat-alat yang digunakan pada tahapan pengamatan adalah kertas milimeter blok, benang, dan alat tulis.
3.3. Rancangan Percobaan Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 8 kombinasi perlakuan dan 4 ulangan. Setiap ulangan terdiri dari 5 botol kultur sehingga total keseluruhan ada 160 unit percobaan. Botol-botol kultur yang berisi media dan tunas mikro ditempatkan di atas rak-rak kultur. Perlakuan yang diberikan dalam percobaan ini dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Media Perlakuan Media A B C D E F G H
Komposisi Ekstrak wortel 25 mL L + Tanpa air kelapa Ekstrak wortel 25 mL L-1 + Air kelapa 200 mL L-1 Ekstrak wortel 50 mL L-1 + Tanpa air kelapa Ekstrak wortel 50 mL L-1 + Air kelapa 200 mL L-1 Ekstrak wortel 100 mL L-1 + Tanpa air kelapa Ekstrak wortel 100 mL L-1 + Air kelapa 200 mL L-1 Ekstrak wortel 150 mL L-1 + Tanpa air kelapa Ekstrak wortel 150 mL L-1 + Air kelapa 200 mL L-1 -1
33 3.3.1. Rancangan Analisis Rancangan analisis yang digunakan dalam percobaan ini berdasarkan model Rancangan Acak Lengkap adalah sebagai berikut (Gaspersz, 1991): Yij = µ + Ti + єij Yij = µ + Ti + єij (i = 1,2,3,4...t ; j = 1,2,3,4...r) (i = 1,2,3,4...t ; j = 1,2,3,4...r)
Yij
: Respon tanaman yang diamati pada perlakuan ke-i ulangan ke-j
µ
: Rataan Umum
Ti
: Pengaruh perlakuan ke-i
єij
: Pengaruh galat percobaan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Berdasarkan model linier tersebut, maka analisis variansnya dapat dilihat
pada Tabel 2. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan uji F. Perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang nyata selanjutnya dilakukan pengujian
lanjut
dengan
menggunakan
uji
jarak
berganda
Duncan
(Duncan Multiple Range Test).
Tabel 2. Analisis Ragam Rancangan Acak Lengkap Sumber
Derajat Bebas
Jumlah Kuadrat
Kuadrat Tengah
Variasi
(DB)
(JK)
(KT)
m-1
JKP
JKP m 1
(rm-1) – (t-1)
JKG
JKG rm m
rm-1
JKP + JKG
Perlakuan
Galat percobaan Total
Sumber : Gaspersz, 1991
F-Hitung
KTP/KTG
34 3.4. Pelaksanaan Percobaan 3.4.1. Sterilisasi Alat dan Ruang Kultur Sterilisasi alat dilakukan pada alat-alat tanam yang akan digunakan untuk penanaman agar terhindar dari hal-hal yang dapat menyebabkan kontaminasi. Sterilisasi alat diawali dengan mencuci alat-alat tersebut menggunakan deterjen kemudian dibilas menggunakan air mengalir, setelah dikeringkan disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada temperatur 121ºC dan tekanan 17.5 psi dalam waktu 1.5 jam. Laminar Air Flow (LAF) dapat disterilisasikan dengan cara penyinaran Ultra Violet selama 60 menit serta pada setiap bagian LAF dibersihkan menggunakan tissue yang telah dibasahi dengan alkohol 70%. Sterilisasi ruang kultur dilakukan dengan penyemprotan alkohol 70%. 3.4.2. Pembuatan Media Media yang digunakan adalah media dasar yang terdiri dari campuran pupuk Growmore dan penambahan senyawa organik kompleks yakni air kelapa dan ekstrak wortel. Pembuatan media dilakukan beberapa tahap, yaitu: 1.
Media pada percobaan ini dibuat per perlakuan. Setiap perlakuan terdiri dari 20 unit botol kultur dimana setiap botol kultur berisi media 5 mL, sehingga volume media dibuat sebanyak 100 mL untuk setiap perlakuan.
2.
Larutan stok ekstrak wortel (Lampiran 6) dan stok air kelapa (Lampiran 7) dibuat dan disiapkan.
3.
Pupuk daun Growmore ditimbang sebanyak 0.2 g dan gula sebanyak 3 g untuk masing-masing media perlakuan, kemudian pupuk daun Growmore dilarutkan dalam aquades menggunakan hot plate magnetic stirer.
35 4.
Setelah Growmore terlarut, dilakukan penambahan gula, ekstrak wortel dan air kelapa sesuai dengan masing-masing perlakuan, kemudian tambahkan aquades hingga mencapai volume 100 mL.
5.
Pengukuran
pH
media.
Pengaturan
pH
dilakukan
sampai
5.2
(Sarwono, 2002). Apabila larutan media kurang dari pH 5.2 maka ditambahkan larutan basa NaOH sedangkan larutan asam HCl ditambahkan apabila pH media lebih dari 5.2. 6.
Agar–agar ditambahkan sebanyak 0.8 g L-1 untuk masing-masing media perlakuan, kemudian menggunakan hot plate dan diaduk dengan magnetic stirer, media dimasak hingga larutan mendidih kemudian dituang ke dalam botol kultur yang telah disediakan masing-masing sebanyak 5 ml. Botol-botol kultur yang telah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan alumunium foil lalu diikat dengan karet gelang.
7.
Setiap botol kultur diberi label untuk menandai setiap jenis perlakuan yang berbeda. Botol-botol kultur yang sudah berisi media kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada tekanan 17.5 psi dan temperatur 121oC selama 15 menit.
3.4.3. Pemilihan Eksplan Eksplan yang digunakan adalah tunas mikro anggrek asal protocorm hasil selfing Cattleya ‘Blc. Mount Hood Mary’ berumur 10 bulan. Eksplan tersebut merupakan hasil kultur in vitro yang diperoleh dari Rumah Bunga Rizal. Eksplan yang digunakan harus terbebas dari kontaminasi dan terlihat dalam kondisi yang segar serta seragam.
36
Gambar 2. Eksplan Tunas Mikro Anggrek Cattleya ‘Blc. Mount Hood Mary’ Berumur 10 Bulan
3.4.4. Penanaman Proses
penanaman
eksplan
pada
media
kultur
dilakukan
di
Laminar Air Flow yang telah disterilkan. Proses penanaman dilakukan secara aseptik untuk mengurangi kontaminasi dan semua peralatan yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow sebelumnya disterilisasi dalam autoclave serta disemprot alkohol 70%. Alat-alat berupa scalpel dan pinset direndam pada alkohol 95% dan dibakar pada api spiritus. Eksplan yang akan ditanam, dikeluarkan secara perlahan dari botol menggunakan pinset, kemudian diletakkan di petridish, setelah itu eksplan diambil satu persatu dan ditanamkan ke media perlakuan dengan menggunakan pinset. Satu buah eksplan tunas mikro anggrek Cattleya ‘Blc. Mount Hood Mary’ ditanam pada satu botol kultur. Selama proses penanaman, botol kultur harus didekatkan pada api spiritus untuk mengurangi terjadinya kontaminasi. 3.4.5. Pemeliharaan Botol-botol kultur yang telah ditanami tunas mikro disusun di rak kaca berukuran 200 cm x 50 cm pada ruang penyimpanan. Rata-rata temperatur dan kelembaban yang digunakan selama masa inkubasi adalah 22ºC dan 70.04% (Lampiran 10), sedangkan penyinaran dengan menggunakan lampu TL 40 Watt
37 dengan jarak 50 cm dari dasar rak kultur dengan jumlah lampu 1 buah dan lama penyinaran 16 jam per hari. Pemeliharaan yang dilakukan antara lain membersihkan ruang kultur dan menyemprotkan alkohol pada botol-botol kultur yang disimpan untuk menghindari kontaminasi. 3.4.6. Pengamatan Pengamatan yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari dua yaitu pengamatan utama dan pengamatan penunjang. Pengamatan dilakukan selama 12 MSI (Minggu Setelah Inkubasi). Pengamatan penunjang yang datanya tidak diuji statistik, terdiri dari : 1) Persentase (%) eksplan yang terkontaminasi, diamati satu hari sejak penanaman hingga
akhir percobaan.
Kontaminasi
dicirikan oleh
munculnya koloni mikroorganisme (jamur dan bakteri) pada permukaan medium dan atau jaringan eksplan, perhitungannya adalah: % eksplan terkontaminasi
Keterangan :
=
∑ eksplan terkontaminasi ∑ total kultur
x 100%
Total kultur = jumlah seluruh botol yang dikulturkan Total eksplan = jumlah seluruh eksplan yang dikulturkan dalam botol kultur (dalam satu botol kultur terdapat satu eksplan)
2) Persentase eksplan berakar (%), dilakukan dengan menghitung eksplan yang tumbuh akar.
Pengamatan utama dilakukan terhadap data-data yang diuji secara statistik, terdiri dari: 1) Jumlah tunas yang tumbuh (buah), dilakukan dengan menghitung jumlah tunas baru yang terbentuk pada 4 MSI, 8 MSI, dan 12 MSI. Pengamatan
38 dilakukan tanpa melalui proses destruksi yaitu dengan mengamati pertumbuhan eksplan dari luar botol. 2) Jumlah daun yang tumbuh (helai), dilakukan dengan menghitung jumlah daun baru yang telah mekar atau terbuka dari tunas pada 4 MSI, 8 MSI, dan 12 MSI. Pengamatan dilakukan tanpa melalui proses destruksi yaitu dengan mengamati pertumbuhan eksplan dari luar botol. 3) Luas daun (cm2), pengukuran dilakukan pada 12 MSI masing-masing sebanyak 2 sampel dari setiap ulangan. Pengamatan dilakukan melalui proses destruksi. Perhitungannya dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : Luas daun monokotil = panjang x lebar x 0.905 (Widiastoety, dkk., 2009) 4) Jumlah akar (buah), penghitungan dilakukan pada 12 MSI masing-masing sebanyak 2 sampel dari setiap ulangan. Pengamatan dilakukan melalui proses destruksi. Perhitungannya dilakukan dengan menghitung jumlah akar yang terbentuk dari tunas asal protocorm. 5) Panjang akar (cm), penghitungan dilakukan pada 12 MSI masing-masing sebanyak 2 sampel dari setiap ulangan. Pengukuran panjang akar menggunakan benang dan kertas milimeter blok. Pengamatan dilakukan melalui proses destruksi. Pengukuran dilakukan dengan mengukur dari pangkal akar yang berbatasan dengan batang sampai ujung akar. 6) Pertambahan tinggi planlet (cm), pengukuran dilakukan pada 12 MSI masing-masing sebanyak 2 sampel dari setiap ulangan. Pengukuran tinggi planlet menggunakan benang dan kertas milimeter blok. Pengamatan
39 dilakukan melalui proses destruksi. Pengukuran tinggi planlet dilakukan dengan mengukur dari mulai pangkal batang sampai ujung daun tertinggi. 7) Bobot segar planlet (g), penimbangan dilakukan pada 12 MSI masing-masing sebanyak 2 sampel dari setiap ulangan. Penimbangan dilakukan
dengan
menggunakan
timbangan
analitik.
Pengamatan
dilakukan melalui proses destruksi. Bobot segar diperoleh dengan cara menimbang planlet yang telah dikeluarkan dari botol kultur dan telah dibersihkan terlebih dahulu dari agar-agar yang menempel.
