Bab II Tinjauan Pustaka
II.1
Teripang
II.1.1 Tinjauan Umum Tentang Teripang Teripang (Holothuroidea) merupakan salah satu hewan laut yang termasuk dalam phylum Echinodermata. Hewan tersebut merupakan golongan yang paling banyak dijumpai , mulai dari paparan terumbu karang, pantai berbatu atau berlumpur, di laut dalam, bahkan di palung laut yang terdalam sekalipun (Nontji,1993). Pada umumnya teripang pemakan deposit pasir yang penting di daerah coral reef (Sutaman,1993). Makanan utama teripang adalah organisme-organisme mikro, detritus (sisa-sisa pembusukan bahan organik), diatomae, protozoa, nematodae, algafilamen, kopepoda, ostrakoda, dan rumput laut (Martoyo, dkk, 1993). Bentuk tubuh teripang adalah silindris memanjang seperti mentimun. Tubuhnya terbagi dalam lima bagian yang sama, memanjang dari mulut sampai anus (Sherman, 1976 dalam Trijoko, 1990). Ditambahkan oleh Nontji (1993), bahwa tubuh teripang umumnya berbentuk bulat panjang atau silindris sekitar 10 – 30 cm, dengan mulut pada salah satu ujungnya dan dubur pada ujung yang lain. Pawson dalam Boolootian (1996) mengemukakan bahwa ukuran teripang adalah berkisar antara 30–50cm dan mempunyai daerah penyebaran yang luas pada berbagai habitat laut. Hidupnya sering berkelompok pada daerah yang berpasir ataupun daerah yang berlumpur. Ditambahkan oleh Barnes (1987), bahwa teripang dapat dijumpai mulai daerah pasang surut sampai laut dalam. Ciri umum teripang yaitu, tidak mempunyai lengan, tiga ambulakral dengan podia yang tumbuh baik terletak di bagian ventral dan dua daerah ambulakral di bagian sebelah dorsal yang podianya tereduksi. Mulut yang terletak di ujung depan biasanya dikelilingi oleh sejumlah tentakel sebagai alat bantu makan dan respirasi. Tubuh teripang biasanya hitam, coklat, hijau muda, sedikit yang berwarna merah muda, oranye, violet dan jarang yang bergaris-garis (Gosner, 1971 dan Barnes, 1987). Ditambahkan pula oleh Nontji (1993), bahwa warna teripang bermacam-
5
macam, ada yang hitam pekat, coklat, abu-abu atau mempunyai bercak pada bagian punggungnya, dan dijumpai pada satu sisi tertentu, yakni pada bagian tubuh yang biasanya berwarna lebih pucat. Setiap jenis teripang mempunyai ukuran tubuh yang berbeda-beda, misalnya Holothuria arta dapat mencapai panjang 60 cm dan berat 2 kg, jenis Actinopyga mauritiana mencapai panjang 30 cm dengan berat 2,8 kg, jenis Thelenota ananas mencapai panjang 100 cm dan berat 6 kg, sedangkan teripang hitam (Holothuria edulis) panjangnya antara 25 – 35 cm dengan berat antara 0,250 – 0,350 kg (Martoyo, dkk, 1994). Adapun kandungan gizi teripang kering ditampilkan pada Tabel II.1. Tabel II.1 Komposisi Kandungan Gizi Teripang Kering (Joko Martoyo, dkk., 1994) Komposisi
Persentase (%)
Air
8,90
Protein
82,00
Lemak
1,70
Abu
8,60
Karbohidrat
4,80
Kalsium
308,00 mg%
Fosfor
23,00 mg%
Zat besi
41,70 mg%
Natrium
770,00 mg%
Kalium
91,00 mg%
Vitamin A
455,00 mg%
Vitamin B
0,04 mg%
Tiamin
0,07 mg%
Riboflavin
0,40 mg%
Niasin
-
Total Kalori
385,00 cal/100 g
6
Ciri khas teripang adalah tubuhnya lunak, berdaging karena osicula yang tertanan dalam kulitnya sebagai rangka dalam yang tereduksi ukurannya menjadi mikroskopis (Lerman, 1986 dalam Trijoko, 1990). Bagian daging teripang inilah yang dijual dalam keadaan kering. Selanjutnya dikemukakan oleh Barnes (1987) bahwa sebagai makanan, teripang mempunyai cita rasa yang khas dan telah banyak dikomsumsi oleh bangsa Asia timur seperti yang terlihat pada Gambar II.1 tentang jenis-jenis teripang ekonomis.
Gambar II.1 Jenis-jenis Teripang Ekonomis
7
Sebagai bahan pangan, teripang khususnya Stichopus Japonicus mempunyai nilai gizi yang cukup tinggi dan rasanya lezat. Teripang kering mempunyai kadar protein tinggi, yaitu 82% dengan kandungan asam amino yang lengkap.Sementara itu teripang mempunyai asam lemak tidak jenuh jenis omega tiga (Ω3) yang penting untuk kesehatan jantung (Martoyo,dkk, 2006). Kandungan gizi teripang Stichopus Japonicus secara lengkap dicantumkan dalam Tabel II.1.
II.1.2 Sistematika dan Ciri Morfologi Teripang Hitam (Holothuria edulis) Menurut Clark dan Rowe (1971), sistematika teripang hitam Holothuria edulis sebagai berikut : Filum
: Echinodermata
Kelas
: Holothuroidea
Ordo
: Aspidochirotda
Famili
: Holothuroidae
Genus
: Holothuria
Species
: Holothuria edulis
Ciri morfologi teripang hitam Holothuria edulis adalah badan teripang hitam berbentuk bulat panjang dan akan segera mengerut jika diangkat dari permukaan air. Di seluruh permukaan badan teripang hitam terdapat bintil-bintil halus (Gambar II.2). Teripang hitam mudah dikenali karena warnanya indah. Bagian punggungnya berwarna hitam keungu-unguan atau kebiru-biruan. Sementara bagian perut, sisi sekitar mulut dan duburnya berwarna kemerah-merahan. Teripang hitam hidup di derah perairan berkarang atau berpasir yang ditumbuhi ilalang laut (Martoyo, dkk,2006).
8
Gambar II.2 Morfologi teripang hitam Holothuria edulis Teripang hitam (Holothuria edulis) merupakan jenis teripang yang banyak ditemukan dalam perairan yang dasarnya mengandung pasir halus, walaupun lebih menyukai perairan karang.Teripang jenis ini pertumbuhannya cepat dan lebih bertoleransi terhadap perubahan lingkungan, banyak diperdagangkan dan mempunyai harga yang tinggi.
9
II.2
Protein
II.2.1 Tinjauan Umum Protein Protein merupakan molekul makro yang mengandung nitrogen dengan massa molekul berkisar 5.000-1.000.000. Protein merupakan suatu unsur utama pembentuk sel, meliputi kira-kira 50% massa kering sel. Protein dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut protein hewani, sedangkan protein yang berasal dari tumbuhan di sebut protein nabati. Tumbuhan membentuk protein dari CO2, H2O, dan senyawa nitrogen. Hewan yang makan tumbuhan mengubah protein nabati menjadi hewani (Poeadjiadi, 1994). Dalam tubuh hewan, protein membentuk unsur struktur yang amat penting, merupakan komponen otot, kulit, rambut, jaringan ikat, dan sebagainya (Winarno, 1992). Semua protein, selain mengandung karbon, hidrogen, dan oksigen juga mengadung nitrogen dan sering mengadung belerang dan fosfor. Adanya nitrogen pada protein merupakan ciri yang penting karena nitrogen memberikan sifat-sifat istimewa kepada protein. Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat dalam protein adalah karbon 50%, oksigen 23%, nitrogen 16%, hydrogen 7%, belerang 0-3%, dan fosfor 0-3% (Poedjiadi,, 1994).
II.2.2 Struktur Protein Molekul protein sangat besar dan terdiri dari rantai panjang asam-asam amino yang berikatan secara kimiawi. Dua puluh enam asam amino dapat ditemukan dan dua puluh diantaranya sering terdapat dalam protein yang biasa didapatkan dalam makanan (Murdijati,dkk,1994). Asam amino adalah senyawa organik yang merupakan unit dasar struktur protein.Dalam asam terdapat gugus amina, -NH2 gugus karboksilat, -COOH, atom H dan gugus R tertentu yang semuanya terikat pada atom karbon α dengan rumus struktur dasar (Gambar II.3). Gugus R adalah alkil (rantai samping) sebagai pembeda antara asam amino satu dengan asam amino lainnya (Stryer, 1994).
10
Gam mbar II.3 Strruktur dasar asam aminoo (sumber htttp://www.mcat 45.ccom/images//Amino-Acid MCAT.pnng) S Satu molekuul protein mengandung m kkira-kira 500 asam aminno, tergabunng bersama d dengan ikataan peptida. Ikatan peptidda terbentukk jika gugus amino (-NH H2) dari satu a asam aminoo bereaksi deengan guguss asam (-CO OOH) dari aasam amino berikutnya d dengan mem mbebaskan satu s molekuul air, tipe reeaksi ini meerupakan su uatu contoh p polimerisasi i kondensasii. Dua asam m amino yanng berikatann bersama membentuk m d dipeptida seeperti yang diperlihatkan d n pada Gam mbar II.4. Raantai asam-assam amino y yang lebih panjang dissebut polipeeptida.Keadaaan alami m molekul prottein adalah k kompleks, k karena memuuat 20 asam amino dalam m sembarangg rangkaian.. Jika suatu p polipeptida disusun hannya dengann 10 macam m asam aminno saja, susu unan asam a aminonya ak kan sebanyaak 2010 atau lebih dari satu milyar. Urutan U atau pola asam a amino dalam m molekul protein dikeenal sebagaai struktur pprimer (Murrdijati dkk, 1994).
P n ikatan pepttida (sumberr http://inorggGaambar II.4 Pembentukan phys.chem.iitb.ac.id/web b/DIDAC) 11
Ikatan-ikatan silang dapat terbentuk antara gugus samping asam amino. Ikatan tersebut terbentuk antarrantai polipeptida yang berbeda atau gugus samping dalam polipeptida yang sama. Salah satu ikatan silang yang paling penting adalah jembatan disulfida. Ikatan silang menentukan struktur sekunder protein, yaitu bentuk dan konfigurasi tiga dimensi molekul protein.Struktur protein sangat bervariasi, tetapi dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok utama menurut bentuk molekulnya (Hawab, 2004): a. Protein globular Molekul-molekul protein globular adalah bulat tetapi tidak harus berbentuk bola. Rantai asam aminonya terlipat dan molekul dapat dipertahankan bentuknya oleh adanya ikatan-ikatan silang antar asam amino dalam rantai itu. Molekulmolekulnya tidak rapat atau tersusun dalam aturan tertentu. Molekul air mudah menerobos ke ruang-ruang kosong dalam molekul protein. Protein globular dapat terdispersi dengan mudah baik dalam air atau larutan garam. b. Protein serat Molekul-molekul protein bentuk serat ini lebih lurus. Ditemukan dalam keadaan hampir lurus sempurna (protein tidak elastik atau protein terentang) atau menggulung dalam bentuk spiral (protein elastik atau gulungan). Dalam protein bentuk serat biasanya terdapat susunan yang teratur dan molekul-molekulnya terkumpul rapat, terdapat ikatan silang antara rantai-rantai asam amino yang berdekatan sehingga molekul air sukar menerobos struktur tersebut oleh karena itu, protein bentuk serat biasanya tidak larut dalam air.
II.2.3 Sifat-sifat protein Sifat substansi protein ditentukan oleh strukturnya, karena banyaknya variasi struktur protein, sifatnyapun sangat bervariasi. Protein bentuk serat bersifat kurang larut dan tidak terpengaruh oleh asam, basa, dan panas yang tidak terlalu tinggi. Protein globular membentuk koloid dalam fasa cair dan terpengaruh oleh asam, alkali dan panas. Protein dapat mengalami suatu proses yang dikenal
12
sebagai denaturasi. Proses denaturasi dapat berlangsung secara reversibel maupun tidak. Penggumpalan protein biasanya didahului oleh proses denaturasi yang berlangsung dengan baik pada titik isoelektrik protein tersebut. Protein akan mengalami koagulasi jika dipanaskan pada suhu ≥500C. Koagulasi hanya terjadi jika pH larutan protein sama dengan titik isoelektrik. Protein yang terdenaturasi pada titik isoelektriknya masih dapat
larut
pada pH selain titik isoelektrik
tersebut (Poedjiadi, 1994).
II.2.4 Fungsi potein dalam tubuh Protein merupakan penyusun utama sel-sel tubuh, membran sel tersusun dari protein, protein juga didapatkan di dalam sel. Jumlah sel dalam tubuh meningkat selama periode pertumbuhan, oleh karena selama periode anak-anak dan remaja kebutuhan protein sangat tinggi. Protein penting untuk pembentukan enzim, antibodi, dan beberapa hormon. Substansi-substansi ini diproduksi dalam sel dan sebahagian protein dilepaskan ke aliran darah dalam
bentuk(antibodi dan
hormon) atau ke dalam usus dalam bentuk (enzim pencernaan). Tidak semua protein yang diperoleh dari makanan dapat digunakan untuk pertumbuhan dan pemeliharaan. Selain itu, makanan dapat menyediakan protein melebihi kebutuhan untuk pertumbuhan dan pemeliharaan. Kelebihan protein ini digunakan untuk energi. Asam amino yang tidak diperlukan untuk sintesis protein akan mengalami deaminasi di dalam hati, yaitu bagian dari molekul asam amino yang mengandung nitrogen dipisahkan untuk membentuk urea. Urea merupakan bahan sisa yang tidak berguna bagi tubuh, diangkut oleh darah ke ginjal dan diekskresikan ke dalam urin. Molekul yang telah mengalami deaminasi yang mengandung karbon, hidrogen dan oksigen memasuki suatu rantai reaksi yang melibatkan oksidasi glukosa dalam sel untuk menyediakan energi.
13
II.3 Asam Amino Hidrolisis sempurna protein murni menghasilkan suatu campuran asam-asam amino penyusunnya. Sebagian besar asam amino dalam organisme hidup adalah asam α-amino, yaitu gugus amino yang terdapat pada atom karbon yang selanjutnya menjadi gugus fungsional. Karena kerangka kovalen protein adalah tetap (Gambar II.2) dan menyangkut gugus fungsi karboksilat dan amino, maka gugus R-lah yang memberi suatu sifat fisik dan kimia pada rantai protein. Asam amino dibagi menjadi empat kelompok berdasarkan polaritas gugus R asam amino (Lehninger, 1997: Wirahadikusumah, 2001): 1.
Asam amino dengan rantai samping nonpolar (hidrofobik) yang terdiri dari alanin, valin, leusin, isoleusin, prolin, fenilalanin triptopan dan metionin, (Gambar II.5).
2.
Asam amino dengan rantai samping polar tak bermuatan yaitu glisin, serin, treonin, sistein, tirosin, asparagin dan glutamin, (Gambar II.6).
3.
Asam amino dengan rantai samping bermuatan negatif (asam amino asam) yaitu asam aspartat dan asam glutamat, (Gambar II.7).
4.
Gugus amino dengan rantai samping bermuatan positip (asam amino basa) yaitu lisin, arginin dan histidin, (Gambar II.8).
14
Nama Asam Amino
Rumus Bangun CH3
CH
Alanin
COOH
NH2
CH3 CH
Valin
COOH
CH
CH3
NH2
CH3
Leusin
CH
CH2
CH
CH3 CH3
COOH
NH2
CH2
CH
CH
COOH
Isoleusin
NH2
CH3 HO
Prolin N H
O O
Fenilalanin
OH
NH2
O
Triptopan
OH
NH2 N H
Gambar II.5 Asam amino dengan gugus R non polar
15
Nama Asam Amino
Rumus Bangun H
Glisin
H
COOH
C NH2
Serin
H2 C
HO
CH
COOH
NH2
Treonin
CH3
Sistein
HS
H C
H C
OH
NH2
CH2
H C
COOH
COOH
NH2
H2N
Tirosin
HO
O
OH
O NH2 HO
Asparagin
NH2
O
NH2
Glutamin
H2N
OH
O
Gambar II.6 Asam amino dengan gugus R polar
16
O
Nama Asam Amino
Rumus Bangun
O Asam Aspartat
C
H C
CH2
O
COOH
NH2
H
O
Asam Glutamat
CH2 O
Gambar II.7
C
CH
H
COOH
NH2
Asam amino dengan gugus R polar bermuatan negatif
Nama Asam Amino
Rumus Bangun
Lisin
H2C
CH2
CH2
H C
CH2
COOH
NH2
NH2
NH2
Arginin
H N
H2N
OH
O
NH
O N OH
Histidin NH2
HN
Gambar II.8 Asam amino dengan gugus R polar bermuatan positip
17
Asam amino tidak hanya berperan sebagai bahan pembangun protein, tetapi juga merupakan precursor bagi banyak senyawa yang mengandung nitrogen penting. Misalnya, glisin diperlukan untuk biosintesis gugus heme pada hemoglobin (Petrucci-Suminar,1987).
II.3.1 Asam Amino Esensial Dan Non Esensial Dari dua puluh asam amino yang umum didapatkan sebagai penyusun protein, sembilan di antaranya adalah esensial dalam susunan makanan. Asam-asam amino esensial ini diperoleh dari protein dalam makanan, karena tidak dapat disintesis dalam tubuh. Asam amino nonesensial dapat disintesis dalam tubuh dengan mengkonversikan satu asam amino menjadi asam amino lain dalam sel-sel tubuh. Sebagai contoh, metionin dan sistein adalah asam amino yang mengandung belerang dan sebagian dari kebutuhan akan metionin dapat dipenuhi dari sistein atau sistin. Daftar asam amino esensial dan nonesensial dicantumkan dalam Tabel II.2.
18
Tabel II.2 Asam amino esensial dan non esensial (Almatsier, 2001) asam amino esensial Nama
Asam amino non esensial
Singkatan
nama
Singkatan
Isoleusin
Ile
Alanin
Ala
Leusin
Leu
Arginin
Arg
Lisin
Lys
Asparagin
Asn
Asam Metionin
Met
aspartat
Asp
Asam
*
Fenilalanin
Phe
glutamat
Glu
Treonin
Thr
Glisin
Gly
Triptopan
Trp
Glutamin
Gln
Valin
Val
Serin
Ser
Histidin*
His
Tirosin
Tyr
Sistein **
Cys
Prolin***
Pro
Esensial untuk anak-anak
** Dapat berada dalam bentuk sistin *** Dapat berada dalam bentuk hidroksiprolin Jika protein pangan dikonsumsi, selama pencernaan akan terjadi reaksi untuk menghasilkan asam amino. Setelah diabsorbsi, asam amino diangkut oleh darah menuju ke sel. Di dalam sel, asam amino mengalami penyusunan ulang membentuk protein baru. Distribusi berbagai asam amino esensial dalam makanan yang kita makan tidak harus sama dengan yang diperlukan untuk sintesis protein di dalam sel. Protein yang mempunyai distribusi asam amino esensial serupa dengan protein dalam tubuh manusia, akan lebih bermanfaat, atau berkualitas lebih baik dari pada protein lain yang tidak dapat menyediakan asam amino esensial dalam jumlah yang memadai (Poedjiadi, 1994).
19
II.3.2 Reaksi metabolisme asam amino Tahap awal reaksi metabolisme asam amino melibatkan pelepasan gugus amino, kemudian terjadi perubahan kerangka karbon pada molekul asam amino. Dua proses utama pelepasan gugus amino, yaitu : a.
Transaminasi
Transaminasi
merupakan proses katabolisme asam amino yang
melibatkan pemindahan gugus amino dari satu asam amino asam amino yang lain, terjadi dalam mitokondria maupun cairan sitoplasma. Dalam reaksi transaminasi, gugus amino dari suatu asam amino dipindahkan pada salah satu dari tiga senyawa keto, yaitu asam piruvat, α-ketoglutarat, atau oksaloasetat sehingga senyawa keto ini diubah menjadi asam keto. Ada dua enzim yang bekerja dalam reaksi transaminasi, yaitu alanin transaminase dan glutamat transminase
yang bekerja sebagai katalis
dalam reaksi, yaitu: alanin transaminase Asam amino + asam piruvat
asam α-keto + alanin
(II.1)
Glutamat transminase As.amino + asam α-ketogltarat
b.
Asam α-keto+asam glutamat (II.2)
Deaminasi oksidatif
Asam glutamat yang dihasilkan dari proses transaminasi, dalam beberapa sel misalnya dalam bakteri, dapat mengalami proses deaminasi oksidatif yang menggunakan glutamat dehidrogenase sebagai katalis. Glutamat transaminase Asam glutamat + NAD+
asam α-ketoglutarat +NH4 + NADH + H+ (II.3)
Reaksi di atas menunjukkan bahwa asam glutamat melepaskan gugus amino dalam bentuk NH4+. Karena asam glutamat merupakan hasil akhir
20
dari proses transaminasi, maka glutamat dehidrogenase merupakan enzim yang penting dalam metabolisme asam amino (Arbianto dkk, 1993).
II.3.3 Sifat asam – basa asam amino Ciri yang paling mencolok dari asam amino ialah sifat amfoternya, yaitu dapat bersifat sebagai asam maupun basa. Asam amino sebenarnya terdapat sebagai ion zwitter dengan struktur seperti yang diperlihatkan pada Gambar II.9 (Lehninger, 1997;Stanley, dkk, 1988) O-
H R
NH3+
O
Gambar II.9 Struktur ion zwitter asam amino Di dalam larutan asam, suatu asam amino akan bertindak sebagai suatu basa dan dalam larutan basa akan bertindak sebagai suatu asam. Ion dipolar/ion zwitter berperan sebagai asam karena merupakan donor proton (Lehninger,1997).
H
H
O
R
O
H+
R O-
NH3+
ONH2
(II.4)
Atau sebagai basa karena merupakan akseptor proton H
H
O
+
R
H+
NH3+
+
21
(II.5)
R
ONH3
O
OH
Asam amino esensial penyusun protein (20 asam amino) kecuali glisin, atom karbon-α merupakan atom karbon kiral/asimetrik karena atom karbon mengikat empat gugus yang berbeda. Atom karbon kiral/asimetrik bersifat optik aktif, yakni dapat memutar bidang polarisasi cahaya. Susunan tetrahedral ikatan valensi di sekitar atom karbon-α pada asam amino dapat menempati dua susunan yang berbeda dalam ruang, yang merupakan bayangan cermin yang tidak saling berhimpit. Kedua bentuk ini dinamakan isomer optik, enansiomer, atau stereoisomer. Larutan salah satu stereoisomer asam amino tertentu akan memutar bidang polarisasi cahaya ke kiri (berlawanan dengan arah jarum jam) yang disebut levorotatory (L) ditunjukkan dengan (-), stereoisomer yang lain akan memutar bidang polarisasi cahaya ke kanan (searah jarum jam) yang disebut dekstrorotatory (D) ditunjukkan dengan (+). Campuran molar yang sama antara bentuk (-) dan bentuk (+) disebut rasemat yang tidak dapat memutar bidang cahaya karena saling meniadakan sifat aktif optik yang dimilikinya. Contoh struktur L dan D suatu asam amino ditunjukkan pada Gambar II.10. H
HO
O
R
NH2
H
HO
NH2
O
R
(b)
(a)
Gambar II.10 Struktur D-alanin (a) dan L-alanin (b)(Lehninger,1997)
II.3.4 Reaksi Gugus Amino Reaksi amino bertumpu pada kemampuan gugus amino untuk bertindak sebagai suatu nukleofil dalam hal ini pasangan elektron bebas dari nitrogen amina dapat membentuk ikatan dengan suatu atom pusat berkekurangan elektron. Asam amino juga amina lain dapat dioksidasi
22
dengan menggunakan oksidan lemah seperti ninhidrin menghasilkan suatu senyawa berwarna ungu, seperti yang diperlihatkan pada Gambar II.11. Jadi, reaksi asam amino apapun dengan dua ekivalen ninhidrin akan memberikan
suatu
senyawa
berwarna
biru-ungu
yang
kuat
(Sastrohamidjojo, 2005). O OH
+
R
H C
COOH
OH NH2 O
Ninhidrin O-
O O N
+
R
C
+
CO2
+
H 2O
H OH
O
Biru-ungu
Gambar II.11 Reaksi ninhidrin dengan asam amino Selain itu, dapat juga digunakan pereaksi OPA (o-phthaldialdehid) yang mengandung 2-merkaptoetanol menghasilkan senyawa yang dapat berfluoresensi .Dengan demikian, dapat dideteksi hasil reaksi tersebut pada daerah UV, (Adijuwana, H., dkk, 1992) seperti yang diperlihatkan pada Gambar II.12 di bawah ini:
OPA asam amino Gambar II.12 Reaksi (o-phthaldialdehid) dengan asam amino
II.4 Analisis Asam Amino
23
Analisis asam amino dapat dilakukan antara lain, dengan metode elektroforesis dan kromatografi. Untuk menghidrolisis asam amino biasanya menggunakan HCl 6 N pada suhu 110 0C selama 12 sampai 48 jam sampai hidrolisis diperkirakan sempurna (Sudarmaji dkk, 1989). Analisis kuantitatif yang pertama telah dilakukan dengan menggunakan kromatografi penukar ion, asam amino dalam eluen direaksikan secara kontinu dengan ninhidrin. Meskipun teknik ini memiliki beberapa kekurangan yang berupa waktu analisis yang lama dan sensitivitas medium pendeteksi yang tidak terlalu tinggi tetapi masih dipergunakan sebagai metode standar analisis. Sejumlah metode telah dikembangkan, salah satu diantaranya dengan metode HPLC yang didasarkan pada reaksi gugus asam amino dengan suatu pereaksi yang akan membentuk suatu pendaran (fluoresensi) atau senyawa turunannya yang mengabsorpsi UV. Salah satu pereaksi yang banyak digunakan adalah o-ptaldialdehid (OPA). Pereaksi ini bereaksi dengan asam amino primer pada suasana basa dengan adanya merkaptoetanol untuk membentuk tioisoindol yang berflourosensi secara kuat. Turunan tersebut segera terbentuk dan memperlihatkan selektivitas yang baik sekali selama pemisahan. Analisis asam amino dengan pereaksi OPA sangat sensitif (mampu mendeteksi sampai 3 pmol untuk asam amino primer dan sekitar 10 pmol untuk asam amino sekunder) dengan waktu analisis sekitar 1 jam. (Adijuwana, H., dkk (1992).
II.4.1 Kromatografi Kromatografi merupakan metode pemisahan komponen-komponen dalam suatu sampel berdasarkan perbedaan antaraksi analit dengan fasa diam dan fasa gerak yang saling kontak, tetapi tidak saling campur. Metode kromatografi dapat diklasifikasikan berdasarkan : ( 1) Jenis fasa gerak yang
digunakan;
(2)
mekanisme
pemisahan;
dan
(3)
teknik
pelaksanaannya. Berdasarkan teknik pelaksanaannya, kromatografi dapat
24
diklasifikasikan lagi menjadi: (1) kromatografi kolom, meliputi kromatografi kolom konvensional, kromatografi gas, serta kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT); dan (2) kromatografi planar, yang meliputi kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (Christian, 1994).
II.4.2 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Faktor utama yang menjadi gaya dorong pada pemisahan molekulmolekul dengan KLT adalah gaya-gaya antarmolekul. Gaya-gaya tersebut dapat berupa gaya van der waals dan gaya London, yang terdapat di antara permukaan adsorben dan molekul yang diadsorbsi serta gaya elektrostatis yang dihasilkan oleh kepolaran molekul (Karjono, 1996). Sistem adsorpsi yang paling umum digunakan terdiri dari adsorben silika gel atau alumina di bawah pengaruh suatu sistim pelarut organik. Sifatsafat tertentu suatu adsorben dapat memberikan pengaruh terhadap pemisahan senyawa-senyawa. Sebagai contoh, alumina dan silika yang mempunyai sifat-sifat sangat berbeda, akan memberikan hasil pemisahan yang berbeda pula. Pengaktifan adsorben juga mempengaruhi retensi analit. Adanya air pada permukaan adsorben akan menurunkan keaktifan adsorben karena molekul-molekul air menghalangi pusat-pusat aktif adsorben. Jika kandungan air cukup besar, akan terbentuk sistem partisi yang menghasilkan retensi yang berbeda karena mekanisme pemisahan yang terjadi berbeda. Selain fasa diam, fasa gerak memainkan peranan yang penting pula pada pemisahan analit dengan KLT. Terkadang dibutuhkan
campuran
fasa
gerak
berupa
multikomponen
untuk
menghasilkan pemisahan yang baik. Sejumlah sistem pelarut telah dikembangkan untuk berbagai macam keperluan. Biasanya dibutuhkan lebih dari satu sistem pelarut sebelum pemisahan semua komponen dapat tercapai.( Treiber, 1987).
II.4.3 Kromatografi Cairan kinerja Tinggi (HPLC)
25
HPLC adalah suatu bentuk kromatografi cair dengan pemisahan yang didasarkan pada perbedaan sifat migrasi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak. Fasa gerak berupa cairan, sedangkan fasa diam dapat berupa padatan atau cairan. Pada prakteknya, campuran zat terlarut yang akan dipisahkan dimasukkan melalui injektor, kemudian dibawa oleh fasa gerak yang mengalir melalui kolom. Selama di dalam kolom komponen-komponen yang dipisahkan mengalami antaraksi kromatografi dan akan keluar dari kolom dalam waktu yang berbeda. Komponenkomponen yang keluar dari kolom selanjutnya dideteksi oleh detektor dan digambarkan oleh rekorder berupa puncak-puncak, seperti yang diperlihatkan pada Gambar II.13 di bawah ini (Sofyatin, 1992).
Gambar II.13 Blok diagram peralatan pokok HPLC ( http://www.boomer.org/c/p3/c03/hplc101.sit) Pada proses pemisahan dengan HPLC, mengalirnya fasa gerak ke dalam kolom dibantu dengan pompa yang bertekanan tinggi. Dengan adanya tekanan yang tinggi, cairan fasa gerak akan mengalir dengan kecepatan yang tinggi sehingga komponen-komponen cuplikan akan terelusi dengan cepat., resolusi tinggi dan kepekaan tinggi. Metode HPLC terutama cocok untuk pemisahan komponen-komponen yang mempunyai sifat sangat polar, BM tinggi dan mudah terurai karena panas (Sofyatin,T., 1992).
26
