6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tanaman Temu Putih (Curcuma zedoaria) Tanaman temu putih (Curcuma zedoaria (Berg) Roscoe) di berbagai negara dikenal dengan nama white tumeric (Inggris), kencur atau ambhalad (India) dan cedoaria (Spanyol). Klasifikasi tanaman temu putih adalah sebagai berikut : 1. Divisio
: Spermathopyta
2. Subdivisio : Angiospermae 3. Kelas
: Monocotyledonae
4. Bangsa
: Zingiberales
5. Suku
: Zingiberaceae
6. Marga
: Curcuma
7. Jenis
: (Curcuma zedoaria (Berg) Roscoe) (Sumarny,2008).
Tanaman temu putih tumbuh liar pada tempat-tempat terbuka yang tanahnya lembab pada ketinggian 0-1.000 m di atas permukaan laut. Sosok tanaman ini mirip dengan temulawak dan dapat dibedakan dari rimpangnya. Tanaman ini tingginya dapat mencapai 2 m. Batangnya merupakan batang semu yang dibentuk dari pelepah-pelepah daun yang tumbuh dari rimpangnya, berbentuk silindris dan lunak. Salah satu ciri khas dari spesies ini adalah adanya warna ungu di sepanjang ibu tulang daun. Helaian daun berwarna hijau muda sampai hijau tua dengan punggung daun berwarna pudar dan berkilat (Dalimartha, 2003). Bentuk daunnya bundar, lonjong ke ujung, pertulangan daun menyirip, warnanya hijau dengan panjang 25-70 cm dan lebar 8-15 cm. Mahkota bunga
6
7
berwarna putih, dengan tepi bergaris merah tipis atau kuning. Rimpang berwarna putih atau kuning muda dengan rasa sangat pahit. Dari rimpangnya keluar akarakar yang kaku dan pada ujungnya terdapat kantong air (Dalimartha, 2003). Gambar karakteristik rimpang temu putih dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1. Karakteristik rimpang temu putih Temu putih banyak ditemukan di Indonesia seperti Jawa Barat, Jawa Tengah, Sumatera, Ambon, dan Irian. Selain itu, temu putih dibudidayakan di India, Banglades, Cina, Madagaskar, Filipina, dan Malaysia (Pdpersi, 2006). 2.2 Khasiat dan Kegunaan Rimpang temu putih rasanya sangat pahit, pedas, sifatnya menghangatkan, dan berbau aromatik. Berbagai manfaat dapat ditemukan dari seluruh bagian tanaman temu putih, mulai dari daun, bunga, rimpang muda, dan rimpang tua. Namun, rimpang merupakan bagian tanaman yang paling banyak dimanfaatkan. Rimpang muda banyak digunakan untuk bumbu masak, sedangkan rimpang tua digunakan sebagai bahan baku industri obat dan kosmetika terutama parfum (Jaya, 2005). Di masyarakat, temu putih banyak digunakan sebagai obat kudis, radang kulit, pencuci darah, perut kembung, dan gangguan lain pada saluran
8
pencernaan. Air perahan rimpang temu putih juga digunakan untuk membuang angin dalam perut, merangsang pengeluaran air empedu, dan juga untuk mengobati usus berdarah (Wikipedia, 2006). Kurkumin yang terkandung dalam rimpang temu putih terbukti memiliki efek antiradang. Aktivitas antiradang kurkumin pertama kali dilaporkan oleh Grieve pada tahun 1971, kurkumin sangat aktif dalam menghambat peradangan baik secara akut maupun kronis pada model hewan percobaan. Pada percobaan akut, kurkumin memiliki potensi yang hampir sama dengan fenilbutason dan kortison. Sedangkan pada percobaan kronis kurkumin hanya menunjukkan setengah potensi fenilbutason (Wikipedia, 2006 dan Sumarny, 2008). Selain sebagai antiradang,
kurkumin
juga
diindikasikan
sebagai
antioksidan. Keaktifan antioksidan kurkumin pertama kali dilaporkan oleh Sharma (1972) melalui uji in vitro maupun in vivo, membuktikan kemampuan kurkumin dalam menghambat lipid peroksidase (LPO) tanpa dan dengan karagenin (Kunchandy and Rao, 1990). 2.3 Minyak Atsiri Minyak atsiri disebut juga minyak esteris, minyak esensial, atau minyak aromatik. Minyak atsiri merupakan kelompok besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu kamar, namun mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri mudah menguap pada suhu kamar tanpa mengalami dekomposisi, berbau wangi sesuai dengan bau tanaman penghasilnya, umumnya larut dalam pelarut organik dan tidak larut dalam air (Galih, 2007). Dalam bidang industri
minyak atsiri digunakan dalam pembuatan
kosmetik, parfum, antiseptik, obat-obatan, flavouring agent dalam makanan atau
9
minuman, serta sebagai pencampur rokok kretek. Beberapa jenis minyak atsiri digunakan sebagai bahan antiseptik internal dan eksternal, bahan analgesik, hemolitik atau sebagai antizimatik, serta sebagai sedativa dan stimulans untuk obat sakit perut (Galih, 2007). Minyak atsiri merupakan suatu produk yang memiliki bau khas sebagai perkembangan proses hidup tanaman. Minyak atsiri dihasilkan oleh sel tanaman atau jaringan tertentu dari tanaman secara terus menerus sehingga dapat memberi ciri tersendiri yang berbeda-beda antara tanaman satu dengan tanaman lainnya. Para ahli biologi menganggap, minyak atsiri merupakan metabolit sekunder yang biasanya berperan sebagai alat pertahanan diri agar tidak dimakan oleh hewan (hama) ataupun sebagai agen untuk bersaing dengan tumbuhan lain dalam mempertahankan ruang hidup (Wikipedia, 2007) Sifat minyak atsiri ditentukan oleh persenyawaan kimia yang terdapat di dalamnya, terutama persenyawaan tak jenuh (terpena), ester, asam, aldehida, serta beberapa jenis persenyawaan lainnya. Beberapa proses yang mengakibatkan perubahan sifat kimia minyak atsiri adalah oksidasi, hidrolisis polimerisasi, dan penyabunan. Minyak atsiri yang baru diekstraksi biasanya tidak berwarna atau berwarna kekuningan. Jika minyak atsiri lama di udara terbuka dan terkena cahaya pada suhu kamar, maka minyak atsiri tersebut dapat mengabsorpsi oksigen di udara sehingga menghasilkan warna minyak yang lebih gelap, bau minyak berubah dari bau wangi alamiahnya dan minyak lebih kental dan akhirnya membentuk sejenis resin. Minyak atsiri dapat menguap pada suhu kamar dan penguapannnya semakin banyak seiring dengan kenaikan suhu (Galih, 2007).
10
Hidrokarbon penyusun utama minyak atsiri adalah persenyawaan terpen. Terpen merupakan senyawa hidrokarbon tidak jenuh dan unit terkecil yang terdapat dalam molekulnya disebut isopren (C5H8) seperti pada Gambar 2.2.
ekor kepala
isopren
satuan struktur isopren
Gambar 2.2 Kerangka dasar satu unit isopren Satuan isopren umumnya tersusun dalam satuan urutan dari kepala ke ekor, yaitu dari ujung bercabang dari satuan isopren yang dihubungkan dengan ujung yang tidak bercabang dari satuan isopren yang lain (Robinson, 1995 dan Soetarno, 1990). Terpen minyak atsiri dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu monoterpen dan seskuiterpen. a. Monoterpen Monoterpen terbentuk dari dua satuan isopren yang membentuk 10 atom karbon. Monoterpena merupakan komponen utama dari minyak atsiri yang berperan dalam menimbulkan bau dan rasa. Monoterpena berupa cairan yang tidak berwarna, tidak larut dalam air, dapat disuling uap, dan berbau harum. Monoterpena mempunyai titik didih berkisar antara 140 - 180°C. Berdasarkan kerangka karbonnya monoterpen dapat dibagi menjadi tiga golongan, yaitu asiklik, monosiklik, dan bisiklik. Asiklik misalnya mirsen, monosiklik misalnya limonen, dan bisiklik misalnya pinen, dengan struktur seperti Gambar 2.3 (Robinson, 1995).
11
Mirsen
Limonen
alf a pinen
Gambar 2.3. Struktur contoh senyawa golongan monoterpen b. Seskuiterpen Seskuiterpen berasal dari tiga satuan isopren dengan 15 atom karbon. Seskuiterpen terdapat sebagai minyak atsiri yang tersuling uap dan berperan penting dalam memberi aroma pada buah dan bunga. Seskuiterpen memiliki titik didih di atas 200 0C. Seskuiterpen dipilah berdasarkan kerangka karbon dasarnya, yang umum adalah asiklik, monosiklik, dan bisiklik. Beberapa contoh golongan seskuiterpen adalah farnesol (asiklik), bisabolen (monosiklik), dan karatol (bisiklik) (Robinson, 1995). Struktur seskuiterpen disajikan pada Gambar 2.4.
CH2 OH
Farnesol
Bisabolena
Karatol
Gambar 2.4. Struktur contoh senyawa golongan seskuiterpen
2.4 Kandungan Kimia Minyak Atsiri Rimpang Temu Putih Rimpang temu putih mengandung 1-2,5% minyak menguap dengan komposisi utama seskuiterpen. Minyak menguap tersebut mengandung lebih dari 20 komponen seperti kurzerenon (zedoarin) yang merupakan komponen terbesar, kurzerena, pirokurkuzerenon, kurkumin, kurkumenon, epikurkumenol, kurkumol
12
(kurkumenol), isokurkumenol, prokurkumenol, dehidrokurdon, furanodienon, isofuranodienon, furanodiena, zederon, dan kurdion. Minyak atsiri yang terdapat pada temu putih asli India juga mengandung 1,8-sineol (15,9%) dan germakron (9,0%) (Pdpersi, 2006 dan Purkayastha et al, 2006). Pada penelitian yang telah dilakukan oleh Setiani, 2010 diperoleh senyawa yang terkandung dalam rimpang temu putih antara lain : kamfen; beta pinen; 1,3,3-trimetil-sineol; kamfor; 1-etenil1-metil-2,4-bis(1-metietenil) sikloheksana; kurzeren; germakron; dan velleral. Minyak atsiri temu putih berupa cairan kental kuning emas mengandung monoterpen dan seskuiterpen. Monoterpen Curcuma zedoaria terdiri dari monoterpen hidrokarbon (alfa pinen, d-kamfen), monoterpen alkohol (d-borneol), monoterpen keton (d-kamfer), monoterpen oksida (sineol). Seskuiterpen dalam Curcuma zedoaria terdiri dari berbagai golongan dan berdasarkan penggolongan yang dilakukan terdiri dari golongan bisabolen, germakron, eudesman, guaian, dan golongan spironolakton. Kandungan lain meliputi etil-p-metoksisinamat, 3,7dimetillindan-5-asam karboksilat (Windono et al, 2002). Adapun beberapa contoh struktur senyawa yang terkandung dalam rimpang temu putih dipaparkan pada tabel 2.1. Tabel 2.1 Contoh struktur senyawa kimia yang terkandung dalam rimpang temu putih Nama senyawa Struktur senyawa Rumus Berat molekul molekul
Kurzerenon
C15H20O2
232
13
C15H22O2 Kurkumol
234
C15H20O Kurzerena
216
C15H22O2 Isokurkumenol
234
Furanodiena
C15H20O
216
C10H16
136
CH2
Kamfen Me
Me
d-kamf en
14
Nama senyawa
Struktur senyawa
Rumus molekul
Berat molekul
C10H18O
154
C10H16O
152
C15H22O
218
C15H20O2
232
C10H18O
154
CH3
1,3,3-trimetilsineol
O CH 3 CH3
CH3 O
Kamfor
Me
d-kamf er Me CMe
Germakron O Me
O CH3
HC
Velleral
CH3 HC O CH 3 CH3 OH
Borneol Me
Me
d-borneol
2.5 Teknik Isolasi Minyak Atsiri Temu Putih dengan Destilasi Uap Metode yang banyak digunakan untuk memisahkan dan memurnikan senyawa-senyawa organik dalam bentuk cair adalah dengan cara destilasi. Terdapat tiga teknik destilasi, yang sering digunakan adalah destilasi sederhana, destilasi uap, dan destilasi fraksi. Untuk mengisolasi minyak, biasanya digunakan teknik destilasi uap. Destilasi uap didasarkan pada volatilitas dari beberapa senyawa organik terhadap uap yang terjadi pada temperatur kurang dari 1000C
15
(Sastrohamidjojo, 2004). Destilasi juga bisa dikatakan sebagai suatu metode pemisahan bahan kimia berdasarkan perbedaan kecepatan atau kemudahan menguap. Komponen yang memiliki titik didih lebih rendah akan menguap terlebih dahulu (Wikipedia, 2008). Prinsip destilasi uap adalah melibatkan kodestilasi campuran air dan senyawa organik yang mudah menguap dan tidak bercampur dengan air. Salah satu keuntungan isolasi minyak atsiri dengan menggunakan destilasi uap diantaranya penetrasi uap ke dalam sel-sel tanaman cukup baik dan membagi uap lebih merata ke seluruh bagian ketel. Selama proses destilasi berlangsung, uap air masuk menembus jaringan material dan melarutkan sebagian minyak yang ada di dalam sel. Uap air menembus dengan cara osmosis yang mengakibatkan pembengkakan membran dan akhirnya minyak sampai pada permukaan. Kemudian minyak langsung diuapkan bersama-sama dengan uap air. Proses ini berlangsung terus menerus sampai semua minyak yang ada di dalam sel keluar. (Sudjadi, 1992). 2.6 Uji Aktivitas Antikanker Metode awal yang digunakan untuk menguji antikanker antara lain adalah uji toksisitas dengan menggunakan larva Artemia salina Leach, sedangkan uji lanjutannya adalah uji in vitro dan in vivo. 2.6.1 Uji toksisitas terhadap larva Artemia salina L Uji toksisitas dengan menggunakan larva Artemia salina Leach merupakan suatu metode skrining awal untuk menentukan sifat sitotoksik suatu ekstrak ataupun senyawa. Penggunaan larva Artemia salina Leach sebagai bioindikator pertama kali dilakukan pada tahun 1956, kemudian penggunaannya
16
meluas untuk toksin-toksin alami dan sebagai skrining umum untuk substansi bioaktif yang terdapat pada eksrak tanaman (Meyer dkk, 1982 dan Steven 1993). Metode pengujian dengan larva Artemia salina Leach merupakan cara yang paling efektif dan sederhana karena ketersediaan telur-telur udang yang mudah menetas, pertumbuhannya cepat dan relatif mudah pengaturan populasinya pada kondisi laboratorium. Pengembangan metode ini didasarkan pada sifat khas dari larva udang yang dapat menerima segala jenis zat dan bahan tanpa seleksi terlebih dahulu, pengerjaannya mudah, cepat serta menggunakan sampel yang relatif sedikit. Selain digunakan sebagai pendeteksi komponen yang dapat membunuh kanker maupun hama, metode ini dapat juga digunakan sebagai metode penapisan awal untuk menemukan komponen antikanker pada tumbuhan tingkat tinggi (Mclaughlin, 1991 dan Meyer, 1982). Uji ini menggunakan larva Artemia salina Leach yang telah berumur 48 jam yang diuji pada konsentrasi ekstrak 10 ppm, 100 ppm, dan 1000 ppm selama 24 jam. Dalam setiap vial (tempat uji), percobaan ini diulang sebanyak 3 kali. Data mortalitas larva selanjutnya dianalisis untuk memperoleh nilai LC50 (konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% larva). Apabila LC50 kurang dari 1000 ppm, dikatakan mempunyai potensi sebagai antikanker (Steven, 1993 dan Meyer, 1982). 2.6.2 Uji in vitro terhadap sel mieloma mencit dan sel HeLa Uji yang dilakukan selanjutnya adalah uji in vitro menggunakan sel mieloma mencit dan sel HeLa. Sel mieloma merupakan sel kanker limfosit B yang berasal dari tikus atau kanker dari plasma sel. Plasma sel banyak terdapat pada sumsum tulang belakang dan merupakan bagian dari sistem imun yang
17
bertanggung jawab dalam produksi antibodi yang berupa imunoglobulin. Mieloma akan menghasilkan imunoglobin abnormal yang disebut protein monoklonal. Sel mieloma juga akan menyerang dan menghancurkan lapisan luar dari tulang sehingga menyebabkan osteolisis (Wikipedia, 2010). Gambar sel mieloma dapat dilihat pada Gambar 2.5.
Gambar 2.5. Sel mieloma mencit Kultur sel HeLa atau HeLa cell line merupakan continuous cell line yang diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim (cervix) seorang wanita penderita kanker leher rahim bernama Henrietta Lacks yang meninggal akibat kanker pada tahun 1951 (Alexander, 2006). Sel HeLa ini cukup aman dan merupakan sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel (Rosita, 2000). HeLa bersifat imortal yang tidak dapat mati karena tua dan dapat membelah secara tidak terbatas selama memenuhi kondisi dasar bagi sel untuk tetap hidup masih ada. Sel HeLa telah mengalami transformasi akibat infeksi human papillomavirus 18 (HPV 18) dan berbeda dengan sel leher rahim yang normal (Wikipedia, 2006b).
18
Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur. Media yang digunakan adalah media RPMI 1640-serum. Di dalamnya terkandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral berfungsi sebagai kofaktor enzim (Freshney,1986). Gambar sel HeLa dapat dlihat pada Gambar 2.6.
Gambar 2.6. Gambar sel HeLa Untuk menentukan jumlah sel yang mati digunakan pewarna larutan tripan biru 0,4%. Sel yang mati akan menyerap tripan biru karena permeabilitas membrannya telah rusak. Maka dari itu, sel yang mati akan terwarnai biru. Sel yang akan dihitung kepadatannya, dirontokkan terlebih dahulu dari dasar botol kultur dan dihomogenkan. Selanjutnya diambil suspensi sel dan larutan tripan biru dengan perbandingan 1 : 9. Campuran tersebut dihomogenkan dan siap dihitung dengan hemositometer. Sebelum dimasukkan ke hemositometer, sebaiknya ditunggu minimal 3 menit dengan tujuan memberikan waktu untuk penyerapan warna dan perhitungan harus diselesaikan dalam waktu kurang dari 10 menit agar
19
tidak ada sel yang mati karena pengaruh zat warna tersebut (Sukardiman, 2006). Data hasil percobaan dianalisis dengan menggunakan uji Anova satu arah untuk mengetahui pengaruh penambahan ekstrak dengan konsentrasi yang berbeda pada kultur sel mieloma mencit dan sel HeLa.
Untuk mengetahui kelompok larutan percobaan mana saja yang berbeda maka dilakukan uji LSD (Least Significant Difference). Selanjutnya ditentukan harga LC50, yakni konsentrasi larutan uji yang menghambat 50% pertumbuhan sel dengan menggunakan analisis probit (Sukardiman, 2006). Menurut Swanson (1990) dan Ma’at (1998) dalam Hidayat (2002) ekstrak tanaman dianggap memiliki aktivitas antikanker jika harga LC50 < 20 µg/mL terhadap kultur sel kanker. 2.7 Metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) merupakan teknik antibodi atau antigen pada suatu sampel. Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Peter Perlmman dan Eva Engvall pada tahun 1971 (Wikipedia, 2008). Dasar penggunaan ELISA dalam imunotoksikologi adalah untuk mendeteksi penyebaran antibodi spesifik pada sampel serum yang dihasilkan dari suatu materi yang telah disintesis dalam suatu antigen khusus. Uji ini dapat dibentuk untuk beberapa golongan antibodi. Serum antibodi spesifik bereaksi dengan antigen tertentu dalam keadaan permukaan tidak bergerak untuk membentuk suatu kompleks. Berbagai macam teknik dapat digunakan untuk mengikatkan suatu enzim ke dalam kompleks tersebut. Selanjutnya enzim dreaksikan dengan substrat yang cocok untuk membentuk reaksi warna yang
20
dapat diukur secara spekktrofotometri. Intensitas dari reaksi warna tersebut dapat dikorelasikan sebagai jumlah antibodi yang dihasilkan (Burleson, 1995). Enzim yang digunakan
untuk melabel antigen atau antibodi harus
memenuhi beberapa persyaratan, diantaranya tidak boleh mengurangi sifat imunologi antigen maupun antibodi, harus dapat diperoleh dalam keadaan murni serta stabil untuk dapat disimpan selama jangka waktu tertentu. Enziim yang banyak dipakai pada saat ini adalah peroksidase, fosfatase lindi, glukosa oksidase dan β-galaktosidase (Kresno, 1996). ELISA telah digunakan secara luas dalam ilmu pengobatann klinik untuk mengidentifikasi adanya bakteri, virus, dan antigen-antigen parasitik. Baru-baru ini, metode ELISA banyak digunakan untuk mendeteksi adanya kontaminankonntaminan antigen atau antibodi (Wikipedia, 2008).
2.8 Identifikasi Minyak Atsiri Rimpang Temu Putih Identifikasi minyak atsiri rimpang temu putih menggunakan teknik spektroskopi kromatografi gas – spektroskopi massa (Harborne, 1987). Kromatografi gas merupakan salah satu metode pemisahan yang baik untuk memisahkan campuran yang rumit dengan tingkat kemurnian hasil pemisahan dan sensitivitas yang tinggi. Kromatografi jenis ini menggunakan fase diam berupa cairan yang sering disebut dengan kromatografi gas cair (GLC) dengan fase geraknya adalah gas. Metode ini sering digunakan dalam identifikasi senyawa karena memberikan waktu retensi yang khas untuk senyawa yang berbeda. Metode ini biasanya digabungkan dengan metode identifikasi lainnya, yaitu
21
spektroskopi massa yang biasa disebut dengan GC-MS (Sastrohamidjojo, 1991 dan Gritter, 1991). Pada identifikasi senyawa organik, molekul organik ditembak dengan berkas elektron menjadi ion bermuatan positif yang berenergi tinggi (ion molekuler), kemudian ion molekuler ini terpisah menjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil. Fragmen-fragmen yang terpisah dicatat sebagai suatu puncak yang dinyatakan dalam satuan massa dibagi muatan (m/e). Spektrometer massa dapat mengidentifikasi massa molekul relatif (BM), dan pemenggalan suatu senyawa yang tidak diketahui, dengan membandingkannya terhadap senyawa yang dikenal (standar). Dari data yang diperoleh bila ada kesamaan, dapat dianggap bahwa senyawa tersebut identik (Silverstein, 1981 dan Gritter, 1991).
