BAB 3 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan sejak bulan Mei 2011 sampai dengan bulan Desember 2011. Kegiatan ini dilakukan di laboratorium Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas objek, kaca penutup, mikroskop, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, öse, bunsen, inkubator, ice box, pinset, vortex, cotton swab, mikropipet, tabung Durhamdan pipet. Bahan yang digunakan antara lain tembolok ayam, contoh air yang digunakan sebagai sumber air bersih dan limbah hasil pencucian, potongan usus besar, Lactophenol Cotton Blue (LPCB), Potatoes Dextrose Agar (PDA), putih telur bebek, larutan NaCl, air suling sucihama, antibiotika (kloramfenikol), larutan Potatoes Dextrose Broth (PDB)dan anticendawan (itrakonazol, ketokonazol, dan griseofulvin)
Metode Pengambilan Contoh Contoh pemeriksaan yang digunakan dalam penelitian adalah tembolok dan potongan usus besar ayam pedaging ras dan ayam bukan ras (ayam buras), air bersih yang digunakan untuk pencucian karkas, sertalimbah air hasil pencucian di pasar tradisional Pasar Gunung Batu, Pasar Anyar, dan Pasar Warung Jambu dan tempat pemotongan unggas (TPU) Jambu Raya, TPU Pondok Rumput, dan RPH Bubulak di wilayah Kota Bogor.
18
Pengolahan Contoh Pengolahan contoh dilakukan berdasarkan metode yang dilakukan oleh Hastiono (1987) yang mengacu pada Thompson (1969). Contoh diproses di ruang inokulasi. Pengolahan tiap-tiap tembolok dilakukan secara “dilution plating” (pengolahan bahan pemeriksaan ke dalam cawan-cawan petri yang mengandung medium perbiakan dengan pengenceran secara bertingkat).
Tahapan-tahapan
yang dilakukan adalah (a) tembolok, potongan usus, air bersih untuk pencucian karkas, dan air limbah hasil pencucian dimasukkan ke dalam kantung plastik kosong sucihama berkode lengkap. Sebanyak 1 g potongan usus dan tembolok, serta 1 mL air bersih untuk pencucian karkas dan air limbah hasil pencucian kemudian dibubuhi larutan NaCl fisiologis yang sucihama sebanyak sembilan kali bobot potongan tembolok sehingga diperoleh pengenceran 1/10; (b) masing-masing contoh yang telah dimasukkan ke dalam larutan NaCl dihomogenisasikan dengan menggunakan vortexdan cairan suspensi yang dihasilkan dimasukkan ke dalam cawan petri masing-masing sebanyak 1,0 mL dan 0,1mL agar didapatkan pengenceran 1:10 dan 1:100; (c) cawan-cawan yang telah terisi suspensi kemudian di tuangi media PDA yang telah dicairkan dan telah ditambahkan antibiotika kloromfenikol 0,05 mg/mL medium, dihomogenkan sampai bercampur dan dibiarkan membeku. Media yang sudah diolah ini lalu diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 48 jam.
Pengamatan Terhadap Koloni C. albicans Koloni yang tumbuh pada pembiakan PDA diamati warna, bentuk, dan baunya. Kemudian secara mikroskopik diperhatikan ukuran dan bentuk selnya, ada tidaknya miselium, kapsul dan ciri-ciri morfologik yang lain (Hastiono 1987)
Identifikasi isolat C. albicans Identifikasi isolat C. albicans dilakukan menurut cara Al-Doory (1980). Pengidentifikasian isolat pertama kali dilakukan dengan cara pemeriksaan natif. Pemeriksaan natif dilakukan dengan menggunakan mengambil koloni dari isolat
19
tembolok, usus besar, air limbah maupun air bersih yang digunakan untuk membersihkan daging ayam dan diteteskan dengan pewarna LPCB diatas gelas objek,ditutup dengan kaca penutup dan diperiksa dengan mikroskop. Tahap selanjutnya adalah dilakukan inokulasi pada suhu 37ºC. Hal ini dilakukan untuk memastikan apakah isolat tersebut patogen atau tidak. Isolat murni diinokulasikan kembali ke dalam media PDA baru, lalu dinkubasikan pada suhu 37 oC. Uji tabung-kecambah (germ tube test) dilakukan untuk mengidentifikasi spesies dari Candida yang telah diisolasi. Jika terbentuk tabung kecambah, maka biakan tersebut kemungkinan adalah C. albicans atau C. stellaoidea. Uji ini dilakukan dengan cara biakan murni berumur 24 jam dibiakkan ke dalam 0,5 mL putih telur bebek dan kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 2-4 jam. Setelah dua jam, biakan diperiksa dengan mikroskop untuk mengetahui ada tidaknya tabung kecambah. Uji asimilasi gula-gula dilakukan untuk memastikan spesies isolat C. albicans. Uji ini menggunakan tabung reaksi yang berisi media cair Sugar assimilation medium yang terdiri dari glukosa, galaktosa, sukrosa, maltosa, laktosa, dan manitol. Sedikit koloni khamir dipindahkan menggunakan öse atau jarum ke dalam tabung reaksi yang di dalamnya terdapat 2mL air suling sucihama, kemudian dilakukan pengadukan dengan menggunakan vortex hingga merata. Suspensi khamir yang dihasilkan disamakan kepekatannya dengan larutan McFarland #1. Sebanyak 0,2mL suspensi khamir dimasukkan ke tabung-tabung gula-gula yang telah disiapkan. Tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 30ºC selama tujuh hari. Hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan dan terjadinya kekeruhan pada tabung jika dibandingkan dengan tabung kontrol (tabung yang tidak diimbuhi dengan gula).
Uji Kepekaan Anticendawan Uji pembentukan zona hambat dilakukan untuk melihat kepekaan isolat C. albicans terhadap anticendawan yang digunakan. Metode yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan metode yang digunakan oleh Kusumaningtyas et al. (2008).
20
Media disiapkan terlebih dahulu dengan cara menuangkan 20 mL PDA ke dalam cawan Petri dan dibiarkan memadat. Masing-masing suspensi C. albicans,yang setara dengan kandungan khamir sejumlah 106cfu/mL, kemudian dioleskan secara merata pada permukaan media dengan menggunakan spatula atau cotton swab. Setelah permukaan mengering, kurang lebih 20 menit, dibuatlah lubang dengan diameter lima milimeter dan kedalaman 0,5 cm dengan menggunakan tabung Durhamsucihama. Setiap lubang diisi dengan 25µL anticendawan yang telah diencerkan dengan menggunakan mikropipet. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37◦C dan dilihat pembentukan zona hambatnya. Anticendawan yang digunakan adalah ketokonazol dengan kadar mulai dari 0,125 µg/mL, itrakonazol dengan kadar mulai dari 0,125 µg/mL, dan griseofulvin dengan kadar mulai dari 0,25 µg/mL dan kadar masing-masing obat terus dinaikkan sampai membentuk zona hambat pada masing-masing isolat.
Uji Penentuan Kadar Minimum Penghambatan (Minimum Inhibitory Concentration- MIC) Tahap akhir dari tata kerja penelitian ini adalah dilakukan penentuan kadar hambat minimum (minimum inhibition concentration,MIC). Uji ini digunakan untuk mengetahui kadar terendah anticendawan yang dapat menghambat pertumbuhan koloni khamir hingga 80% dari pertumbuhan koloni khamir. Uji ini mengikuti teknik yang telah dilakukan oleh Espinel-Ingroff dan Cantón (2007). Uji ini digunakan untuk mengetahui kadar terendah anticendawan yang dapat menghambat pertumbuhan koloni C. albicansyang ada dalam tembolok dan usus ayam maupun air bersih yang akan digunakan untuk mencuci karkas ayam serta air limbah pencucian ayam. Uji ini diawali dengan menempatkan koloni C. albicans umur 24 jam ke tabung reaksi yang di dalamnya terdapat sembilan mililiter air suling sucihama.Dilakukan pengadukan hingga menyatu. Suspensi C. albicans yang dihasilkan disamakan kepekatannya dengan larutan McFarland #1 yang setara dengan kandungan khamirsejumlah 108 CFU/mL. Kemudian,suspensi C.albicans diencerkan dengan cara memindahkan sebanyak 1 mL larutan suspensi C. albicans ke dalam 9 mL larutan PDB untuk menghasilkan larutan suspensi yang mengandung khamir sejumlah 107 CFU/mL, kemudian diencerkan kembali
21
dengan memindahkan suspensi yang telah dihasilkan tersebut sebanyak 1mL ke dalam 9 mL larutan PDB untuk menghasilkan larutan suspensi yang mengandung khamir sejumlah 106 CFU/mL. Setelah itu sebanyak 11,25 µL anticendawan yang akan diujiditambahkan ke dalam suspensi khamir terakhir. Anticendawan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ketokonazol dengan kadar 8 µg/mL, 2 µg/mL, 0,5 µg/mL, dan 0,125 µg/mL; itrakonazol dengan kadar 16 µg/mL, 4 µg/mL, 0,5 µg/mL, dan 0,125 µg/mL; serta griseofulvin dengan kadar 128µg/mL, 16µg/mL, 2 µg/mL, dan 0,25 µg/mL. Suspensi C. albicans yang telah ditambahi dengan anticendawandiencerkan sampai ke tingkat pengenceran 10-7. Sebanyak satu mililiterdari masing-masing tabung pengenceran 10-3 sampai 10-7 dituangkan ke dalam satu cawan petri. Setelah itu, ke dalam semua cawan dituangi media PDA yang mengandung sebelumnya telah diimbuhi antibiotika kloramfenikol dengan dosis 0,05 mg/mL medium. Pencampuran harus merata sehingga cawan yang telah ditambahkan media dihomogenkan dengan cara membentuk angka 8 beberapa saat untuk seterusnya didiamkan hingga media agar memadat. Seluruh cawan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh setelah masa inkubasi dicapai dihitung koloni dengan aturan hanya cawan yang diperkirakan koloni yang tumbuh pada kisaran 25-250 CFU saja yang akan dihitung.
Analisis Data Data kepekaan anticendawan terhadap C. albicans yang dihasilkan pada penelitian kali ini diolah dengan menggunakan analisis One Way ANOVA dilanjutkan dengan uji Duncan.
