B-sejtek és vírusok kölcsönhatásainak vizsgálata patogén (EBV) általi transzformáció és lentivirális vektor (HIV-1) általi transzdukció segítségével
Dr. Kvell Krisztián
PhD tézis
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Immunológiai és Biotechnológiai Intézet
2007
B-sejtek és vírusok kölcsönhatásainak vizsgálata patogén (EBV) általi transzformáció és lentivirális vektor (HIV-1) általi transzdukció segítségével
Dr. Kvell Krisztián
PhD tézis
Program-vezető: Prof. Dr. Németh Péter PhD Témavezetők: Dr. Balogh Péter PhD1, Prof. Rudolf H. Zubler MD PhD2 és Prof. Dr. Németh Péter PhD1 1: Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Immunológiai és Biotechnológiai Intézet 2: Research and Development Unit, Division of Hematology Department of Internal Medicine, Geneva University Hospitals, Switzerland
2
BEVEZETÉS Az Epstein-Barr vírus (EBV) a herpesvírus-család tagja, humán patogén kettősláncú DNS vírus kiterjedt genetikai állománnyal (172 kb) és programmal (85 gén). Az EBV kifejezett humán B-sejt tropizmussal rendelkezik. A felnőtt lakosság több mint 90%-a fertőzött a vírussal. A vírus élete bifázisos: a kezdeti lítikus ciklust követő gyors replikáció utáni latens fázisban a hosszú-életű memória B-sejtekben szunnyad. Az első fázisban kifejezett, míg a latencia-programok alatt visszafogott a virális gének aktivitása. Változatos kórképekért felelős: mononukleózis, Burkitt-limfóma, nazopharingeális karcinóma, Hodgkinkór és az AIDS-betegekben illetve transzplantáltakban megfigyelt limfoproliferációs betegség (PTLD) kialakulásáért. A PTLD betegség erős és tartós immun-szuppresszió esetén megfigyelhető EBV reaktiváció következménye. PTLD betegséget nem csak endogén EBV reaktiváció, hanem EBV szuperinfekció is kiválthat immunhiányos állapotban. Az egyes kórképekben; lítikus fázisban és latens programok esetén jellegzetes, egymástól jelentősen eltérő EBV gén-expressziós mintázatok figyelhetők meg. Az EBV alapú virális vektorok alkalmazása már létező, azonban ma még kiforratlan technika. Továbbá valószínűleg még a technika jelentős fejlődése esetén is kétes értékű lenne egy EBV-alapú virális vektor (mint a vizsgálat szempontjából inert(?) vektor) használata egyes EBV-gének illetve komplett EBV gén-expressziós mintázatok vizsgálatára humán primer B-sejtekben. A humán immun-deficiencia vírus-1 (HIV-1) humán patogén retrovírus, mely a lentivírusok családjába sorolható RNS vírus. Biotechnológiai módszerekkel a vad típusú vírusból kiindulva HIV-1 alapú mesterséges virális vektorok készíthetők. Az eredeti HIV genom virulenciáért és replikációért felelős génjének eltávolításával létrehozott vektor biztonságosan használható standard P2 laboratóriumi körülmények között. Amennyiben a vad típusú vírus felszínén levő gp120 sejtfelszíni ligand helyett VSV-G (vezikuláris stomatitis vírus G-protein) fehérjét pszeudotipizálunk, akkor a vektor tropizmusát jelentősen
3
kiterjesztjük és az így gyakorlatilag bármely emlős faj tetszőleges szövetének sejtjeihezl képes kapcsolódni. A leírt módosításoknak köszönhetően egy biztonságos, nagyon sokoldalú és rugalmas vektort kapunk, mellyel tetszőleges gént vagy géneket építhetünk osztódó és nyugvó, sejtvonalak és primer sejtek magjába tartósan. A lentivirális vektorok kutatási és génterápiás célzattal történő in vitro és in vivo felhasználása egyaránt rendkívül ígéretes. Ha sikerülne olyan humán primer B-sejt monokultúra rendszert létrehozni, melyben hatékonyan használhatók lentivirális vektorok, az lehetőséget adna többek között egyes EBV-gének illetve részenként összeillesztve komplett EBV gén-expressziós programok (lítikus és latens) humán primer B-sejtre kifejtett hatásának vizsgálatára, a kísérlet szempontjából inert karrier vektor (HIV-1 alapú lentivirális vektor) felhasználásával.
CÉLKITŰZÉSEK 1. Az endogén EBV reaktiváció következtében kialakuló humán B-sejtes PTLD betegség állatkísérletes modellezése ember-egér (hu-SCID) kiméra rendszerben.
2. A PTLD betegség állatkísérletes modelljének standardizálása ismert EBV törzs in vivo elvégzett szuperinfekciójával, a bevitt exogén EBV törzs dominanciájának kimutatása.
3. Lentivirális vektor hatékony felhasználására alkalmas humán primer B-sejt monokultúra rendszer létrehozása, génbeviteli hatékonyság vizsgálata marker gén (GFP) felhasználásával.
4. GFP mellett funkcionálisan aktív intracelluláris (vFLIP) és szekretált (IL-4) transzgén bevitele és funkcionalitásuk vizsgálata humán primer B-sejtekben (’proof of principle’).
4
ANYAG ÉS MÓDSZER Humán sejtek izolálása Egészséges donorok véréből előállított buffy-coatot Ficoll-gradiens centrifugálással tisztítottam tovább. A kapott fehérvérsejt-szuszpenzióból (PBMC) az adherens sejtek kitapasztása után (PBL) anti-CD19-beads technikával nagy tisztaságú (>97%) B-sejt szuszpenzió nyertünk.
SCID egerek A C.B.17 scid/scid homozigóta egereket SPF körülmények között antibiotikus védelemben tartottuk. Az állatokat rendszeresen követtük, a ’leaky’ egyedeket a kísérletekből kizártuk.
Hu-SCID kiméra létrehozása Megfelelő mennyiségű (3-6x107) PBMC i.p. injekciójával kimérizmus alakítható ki SCID egérben. A fajok közti immunológiai kimérizmus kb. 4 hét után funkcionális.
Exogén EBV törzs A B95-8 selyemmajom sejtvonal EBV tartalmú felülúszója a Baranya Megyei ÁNTSZ Virológiai Laboratóriumából származik. A felülúszó infektív EBV virionokat tartalmaz, melyet i.p. injekcióval juttattunk 10 nappal korábban létrehozott hu-SCID kimérákba.
Hu-SCID kiméra rendszerek vizsgálata A humán B-sejtes limfoproliferáció következtében moribund állapotú egerekből peritoneális sejteket és nyirokszerveket távolítottunk el. Sejtfelszíni és intracelluláris jelölést követően a sejteket flow-cytometriás analízissel vizsgáltuk. A nyirokszervekből (lép, nyirokcsomók) metszeteket készítettünk, melyeket fixálás után immunhisztokémiai analízisnek vetettünk
5
alá. Egyes állatok lépéből RNS izolálást követően aktív EBV törzseket azonosítottunk irodalomban
közölt
primerek
és
kereskedelmi
forgalomban
kapható
reagensek
felhasználásával RT-PCR módszerrel. Ismert EBV törzsek DNS-ét használtuk kontrollként.
B-sejt monokultúra rendszer Nagy tisztaságban izolált (lásd fent) humán primer B-sejteket aktiváltunk CpG oligo, antihumán Ig, humán rekombináns IL-2 és IL-10 jelenlétében. A sejtek a kultúra 3. napján hatékonyan fertőzhetők lentivirális vektorral. A kultúra időtartama maximum 10 nap, mialatt osztódás és Ig szekréció egyaránt mérhető.
Lentivirális vektorok készítése A felhasznált mono- (GFP) és bicisztronos (vFLIP-GFP vagy IL-4-GFP) vektorok a Genfi Orvostudományi
Egyetemmel
(CMU)
és
a
Genfi
Kantonális
Kórházzal
(HUG)
kollaborációban készültek.
Transzfektált B-sejtek vizsgálata A transzfektált sejtekben a transzgenikus fehérjék a kultúra 48 óra elteltével aktívak. Minden alkalmazott módszerhez kereskedelmi forgalomban kapható antitesteket és reagenseket használtunk. Sejtfelszíni és intracelluláris jelölést követően flow-cytometriás analízissel vizsgáltuk a sejteket transzgén expresszió tekintetében. A bevitt vFLIP transzgenikus fehérje jelenlétét Western-blot módszerrel is kimutattuk, védő hatását natív kultúrában és flow cytometriás sortolással dúsított sejteken is vizsgáltuk FasL jelenlétében. A transzfektált sejtek által szekretált IL-4 mennyiségét ELISA módszerrel határoztuk meg. A transzgenikus IL-4 funkcionalitását másodlagos kultúrákban bizonyítottuk (CD40L kultúrában fokozott proliferáció, EL4/B ko-kultúrában IgE termelés).
6
EREDMÉNYEK 1. A hu-SCID kiméra rendszerben az endogén EBV reaktiváció következtében fatális humán B-sejtes limfoproliferáció alakul ki. Az elváltozás több jegye megegyezik a humán PTLD betegséggel. A kísérletes állatok túlélése nagymértékű időbeli variancát mutat (46-67 nap).
2. A PTLD betegség modellje az állatok túlélése tekintetében jelentősen standardizálható (3032 nap) ismert EBV törzs in vivo elvégzett szuperinfekciójával. Az exogén bevitt EBV törzs (B95-8) dominanciája a kiméra szerveiben bizonyítható.
3. CpG oligo, α-Ig, IL-2 és IL-10 aktivációval olyan maximum 10 nap időtartamú humán primer B-sejt monokultúra rendszer hozható létre, melyben a B-sejtek nagy hatékonysággal transzfektálhatók lentivirális monocisztronos vektorokkal (kb. 25-30% GFP+ populáció).
4. Lentivirális bicisztronos vektorral B-sejtekbe GFP mellett egyéb funkcionálisan aktív transzgének is hatékonyan bejuttathatók (kb. 15% GFP+ populáció). A lentivirális vektorral bevitt vFLIP gén hatékonyan megvédte a GFP+ sejteket FasL mediálta apoptózis ellen. Amennyiben IL-4 gént juttattunk lentivirális vektorral B-sejtekbe, a GFP+ B-sejtek által szekretált transzgenikus IL-4 szintén funkcionálisan aktív volt (proliferáció-fokozás, IgE izotípus-váltás) másodlagos B-sejt kultúra rendszerekben.
7
MEGBESZÉLÉS Hu-SCID kiméra rendszer létrehozásakor egészséges emberi donorokból származó fehérvérsejtekkel (PBMC) repopulálunk immunhiányos egereket (SCID törzs). A rendszerben az
immunológiai
kimérizmus
műkodőképes,
a
limfocita-recirkuláció
megtartott,
immunológiai memória hívható elő és alakítható ki. A kimérában mégis súlyos immunhiányos állapotot idéző EBV reaktiváció következtében poliklonális, fatális kimenetelű humán Bsejtes limfoproliferáció alakul ki, akárcsak PTLD esetében. Reaktiváció során az EBV génexpressziós mintázat ismerten jelentős változáson megy keresztül. A limitált EBV génexpressziót mutató I-es latencia-programból rohamosan a III-as latencia programig bővül az aktív EBV gének köre. Az endogén reaktivációnál nagyobb eséllyel és ütemben fejlődik ki humán PTLD és modellje exogén EBV szuperinfekció esetén, mely rögtön a III-as latencia programot indítja el. A korábban irodalomban leírt humán primer B-sejt transzfekciós rendszerek vagy csak kis hatékonysággal működtek (pl. CD40L rendszer), vagy csak kokultúra rendszerben voltak kellően hatékonyak (pl. EL4/B-sejt rendszer). A témában fontos előrelépés, hogy egyedülálló módon hatékony lentivirális transzfekciós módszer sikeres adaptálását végeztük egy humán primer B-sejtes monokultúra rendszerben (CpG rendszer). Marker gén mellet egyéb, modell értékű intracelluláris és szekretált transzgenikus fehérjék génjeit építettük be a célsejtekbe. A transzgenikus fehérjék funkcionálisan tökéletesen működőképesek voltak. A lentivirális technikák hatékony adaptálása humán primer B-sejtes monokultúrában új távlatokat nyithat többek között az egyes EBV gének és komplett EBV gén-expresszió mintázatok kutatásában. Lehetővé teszi a humán primer B-sejteken végzett vizsgálatokat a genetikailag gyakran jelentősen (pl. endogén EBV következtében) megváltozott humán Bsejtvonalak használata helyett oly módon, hogy a kísérletekhez a vizsgált (pl. EBV) gének vagy géncsoportok szempontjából inert virális vektort (HIV-1 alapú vektor) alkalmazunk.
8
PUBLIKÁCIÓK Összes impakt faktor: 27.35 A tézis alapját képező közlemények (impakt faktoruk: 23.64) Kvell K, Nguyen TH, Salmon P, Glauser F, Werner-Favre C, Barnet M, Schneider P, Trono D, Zubler RH. Transduction of CpG DNA-stimulated primary human B cells with bicistronic lentivectors. Mol Ther. 2005 Nov;12(5):892-9. impakt faktor: 6.13 Bovia F, Salmon P, Matthes T, Kvell K, Nguyen TH, Werner-Favre C, Barnet M, Nagy M, Leuba F, Arrighi JF, Piguet V, Trono D, Zubler RH. Efficient transduction of primary human B lymphocytes and nondividing myeloma B cells with HIV-1-derived lentiviral vectors. Blood. 2003 Mar 1;101(5):1727-33. impakt faktor: 10.12 Kvell K, Balogh P, Nemeth P. [Clinical aspects of Epstein-Barr-virus-associated lymphoproliferative disease] Orv Hetil. 2002 Apr 7;143(14):713-9. Review. Hungarian. Kvell K, Balogh P, Nemeth P. Fine-tuning the EBV+ hu-PBL-SCID xenogeneic chimera model using in vivo superinfection. Pathol Oncol Res. 2000;6(4):280-6. Cooper EL, Kvell K, Engelmann P, Nemeth P. Still waiting for the toll? Immunol Lett. 2006 Apr 15;104(1-2):18-28. impakt faktor: 1.71 Kvell K, Czompoly T, Pikkarainen T, Balogh P. Species-specific restriction of cell surface expression of mouse MARCO glycoprotein in murine cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Mar 24;341(4):1193-202. impakt faktor: 2.84 Bartis D, Boldizsár F, Kvell K, Szabó M, Pálinkás L, Németh P, Monostori E, Berki T. Intermolecular relations between the glucocorticoid receptor, ZAP-70 kinase, and Hsp-90. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Mar 2;354(1):253-8. impakt faktor: 2.84 Kvell K, Cooper EL, Engelmann P, Nemeth P. Blurring borders: innate immunity with adaptive features. Clinical and Developmental Immunology 2007 (in press) Egyéb közlemények (impakt faktoruk: 3.71) Pal J, Nyarady Z, Marczinovits I, Par A, Ali YS, Berencsi G, Kvell K, Nemeth P. Comprehensive regression analysis of hepatitis B virus X antigen level and anti-HBx antibody titer in the sera of patients with HBV infection. Pathol Oncol Res. 2006;12(1):34-40.
9
Bagamery K, Landau R, Kvell K, Graham J. Different platelet activation levels in non-pregnant, normotensive pregnant, pregnancyinduced hypertensive and pre-eclamptic women. A pilot study of flow cytometric analysis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 Jul 1;121(1):117-8. impakt faktor: 1.00 Bagamery K, Kvell K, Landau R, Graham J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 2005 May;65(1):84-7. impakt faktor: 2.10 Bagamery K, Kvell K, Barnet M, Landau R, Graham J. Are platelets activated after a rapid, one-step density gradient centrifugation? Evidence from flow cytometric analysis. Clin Lab Haematol. 2005 Feb;27(1):75-7. impakt faktor: 0.61 Nagy G, Szekeres G, Kvell K, Berki T, Nemeth P. Development and characterisation of a monoclonal antibody family against aquaporin 1 (AQP1) and aquaporin 4 (AQP4). Pathol Oncol Res. 2002;8(2):115-24. KONFERENCIÁK Nemzetközi konferenciák Nemzetközi Immunológiai Kongresszus (EFIS), Stockholm, 2001 Predictive Oncology and Intervention Strategies, Párizs, 2002 „Fresh air” Scientific Forum, Changins, 2002 „Fresh air” Scientific Forum, Prangins, 2003 Federation of the Societies of Biochemistry and Molecular Biology (FEBS), Budapest, 2005 Signals and Signal Processing in the Immune System (SASPITIS), Balatonöszöd, 2005 Hazai konferenciák Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Debrecen, 2001 Magyar Élettani Társaság Vándorgyűlése, Szeged, 2001 Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztály, Sárospatak, 2001 Magyar Immunológiai Társaság Konferencia, Eger, 2001 Magyar Immunológiai Társaság Konferencia, Szeged, 2004 Membrán Transzport Konferencia, Sümeg, 2005 Magyar Immunológiai Társaság Konferencia, Sopron, 2005 Membrán Transzport Konferencia, Sümeg, 2006 Díjazott előadások, pályamunkák TDK konferencia, III. díj, Pécs, 1999 Korányi Frigyes Tudományos Fórum, II. díj, Budapest, 1999 Rektori Pályamunka II. díj, Pécs, 1999 Pécsi Akadémiai Bizottság pályázata, II. díj, Pécs, 2000 TDK konferencia, I. díj és Németh Árpád különdíj, Pécs, 2001 OTDK konferencia, Hematológiai és Transzfúziológiai Társaság különdíja, Pécs, 2001 XXXVI. Membrán Transzport Konferencia, Kovács Tibor díj, Sümeg, 2006
10
Examination of B cell and virus interactions through transformation by a pathogen (EBV) and transduction by a lentiviral vector (HIV-1)
Krisztián Kvell MD
PhD thesis
Department of Immunology and Biotechnology Faculty of Medicine, University of Pécs, Hungary
2007
Examination of B cell and virus interactions through transformation by a pathogen (EBV) and transduction by a lentiviral vector (HIV-1)
Krisztián Kvell MD
PhD thesis
Program leader: Prof. Péter Németh MD PhD Project leaders: Dr. Péter Balogh MD PhD1, Prof. Rudolf H. Zubler MD PhD2 and Prof. Péter Németh MD PhD1 1: Department of Immunology and Biotechnology Faculty of Medicine, University of Pécs, Hungary 2: Research and Development Unit, Division of Hematology Department of Internal Medicine, Geneva University Hospitals, Switzerland
2
INTRODUCTION The Epstein-Barr virus (EBV) is a member of the herpes virus family, human pathogenic ds DNA virus with vast genetic material (172 kb) and programme (85 genes). EBV has expressed human B-cell tropism. Over 90% of the adult population harbours the virus. The virus has a biphasic life-cycle: Following quick replication during the initial lytic cycle it resides in long-lived memory B-cells during latency. During the first phase there is extensive viral gene activity that becomes rather restricted during latency programmes. EBV is responsible for various diseases: Mononucleosis, Burkitt’s lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, Hodgkin’s disease and lymphoproliferative disease seen in transplanted- and AIDS-patients (PTLD). PTLD is the result of EBV reactivation seen in the cases of strong and prolonged immune-suppression. PTLD may not only be triggered by the reactivation of endogenous EBV, but also by exogenous EBV superinfection. Gene expression patterns seen in various diseases or during the lytic and latent programmes are significantly different and characteristic to the pathologies. The utilisation of EBV-based viral vectors is an existing, but to date technically demanding method. Moreover, even a technically advanced EBV-based viral vector is unlikely to be an inert vector for experiments examining individual EBV genes or complete EBV gene clusters when assayed in human primary B-cells. The human immune-deficiency virus-1 (HIV-1) is a human pathogen retrovirus that belongs to the family of lentiviruses. Via biotechnological methods HIV-1 based lentiviral vectors may be prepared starting from the wild-type virus. Vectors created by the removal of genes from the original HIV-1 genome responsible for virulence and replication may be securely used under standard P2 laboratory conditions. If the original viral envelope protein (gp120) is pseudotyped by a ubiquitous ligand (VSV-G or vesicular stomatitis virus Gprotein), then vector tropism is significantly broadened, allowing for the infection of practically any cell type of any given mammalian species. The above modifications yield a
3
very flexible and yet safe viral vector that may be used for the stable delivery of any given transgene into the nuclei of both dividing and resting cells of cell-lines or primary cells. The research-oriented and therapeutic applications of lentiviral vectors in vitro and in vivo are all very promising fields. If one would create a human primary B-cell monoculture system suitable for the efficient use of lentiviral vectors, that would also allow for the examination of individual EBV genes, complete EBV gene clusters, and even entire (lytic and latent) EBV gene-expression programmes affecting B-cells via the use of an inert carrier (HIV-1 based lentiviral) vector.
AIMS 1. Development of a human-mouse (hu-SCID) chimera system as an animal model for human primary B-cell-dominant PTLD disease triggered by endogenous EBV reactivation.
2. Standardisation of the animal model of the PTLD disease by performing in vivo superinfection utilising a known EBV strain, proving its presence and dominance.
3. Development of a human primary B-cell monoculture system that allows for the efficient use of lentiviral vectors, assay of gene delivery efficiency through the use of marker gene (GFP).
4. The introduction of functionally active intracellular (vFLIP) and secreted (IL-4) transgenes along with GFP and the assay of their functionality in primary B-cells (proof of principle).
4
MATERIALS AND METHODS Isolation of human cells Buffy-coats derived from healthy blood donors were further purified by Ficoll-gradient centrifugation. From the resulting leukocyte suspension (PBMC) then adherent cells were removed (PBL) followed by anti-CD19-beads separation to yield a highly pure (>97%) B-cell suspension.
SCID mice C. B. scid/scid homozygous mice were kept under SPF conditions in continuous antibiotic prophylaxis. Animals were regularly checked for leaky phenotypes that were.
Establishment of hu-SCID chimeras Following the injection of an appropriate amount of PBMC (3-6x107) chimerism may be established in SCID mice. Interspecies immunological chimerism becomes functional after approx. 4 weeks.
Exogenous EBV strain The EBV containing supernatant of the B95-8 marmoset cell-line came from the Regional Laboratory of Virology, Institute of State Public Health Service at Pécs. The supernatant contained infective virions introduced by i.p. injection 10 days following the PBL injection.
Examination of hu-SCID chimera system Peritoneal cells and the lymphoid organs were removed from moribund mice due to human Bcell lymphoproliferation. Following surface and intracellular staining the cells were assayed by flow-cytometry. From the lymphoid organs (spleen, lymphatic glands) sections were
5
made, that were assayed by immuno-histochemistry following fixation and staining as above. Following RNA isolation from the spleen of certain animals active EBV strains were identified using known primers and commercially available reagents by RT-PCR. DNA from known EBV strains was used as control.
B-cell monoculture system Highly pure (see above) human primary B-cells were activated by CpG oligo, ant-Ig, human recombinant IL-2 and IL-10. Cells were efficiently transducible by lentiviral cultures three days later. Cultures last most max. 10 days during which proliferation and Ig secretion occur.
Preparation of lentiviral vetors The used mono- (GFP) and bicistronic vectors (vFLIP-GFP or IL-4-GFP) were prepared in collaboration with the Medical University Centre (CMU) and the Geneva University Hospital (HUG).
Examination of transduced B-cells Transgenic proteins are active in the cultures 2 days after infection. Commercially available reagents and antibodies were used for all the applied methods. Cells were examined for transgene expression by flow-cytometry following surface and intracellular staining. The presence of the introduced transgenic vFLIP protein was shown by Western-blot, its protective effect against FasL was assayed in native cultures and on cells enriched by flowcytometric sorting. The quantity of IL-4 secreted by transgenic cells was measured by ELISA. The functionality of transgenic IL-4 was examined in secondary cultures (increased proliferation in the CD40L system, IgE secretion in the EL4-B5/B co-cultures.
6
RESULTS 1. As a result of endogenous EBV reactivation fatal human B-cell lymphoproliferation develops in the hu-SCID chimera system. Several aspects of the disease show similarity to the human PTLD. The survival of experimental animals shows significant variance (46-67 days).
2. The PTLD model may be significantly standardised in terms of survival (30-32 days) following in vivo superinfection with a known EBV strain. The dominance of the exogenous EBV strain (B95-8) is shown chimera organs.
3. The utilisation of CpG oligo, α-Ig, IL-2 and IL-10 allows for the establishment of a human primary B-cell monoculture system in which B-cells are efficiently transduced by monocistronic lentiviral vectors (approx. 25-30% GFP+ population).
4. Bicistronic lentiviral vectors allow for the efficient transduction of functionally active transgenes along with GFP (approx. 15% GFP+ population). The vFLIP gene introduced by lentiviral vector efficiently protected GFP+ cells from FasL-mediated apoptosis. If the IL-4 gene was introduced into B-cells by lentiviral vectors, then transgenic IL-4 secreted by GFP+ cells was also functional in secondary B-cell culture systems (increased proliferation, IgE isotype switch).
7
DISCUSSION During the establishment of the hu-SCID chimera system we repopulate immunedeficient mice (SCID) with leukocytes (PBMC) isolated from healthy human donors. Immunological chimerism is functional in the system, lymphocyte homing is normal, immunological memory may be recalled and developed. Still, as a result of EBV reactivation resembling PTLD, polyclonal, fatal human B-cell lymphoproliferation occurs. During reactivation EBV gene expression pattern is known to undergo significant changes. Starting from latency programme I the group of active EBV genes expands to latency programme III. Human PTLD develops at higher chances and rate in patients and in the model system in cases of exogenous EBV superinfection, compared to endogenous reactivation, as the former immediately initiates latency programme III. Previously described human primary B-cell culture systems used for transduction either gave low efficiencies (i.e. the CD40L system) or were co-culture systems (i.e. EL4B5/B system). It is a milestone in the field to combine the efficient lentiviral transduction method with a human primary B-cell monoculture system (CpG system). Along with a marker gene further genes, encoding ‘proof-of-principle’ intracellular and secreted transgenic proteins were introduced into the target cells. The transgenic proteins were functionally intact. The adaptation of the lentiviral technique in a human primary B-cell monoculture system offers new perspectives to the research of individual EBV genes and complete EBV gene clusters. This allows researchers to perform experiments on human primary B-cells instead of human B-cell lines that are often genetically instable (i.e. due to endogenous EBV) in a manner, so that the employed (HIV-1 based) lentiviral vector is functionally inert in terms of the assayed (i.e. EBV) genes or gene-clusters.
8
